Trờn thế giới ủó cú nhiều phương phỏp phõn tớch hiện ủại, chớnh xỏc ủể xỏc ủịnh Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuụi bằng sắc ký khớ khối phổ Hasnoot và cộng sự , 1994 ; He
Trang 1ứng dụng phương pháp xác định Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi bằng kỹ thuật Elisa (enzyme – Link
imunosorrbent assay)
Đ Thị Khang, Phan Thanh Đạm, Dương Thị Thu Anh, Đào Đức Hảo
Phũng Phõn tớch Thức ăn và sản phẩm chăn nuụi
1 Đặt vấn đề
Clenbuterol và salbutamol là những chất thuộc nhúm β Agonits cú tỏc dụng làm gión phế quản Đõy là một dược phẩm sử dụng ủể ủiều trị hen suyễn trờn người, cỏc trường hợp viờm phổi dị ứng trờn ngựa và viờm ủường hụ hấp trờn bũ Người ta khỏm phỏ rằng khi dựng liều cao cỏc chất β Agonits theo ủường miệng, thuốc cú thể tạo ra một sự gia tăng nhanh chúng và rừ rệt sự tăng khối cơ ủồng thời làm giảm khối lượng mỡ Cỏc nhà chăn nuụi ủó phỏt hiện ra tỏc dụng kỳ diệu này của Clenbuterol và Salbutamol nờn ủó bổ sung vào trong thức ăn gia sỳc, gia cầm nhằm tạo ra những con vật cú quầy thịt nạc hơn và tăng trọng nhanh hơn nhằm thu lợi nhuận cao (Eshaq và cộng sự, 2003) Tuy nhiờn, người ta ủó phỏt hiện ra sự tồn
dư của Clenbuterol và Salbutamol trong thịt và phủ tạng, ủặc biệt là gan của những con vật ủược nuụi bằng thức ăn cú chứa cỏc chất này và ủó gõy ảnh hưởng ủến sức khoẻ người tiờu thụ (Yu và cộng sự., 2004) Hiện nay Mỹ, Canaủa, và cỏc nước trong liờn minh chõu Âu ủó cấm sử dụng cỏc chất thuộc nhúm beta Agonits.Ở Việt Nam, Bộ Nụng nghiệp và PTNT cũng ủó ra quyết ủịnh số 54/2002/QĐ-BNN ngày
20 thỏng 06 năm 2002, cấm sử dụng cỏc chất thuộc nhúm β Agonist trong thức ăn chăn nuụi Tuy nhiờn việc sử dụng bất hợp phỏp cỏc chất cấm như Clenbuterol và Salbutamol vẫn cú trờn thị trường thức ăn chăn nuụi nước ta Trờn thế giới ủó cú nhiều phương phỏp phõn tớch hiện ủại, chớnh xỏc ủể xỏc ủịnh Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuụi bằng sắc ký khớ khối phổ (Hasnoot và cộng sự ,
1994 ; He và cộng sự , 2005) nhưng với chi phớ rất cao Ngoài ra, phương phỏp ELISA cũng ủó ủược sử dụng rộng rói ủể xỏc ủịnh cỏc chất dư lượng thuốc trừ sõu, ủộc tố nấm mốc (Skerritt,1998) Ở Việt Nam, việc kiểm tra cỏc chất cấm trong thức ăn chăn nuụi gặp rất nhiều khú khăn do chưa ủược trang bị thiết bị hiện ủại ủể
Trang 2thể xỏc ủịnh chớnh xỏc cỏc chất này trong thức ăn chăn nuụi và chưa cú một bỏo cỏo nào về phương phỏp phõn tớch Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuụi Nội dung của đề tài là ứng dụng quy trình phân tích của nhà sản xuất bộ kít chuẩn Clenbuterol và Salbutamol của hãng BIOO SCIENTIFIC - M Ỹ bằng phương pháp ELISA để xác định sự có mặt của các chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi Phương pháp của nhà sản xuất đưa ra là định lượng các chất Clenbuterol và salbutamol trong thức ăn chăn nuôi Tuy vậy độ chính xác của kết quả phân tích còn phu thuộc vào kỹ năng và thiết bị thí nghiệm và thành phần của mẫu thí nghiệm Mục ủớch của nghiờn cứu này là ủỏnh giỏ ủộ ổn ủịnh và ủộ chớnh xỏc của phương phỏp phõn tớch ELISA ủể xỏc ủịnh cỏc chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuụi
2 Vật liệu và phương pháp thực hiện
2 V t liệu nghiờn cứu
Đối tượng nghiờn cứu:
- Mẫu thức ăn chăn nuụi, những sản phẩm ủể bổ sung vào trong thức ăn chăn nuụi
- Hoỏ chất :
+ Sử dụng 2 loại bộ kit chuẩn Salbutamol và Clenbuterol của hóng BIOO SCIENTIFIC - M Ỹ Trong mỗi bộ kit chuẩn này cú một khay ủựng 96 giếng ủó phủ chất ủặc biệt (khỏng nguyờn) và chất chuẩn Salbutamol hoặc Clenbuterol ủó ủược pha sẵn theo cỏc nồng ủộ khỏc nhau và cỏc hoỏ chất ủể thực hiện xột nghiệm ELISA
+ Cỏc hoỏ chất ủể xử lý mẫu ban ủầu trước khi tiến hành xột nghiệm trờn ELISA như acetonitrile, ethyl acetate, n-hexan là những hoỏ chất tinh khiết của MERCK(Đức) Nước cất dựng ủể pha loóng là nước cất 2 lần
Địa ủiểm
Phũng phõn tớch thức ăn và sản phẩm chăn nuụi - Viện Chăn Nuụi
Thời gian
Từ thỏng 4 ủến thỏng 9 năm 2006
2.2 Phương phỏp thực hiện
Cỏch bố trớ thớ nghiệm
Trang 3- X©y dùng ®−êng chuÈn cña Clenbuterol vµ Salbutamol dùa trªn 6 loại nồng ñộ chất chuẩn (Salbutam dmol hoặc Clenbuterol) khác nhau: 0 ppb; 0.05ppb; 0.15ppb; 0.5ppb; 1.5ppb; 4.5ppb Đường chuẩn của mỗi chất ñược xây xựng dựa trên 5 nồng ñộ chuẩn trên và % hấp thụ tối ña của mẫu tương ứng với 6 nồng ñộ trên
- Chất chuẩn Clenbuterol và Salbutamol ñược thêm vào mẫu trắng ở các nồng ñộ khác nhau : 1ppb; 2ppb; 3ppb; 4ppb Mỗi mức nồng ñộ thêm vào mẫu trắng ñược lặp lại 10 lần
- So sánh kết quả phân tích của 3 mẫu thức ăn chăn nuôi ñược phân tích bằng phương pháp sắc ký khí khối phổ(GC-MS) tại phòng thí nghiệm - Bộ Nông nghiệp của Malaysia và phương pháp ELISA tại phòng phân tích Viện Chăn Nuôi
Nguyên lý c a ph ng pháp
Dùa trªn nguyªn lý cña ph¶n øng kh¸ng thÓ – kh¸ng nguyªn Kháng nguyên ñược cố ñịnh trên bề mặt của giếng phân tích Kháng nguyên tự do (chất cần phân tích) và một lượng kháng thể cố ñịnh ñược cho vào Kháng nguyên tự do(chất cần phân tích) và kháng nguyên cố ñịnh sẽ cạnh tranh ñể bám vào kháng thể Lượng kháng nguyên tự do càng nhiều thì lượng kháng thể bị kháng nguyên cố ñịnh giữ lại càng ít Sau khi rửa trôi các chất còn dư, dùng một kháng thể thứ 2 có ñánh dấu enzym ñể phát hiện lượng kháng thể ban ñầu bị giữ lại Bằng phản ứng tạo màu và phép ño cường ñộ mầu tại bước sóng 450nm và cường ñộ màu này tỷ lệ nghịch với nồng ñộ chất cần phân tích Từ ñó suy ra lượng kháng nguyên tự do (chất cần phân tích) là bao nhiêu
Quy trình th c hi n
X: lý mẫu
Trang 4Thêm 8 ml Acetonitrile và 1ml Ethyl acetate Làm ñồng ñều hỗn
hợp trong 3 phút
Ly tâm 5 phút với lực RCF 4.000g và lấy 6 ml
dung dich lớp trên vào ống nghiệm mới
Thêm 1 ml n-hexan và 1ml 1x PBS Làm ñồng ñều hỗn hợp trong 1 phút
Ly tâm 5 phút với lực RCF 4.000g và lấy 50 µl phần dung dịch lớp
dưới ñem phân tích trên ELISA ở bước sóng 450 nm
Trộn ñều mẫu, nghiền qua mắt sàng
Trang 53
(ppb)
Trang 62.4 Phương pháp xử lý số liệu
Các số liệu thu thập ñược xử lý theo phương pháp thống kê sinh vật học, phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm Minitab version 14.0 for Window 2000,
sử dụng mô hình thống kê tuyến tính tổng quát (GLM)
3 KÕt qu¶ vµ th¶o luËn
Mỗi bộ kit chuẩn của từng chất Clenbuterol hoặc Salbutamol có 96 giếng ñược phủ sẵn kháng nguyên và các hoá chất cần thiết ñể thực hiện xét nghiệm ELISA Nếu một số lượng mẫu lớn (khoảng 40 mẫu) có thể thực hiện trong thời gian ngắn (4h) như vậy số lượng mẫu phân tích nhiều sẽ giảm chi phí phân tích và tiết kiệm thời gian
B¶ng 1 Kết qu& thu h>i c?a các chAt chuẩn C ñược thêm vào mẫu trBng
n
Kết quả thu ñược (ppb)
% thu hồi của
Nồng ñộ Clenbuterl
(ppb)
Qua kết quả bảng 1 trên ta thấy hiệu suất thu hồi của chất Clenbuterol ở các mức thêm vào mẫu trắng từ 1- 4 ppb ñã ñạt kết quả từ 72.40% ñến 76.33 % và ñộ lệch chuẩn (R.S.D) nhỏ hơn 10% Như vậy, các kết quả hoàn toàn trong khoảng cho phép chấp nhận ñược
B¶ng 2 Kết quả thu h>i của chAt chuẩn S ñược thêm vào mẫu trBng
Nồng ñộ
Kết quả thu ñược (ppb)
% thu hồi của chuẩn
R.S.D (%)
(ppb) (p pb)
Trang 7(ppb) m SE m SE
Qua kết quả bảng 2 ở trờn, ta thấy hiệu suất thu hồi của chất Salbutamol ở cỏc mức thờm vào mẫu trắng từ 1- 4 ppb ủạt từ 70.05% ủến 80.50 % và ủộ lệch chuẩn (R.S.D) nhỏ hơn 10% Như vậy, cỏc kết quả ủể ủỏnh giỏ ủộ ổn ủịnh của phương phỏp hoàn toàn trong khoảng cho phộp của phõn tớch
Bảng 3 sỏnh kết quả phõn tớch gi a 2 phương phỏp và G
Kết quả phõn tớch tại Viện Chăn Nuụi (ppb)(ELISA)
Kết quả phõn tớch tại Malaysia (ppb)(GC-MS)
Qua kết quả bảng 3.2 ta thấy ở mẫu õm tớnh (khụng cú chất Clenbuterol và Salbutamol) thỡ kết quả giữa 2 phương phỏp phõn tớch thống nhất như nhau Nhưng
ở 2 mẫu dương tớnh (Cú chất Clenbuterol hoặc Salbutamol) thỡ kết quả giữa 2 phương phỏp hoàn toàn khỏc nhau Giỏ trị chờnh lệch trung bỡnh giữa kết quả của phương phỏp GC-MS và ELISA ủối với Clenbuterol là 2.904 ppb và ủối với salbutamlol là 2.52ppb với p <0.001.Mặt khỏc phương phỏp phõn tớch GC- MS ủược phõn tớch ở trung tõm phõn tớch xột nghiệm - Malaysia trờn thiết bị phõn tớch hiện ủại, chớnh xỏc cú ủộ tin cậy cao Như vậy so sỏnh với kết quả phõn tớch trờn GC-MS thỡ cỏc kết quả phõn tớch trờn ELISA ủối với mẫu dương tớnh khụng cú giỏ trị ủịnh lượng chớnh xỏc chất cần phõn tớch
4 Kết luận và đề nghị
4.1 Kết lu n
Trang 8- Phương pháp ELISA ñã xác ñịnh ñược các chất Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi và hoàn toàn phù hợp là phương pháp phân tích thường xuyên trong phòng thí nghiệm về phân tích thức ăn chăn nuôi có ñộ ổn ñịnh và ñộ chính xác chấp nhận ñược với hiệu suất thu hồi > 65% và ñộ lệch chuẩn RSD < 10%
- Phân tích bằng phương pháp ELISA phù hợp ñể sàng lọc với số lượng mẫu lớn, tiết kiệm thời gian chi phí phân tích
- Các kết quả phân tích Clenbuterol và Salbutamol trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp ELISA ñược trả lời kết quả chính xác ở dạng ñịnh tính có
nghĩa là có hay không Clenbuterol và Salbutamol
.2 Đề nghị
Tiếp tục ñược nghiên cứu phân tích các chất cấm khác trong thức ăn chăn nuôi như nitrofuran, chloramphenicol, cimaterol….bằng phương pháp ELISA
Tµi liÖu tham kh¶o
1.
Eshaq et al., 2003 Eshq,S.C Chai,S Jamokha, G.Aznar and M.K Hoffman, Determinationof ractopamin in animal tissue by liquid chromatography- fluorescence and
liquid chromatography/tandem mass spectrometry, Anal.Chim Acta 483 (2003), pp 137-145
2.
Hassnoot et al ,1994 W.Hassnoot, P.Stouten and A.M.Lommen, Determination of
fenoterol and ractopamin in urine by enzyme immunoassay, Analyst 119 (1994), pp
2675-2680
3.
He et al., 2005 L.M.He, Y.J.Su and H.J.Zhang, Detection of clenbuterol in animal tissues
and feeds by cappilary gas chromatography- mass spectrometry, J.Chin.Mass Spectrom.Sos.26
(2005), pp 168-172
4.
Yu et al., 2004 H.X Yu and S.M Yang, Advance in detremination of ractopamin residues
in animal tissues end excrements, Chin.J.Vet.Drug 38 (2004), pp 44- 47
ractopamin and clenbuterol in feeds by gas chromatography – mass spectrometry, J Animal
Feed Science and Technology 3 (2007), pp.316-323
Skeritt., 1998 Approate 3nalytical Technologies for Monitoring Agrochemical Residues.In
Seeking Agricultural Produce Fee of Pesticide Residues. Internatioanal Workshop held in
Yogyakarta, Indonesia, 17- 19 February 1998 ACIAR Proceeding No.85 ISBN 1 86320 2277, Canberra Australia.
... data-page="8">- Phương pháp ELISA ñã xác ñịnh ñược chất Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn ni hồn tồn phù hợp phương pháp phân tích thường xun phịng thí nghiệm phân tích thức ăn chăn ni có độ ổn định độ xác. .. Phân tích phương pháp ELISA phù hợp ñể sàng lọc với số lượng mẫu lớn, tiết kiệm thời gian chi phí phân tích
- Các kết phân tích Clenbuterol Salbutamol thức ăn chăn ni phương pháp ELISA trả... lời kết xác dạng định tính có
nghĩa có hay không Clenbuterol Salbutamol
.2 Đề nghị
Tiếp tục nghiên cứu phân tích chất cấm khác thức ăn chăn nuôi nitrofuran,
