Nghiên cứu chế biến protein nấm men trong phụ phẩm sản xuất bia làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi

Sinh khối nấm men bia không những giàu giá trị dinh dưỡng mà còn có khả năng kích thích ăn ngon miệng, cải thiện khả năng tiêu hoá của vật nuôi, giúp vật nuôi ăn nhiều và hấp thụ tối đa

Nghiên cứu chế biến Protein nấm men trong phụ phẩm sản xuất bia làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi

Nguyễn Thị Hoàng Anh 1 , Bùi Thị Thu Huyền 2 , Trịnh Vinh Hiển 1

1 Trạm Nghiên cứu va Chế biến SPCN - Viện Chăn Nuôi

2 Bộ môn Nghiên cứu Dinh dưỡng TACN - Viện Chăn Nuôi

Summary

Microbal Biomass Product (MBP) or Single Cell Protein (SCP) are widely used all over the world

to solve Protein shortage In this study, brewing yeast is treated and processing to produce peotein rich yeast powder Treatment to remove biterness from brewing yeast biomass is carry out in condition: NaOH concentration is 0.1% temperature of soluble from 2-5°C for 30 minutes Parameters for yeast autolysis are defined: temperature of soluble is 50°C for 18 hours, pH 7.0 The yeast powder is rick in protein and free amino nitrogen at level of 48.15 and 36.087% respectively It is valuable material to fortifiy protein in feed animal, creating great potential for the yeast powder to be be apply in feed processing industry

1 Đặt vấn đề

Nấm men là vi sinh vật điển hình cho nhóm nhân thật [13], được phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên, nhất là trong môi trường có chứa đường hay có độ pH thấp Trong dinh dưỡng, từ lâu nấm men đã được biết đến như một nguồn thức ăn

bổ sung an toàn và có giá trị cao với hàm lượng cũng như chất lượng Prôtêin rất cao (40-60%), các thành phần Vitamin phong phú, đặc biệt là các Vitamin nhómB Sử dụng sinh khối nấm men đảm bảo an toàn về thực phẩm Sinh khối nấm men bia không những giàu giá trị dinh dưỡng mà còn có khả năng kích thích ăn ngon miệng, cải thiện khả năng tiêu hoá của vật nuôi, giúp vật nuôi ăn nhiều và hấp thụ tối đa Do vậy trên thế giới người ta đã tận dụng các nguồn dinh dưỡng như

rỉ đường, dịch hồ sunfit, tổng hợp cacbon hydrat, chất thải chứa tinh bột để sản xuất sinh khối nấm men và thu hồi chế phẩm Protein để sản xuất nhiều loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao ở Việt Nam, sinh khối nấm men thu được từ các nhà máy bia là rất lớn Người ta ước tính được rằngtrung bình cứ sản xuất 1000 lit bia thì thu được 12 kg nấm men sệt tương ứng với 1,5 kg nấm men khô trong đó chứa gần 700g Prôtêin tương ứng với lượng Prôtêin trong 4 kg thịt [3] Tính đến năm 2003, công suất bia của cả nước đạt 1,29 tỷ lít, đến năm 2004 đã vượt trên 1.37 tỷ lít và chỉ riêng quý I năm 2005, công suất bia cả nước đã đạt 1.5 tỷ lít Ước

tính đến năm 2010, công suất bia cả nước sẽ vượt con số 2.5 tỷ lít và tương ứng với

nó là 18 triệu tấn sinh khối nấm men năm 2005 và sẽ là 30 triệu tấn vào năm 2010 [9] Trong đó chỉ một phần rất nhỏ được sử dụng cho quá trình tái sản xuất, phần còn lại không được dùng làm thức ăn cho gia súc cũng huỷ bỏ Việc dùng làm thức

ăn gia súc chỉ dừng lại ở mức độ thô, trộn trực tiếp làm thức ăn bổ sung nên số lượng sử dụng rất hạn chế Điều này không những không mang lại hiệu quả kinh tế lại còn có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường rất lớn Thực tế đó đã đặt ra cho ngành sinh học thực phẩm nhiệm vụ phải tiến hành nghiên cứu để tận dụng nguồn dinh dưỡng giá trị đầy tiềm năng này Năm 1997-1998, Viện Công nghiệp Thực Phẩm

đã nghiên cứu thành công sản phẩm bột dinh dưỡng cho trẻ em được sản xuất từ

sinh khối nấm men bia S carlbergensis được tách từ xưởng thực nghiệm của Viện

Sản phẩm có hàm lượng Protein cao từ 46,27- 56,67% với đầy đủ các dưỡng chất cần thiết và quan trọng như các loại axitamin không thay thế, Vitamin, chất khoáng…[9] Năm 2002, công ty cổ phần Dược vật tư y tế Thanh Hoá cũng sản xuất thành công thuống uống Biofin ở quy mô công nghiệp từ nguồn sinh khối nấm men của công ty bia Thanh Hoá Qua đó ta thấy việc tận dụng nguồn sinh khối này rồi qua các điều kiện sử lý tối ưu tạo ra được một chế phẩm kích thích tăng trọng và tăng sản cho gia súc gia cầm là hết sức cần thiết Chính vì các mục

tiêu trên, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sử dụng Protein nấm men trong phụ phẩm sản xuất bia làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi”

2 Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.1 Vật liệu, thiết bị

- Sinh khối nấm men từ nhà máy bia Việt Hà, nhà máy bia Thanh hoá và các hoá chất cần thiết phuc vụ cho xử lý sinh khối nấm men

- Thiết bị: Máy đo quang phổ (Ultrospec 3000pro - Anh), máy ly tâm công nghiệp (Việt nam), máy sấy phun (Đức), kính hiển vi (Đức-CLFM), máy đo mật

độ quang (Đức), máy đo pH (Mỹ), máy cất đạm Keldan (Nhật), máy sắc ký lỏng cao áp

2.2 Thời gian, địa điểm tiến hành

- Thời gian: Từ tháng 2 đến tháng 12 năm 2006

- Địa điểm tiến hành: Viện Chăn nuôi, Công ty CP Nông sản Thanh Hoa,

Viện Công nghiệp Thực phẩm, ĐH Khoa học Tự nhiên

2.3 Nội dung nghiên cứu

Nội dung 1: Nghiên cứu chế biến Protein nấm men trong phụ phẩm sản xuất bia

làm nguyên liệu thức ăn chăn nuôi

- Xác định phương pháp rửa vị đắng của hoa Houblong trong nguyên liệu

- Xác định phương pháp phá vỡ thành tế bào nấm men đạt hiệu quả cao nhất

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ tới hiệu quả thu hồi và chất lượng của sinh khối nấm men sau khi sấy phun

- Xây dựng quy trình sản xuất bột nấm men

- Nghiên cứu khả năng tái sử dụng phụ phẩm men bia làm men giống phục

vụ cho quá trình tạo sinh khối nấm men

Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng tái sử dụng phụ phẩm men bia làm men giống

phục vụ cho mục đích tạo sinh khối nấm men

- Đánh giá khả năng sống và tỷ lệ sống của tế bào nấm men bia

- Nhân giống nấm men bia thuần khiết

- Giảm sự tạp nhiễm của vi khuẩn

- Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình tạo sinh khối

2.4 Phương pháp nghiên cứu

Đ Xác định vật chất khô của nguyên liệu:

Chuẩn bị các mẫu thí nghiệm Cân xác định chính xác khối lượng ban đầu của các mẫu, đem sấy khô các mẫu tới khối lượng không đổi Xác định khối lượng của mẫu sau khi sấy khô Vật chất khô của nguyên liệu được tính như sau:

Vật chất khô = trọng lượng sau khi sấy: trọng lượng trước khi sấy (%)

Đ Xác định phương pháp rửa vị đắng của hoa Houblong trong nguyên liệu:

- Các tác nhân loại đắng cho dịch nấm men: Nước cất, axit loãng H3PO4 0.05%, dung dịch kiềm NaOH 0.05% và dung dịch muối NaCl 0.05%

- Cách tiến hành: Dùng tác nhân loại đắng trộn đều với sinh khối nấm men (0.1 kg men được trộn cùng 500ml mỗi tác nhân loại đắng), sau đó cho nấm men lắng trong khoảng 2 giờ rồi tiến hành li tâm lạnh Lấy phần dịch trong ở trên đem

đo OD ở bước sóng 275 nm, đồng thời lấy phần sinh khối nấm men ở dưới dùng cảm quan để thử độ đắng (nếm)

Đ Sử dụng phương pháp thuỷ phân thành tế bào nấm men bằng dung dịch kiềm để phá vỡ thành tế bào nấm men

- Xác định khoảng pH phù hợp: Tiến hành thí nghiệm tại các pH khác nhau (7, 8, 9, 10, 11,12) trong khoảng thời gian 18 giờ, tại nhiệt độ 240C

- Xác định thời gian thuỷ phân tối ưu: Tiến hành với pH vừa xác định trong thời gian 14, 16, 18, 20, 22, 24 giờ tại nhiệt độ 240C

- Xác định nhiệt độ thuỷ phân thích hợp: Tiến hành với pH và thời gian đã xác định ở các nhiệt độ khác nhau: 16, 18, 20, 20, 24, 26, 280C

Tại mỗi thời điểm: Dịch nấm men sau khi xử lý được đem li tâm, lấy dịch trong ở trên đem xác định hàm lượng protein được giải phóng Mặt khác lấy dịch nấm men sau xử lý làm tiêu bản, soi kính hiển vi điện tử để xác định tỷ lệ tế bào bị thuỷ phân (trên 1 trường hiển vi kính xác định lượng tế bào bị phá vỡ so với tổng

số tế bào theo cảm quan) Từ kết quả thu được ta xác định được pH, thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân tế bào nấm men

Đ Sử dụng phương pháp tự phân để phá vỡ thành tế bào nấm men: các bước tương tự như thuỷ phân thành tế bào bằng dung dịch kiềm:

- Xác định thời gian tự phân tối ưu: 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26 giờ tại nhiệt

độ 500C

- Xác định nhiệt độ tự phân thích hợp: Tiến hành thời gian đã xác định ở các nhiệt độ khác nhau: 40; 45; 50; 55; 60, 650C trong 18 gi3

Đ Sử dụng phương pháp Keldan để xác định đạm toàn phần

Đ Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng cao áp để xác định hàm lượng các axit amin của các mẫu nghiên cứu

Đ Sử dụng phương pháp sấy phun để sấy khô sản phẩm: Tiến hành sấy phun theo các chế độ: nhiệt đầu vào 2800C, nhiệt độ đầu ra 1000C

Đ Đánh giá khả năng sống của tế bào nấm men

- Lấy 10 gam sinh khối nấm men cho vào bình đựng 90 ml nước vô trùng, lắc

đều (độ pha loãng mẫu 10-1), tiếp tục pha loãng mẫu tới 10-5 Với mỗi nồng độ lấy 0.05ml cấy gạt trên đĩa thạch dinh dưỡng, để tủ ấm 24 giờ

- Quan sát :

+ Tế bào sống: phát triển thành khuẩn lạc

+ Tế bào chết: không phát triển thành khuẩn lạc

Đ Nhân giống nấm men thuần khiết

- Bằng cách sử dụng kỹ thuật pha loãng, chọn trên đĩa thạch các khuẩn lạc riêng rẽ, sau đó cấy ziczac một lần nữa

- Sau đó lấy một ít tế bào trên khuẩn lạc làm tiêu bản, soi kính hiển vi xem

có nhiễm vi khuẩn không

- Từ đó ta thu được giống nấm men thuần khiết

Đ Giảm sự tạp nhiễm của các vi khuẩn (lactic)

- Rửa bằng nước cất: nước được làm lạnh ở nhiệt độ 0-40C trộn đều với dịch

có chứa nấm men, sau đó để lắng, gạn bỏ lớp nước phía trên (vi khuẩn và tế bào vỡ

bị loại bỏ) Lặp lại nhiều lần thí nghiệm

- Bổ sung bằng (NH4)2SO4: Bổ sung vào dịch lên men đã được pha loãng bằng nước cất theo tỷ lệ 1:2 lượng muối vừa đủ, trộn đều sau đó để lắng

Sau quá trình rửa, lấy mẫu, pha loãng, cấy gạt trên môi trường MRS và Martin Xác định khả năng tồn tại của vi khuẩn lactic và xem xét ảnh hưởng của quá trình rửa đến khả năng phát triển của tế bào nấm men bằng đếm số lượng

khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch

Đ Lựa chọn môi trường thích hợp cho quá trình tạo sinh khối nấm men

Môi trường nghiên cứu:

+ Môi trường 1: môi trường Martin (đặc trưng cho tất cả nấm men)

+ Môi trường 2: nước chiết Malt (250g malt/l)

Sau 48 giờ nuôi cấy lắc tại nhiệt độ 300C sinh khối nấm men thu được đem sấy khô và xác định cân trọng lượng khô

3 Kết quả nghiên cứu và thảo luận

.1 Nội dung 1

3.1.1 Xác định vật chất khô của nguyên liệu

Bảng 1 Bảng phân tích vật chất khô của nguyên liệu

Trọng lượng mẫu thí nghiệm (g) Các mục

NL ban đầu 60,12 90,25 101 111,9 75,5

NL sau khi sấy 20,84 31,05 35,02 39,20 25,96

% Vật chất khô 34,66 34,40 34,67 35,03 34,38 Vật chất khô trung bình (%) 34,63

3.1.2 Xác định phương pháp rửa vị đắng của hoa Houblong trong nguyên liệu

Một đặc điểm quan trọng để nấm men thu hồi từ các nhà máy có thể sử dụng được trong công nghiệp thực phẩm và làm nguyên liệu chế biến thức ăn chăn nuôi là phải loại bỏ được nhựa của hoa houblon gắn rất chặt trên bề mặt của tế bào nấm men, làm cho nấm men có vị đắng Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành các phương pháp khác nhau để xử lý cho hết vị đắng của sinh khối nấm men Các tác nhân loại

đắng trộn đều với sinh khối nấm men (1 kg men được trộn cùng 5l mỗi tác nhân loại đắng), sau đó cho nấm men lắng xuống rồi li tâm lạnh Phần dịch sau li tâm

được đem đo OD

Kết quả thu được được trình bày ở bảng 2

Bảng 2 Kết quả rửa vị đắng trong nguyên liệu bằng các phương pháp khác nhau

Tác nhân rửa pH sau sử lý OD (275nm) Số lần rửa để hết

đắng

S ẫu th

Kết quả cho thấy độ đục sau khi xử lý bằng NaOH 0,05% là cao nhất (OD=0,36) Điều đó có được là do thành phần axit đắng của nhựa hoa houblon gắn

trên bền mặt tế bào nấm men kết hơp với NaOH chuyển sang dạng hoà tan Vì vậy, dung dịch sau xử lý có màu vàng sẫm và độ đục tăng lên Còn xử lý nấm men bằng các tác nhân khác nh− NaCl 0.05%, H3PO4 0.05%, n4 5c cất mang lại kết quả không mong muốn, sản phẩm sau khi rửa 1-2 lần vẫn có vị đắng Tuy nhiên nếu tiến hành rửa nguyên liệu nhiều lần (4-6 lần) thì sản phẩm cũng giảm dần độ đắng, nh−ng so với rửa bằng dung dịch NaOH thì tốn thời gian hơn rất nhiều Chính vì vậy chúng tôi đã chon dùng NaOH là tác nhân loại đắng

Sau khi xác định đ−ợc tác nhân loại đắng có hiệu quả nhất là NaOH, chúng tôi tiến hành xác định nồng độ NaOH tối −u cho quá trình loại đắng Kết quả đ−ợc trình bày ở bảng 3:

Bảng 3 Xác định nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình loại đắng dịch nấm men

Nồng độ

NaOH (%)

pH của dung dịch

xử lý

OD (275nm)

Tính chất của sản phẩm cuối

Số mẫu thử

Nhìn vào bảng trên ta thấy độ đục của dung dịch sau xử lý tăng lên rất nhanh cho đến khi nồng độ NaOH đạt 0,1% ở nồng độ NaOH từ 0,12% trở lên các giá trị này tăng không đáng kể, chứng tỏ thành phần axit đắng đ−ợc tách gần nh− là hết ở nồng độ 0,1% Mặt khác, nồng độ NaOH cao có thể là nguyên nhân phá huỷ các phân tử protein đ−ợc giải phóng từ tế bào nấm men Do đó, nông độ NaOH thích hợp đ−ợc lựa chọn cho quá trình loại đắng là 0,1%


 Phá vỡ thành tế bào nấm men bằng phương pháp thuỷ phân (dùng dung dịch kiềm)

Kiềm có tác dụng thuỷ phân phức hệ glucan, protein và lipit gây hư hỏng mạng lưới cấu trúc của thành và màng dẫn tới phá vỡ tế bào [10] Nhờ vậy chất nội bào được tiết ra môi trường dễ dàng Phương pháp thuỷ phân thành tế bào nấm men bằng dung dịch kiềm được dùng rộng rãi với quy mô khá lớn để thu hồi Tuy nhiên quá trình kiềm hoá mạnh có thể cho sản phẩm protein bị biến tính cắt mạch đáng

kể nhất là với các sản phẩm không bền ở pH cao

Bảng 3 ả nh hưởng của pH tới quá trình thuỷ phân tế bào nấm men

pH dịch nấm men

sau khi loại đắng

pH dịch nấm men sau thuỷ phân

% protein được giải phóng

Tỷ lệ nấm men bị phá

vỡ thành tế bào (%)

Nhìn vào bảng trên ta thấy, sau quá trình rửa đắng (pH = 7) dịch nấm men

được xử lý với pH= 10 thì tỷ lệ tế bào bị phá vỡ là 100% Tuy nhiên lượng protein giải phóng tại pH=10 chưa phải là cao nhất, với dịch nấm men sau quá trình xử lý pH>10 thì lượng protein tăng dần nhưng tăng không nhiều (từ 47.28% đến 47.30%) Chính vì vậy ta chọn pH= 10 là pH thích hợp nhất cho quá trình thuỷ phân tế bào nấm men, bởi với pH >10 ta phải tiêu tốn thêm lượng NaOH để tăng giá trị pH lên

Sau khi xác định được pH thích hợp cho quá trình thuỷ phân thành tế bào nấm men, ta tiếp tục xác định thời gian và nhiệt độ thích hợp cho quá trình thuỷ phân

Bảng 4.ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tới quá trình thuỷ phân tế bào nấm men

pH sau

khi xử lý

Nhiệt độ xử

lý (oC)

Thời gian

xử lý (giờ)

% protein được giải phóng

Tỷ lệ nấm men bị phá

vỡ thành tế bào (%)

Nhìn vào kết quả ở bảng trên ta thấy ngay ở cùng một nhiệt độ xử lý là

240C, khi thời gian xử lý bắt đầu là 18 giờ thì tỷ lệ tế bào giải phóng ra là 100% và lượng protein giải phóng là 47.28% Sau khoảng thời gian đó đem dịch trong đi phân tích protein ta thấy hàm lượng protein giải phóng ra tăng không đáng kể (47.30%) Do vậy, chúng tôi đã chọn thời gian thích hợp cho quá trình thuỷ phân thành tế bào là 18 giờ Mặt khác, cùng thời gian xử lý nhưng ở các dải nhiệt độ khác nhau, khi nhiệt độ xử lý là 200C thì tỷ lệ tế bào bị phá vỡ cũng là 100% Sau

đó nhiệt độ xử lý được nâng lên, mặc dù tỷ lệ tế bào được giải phóng ra là như nhau nhưng lượng protein giải phóng ra có sự sai khác chút ít (từ 47.28tới 47.30%) Hơn thế nữa, nếu tăng nhiệt độ xử lý lên cao tiếp (trên 260C) khi đó là thời điểm thích hợp cho các enzym nội bào hoạt động, quá trình phân huỷ protein

được giải phóng sẽ diễn ra, làm giảm chất lượng của sản phẩm Chính vì vậy, nhiệt

độ xử lý thích hợp được lựa chọn là 240C

Tự phân là quá trình phân huỷ thành phần peptido- glucan ở thành tế bào bởi phức hệ enzim của thành tế bào được khỏi trạng thái liên kết khi xử lí tế bào nấm men bằng các tác nhân xử lý, làm proteaza và những enzim khác thoát ra ngoaì môi trường dễ dàng Từ đó, proteaza được chiết ra lại tiếp tục thuỷ phân Protein, tiếp tục gây hư hỏng rồi dẫn tới phá huỷ hoàn toàn thành tế bào

Sau khi tiến hành rửa loại đắng ta thu được nấm men có pH =7.0 Đây là pH thích hợp cho các cho phức hệ enzim bao gồm có glucanaza, manaza, proteaza, xylanza chiết xuất ra, phân cắt các thành phần glucan, manana, gây hư hỏng mạng lưới cấu trúc thành tế bào, là cơ sở cho phương pháp phá huỷ thành tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân Do vậy, ta chọn pH = 7 là pH của môi trường để tiến hành phương pháp tự phân

Sau khi đã chọn được pH ta tiếp tục nghiên cứu xác định nhiệt độ và thời gian thích hợp cho quá trình tự phân