Phân tích đa dạng trình tự ADN ty thể và mối quan hệ di truyền của bò H’mông với một số quần thể bò khác

Trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày: Một số kết quả phân tích sự ña dạng trình tự ADNvùng D-loop ty thể, xác ñịnh sự lai tạp giữa hai loại bò có u và bò không có u ở quần thể bò H’m

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG TRÌNH TỰ ADN TY THỂ VÀ MỐI QUAN HỆ DI TRUYỀN CỦA BÒ H’MÔNG VỚI MỘT SỐ QUẦN THỂ BÒ KHÁC

Phạm Doãn Lân 1 , Nguyễn Trọng Bình 1 , Trần Xuân Hoàn 1 , Vũ Chí Cương 1 ,

Lê Đình Lương 2 và J.C Maillard 3

1

Phòng TN trọng ñiểm Công nghệ tế bào ñộng vật -Viện Chăn nuôi - Thụy phương - Từ Liêm - Hà Nội

2 Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia - Hà Nội

3 Giám ñốc CIRAD vùng Đông Nam Á

*

Tác giả liên hệ: Phạm Doãn Lân - Phòng Thí nghiệm trọng ñiểm Công nghệ tế bào ñộng vật

Tel: (04).2.166.147 / 0914 366 975; Fax: (04) 8 389.775; Email: pdlanvn@yahoo.com

ABSTRACT

Mitochondrial DNA sequence diversity and phylogenetic relationships of H’Mong

cattle to other cattle populations

H’mong cattle is an local breed with unclear origin To assess the mitochondrial DNA sequence diversity and phylogenetic relationship of H’mong cattle to various other cattle populations, we analyzed for partial (530bp) of mtDNA D-loop sequences of 26 H’mong cattle samples in conjunction with previous published sequences from Northeast Asian (Korea, Japan), Europe, Africa, India and American bison cattle The results showed that 14 haplotypes were observed in total of 26 analyzed cattle samples, indicating that the H’mong cattle population had a high diversity of mtDNA In phylogenetic analysis, the H’mong cattle

samples were clustered into two distinct genetic lineages: taurine (Bos taurus) and zebu (Bos

indicus) The H’mong zebu lineages are closely related to Indian zebu cattle and are clearly

separate from other cattle populations while the H’mong taurine lineages, Eropean, African, Japanese and Korean cattle clustered together These results suggested that H’mong taurin lineages are closely related to cattle of Northeast Asian and Europe

Keywords: Mitochondrial DNA diversity, phylogenetic relationship, Bos indicus, Bos taurus

ĐẶT VẤN ĐỀ

Bò có vai trò chính trong sự phát triển của nền văn minh loài người và là một trong những loài vật nuôi thuần hoá có ý nghĩa kinh tế nhất Có hai phụ loài chính ñó là bò

không có u (Bos taurus) và bò có u (Bos indicus) ñều ñược cho là bắt nguồn từ bò rừng Châu Âu (Bos primigenius) ñã tồn tại từ cách ñây 8.000 - 10.000 năm và ñược thuần

hoá riêng biệt (Epstein, 1971; Epstein và Mason, 1984; Machugh và cs, 1997; Loftus

và cs, 1994)

Các giống bò hiện nay ñều là các biến thể của hai phụ loài Bos indicus và Bos taurus

Tính ña dạng về di truyền, nguồn gốc, sự bảo tồn và lợi ích của các giống bò này ñã ñược quan tâm nghiên cứu nhiều trên Thế giới

Bò H’mông hay bò Mèo là một giống bò ñịa phương ñặc trưng của tỉnh Hà Giang, chúng gắn liền với ñời sống và văn hoá của ñồng bào dân tộc H’mông Cùng với người

H’mông, bò H’mông sinh sống bán cô lập ở ñộ cao cao trên 1.000 mét so với mặt nước biển do ñó chúng ít bị lai tạp bởi các giống bò khác Theo một số giả thiết cho rằng bò

vàng Việt Nam có nguồn gốc từ bò có u Ấn Độ (Bos indicus) và bò vàng Trung Quốc không có u (Bos taurus) (Lê Viết Ly và cs, 1999) Tuy nhiên chưa có một bằng chứng

nào ở mức ñộ phân tử về sự lai tạp và nguồn gốc giữa hai dòng bò có u và bò không có

u ở bò Vàng Việt Nam nói chung và ở bò H’mông nói riêng ñược công bố

Trong nghiên cứu này chúng tôi trình bày: Một số kết quả phân tích sự ña dạng trình tự ADNvùng D-loop ty thể, xác ñịnh sự lai tạp giữa hai loại bò có u và bò không có u ở quần thể bò H’mông ñồng thời so sánh mối quan hệ di truyền giữa bò H’mông với một

số quần thể bò khác của Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Phi, Châu Âu, và bò rừng

Mỹ (Bison bison)

Ậ LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu

Hai mươi sáu cá thể bò H’mông ñược chọn ngẫu nhiên ở các huyện Đồng Văn, Mèo Vạc, Xín Mần và Hoàng Su Phì của tỉnh Hà Giang Trình tự nucleotit vùng D-loop ty thể của các mẫu bò Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi bò rừng Châu

Mỹ ñược thu thập từ ngân hàng gen Quốc tế (GeneBank)

Tách chiết ADN và nhân ADN ñặc hiệu (PCR)

Quy trình tách chiết ADN hệ gen từ các mẫu mô tai của 26 cá thể bò H’mông ñược thực hiện theo bộ kít tách QIAamp của hãng Qiagen (Đức)

Vùng ADN D-loop ty thể có kích thước 990 bp ñược nhân ñặc hiệu bởi phản ứng PCR với cặp mồi ñặc hiệu có trình tự:

Mồi xuôi: 5’-ACTAGGCATTTTCAGTGCCTTGCTT-3’

Mồi ngược: 5’-CCCAAAGCTGAAGTTCTATTTAAACTA-3’

Phản ứng PCR ñược tiến hành trong tổng thể tích 50 µl bao gồm: Đệm PCR 1x, 1,5mM MgCl2, 200 µM mỗi loại dNTP (A,T,G,C), 0,2 µM mỗi loại mồi xuôi, mồi ngược và 50-100 ng ADN khuôn Phản ứng PCR ñược thực hiện theo các bước: Trước tiên ADN ñược biến tính ở 94oC trong 4 phút, tiếp theo ñó với 32 chu kỳ, mỗi chu kỳ ñược thực hiện ở ñiều kiện như sau: biến tính ở 92oC trong 1 phút, gắn mồi ở 55oC trong 1 phút, tổng hợp chuỗi ADN ở 72oC trong 1 phút 20 giây Cuối cùng kết thúc phản ứng ở 72oC trong 10 phút

Phản ứng giải trình tự

Sản phẩm PCR sau ñó ñược tinh sạch bằng bộ kít tinh sạch (QIAquick PCR

Mix) của hãng Beckman Coulter và ñược tiến hành phân tích trên máy giải trình tự CEQ8000

Phân tích trình tự

Trình tự nucleôtit vùng D-loop ty thể của các mẫu bò H’mông ñược so sánh với trình

tự các mẫu bò của Nhật Bản, Hàn Quốc, Ấn Độ, Châu Âu, Châu Phi, bò rừng Mỹ (Bos binson) và trình tự toàn bộ ADN ty thể của hai mẫu bò không có u và có u ñối chứng

với mã truy cập trên ngân hàng gen tương ứng là V00654 và NC-005971 sử dụng công

cụ CLUSTALW trong phần mềm BIOEDIT và DNAsp

Khoảng cách di truyền giữa các trình tự vùng D-loop ty thể của các nhóm bò ñược tính theo phương pháp của Tamura và Nei (1993) Cây quan hệ di truyền (phylogenetic tree) ñược xây dựng bằng phần mềm MEGA phiên bản 4.0 (Kuma và cs, 1994)

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Sự ña dạng trình tự ADN vùng D-loop ty thể

ADN ty thể là một dạng vật liệu di truyền nằm ở ngoài nhân ñược di truyền theo dòng

mẹ Chúng có tỷ lệ ñột biến cao hơn 5-10 lần so với hệ gen trong nhân, ñặc biệt vùng kiểm soát D-loop (displacement loop) có tỷ lệ thay ñổi rất cao do ñó thường ñược sử dụng trong các nghiên cứu về phân loại và nguồn gốc tiến hoá của các loài

Tiến hành giải trình tự ADN vùng D-loop ty thể của các mẫu bò H’mông chúng tôi thu ñược ñoạn trình tự nuclêôtit có ñộ dài 530 bp (base pair) trên ñộ dài 990 bp của sản phẩm PCR Đoạn trình tự này có vị trí từ nuclêôtit 15813 ñến 16343 của toàn bộ trình

tự ADN ty thể ñược công bố bởi Anderson và cộng sự (1982) với mã truy nhập trên ngân hàng gen Quốc tế là V00654

So sánh và phân tích trình tự D-loop ty thể của 67 mẫu bò bao gồm: H’mông (26 mẫu); Hàn Quốc (4 mẫu bò vàng); Nhật Bản (9 mẫu bò ñen), Ấn Độ (6 mẫu gồm các giống Harianna, Sahiwal, Tharparkar); Châu Phi (8 mẫu gồm các giống: Butana, Fulani, Kenana và N’Dama); Châu Âu (12 mẫu gồm các giống: Aberdeen Angus, Charolais, Friesian, Here ford, Jersey và Simantal) và 2 mẫu ñối chứng của bò có u và không có

u, kết quả cho thấy xuất hiện 39 kiểu di truyền ñơn ty thể (haplotype) và có 50 ñiểm ña hình (polymorphic site) trên toàn bộ ñoạn trình tự ADN ñược phân tích (530 bp) Trong số 26 mẫu bò H’mông ñược phân tích thì có 14 kiểu di truyền ty thể ñược xác ñịnh, kết quả ñược trình bày ở Hình 1

Hình 1: Sai ña dạng trình tự vùng D-loop ty thể của 67 mẫu bò phân tích Ký hiệu của

các mẫu ñược thể hiện ở cột thứ nhất: EU (Châu Âu); AF (Châu Phi); JP (Nhật Bản);

KR (Hàn Quốc); VN (Viêt Nam); IN (Ấn Độ) V00654 và NC005971- tương ứng là

trình tự ADN ty thể chuẩn của mẫu bò không có u (B s taurus) và bò có u (Bos

indicus) Ký hiệu (-) chỉ sự tương ñồng giữa các nuclêôtit, (*) mất hoặc thêm

nuclêôtit

Qua hình 1 cho thấy trình tự ADN vùng D-loop ty thể ở bò H’mông ñược tách biệt

thành hai nhóm: nhóm H’mông 1 với các mẫu từ VN1 ñến VN9 có trình tự của dòng

bò không có u (Bos taurus); nhóm H’mông 2 với các mẫu từ VN10 ñến VN14 có trình

tự của dòng bò có u (Bos indicus) Trong số 26 mẫu bò H’mông ñược phân tích ngẫu

nhiên Kết quả cho thấy, có 14 mẫu thuộc dòng bò có u và 12 mẫu thuộc dòng bò

không có u (Hình 2) Điều ñó cho thấy rằng tính ña dạng ADN ty thể của quần thể bò

H’mông là tương ñối cao

Khoảng cách và mối quan hệ di truyền

Khoảng cách di truyền trung bình giữa các quần thể bò ñược ước lượng dựa trên

phương pháp của Tamura-Nei Kết quả ñược thể hiện ở Bảng 1

[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8]

[1] Châu Âu 0,000

[2] Châu Phi 0,008 0,000

[4] Nhật Bản 0,007 0,013 0,065 0,000

[8] Bò rừng

Mỹ

Qua Bảng 1 cho thấy, khoảng cách di truyền giữa bò rừng Mỹ và các quần thể bò khác (Châu Âu, Châu Phi, Ấn Độ, Việt Nam, Hàn Quốc, Nhật Bản) ñều lớn hơn 0,1 Trong

khi ñó, khoảng cách di truyền giữa bò Ấn Độ, H’mông 2 (thuộc dòng bò có u) và các

quần thể bò thuộc dòng không có u (Châu Âu, Nhật Bản, Hàn Quốc, Châu Phi,

H’mông1) lớn hơn 0,05 Khoảng cách di truyền giữa quần thể bò Châu Âu, Châu Phi,

Nhật Bản, Hàn Quốc và H’mông 1 dao ñộng trong khoảng 0,007–0,013 Khoảng cách

di truyền giữa nhóm bò H’Mông 1 và bò có u Ấn Độ là 0,004

Cây phân loài di truyền ở hình 2 cho thấy quần thể bò H’mông nhóm 1 và Châu Âu,

Châu Phi, Hàn Quốc, Nhật Bản ñều thuộc dòng bò không có u và có mối quan hệ gần

nhau ñồng thời chúng tách biệt so với bò có u Ấn Độ và bò rừng Mỹ Trong khi ñó

nhóm bò H’mông 2 có mối quan hệ di truyền rất gần với quần thể bò có u Ấn Độ

Mặc dù kết quả tính khoảng cách di truyền trên Bảng 1 cho thấy, giữa nhóm bò

H’mông 1 và bò Châu Âu, Hàn Quốc, Nhật Bản có mối quan hệ di truyền gần nhau

hơn so với nhóm bò Châu Phi tương ứng là (0,007-0,01) và (0,012) nhưng ở cây phân

loài di truyền (Hình 2) không cho thấy có sự tách biệt hẳn giữa các nhóm bò Châu Phi

và H’mông 1, Châu Âu, Hàn Quốc và Nhật Bản

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi giống với kết quả nghiên cứu của Kim và cs (2003),

khi nghiên cứu mối quan hệ di truyền của một số giống bò của Hàn Quốc cũng không

cho thấy sự tách biệt giữa bò Hàn Quốc, Châu Âu và Châu Phi Trong khi ñó, Mannen

và cs (1998) khi nghiên cứu nguồn gốc của giống bò ñen Nhật Bản (B
 taurus) dựa

trên phân tích trình tự ADN ty thể ñã cho thấy sự tách biệt giữa bò Châu Âu với bò

Châu Phi Trong ñó, một số cá thể bò ñen của Nhật Bản có mối quan hệ di truyền gần

gũi với bò của Châu Âu

Ngoài ra, một số nghiên cứu khác cũng ñã cho rằng hầu hết các giống bò ngày nay có

nguồn

gốc thuần hoá từ 3 khu vực khác nhau: Khu vực Tây Á là nguồn gốc của bò có u (Bos

indicus) bao gồm các giống bò có u Ấn Độ hiện nay, vùng Cận Đông và Châu Phi là

nguồn gốc của bò không có u -Bos taurus (Bradley và cs, 1996; Loftus và cs, 1994;

Troy và cs, 2001) Cho dù các giống bò Châu Phi hiện nay chúng có ñặc ñiểm hình

thái là dạng trung gian của hai phụ loài Bos indicus và Bos taurus tuy nhiên nguồn gốc

xuất hiện ban ñầu ở Châu Phi ñược cho là bò Bos taurus

Hìn 2: Cây quan hệ di truyền của 67 m9u bò ở Việt Nam (VN), Hàn Quốc (KR), Nhật Bản (JP), >n Độ (IN), Châu Âu (EU), Châu phi (AF), 5 mẫu bò rừng Châu Mỹ (Bison)

và 2 mẫu bò có u và không có u ñối chứng tương ứng là V00654, NC00597

Theo tác giả Phillips (1961) và Payne (1995) thì các giống bò bản ñịa của Trung Quốc

JP U87635

KR AF409056

JP U87639

JP U87637 VN8

JP U87634 Bos taurusV00654 VN22

VN5 VN13

JP U87640

EU L27716

JP U87650

EU L27734

EU L27735

KR AF409055

EU L27718

EU L27727

EU L27725

KR AF409057

EU L27713 VN23 VN19 VN1 VN15

EU L27724

AF L27730

AF L27728

AF L27721 VN11

KR AF409054

AF L27714 VN4 VN20

IN L27723 VN18

IN L27722

IN L27736

IN L27733 Bos indicusNC005971 VN2

VN43 VN6 VN9 VN10 VN16 VN26 Bison U12946 Bison U12936 Bison U12959

0 00

0 0 1

0 02

0 0 3

0 04 0.05

0 0 6

Bò không u

Bos taurus

Bò có u

Bos indicus

Bò rừng Mỹ

Bison bison

tập trung ở phía Bắc với tỷ lệ 81,8-100% ở các giống và ñược cho là do du nhập từ Mông Cổ trong khoảng thời gian giữa 3766-3122 năm trước Công Nguyên Trong khi

ñó bò không có u chủ yếu tập trung ở phía Nam Trung Quốc với tỷ lệ 63,3-100% ở các giống

KẾT LUẬN

Qua phân tích sai khác trình tự ADN vùng D-loop ty thể trên quần thể bò H’mông cho thấy tính ña dạng di truyền ADN ty thể là tương ñối cao

Quần thể bò H’mông có nguồn gốc từ sự lai tạp của hai dòng bò không có u (Bs taurus) và có u (Bos indicus), tỷ lệ bò có u chiếm 53,8%

Dòng bò không có u ở quần thể bò H’mông có mối quan hệ di truyền gần với bò không

u của Hàn Quốc, Nhật Bản (có nguồn gốc du nhập từ bò không u phía Bắc Trung Quốc) và Châu Âu, trong khi ñó dòng bò có u có mối quan hệ di truyền gần gũi với bò

có u Ấn Độ

Kết quả nghiên cứu ñã bước ñầu cung cấp bằng chứng ở mức ñộ phân tử cho thấy phù

hợp với nhận ñịnh rằng bò Vàng Việt Nam có nguồn gốc từ bò có u Ấn Độ (Bos

indicus) và bò Vàng Trung Quốc không có u (Bos taurus)

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Lê Viết Ly., Hoàng Kim Giao., Mai Văn Sánh., Võ Văn Sự., Lê Minh Sắt, (1999) Chuyên khảo bảo tồn nguồn gen vật nuôi ở Việt Nam Tập I: Phần gia súc Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà nội

Anderson, S., de Bruiji, M H., Coulson, A R., Eperon, I C., Sanger, F., and Young, I g, (1982) Complete sequence of bovine mitochondrial DNA Conserved features of the mammalian mitochondrial genome J Mol Boil 156, pp 683-717

Bradley, D G., Machugh, D E., Cunningham, P and Loftus, R T, (1996) Mitochondrial diversity and the origins of African and European cattle Poc Natl Acad Sci USA 93,

pp 5131-5135

Epstein, H., (1971) The origin of domestic animals of Africa Aficana Publishing Corporation, New York Vol.1, pp 185-555

Epstein, H., and Mason, I L, (1984) Evolution of domesticated animal Edited by I L Mason Long man, New York, pp.6-27

Kim, K I., Lee, J H., Lee, S S and Yang, Y H, (2003) Phylogenetic relationships of Northeast Asian cattle to other cattle populations determined using mitochondrial DNA D-Loop sequence polymorphism Biochem Gentic 41, pp 91-98

Kuma, S., Tamura, K and Nei, M, (1994) Molecular evolutionary genetic analysis software for microcomputers Comput.Appl.Biosci 10, pp 189-191

Loftus, R T., Machugh, D E.,Bradley, D G., Sharp, P M and Cunnigham, P, (1994) Evidence for two independent domestications of cattle Proc.Natl Acad Sci USA 91, pp.2757-2761

Machugh, D E., Shriver, M D., Loftus, R T.,Cunningham, P and Bradley, D G (1997) Microsatellite DNA variation and the evolution, domestication and phylogeography of

Mannen, H., Tsuji, S., Loftus, R T and Bradley, D G, (1998) Mitochondrial ADN variation

and evolution of Japanese black cattle (Bos taurus) Genetic 150, pp 1169-1175

Payne WJA, (1995) Diffusion of cattle throughout of Asia in tropical cattle: origins, breeds and breeding policy Black well Sciences Ltd., Oxford, pp 15-22

Phillips W, (1961) World distribution of the major types of cattle J Heredity 86, pp 248-249 Tamura, K., and Nei, M, (1993) Estimation of the number of nucleotide substitutions in the control region of mitochondrial DNA in humans and chimpanzees Mol Biol Evol 10,

pp 512-526

Troy, C S., Machugh, D.E., Balley, J F., Magee, D A., Loftus, R T., Cunnigham, P., Chamberlain, A T., Sykes, B C., and Bradley, D G, (2001) Genetic evidence for Near-Eastern origins of European cattle Nature 410, pp 1088-1091

Xin Cai., Hong Chen., Chuzhao Lei., Shan Wang., Kai Xue and Bao Zhang, (2006) mtDNA diversity and genetic lineages of eighteen cattle breeds from Bos Taurus and Bos indicus in China Genetica, DOI 10.1007/s10709-006-9129-y