Xác định sự đa dạng di truyền 5 quần thể gà nuôi tại hà giang bằng các chỉ thị Microsatellite

Một trong những kỹ thuật ủược sử dụng trong việc nghiờn cứu sự sai khỏc di truyền của quần thể là sự ủa dạng cỏc microsatellite.. khổ nhiệm vụ của hợp phần phòng thí nghiệm-Dự án Biodiva

Xác định sự đa dạng di truyền 5 quần thể gà nuôi tại Hà Giang

bằng các chỉ thị Microsatellite

Nguyễn Trọng Bình 1 , Phạm Doãn Lân 1 , Trần Thị Thu Thuỷ 1 , Đỗ Ngọc Duy 1 , Nguyễn Văn Ba 1 , Lê Quang Nam 1 , Lê Thị Thuý 1 , Vũ Chí Cương 1 , J.C Maillar 2

1 Viện Chăn Nuôi; 2 Điều phối viên dự án Biodiva

Summary

The objective of the study was to access genetic diversity of 5 chicken populations (431 samples)

in Ha Giang province 21 microsatellites (FAO) was used On average, there were 8.05 ± 4.41alleles per locus (maximum in locus LEI094 and minimum in locus MCW103) and 6.7 ± 3.4 alleles per locus across populations Within populations, the average observed heterozygote frequency was 0.555 with a range between 0.541 (pop5) and 0.567 (pop2) In all populations, inbreeding was indicated by heterozygosity deficiency (mean Fis = 0.104) The genetic differentiation between populations was low with a mean Fst = 0.025 demonstrated that about 97.5% of the total genetic variation was due to the genetic differentiation within each population By using Structure software with 3 2 k 26, no appropriate k value showed that there were mixed breeds in 5 populations

1 Đặt vấn đề

Đa hỡnh ADN là cụng cụ hữu hiệu cho việc phõn tớch sõu ở mức ủộ phõn tử những tớnh trạng kinh tế quan trọng và những tiềm năng ứng dụng của chỳng trong việc nõng cao năng xuất và hiệu quả chăn nuụi Ngoài ra những chỉ thỉ ADN cũng ủược sử dụng ủể tỡm hiểu quỏ trỡnh tiến hoỏ và thuần hoỏ của cỏc loài vật nuụi Một trong những kỹ thuật ủược sử dụng trong việc nghiờn cứu sự sai khỏc di truyền của quần thể là sự ủa dạng cỏc microsatellite Kỹ thuật chỉ thị phõn tử microsatellite (MS) là cỏc ủoạn lặp lại ủược phõn bố trong toàn bộ hệ gen Cỏc trỡnh tự lặp lại này bao gồm 1-6 bp và tổng ủộ dài khụng quỏ 100 bp vớ dụ như (CA)n, (GAA)m (Tautz, Renz 1984) Microsatellite cú thể tỡm thấy ở tất cả mọi nơi trong hệ genome, bao gồm cả vựng mó hoỏ và khụng mó hoỏ (Toth, và cs) Vỡ vậy, kỹ thuật này cú thể sử dụng trong rất nhiều lĩnh vực khỏc nhau như lập bản ủồ

di truyền, bản ủồ liờn kết trong cỏc nghiờn cứu về quần thể, hỡnh sự

Với sự ủa dạng về cỏc ủặc ủiểm kiểu hỡnh và kiểu gen trờn cỏc quần thể gà

ở Việt nam, cũng như tầm quan trọng phỏt triển và bảo tồn cỏc giống gà bản ủịa vỡ vậy việc nghiờn cứu sự sai khỏc di truyền của cỏc quần thể này là thiết yếu Trong

khổ nhiệm vụ của hợp phần phòng thí nghiệm-Dự án Biodiva, chúng tôi ñã tiến hành phân tích kiểu gen gà thông qua 21 microsatellite ñể ñánh giá sự sai khác

di truyền của các quần thể gà Hà Giang thông qua các chỉ thị microsatellite

Thời gian tiến hành từ tháng 10 năm 2005 ñến nay

2 §èi t−îng, nguyªn liÖu vµ ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu

2.1 Đối tượng

Quang (POP2), Vị Xuyên (POP3), Hà Giang (POP4) và Đồng Văn (POP5)

2.2 Nguyên liệu

- Các hoá chất, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu ñược ñặt từ các hãng: Fermentas, Merk, Qiagen, Beckman

2.3 Phương pháp

- Tách chiết ADN tổng số: ADN tổng số ñược tách chiết bằng Kit tách

máu của hãng Qiagen

- Đa hình ADN:

+ Nghiên cứu sự ña hình ADN trên 21 cặp mồi microssatlite theo tiêu chuẩn của FAO

+ Nhân gen bằng phương pháp PCR: Sử dụng phương pháp PCR ñể nhân

lên các ñoạn gen có chứa các microsatellite Thành phần phản ứng PCR: Buffer

+ Phân tích Fragment trên máy giải trình tự CEQ8000 và phân tích trên phần mềm CEQ system

- Phân tích sự ña dạng di truyền dựa trên các phần mềm thống kê:

+ Phần mềm Fstat (Goudet, J., 2001): Đánh giá sự ñang dạng di truyền giữa các cá thể trong mỗi quần thể, giữa các quần thể và giữa các cá thể trong một quần thể ñồng nhất cũng như ước lượng sự lạc dòng cân bằng (HW của các quần thể và các locus

+ Phần mềm Genetics phiên bản 4.03 (Belkhir K., 2004): Xác ñịnh phân bố các cá thể trong quần thể theo mô hình không gian hai chiều AFC

+ Phần mềm Phylip phiên bản 3.5, (Felsenstein, 1993): Vẽ cây phân loại dựa trên khoảng cách di truyền giữa các quần thể

+ Phần mềm Structure phiên bản 2.0 (Pritchard et al., 2000): Ước lượng sự phân tách quần thể theo giống

- Một số công thức liên quan cấu trúc quẩn thể

Một số cách tính tiện lợi cho cấu trúc quần thể là giá trị thống kê F ñược Wright phát triển (1965)

Giá trị F ñược tính theo công thức F = (He – Ho)/He

* Trong quần thể:

F = Fis = (He – Ho)/He Trong ñó:

Ho: là tần số dị hợp tử quan sát = f(Aa)

He: là tần số dị hợp tử lý thuyết = 2pq

Fis: hệ số cận huyết giữa các cá thể trong quần thể Thể hiện sự biến thiên của tần số alen [1;-1], ñánh giá mức ñộ cận huyết của các cá thể trong quần thể

* Giữa các quần thể với nhau:

F = Fst = (Ht – Hs)/Ht Trong ñó:

Ht: là tần số dị hợp tử lý thuyết của các quần thể tạo thành 1 quần thể duy

Hs: Trung bình dị hợp tử của các quần thể

3 KÕt qu¶ vµ th¶o luËn

3.1 Kết quả tách chiết ADN

ADN tổng số ñược tách chiết từ các mẫu máu gà và ñược kiểm tra trên gel agarose 1% kết quả ñược thể hiện dưới Hình 1:

Hình 1 Kết quả tách chiết ADN tổng số từ máu gà

Qua kết quả tách chiết ADN tổng số và ñược kiểm tra trên gel cho thấy chất lượng của ADN ñáp ứng ñược các yêu cầu cho phản ứng Multiplex-PCR

3.2 Kết quả nhân gen và phân tích trên máy giải trình tự CEQ8000

- Với 21 cặp mồi chia làm 5 mix khác nhau ñể tiết kiệm thời gian và hoá chất: + Mix 1 với 5 cặp mồi: MCW295, ADL112, MCW216, MCW014, MCW089 + Mix 2 với 5 cặp mồi: MCW111, MCW078, MCW222, LEI094, MCW183

+ Mix 3 với 4 cặp mồi: ADL278, MCW069, MCW034, MCW103

+ Mix 4 với 4 cặp mồi: ADL268, MCW037, MCW067, MCW206

+ Mix 5 với 4 cặp mồi: MCW081, MCW248, LEI166, MCW330

- Sau khi tiến hành nhân các cặp mồi microsatellite, tiến hành phân tích các mẫu trên máy giải trình tự CEQ8000 và phân tích trên phần mềm CEQ system

Kích thước allele của mỗi locus sau khi nhân lên trong mỗi phản ứng multiplex PCR ñược xác ñịnh trên máy giải trình tự CEQ 8000, kết quả thể hiện ở Hình 2:

0

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

g567 mix2.A01_0606141244

Size (nt)

MCW111

M CW078

M CW222

L EI094

M CW183

M CW183

Hình 2. Kết quả xác ñịnh kích thước allele trên máy giải trình tự CEQ 8000

Dựa trên các kết quả thu ñược chúng tôi ñã tiến hành phân tích sự ña dạng

di truyền của các quần thể gà tại Hà Giang trên các phần mềm thống kê khác nhau

3.3 Sự phân bố của các allele

g tôi tiến hành nghiên cứu trên 431 cá thể trên 5 quần thể (trung bình 86,2 cá thể/quần thể) Kết quả phân tích allen ñược tiến hành chạy trên phần mềm Fstat Qua ñó, thu ñược số lượng allele trung bình của các quần thể trên mỗi locus

là 8.05 ± 4.41 trong ñó locus có số allele thấp nhất là locus MCW103 với 2 allele

và locus có số allele cao nhất là LEI094 với 19 allele Kết quả này kh ng ñịnh hầu hết tất cả các locus ñều có sự ña hình cao

B ng 1 Đặc ñiểm của các locus microsatellite : Khoảng cách, số allele theo lý

thuyết, số allele quan sát và kích thước của các allele

Locus Kho¶ng

c¸ch

Sè allele quan s¸t

KÝch th−íc c¸c allele

MCW295 85-107 10 853,5,5, 87, 89, 913,5, 932,4,5, 95, 97, 992, 1013, 103, 1051,3,4,5 ADL112 120-134 4 124, 1261,3,128,130

MCW216 139-149 4 1393,4,141,145,1471,4,5

MCW014 164-182 13 1611,3,4, 163, 167, 1695, 1711,2,4,5, 173, 175, 177, 1791,3,4, 1811,

1832,4,5, 1853, 1873 MCW098 261-265 3 255, 257, 2591,3

MCW111 96-120 6 97, 99, 101, 1054, 107, 1114

MCW078 135-147 4 138, 140, 142, 1441

MCW222 220-226 5 216, 218, 2202, 2224, 2241,2,3,5

LEI094 247-287 19 249, 2511,3, 2531,4, 255, 2593.4, 261, 263, 265, 267, 2691,2,4,

2711,2, 273, 2751,2,5, 277, 2792, 2814, 2834, 285, 2871,3,4,5 MCW183 296-326 15 293, 2953,4, 2971,2,3,4, 301, 3033, 3051, 311, 3131,3,4,5, 315,

3173,4, 3191,2,3,4, 3211,,3,4,5, 3251,2,3,4, 3312,3,4, 3331,2,3,4 ADL278 114-126 8 1092,3,4,5,6, 111, 1151,2,3,4,5, 117, 119, 121, 1231, 1271,2,3,4,5 MCW069 158-176 11 155, 1572,5, 159, 161, 163, 165, 1674, 169, 1713, 1733,

1751,2,3,4 MCW034 212-246 14 2142,5, 220, 222, 2241,3,4, 2261,5, 228, 230, 2323,4, 2344, 2364,

238, 240, 2423,4, 244 MCW103 266-270 2 266, 270

ADL268 102-116 6 101, 107, 1104, 112, 114, 1161,2,5

MCW037 154-160 4 151, 153, 155, 1573,5

MCW067 176-186 6 1691,3,5, 171, 173, 175, 177, 1791,3

MCW206 221-249 11 220, 222, 2241,2,5, 226, 228, 230, 232, 2342,3,4,5, 242, 2444,5,

2481,2,5 MCW081 112-135 8 110, 112, 1183, 1201,3,4, 1281,3,4, 1301,2,3,5, 132, 1345

MCW248 205-225 6 213, 215, 217, 219, 221, 223

LEI166 354-370 7 334, 3461,2,3,4,5, 348, 350, 352, 3543, 3581,3,4,5

MCW330 256-300 11 2561, 2585, 266, 268, 2701,3,5, 2741,3,4, 276, 278, 284, 286, 288

1,2,3,4,5: Allele kh«ng xuÊt hiÖn t¹i quÇn thÓ 1,2,3,4,5

3.4 Đánh giá sự ña dạng di truyền trên các locus

Dựa trên phân tích mẫu bằng phầm mềm Fstat thu ñược các kết quả: tần số

di hợp tử quan sát (Ho) và lý thuyết (Hs), hệ số cận huyết giữa các cá thể trong mỗi quần thể (Fis), hệ số cận huyết giữa các quần thể (Fst) và hệ số cận huyết giữa các cá thể trong microsatellite trên 5 quần thể Kết quả ñược thể hiện trên bảng 2:

Bảng 2 T=n số dị hợp t? quan sát (Ho) và mong ñợi (He), Fis, Fit, Fst của các

microsatellite trên các quần thể

LocName Ho He Ht Fit Fst Fis

MCW295 0.68 0.785 0.792 0.154 0.007 0.149 ADL112 0.606 0.544 0.544 -0.079 0.002 -0.082 MCW216 0.288 0.42 0.426 0.311 0.014 0.302 MCW014 0.657 0.781 0.786 0.161 0.012 0.151 MCW098 0.232 0.269 0.275 0.107 0.014 0.094 MCW111 0.723 0.757 0.759 0.047 0.003 0.044 MCW078 0.371 0.48 0.491 0.257 0.023 0.239 MCW222 0.425 0.53 0.55 0.193 0.042 0.158 LEI094 0.736 0.834 0.834 0.107 0.001 0.106 MCW183 0.476 0.519 0.523 0.082 0.012 0.071 ADL278 0.515 0.618 0.628 0.161 0.019 0.144 MCW034 0.69 0.754 0.756 0.085 0.004 0.082 MCW103 0.48 0.492 0.49 0.026 -0.003 0.029 ADL268 0.631 0.654 0.658 0.058 0.006 0.053 MCW037 0.479 0.64 0.647 0.243 0.018 0.23

MCW067 0.637 0.715 0.722 0.103 0.009 0.095

MCW206 0.698 0.784 0.783 0.107 -0.001 0.108

MCW081 0.414 0.462 0.464 0.106 0.007 0.099

MCW248 0.628 0.694 0.695 0.085 0.004 0.081

LEI166 0.612 0.622 0.629 0.026 0.013 0.013

MCW330 0.685 0.791 0.803 0.131 0.017 0.116

TB 0.555 0.626 0.631 0.118 0.011 0.108

- Giá trị trung bình của tần số dị hợp tử quan sát ñược của 21 mirosatellite trên 5 quần thể là 0,555 Trong ñó, tần số di hợp tử thấp nhất ở marker MCW098

là 0,232 và tần số di hợp tử cao nhất ở marker LEI094 là 0,736 Hệ số cận huyết Fis trung bình trên cả 5 quần thể là 0,108, giá trị Fit và Fst trung bình trên cả 5 quần thể tương ứng là 0,118 và 0,011

3.5 Kết quả phân tích phần mềm genetics trên 5 quần thể

quần thể ñươc thể hiện trên bảng 3:

Bảng 3. T n số dị hợp t
Ho, He, giá trị Fis, Fst trung bình trên m@i qu n thể

Số allele trung

bình/quần thể

He Hn.b Ho Fis Fst

Pop1 6,7 ± 3,5 0.614 0.617 0.548 0.105 0.027 Pop2 7,3 ± 3,75 0.625 0.628 0.567 0.110 0.024 Pop3 6,24 ± 2,98 0.617 0.622 0.564 0.107 0.026 Pop4 6,67 ± 3,5 0.610 0.614 0.556 0.110 0.027 Pop5 6,5 ± 3,3 0.640 0.647 0.541 0.089 0.021

6,7 ± 3,4 0.6212 0.6256 0.5552 0.1042 0.025

Kết quả trên bảng 3 cho thấy: Tần số dị hợp tử trung bình/quần thể là 0,555, tần số di hợp tử quan sát lớn nhất ở quần thể 2 với tần số 0,567 và nhỏ nhất tại quần thể 5 với tần số 0,541 Tỷ lệ nội phối ở các quần thể khác nhau là khác nhau, quần thể có tỷ lệ nội phối trung bình của các quần thể là 0,104 cao nhất là quần thể

2 và quần thể 4 với tần số 0,110 còn quần thể có tỷ lệ nội phối thấp nhất là quần

ể 5 với tần số 0,089 Tỷ lệ nội phối của 5 quần thể khi chúng tôi nghiên cứu là khá cao khi so sánh với kết quả nghiên cứu trên 3 quần thể gà H’mong tại Sơn La của Cuc et al (2006) Kết quả của chúng tôi thu ñược cho thấy có thể do tập quán sinh sống và chăn nuôi của người dân tại các ñịa ñiểm thu thập mẫu

Sự sai khác di truyền trong các giống và các quần thể phụ thuộc vào mức

ñộ ñột biến, sự di cư và chọn lọc cũng như là sự lạc dòng di truyền (genetic drift) Giá trị trung bình Fis của các locus và quần thể cao (theo thứ tự là 0.108 và 0.104) thể hiện sự ña dạng di truyền trong mỗi locus trên từng quần thể Tuy nhiên, giá trị Fst trung bình giữa các quần thể (0.025) là không cao như mong ñợi chứng tỏ sự sai khác di truyền giữa các quần thể là thấp Điều này ñược lí giải một phần qua tập quán chăn nuôi của các nông hộ và sự trao ñổi gia cầm có thể dẫn ñến sự lạc dòng di truyền giữa các quần thể

3 Kết quả ñánh giá khoảng cách di truyền và xây dựng cây phân loại quần thể

Thông qua phần mềm genetics chúng tôi thu ñược khoảng cách di truyền của các quần thể, kết quả ñược thể hiện qua bảng 4

Bảng 4.So sách giá trị Fst theo t+ng cặp quần thể và giá trị p thu ñược sau 10000

lần hoán vị

5

*: ñộ tin cậy 5%; **: Độ tin cậy 1%

Phần mềm Phylip cho phép ta vẽ ñược cây phân loại giữa các quần thể (H3) Qua hình ta dễ thấy khoảng cách giữa quần thể 2 và quần thể 5 gần nhất và giữa quần thể 2 và quần thể 1 xa nhất Tuy nhiên chưa có sự phân tách rõ ràng giữa các quần thể (khoảng cách di truyền giữa các quần thể chưa cao)

Hình 3. Cây phân loại quần thể

3.7 Kết quả ñánh giá mức ñộ phân tách quần thể theo giống qua phần mềm Structure

Để ñánh giá mức ñộ phân tách quần thể một cách rõ ràng hơn, chúng tôi tiến hành chạy phần mềm Structure với các quần thể trên cùng mẫu ñối chứng là quần thể gà Hồ (24 mẫu) Các cá thể ñược phân tách vào 3 ,4, 5, 6 giống giả ñịnh (3 ≤ k ≤ 6)

Bảng 5. Kết quả phân tách các cá thể theo giống với k = 3, 4 ,5 

Ở tất cả các lần chạy (với xác suất hơn 80% trên mỗi lần chạy), sự phân tách giống gà Hồ của quần thể ñối chứng (quần thể 6) là rất rõ Với k = 3 cho

K = 3

K= 4

1 0.191 0.147 0.22 0.231 0.21

2 0.194 0.178 0.202 0.203 0.223

3 0.194 0.166 0.222 0.217 0.202

4 0.194 0.174 0.206 0.217 0.209

5 0.276 0.124 0.212 0.189 0.198

6 0.091 0.619 0.108 0.078 0.104

K = 5

1 0.181 0.166 0.181 0.179 0.124 0.169

2 0.177 0.172 0.168 0.165 0.156 0.161

3 0.167 0.162 0.172 0.205 0.128 0.166

4 0.172 0.163 0.173 0.166 0.158 0.167

5 0.169 0.19 0.162 0.177 0.109 0.194

6 0.08 0.085 0.075 0.081 0.601 0.079

K = 6

ể ầ ể ộc ề ộ ố ị

dạng về giống trong mỗi quần thể Cỏc giỏ trị k = 4, 5, 6 cho một kết quả tương tự Kết quả này cũng phự hợp với kết quả chạy Genetics/ AFC trờn 6 quần thể (H4) Cỏc cỏc thể trong quần thể 1, 2 ,3 ,4, 5 tập trung trong một phõn vựng trong khi phõn lớn cỏc cỏ thể trong quần thể 6 tỏch riờng thành khu vực riờng

Hỡnh 4. Mụ hỡnh khụng gian 2 chiều về sự phõn bố cỏc quần thể theo AFC

Như vậy, cựng với giỏ trị Fst khụng cao và sự phõn tỏch giống theo phần mềm Stucture khụng rừ ràng kh ng ủịnh rằng cú sự pha tạp về giống trong cỏc quần thể

4 Kết luận và đề nghị

4.1 Kết luận

Qua cỏc kết quả phõn tớch trờn, chỳng tụi rỳt ra một số kết luận sau:

1 Đó tỏch chiết thành cụng ADN ủủ tiờu chuẩn về ủộ tinh sạch và nồng ủộ cho cỏc nghiờn cứu tiếp theo Tỷ lệ tỏch chiết ADN từ mỏu tổng số ủạt 92,66%

2 Đó chuẩn húa thành cụng cỏc phản ứng PCR-Multiplex cho 21 cặp mồi trong 5 mix

3 Số lượng allele trung bỡnh của cỏc quần thể trờn mỗi locus là 8.05 ± 4.41 trong ủú locus cú số allele thấp nhất là locus MCW103 với 2 allele và locus cú số allele cao nhất là LEI094 với 19 allele Số allele trung bỡnh/quần thể là 6.7 ± 3.4

4 Tần số dị hợp tử trung bỡnh/locus là 0.555, thấp nhất là 0.232 (MCW098)

và cao nhất là 0.736 (LEI094) Tần số dị hợp tử trung bỡnh/quần thể là 0.555, thấp nhất là 0.541ở quần thể 5 và cao nhất là 0.567 ở quần thể 2