Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng phương pháp tạo thể thuỷ tinh Vitrification method Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Văn Lý, Lưu Công Khánh, Phan Lê Sơn Bộ môn Cấy truyền Phôi Abstrac
Trang 1Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng phương pháp tạo
thể thuỷ tinh (Vitrification method)
Nguyễn Thị Thoa, Nguyễn Văn Lý, Lưu Công Khánh, Phan Lê Sơn
Bộ môn Cấy truyền Phôi
Abstract This study was conducted to apply a new method for cryopreservation of bovine embryos by Vitrification solutions In This study, total of 90 embryos were freezed by Vitrification method After thawing and in vitro culture, the hatching rate of embryo was 74,74%
Đặt vấn đề Ngày nay công nghệ bảo quản lạnh tế bào động vật đ/ trở thành thông dụng Nhiều nước tiên tiến trên thế giới đ/ thành lập ngân hàng phôi, tinh, ngân hàng gen động vật và đ/ trở thành thương mại hoá Mặt khác đối với ngành y học, công nghệ bảo quản lạnh tinh, phôi
đ/ mang lại hạnh phúc cho nhiều cặp vợ chồng sau khi chữa khỏi bệnh hiểm nghèo mà không có khả năng thụ tinh nhưng vẫn có khả năng mang thai bằng cấy phôi đông lạnh Với công nghệ sinh học hiện đại cấy phôi đông lạnh còn hạn chế được những bệnh về gen Trước đây đ/ có nhiều nghiên cứu về đông lạnh phôi bò, như phương pháp đông lạnh một bước, đông lạnh 3 bước Việc bảo quản phôi bò bằng phương pháp đông lạnh ngày càng
đ-ược cải tiến Đông lạnh phôi bằng phương pháp tạo Thể thuỷ Tinh (Vitrification method)
đ/ được nhiều nước nghiên cứu và áp dụng có hiệu quả
ở Việt Nam ( Bộ môn CTP) đ/ áp dụng thành công đông lạnh phôi bò bằng phương pháp
đông lạnh một bước, phương pháp 3 bước nhưng đông lạnh bằng phương pháp Tạo Thể Thuỷ Tinh (Vitrification method) chưa được nghiên cứu ứng dụng
ưu điểm của phương pháp này so với hai phương pháp trước đây là quá trình đông lạnh không tạo đá nội bào, không gây thiệt hại cho phôi, đơn giản, không mất nhiều thời gian,
đưa phôi vào cọng rạ ở nhiệt độ phòng trực tiếp vào Nitơ lỏng, không cần máy móc đắt tiền, dễ áp dụng trong thực tế sản xuất, góp phần giảm chi phí trong công nghệ CTP
Mục đích
- áp dụng đônng lạnh phôi bò bằng phương pháp tạo Thể Thuỷ Tinh (Vitrification method) trong điều kiện Việt Nam
- Góp phần giảm chi phí trong công nghệ CTP Bò
Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Trang 2Néi dung nghiªn cøu
- S¶n xuÊt ph«i TTON
- §¸nh gi¸ ph©n lo¹i ph«i
- §«ng l¹nh ph«i
Ph−¬ng ph¸p nghiªn cøu
S¶n xuÊt ph«i trong èng nghiÖm
Thu tÕ bµo trøng,nu«i tÕ bµo trøng chÝn invitro, ho¹t ho¸ tinh trïng vµ TTON, theo dâi sù ph¸t triÓn cña ph«i ThÝ nghiÖm ®−îc tiÕn hµnh t¹i phßng thÝ nghiÖm ViÖn Ch¨n Nu«i
§¸nh gi¸ ph©n lo¹i ph«i
Ph©n lo¹i ph«i theo chÊt l−îng vµ theo giai ®o¹n ph¸t triÓn
Trang 3Đông lạnh phôi
Thành phần của môi trường đông lạnh
Glycol
*PEG: Poly Ethylene Glycol(M.W.=8,000)
MôI trường cơ bản là D-PBS
- Chuẩn bị môi trường đông lạnh
Lấy 150àl môi trường V1vào đĩa số1
150 àl mỗi trường V2 vào đĩa số 2
150 àl mỗi trường V3 vào đĩa số 3
3 ml môi trường sucrose vào đĩa số 4
3 ml môi trường PBS 20%CS vào đĩa số 5
- Tiến hành đông lạnh
Sau khi đánh giá phân loại, những phôi tốt (những phôi đúng với giai đoạn phát triển, khối
tế bào phân chia đều liên kết chặt chẽ, vòng trong suốt tròn sáng) được chuyển vào môi trường V1 để cân bằng 5 phút sau đó chuyển sang môi trường V2 để cân bằng 5 phút và vào môi trường V3 để 1 phút, ngay lập tức hút phôi cùng với môi trường V3 vào cọng rạ loại 0,25ml, cho vào Nitơ lỏng -196°C (trong vòng 1 phút) Cho vào bình Nitơ lỏng bảo quản lâu dài
Giải đông phôi
- Chuẩn bị môi trường giải đông
- Lấy150 ml môi trường (MT) 0,5 MSucrose vào đĩa 1
- 150ml MT 0,25 M Sucrose vào đĩa 2
- 150ml MT PBS +20% CS vào đĩa số 3
Lấy cọng rạ ra khỏi Nitơ lỏng giữ trong không khí 5-6 giây, cho cọng rạ vào nứớc ấm 20°C khoảng 30 giây, lấy cọng rạ ra khỏi nứớc ấm, cắt đầu cọng rạ cho phôi vào đĩa petre,tìm phôi dưới kính hiển vi soi nổi, sau đó hút phôi vào đĩa 1 để 5 phút, chuyển sang đĩa 2 để 5 phút, chuyển sang đĩa 3 và chuyển vào đĩa rửa D-PBS 20%CS, rửa 2-3 lần sau đó chuyển
Trang 4vào giọt nuôi CRaa1 và cho vào tủ nuôi cấy CO2 5%, nhiệt độ 38,5°C, ẩm độ tối đa 98% Theo dõi khả năng sống và phát triển của phôi
Kết quả
Chất lượng phôi trước khi đông lạnh
lạnh (n)
Trong số 99 phôi được đông lạnh, phôi nang, phôi dâu loại A là 68 chiếm 68,68% Phôi nang, dâu loại B là 31 chiếm 31,31%
Phôi nang, dâu loại A chiếm tỷ lệ cao hơn phôi nang, phôi dâu loại B
Chất lượng phôi nuôi sống sau giải đông
Sau khi giải đông và nuôi cấy in vitro, trong số 99 phôi đ/ có 74 phôi sống và phát triển
đến thoát màng, chiếm 74,74% thấp hơn so với Nhật Bản và Hàn Quốc (74,74 so với 89%
và 86%) Số phôi chết và thoái hoá là 25 (25,25%)
Số phôi nang sống sau giải đông và nuôi cấy in vitro cao hơn so với phôi dâu (84,09% so với 67,27%;) kết quả này này phù hợp với các kết quả nghiên cứu của các tác giả; Saito,N., K.Imai, M.Tomizawa, Shin-noh, S Kaidi,A Van Langendonckt, A.Massip, F.Dessy and I.Donnay
Kết luận và đề nghị Kết luận
Bước đầu nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng phương pháp tạo Thể Thủy Tinh thành công trong điều kiện Việt Nam
Tỷ lệ phôi sống sau giải đông của thí nghiệm này là 74,74%
Có thể áp dụng phương pháp đông lạnh này vào sản xuất
Trang 5Đề nghị đựợc tiếp tục nghiên cứu đông lạnh phôi bò bằng phương pháp tạo Thể thuỷ tinh (Vitrification method) để nâng cao tỷ lệ phôi sống sau giải đông
Tài liệu tham khảo Saito,N., K.Imai,M.Tomizawa Effect of sugar-addition on the survival of vitrified bovine blastocysts produced in vitro Theriogenology, 41,1053-1060,1994
Saito,N., K.Imai The effect of addition of various monosacchorides to vitrification solutions on the survival
of bovine blastocysts produced in vitro Cryobiology and Cryotechnology, Vol 43,No 1, 34-39
Shin-noh, M.et al Effect of in vitro culture of bovine embryos biopsied with a microblade on in-vitro survival after vitrivication Theriogenology, 49,227,1998
S Kaidi,A Van Langendonckt,A.Massip,F.Dessy and I.Donnay Cellular alteration after dilution of cryoprotective solution used for the vitrification of invitro-produced bovine embryos Theriogenology,52:515-525,1999
G.Vạjta, P Holm, M.Kwayama, P.J Booth, H.Jacobsen, T.Greve,and H.Callesen Open pulled straw(OPS) vitrification: A new way to reduce cryoinjuries of bovine Ova and Embryos Molecular reproduction and development 51: 53-58(1998)