Phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H: 1,2 của Salmonella typhimurium trong Escherichia coli BL21

LỜI NóI ĐẦU Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn trên toàn thế giới.

LỜI NóI ĐẦU

Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây nhiễm độc thức ăn trên toàn thế

giới Theo thống kê của tổ chức Y tế thế giới (WHO) năm 1998, hàng nămtrên thế giới có khoảng hơn 10 triệu trẻ em dưới 5 tuổi và người già chết donhiễm độc thức ăn, trong đó 90% trẻ em sống ở các nước đang phát triển (bao

gồm cả Việt Nam) Ngoài việc gây nhiễm độc thức ăn, Salmonella còn gây ra

các chứng bệnh nguy hiểm khác như sốt thương hàn, nhiễm trùng máu cấptính, sẩy thai, viêm khớp và các bệnh về đường hô hấp Hai chủng chính gây

nhiễm độc thức ăn cho người đó là S typhimurium và S enteritidis Một vấn

đề rất đáng lo ngại hiện nay là hầu hết các chủng Salmonella đặc biệt là S typhimurium đã kháng được nhiều loại kháng sinh khác nhau Chính vì vậy, việc điều trị các bệnh do Salmonella ngày càng gặp nhiều khó khăn, chi phí

tốn kém và đòi hỏi phải tạo ra nhiều loại kháng sinh mới Vấn đề khác không

kém phần quan trọng đó là gia cầm khi bị nhiễm Salmonella không biểu hiện

bất kỳ một triệu chứng bất thường nào, điều này đã gây khó khăn trong việcngăn chặn vùng bị dịch

Xuất phát từ thực tế trên, một phương pháp được xem là hiệu quả nhất

để ngăn chặn Salmonella nhiễm ở gà là tạo ra một loại vacxin cho gia cầm chống lại sự xâm nhiễm của Salmonella Đây không chỉ là tính cấp thiết của

ngành chăn nuôi mà còn là biện pháp chủ động trong công tác an toàn thựcphẩm và bảo vệ sức khoẻ cộng đồng

Hiện nay trên thị trường có nhiều loại vacxin cho gà chống lại

Salmonella như vacxin chết, vacxin sống giảm độc lực, nhưng mỗi loại

vacxin lại có nhược điểm riêng Vacxin sống giảm độc lực có hiệu quả caonhưng lại không an toàn Do đó, gần đây các nhà khoa học trên thế giới đangtập trung nghiên cứu tạo ra vacxin thành phần bằng kỹ thuật ADN tái tổ hợp

và được gọi là vacxin tái tổ hợp Vacxin tái tổ hợp ra đời khắc phục được

những nhược điểm trên do việc sử dụng nguồn kháng nguyên thành phần cónhiều ưu điểm vượt trội hơn về độ an toàn khi sử dụng để gây đáp ứng miễndịch một cách đặc hiệu Đây còn là lựa chọn kinh tế so với các phương pháp

cũ khi đưa vào ứng dụng, sản xuất vacxin thành phẩm Từ yêu cầu cấp thiết

về tăng cường sức khoẻ cộng đồng, an toàn thực phẩm, chúng tôi đã tiến hành

đề tài nghiên cứu: “Phân lập và biểu hiện gen fljB mã hoá kháng nguyên roi H: 1,2 của Salmonella typhimurium trong Escherichia coli BL21” nhằm

thu được lượng lớn kháng nguyên tinh sạch, dùng cho việc nghiên cứu và sản

xuất vacxin thế hệ mới là vacxin tái tổp hợp chống lại Salmonella

Công việc được tiến hành tại Phòng kỹ thuật Di truyền, Viện công nghệsinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. Khái quát chung về Salmonella

1.1.1 Tình hình dịch bệnh

Vi khuẩn Salmonella đã được nghiên cứu từ hàng trăm năm nay, tuy

nhiên trong mấy chục năm trở lại đây, chúng được các nhà nghiên cứu quan

tâm bởi sự gia tăng các bệnh ngộ độc thực phẩm ở người do Salmonella gây

ra Vào năm 1980, khi tìm hiểu nguyên nhân của dịch tả, Daniel E Salmon đãphát hiện trong ruột của lợn có một loại vi sinh vật gây sốt, tiêu chảy [61].Sau đó, ông phát hiện chủng vi khuẩn này còn sinh sống trong ống tiêu hoácủa các động vật có vú, bò sát, chim và cả côn trùng Vi khuẩn này là vi

khuẩn gram âm, hình que, di động được, thuộc họ Enterobacteriaceae và có quan hệ gần gũi với vi khuẩn E coli Năm 1984, ông đã phân lập nuôi cấy và đặt tên chủng là Salmonella

Salmonella đã gây tác hại không nhỏ đối với người và động vật, gây ảnh

hưởng nghiêm trọng đến nền kinh tế Theo ước tính của tổ chức Y tế thế giới

[63], chỉ tính riêng ở Mỹ, năm 2004 có 1,4 triệu người nhiễm Salmonella Trong

số những trường hợp nhiễm có 183000 trường hợp phải điều trị tại bệnh viện,

580 trường hợp bị tử vong, tổng thiệt hại kinh tế lên tới 3 tỉ USD Cũng tương tự,

ở Đan Mạch, theo thống kê năm 2001, tổng chi phí để khắc phục hậu quả do

Salmonella lên tới 25 triệu USD.

Tại Việt Nam, mặc dù chưa có thống kê nào về thiệt hại do Salmonella

gây ra, nhưng báo cáo mới nhất của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôncho thấy, độ nhiễm khuẩn trong các sản phẩm chăn nuôi như thịt lợn, thịt bò,

thịt gà ở Hà Nội là 100%, trong đó 40% là nhiễm Salmonella [63] Hơn nữa,

cả trong những sản phẩm được coi là đảm bảo để xuất khẩu cũng chứa

Salmonella Chỉ trong 3 tháng cuối năm 2001, Cơ quan Lương thực và Dược

liệu Hoa Kỳ (FDA) đã tịch thu và tiêu huỷ hàng trăm lô thực phẩm được nhập

khẩu từ Việt Nam, đặc biệt là mặt hàng hải sản bị nhiễm Salmonella Thiệt

hại kinh tế do vấn đề tiêu huỷ lên đến hàng trăm ngàn USD Báo chí đã đưatin, tại kho dự trữ lạnh của khu công nghiệp Sóng Thần Thành phố Hồ Chí

Minh đã từng tồn tại 19 tấn gà nhiễm Salmonella [58] Con số đó không

những ảnh hưởng đến nền kinh tế mà còn thực sự là mối lo ngại cho an toànsức khoẻ cộng đồng

1.1.2.Một số đặc điểm vi sinh về Salmonella

Salmonella là loại vi khuẩn gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, dạng hình que với chiều dài 2-5 ỡm, chiều rộng 0,5 -1,5 ỡm Samonella có khả năng

sinh trưởng cả trong môi trường hiếu khí và kỵ khí, không sinh bào tử [16]

Salmonella có thể nuôi cấy dễ dàng ở nhiệt độ 37oC trong môi trường

nuôi cấy thông thường Khi sinh trưởng trên môi trường đặc, Salmonella phát

triển thành các khuẩn lạc nhỏ, đường kính 2- 4 mm, mịn và đồng nhất Cũnggiống như hầu hết các vi khuẩn khác, điều kiện pH tối ưu cho vi khuẩn nàyhoạt động là pH trung tính 6-8 Tuy nhiên, trong cả môi trường kiềm và axít

vi khuẩn này vẫn có khả năng tồn tại Ngoài tính chất chung của họ vi khuẩn

đường ruột Enterobacteriaceae, vi khuẩn Salmonella còn có một số tính chất:

không lên men đường Lactoza, Sacaroza, Ureaza(-), Indol(-), H2S(+)

Salmonella có sức sống và sức đề kháng tốt, trong canh trùng, trong

đất có thể sống được vài tháng, trong nước 3 tuần, trong nước đá sống từ

2-3 tháng, trong phân sống khoảng vài tuần

Phần lớn Salmonella đều có khả năng di chuyển nhờ roi trừ S gallinarum và S pullorum Khả năng này sẽ mất đi khi xử lý chúng với tác

nhân vật lý gây sốc nhiệt cho tế bào như: nhiệt độ lạnh hoặc nhiệt độ cao [16]

ở 50oC khoảng 1giờ, ở 60oC khoảng 10-20 phút, 100oC khoảng 5 phút và cácchất khử trùng như Chloramin 3%, vv… Thông thường, khi mất khả năng di

chuyển, Salmonella cũng mất khả năng sinh trưởng.

1.1.3 Phân loại Salmonella

Theo hệ thống phân loại Kaufman-White, Salmonella khoảng hơn

2501 các typ huyết thanh (serotyp) khác nhau [16 63] và số lượng này ngày

một tăng lên Trong đó, Salmonella được chia làm 2 loài chính là S enterica và

S bongori, S enterica lại được chia ra làm 6 dưới loài khác nhau là S enterica,

S salamae, S arizonae, S diarizonae, S indica và S houtenae Theo hệ thống phân loại này, S typhimurium nằm trong dưới loài S enterica [16, 21].

Sự phân loại các typ huyết thanh khác nhau của Salmonella được dựa

vào kháng nguyên bề mặt tế bào vi khuẩn: kháng nguyên thân hay khángnguyên O (somatic antigen), kháng nguyên roi hay kháng nguyên H (flagellarantigen) và kháng nguyên vi (vi antigen) Kháng nguyên O là chuỗi phức hợplipopolisaccarit-protein nằm trên bề mặt tế bào vi khuẩn Kháng nguyên Hđược tạo thành bởi các tiểu phần protein là flagellin Sự đa dạng về vùng giữacủa flagellin là cơ sở cho sự đa dạng về kháng nguyên H Một số typ huyết

thanh như là S typhimurium, S dublin còn có thêm kháng nguyên vi Đây là

loại kháng nguyên định vị bên ngoài vỏ polisacarit của vi sinh vật, có liênquan đến tính độc riêng với tế bào chủ [16]

1.1.4 Bệnh học của sự lây nhiễm Salmonella

Salmonella là loại vi khuẩn có khả năng gây bệnh, lây nhiễm chủ yếu

qua con đường ăn, uống Chúng có khả năng sống trên nhiều động vật, trongtrứng của gia cầm [2, 16, 19]

Vi khuẩn này liên quan đến một loại bệnh thường gặp ở người: như bệnh

thương hàndo(S typhi gây nên Bệnh thương hàn là một trong những căn

bệnh nguy hiểm và biểu hiện lâm sàng phổ biến nhất gây tổn thương nhiềuphủ tạng, đặc biệt là hệ tiêu hoá

Tuy nhiên mỗi cơ thể chủ khác nhau có sự thích ứng khác nhau với

mỗi loại Salmonella: S.typhimurium và S enteritidis là hai loài thường gây bệnh cho người và gia súc, gia cầm, và S dublin gây bệnh tiêu chảy ở lợn [63] Tuy có nhiều loại Salmonella, nhưng chỉ một số Salmonella gây bệnh

cho người và động vật

Hầu hết sự lây nhiễm Salmonella vào cơ thể người thường là do ăn phải thức ăn có nguồn gốc động vật và gia cầm bị nhiễm Samonella Để có thể gây bệnh, Samonella phải có một loạt các nhân tố gây độc Các nhân tố này

bao gồm: khả năng xâm nhập vào tế bào, phức hệ vỏ lipopolysaccarit, khảnăng phát triển trong nội bào và khả năng tạo độc tố Sau khi xâm nhập vào

bụng, Salmonella nhân lên trong ruột hồi và ruột kết xâm nhiễm vào biểu mô ruột, và tăng sinh nhanh trong biểu mô và nang lympho Từ đây, Salmonella

lan ra khắp cơ thể và cuối cùng bị chặn lại bởi các tế bào lưới nội mô Dưới

sự kiểm soát của hệ thống lưới nội mô, sự phát triển của Salmonella bị ức chế Tuy nhiên với mỗi typ huyết thanh Salmonella khác nhau lại có khả năng gây độc khác nhau Một số typ Salmonella có khả năng nhiễm vào gan, lá lách,

xương, màng não và một số cơ quan khác trong cơ thể gây ra tác hại nghiêm

trọng với cơ thể Sau khi nhiễm Salmonella vào người, và triệu chứng sẽ xuất

hiện sau 12 đến 72 giờ như đau bụng tiêu chảy, đau đầu, nôn mửa, sốt cao.Bệnh này có thể tự khỏi sau một vài ngày đến một tuần nhưng cũng gây tổnthương cơ thể người bệnh, đặc biệt những người già, các em nhỏ và nhữngngười có thể trạng yếu thì sự lây nhiễm có thể dẫn tới làm tăng khả năng mắc

các chứng bệnh khác Khi xâm nhập vào ruột, Salmonella kích thích sự đáp ứng viêm ác tính, gây loét ruột Nội độc tố do Salmonella tiết ra có khả năng

ức chế quá trình tổng hợp protein Cho đến nay, độc tố gây viêm ác tính, sự lở

loét vẫn chưa được biết rõ Sự xâm nhiễm của Salmonella lên màng nhày gây

kích thích các tế bào biểu mô giải phóng ra hàng loạt các cytokin như: IL-1,IL-6, IL-8, TNF-2, IFN-U, MCP-1 và GM-CSF [12] Các nhân tố gây độclàm viêm đường ruột [59], một số khác đi vào hệ tuần hoàn gây nhiễm trùngmáu cấp tính có thể dẫn đến tử vong [31]

Có 30000 ca của người nhiễm vi khuẩn Salmonella đã gián tiếp được

công bố ở Anh Sự nhiễm bệnh này do lây lan từ gia cầm Bởi vậy hạn chế sự

lây nhiễm Salmonella trong những đàn gà sẽ đem lại kết quả quan trọng cho

sức khoẻ cộng đồng Ngoài khả năng lây nhiễm trên người, Salmonella cũng nhiễm vào các động vật khác S typhimurium có thể nhiễm vào gà qua thức

ăn hoặc nhiễm từ gà mẹ sang gà con [25] Hậu quả của sự lây nhiễm này là gàcon có thể bị chết [12]

1.1.5 Sự đề kháng của Salmonella với các kháng sinh

Cho đến nay, có nhiều báo cáo ghi nhận khả năng kháng lại kháng sinh

của Salmonella [63] Tính đề kháng này do sự truyền gen giữa các chủng vi

khuẩn Nguy hiểm hơn, thông qua sự chuyển đoạn ADN cộng gộp,

Salmonella có khả năng kháng đồng loạt các chất kháng sinh khác nhau Một minh chứng gần đây về tính kháng nhiều chất kháng sinh là chủng S typhimurium DT104 Chủng vi khuẩn này có thể kháng lại một số chất kháng

sinh thông thường nên khi động vật và người bị nhiễm việc điều trị bằng các

loại kháng sinh thường không hiểu quả [62] Mặt khác, S typhimurium kháng

chloramphenicol xảy ra ngày một nhiều ở các nước đang phát triển từ đầunăm 70 đến giữa năm 80 Cuối những năm 80 đến đầu những năm 90, người

ta phát hiện thấy S typhimurium có plasmit đề kháng với chloramphenicol,

ampixillin, cotrimoxazol ở Châu á và Đông Bắc Phi Vì vậy, việc tìm ra một

loại vacxin để chống Salmonella là hết sức cần thiết.

1.2 Kháng nguyên của Salmonella

1.2.1 Đặc điểm chung về kháng nguyên của Salmonella

Salmonella có 3 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên thân (O);

kháng nguyên roi (H); kháng nguyên vi có ở một số typ huyết thanh khác như:

S typhi, S dublin và S hirschfeldii Kháng nguyên nằm trong lớp vỏ

lypopolysaccharit gọi là nội độc tố tạo thành phần phía ngoài của thành vi khuẩn.Nội độc tố gồm 3 lớp: lớp ngoài (O), lớp giữa (R) và lớp nền (lớp lipit A)

1.2.1.1 Kháng nguyên thân O (lypopolysaccharit)

Salmonella có tới hơn 60 kháng nguyên O khác nhau Kháng nguyên

thân có cấu trúc dạng sợi lypopolysaccharit-protein được bộc lộ trên bề mặt tếbào do đó khả năng gây đáp ứng miễn dịch rất mạnh Kháng nguyên (O) gồmhai phần: phần nhân cơ bản và phần các chuỗi ngang Phần nhân cơ bản giống

nhau trong tất cả Salmonella Phần các chuỗi ngang gồm có những tiểu đơn vị

oligosidic có tính tái diễn, chính các chuỗi ngang quyết định tính đặc hiệu của

mỗi nhóm Salmonella Mặt khác kháng nguyên thân (O) rất khó biểu hiện

trong những hệ biểu hiện thông thường

1.2.1.2 Kháng nguyên tua riềm (vi)

Kháng nguyên tua riềm là những sợi protein nhỏ nằm trên bề mặt của vikhuẩn, nó có thể do một hay một số tiểu phần protein cấu thành Dạng điểnhình cho tua riềm là cấu trúc hình xoắn ốc [37] Tuỳ thuộc vào sự thích nghi

Kháng nguyên H (Roi)

Màng trong Lớp peptidoglycan

Kháng nguyên Vi

Kháng nguyên O (Chuỗi polisaccarit)

Màng ngoài Tua riềm

Nội bào

Hình 1 1: Khái quát cấu trúc kháng nguyên của Salmonella

về khả năng sống, khả năng gây bệnh, mỗi loài vi khuẩn có dạng tua riềmkhác nhau Chức năng chính của tua riềm là khả năng kết dính, tương tác với

vi khuẩn và với các nhân tố khác Đối với Salmonella, cấu trúc tua riềm

thường có dạng dày và cứng nên giúp chúng gắn thụ động lên bề mặt tế bàobiểu mô cơ thể chủ, nhờ sự nhận biết của thụ thể, các tín hiệu có bản chất ion

Ca2+ từ tế bào vi khuẩn được giải phóng tạo ra đáp ứng các nội bào của tế bàochủ, kích thích sự giải phóng ra các cytokin điều khiển đáp ứng miễn dịch cócho vi khuẩn [51]

1.2.1.3 Kháng nguyên roi H

Kháng nguyên roi H với bản chất là protein cấu trúc có mặt ở hầu hết các

typ huyết thanh của Salmonella [34] Do có thành phần đơn nhất là protein

tham gia chức năng cấu trúc nên chúng ít hoặc không mang tính độc và dễdàng được phân lập cũng như biểu hiện bằng công nghệ ADN tái tổ hợp.Ngoài ra protein này thường được tiết ngoại bào và có khả năng cho đáp ứngmiễn dịch cao Một số nghiên cứu gần đây cho thấy kháng nguyên của các vikhuẩn thuộc nhóm gram âm ái lực mạnh với các chuỗi polypeptit bề mặt gây

ra sự tổng hợp TNF-ỏ và Interleukin-1õ (IL- 1õ) từ tế bào monocyte ở người.Nhân tố này đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn chặn sự xâm nhiễm của

Salmonella và tạo khả năng đáp ứng miễn dịch ghi nhớ [18, 27] Như vậy

kháng nguyên H không chỉ đơn thuần là protein cấu trúc mà còn thể hiện rõtính gây miễn dịch bảo hộ Chính dựa vào đặc tính này mà kháng nguyên Hđược chọn làm đối tượng để nghiên cứu sản xuất protein tái tổ hợp phục vụcho việc tạo vacxin tái tổ hợp sau này

Trong nghiên cứu của chúng tôi gen fljB mã hoá cho kháng nguyên roi H: 1,2 của vi khuẩn Salmonella đã được sử dụng làm cơ sở nghiên cứu sản

xuất vacxin tái tổ hợp

1.2.1.3.1 Cấu trúc protein flagellin của Salmonella

Roi của vi khuẩn Salmonella tồn tại ở dạng siêu xoắn và được cấu tạo

từ một protein đơn nhất gọi là flagellin Cấu trúc siêu xoắn này bao gồm 11 vi

sợi (protofilament), khi sử dụng phương pháp tia Rơngen (X-ray) để quan sátcấu trúc tinh thể của một đoạn flagellin thì người ta thấy rằng ẩn đi 100 gốccấu trúc về vi sợi Vì vậy, với phương pháp sử dụng kính hiển vi điện tử nhiệt

độ thấp (eletron cryomicroscopy) người ta có thể quan sát một cách toàn diệnhơn về cấu trúc xoắn

Đi sâu về mặt cấu trúc ta thấy rằng phân tử flagellin gồm bốn vùng(ký hiệu là D0, D1, D2, D3, D4) được nối với nhau bằng các cặp đoạn nốisong song (gọi là vùng đệm) Mô hình khung cacbon ở vị trí ỏ (Cỏ) cho thấy

sự tạo thành các nếp gấp và phần đầu của chuỗi xoắn ỏ được cuộn vào trongvùng D0 Đầu N của chuỗi (ND0) được bắt đầu từ axit amin Gln ở vị trí thứ 2kéo dài tới Serin ở vị trí 32, trong khi đó ở đầu C của chuỗi xoắn (CD0) lạibắt đầu từ Alanin 459 và kéo dài tới Serin 491 Trong đó vùng đệm bao gồmhai chuỗi là NS và CS, một chuỗi bắt đầu từ ser 32 đến Ala 44 còn chuỗi khácbắt đầu từ Glu 454 tới Ala 459 Đầu N của vùng D1 (ND1a) bắt đầu Ala 44 vàkéo dài tới Ala 99, đây chính là đoạn tiếp theo của đoạn ND1b Sau đó, chuỗitiếp tục kéo dài xuống phía dưới và quay ngược lại ở vị trí của hai chuỗi kẹptóc õ và kết thúc ở trong domain D2 Đầu C của chuỗi xoắn ỏ trong vùng D1(CD1) bắt đầu từ Asn 406 và kéo dài tới Glu 454 So với F41, quá trình kéodài ND1a và CD1 lên phía trên của vùng D1 xuống phía dưới Hai vùng D0,D1 có kích thước theo chiều dọc tương ứng khoảng 50Å, 80Å và vùng đệm

có chiều dài khoảng 20 Å

Hình1.2 Cấu trúc siêu hiển vi protein flagellin

của vi khuẩn S typimurium

1.2.1.3.2 Quá trình hình thành flagella của Salmonella

Roi của Salmonella được cấu tạo từ một protein đơn nhất được gọi là

flagellin, kích thước cua flagellin ở các chủng Salmonella là khác nhaukhoảng 20-60 kDa, được mã hoá bởi hơn 50 gen thuộc 17 operon khác nhau[26] Một đơn vị điều hoà sinh tổng hợp roi gồm 3 lớp gen (sớm, trung gian,

và muộn) [20] Hình 1.3

Các gen muốn phiên mã được cần có vùng trình tự ái lực với ARNpolymeraza, vùng này được gọi là promoter Tương ứng với ba lớp gen (sớm,trung gian, và muộn) là lớp promoter (lớp 1, lớp 2, lớp 3) đóng vai trò khởiđộng quá trình phiên mã [3] Promoter lớp 1 ở dạng promoter đơn, với tín

hiệu khởi đầu là cAMP-CAP thực hiện phiên mã hai gen flhD và flhC mã hóa

cho phức hệ hoạt hoá, quá trình dịch mã tạo protein cần thiết cho lắp ghépđược tiến hành để hình thành nên cấu trúc phần gốc roi Phần trục roi được

tạo thành bởi quá trình dịch mã của hai gen fliC và fljB nằm trong lớp gen

muộn [22] Hoạt động tuần tự của các lớp gen sớm, trung gian có vai trò điềukhiển sự biểu hiện của lớp gen muộn Quá trình sẽ kết thúc tại thời điểmprotein flagellin được tạo ra và vận chuyển ra ngoài màng tế bào, tham gia lắpghép để tạo nên phức hệ roi của vi khuẩn [46] hình 1.4

_

cAMP-CAP flh C D

flg A flg B C D E F G H I J flh B A

fliA fliB fli E fli F G H i J K fli L M N O P Q R

fig K L fli D

fli C

mot A B che A W tar che R B Y Z

ở mỗi typ huyết thanh khác nhau, protein flagellin được biểu hiện cácpha là khác nhau có thể một pha, hai pha thậm chí có thể nhiều hơn ba pha (ở

S rubislaw) [47]

Quá trình biểu hiện protein cấu trúc flagellin của Salmonella gồm hai pha do gen fliC và fljB quy định, được điều khiển biểu hiện không đồng thời

1.2.1.3 3 Cơ chế điều hoà biểu hiện protein roi H của Salmonella

FliC, fljB quy định hai pha khác nhau của kháng nguyên H và được điều khiển biểu hiện không đồng thời Gen fliC mã hoá cho kháng nguyên H: i (495 axit amin), gen fljB mã hóa cho kháng nguyên H: 1.2 (506 axit amin).

Dựa vào trình tự axit amin của protein flagellin, người ta chia protein ra làmtám vùng khác nhau, trong đó vùng I, II, VIII là vùng bảo thủ, vùng IV, V, VI

là những vùng siêu biến, xác định tính đặc hiệu cho kháng nguyên H Vùng

Hình 1.4 Cấu trúc phức hệ roi của vi khuẩn S

typhimurium

siêu biến của gen fliC (86 axit amin) mang epitop đặc trưng cho kháng nguyên H: i, vùng siêu biến của fljB (102 axit amin) mang epitop đặc trưng

cho kháng nguyên H: 1,2 [17] Ngoài ra, tận cùng đầu N của protein còn cótrình tự có vai trò quan trọng trong quá trình tiết và polyme hoá để cấu tạonên trục roi [50] Bằng việc so sánh khả năng kết cặp đặc hiệu giữa kháng thể

đơn dòng kháng fliC và kháng thể đơn dòng kháng fljB, Vries và cộng sự cho thấy, ngoài khả năng bắt cặp đặc hiệu với fliC, kháng thể kháng fliC còn bắt cặp với kháng nguyên của các chủng Salmonella khác như: S bonariensis, S kentucky, S jukestown, S takoradi, S bandia [17] Cách tổ chức của gen fljB và fliC trên hệ gen và cơ chế hoạt động luân phiên giữa chúng đó là: trên nhiễm sắc thể, operon fljB-fljA nằm phía trước operon fliC và có hai promoter riêng biệt nhau Operon fljB-fljA do một promoter điều khiển có khả năng hoạt

động như một invertasome với hai trình tự lặp lại đảo ngược nằm ở hai đầu

Mỗi trình tự có chiều dài 13 cặp Khi promoter của operon fljB-fljA nằm xuôi chiều, hai gen fljB và fljA sẽ được phiên mã Protein FljB sẽ tham gia vào cấu trúc roi Protein FljA có vai trò là một chất ức chế gen fliC Trong trường hợp này roi của vi khuẩn S typhimurium sẽ có pha H: 1,2, hay flagellin sẽ biểu hiện ở H: 1,2 Ngược lại, khi promoter của operon fljB-fljA đảo chiều theo cơ chế thắt thòng lọng (looping), gen fljB và fljA sẽ ngừng hoạt động, do đó, gen

fliC không còn bị ức chế bởi protein FljA Nó sẽ được phiên mã và cho ra

flagellin H: i hay còn gọi là pha H: i Người ta theo dõi thấy xác suất xảy ra

sự thay thế giữa hai gen đó trong một thế hệ tế bào là 10-5 đến 10-3 [18]

Hình 1.5: Cơ chế hoạt động luân phiên của hai gen fljB và

fliC trong vi khuẩn S typhimurium

mRNA

P

Flagellin H: i mRNA

Đảo đoạn

1.2.2 Vai trò của kháng nguyên H trong đáp ứng miễn dịch bảo hộ

phòng chống Salmonella

Như ở phần trước đã đề cập S typhimurium là nguyên nhân chính gây

ngộ độc thức ăn, vừa làm thiệt hại kinh tế vừa làm ảnh hưởng đến sức khoẻ

cộng đồng Mặt khác, với khả năng kháng lại các chất kháng sinh, S typhimurium đang là mối đe doạ cho con người Vì vậy, để khắc phục và

phòng tránh những hậu quả do chủng vi khuẩn này gây ra, chúng ta cần phảisản xuất được loại vacxin an toàn và hiệu quả cao Qua thời gian nghiên cứu,với những thành công trong lĩnh vực sinh học phân tử ở nước ta, việc nghiêncứu chế tạo ra một loại vacxin tái tổ hợp với độ an toàn và hiệu quả là điều cóthể thực hiện Tuy nhiên, muốn tạo ra được một loại vacxin hiệu quả nhất, thìviệc quan trọng nhất là xác định chính xác nguồn kháng nguyên sử dụng để

chế tạo vacxin tái tổ hợp Sau khi S typhimurium xâm nhập và bám dính lên

tế bào biểu mô ruột, trong cơ thể chủ đáp ứng lại sự nhiễm đầu tiên là cơ chế

tự bảo vệ không đặc hiệu bằng quá trình thực bào bởi bạch cầu đơn nhân,bạch cầu đa nhân trung tính, và đại thực bào Khi tế bào vi khuẩn bị dung giải

sẽ tiết ra nội độc tố, gây hoạt hoá bổ thể theo con đường nhánh tạo ra hiệntượng opsonin hoá vi khuẩn Ngoài ra, khi nội độc tố được giải phóng, nókích thích đại thực bào và các tế bào viêm khác để sản xuất ra các cytokinnhư TNF, IL-1,IL-6 và các chất gây viêm khác, làm tăng phản ứng viêm cấp[28] Các quá trình ấy cũng dẫn tới sự hoạt hoá tế bào miễn dịch đặc hiệu để

loại trừ S typhimurium Các kháng nguyên không phụ thuộc tuyến ức (LPS)

kích thích lympho B tạo kháng thể đặc hiệu (chủ yếu là IgM) [3] Những phần

kháng nguyên khác của S typhimurium được đại thực bào xử lý và trình diện

cùng với phân tử MHC II cho tế bào T CD4+, khi đó các tế bào này được hoạthoá tiết ra IL-4, IL-5, IL-6 kích thích dòng tế bào B sản xuất ra kháng thể Ig

G đặc hiệu [54]

Trong quá trình đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ với sự lây nhiễm của

S typhimurium, kháng nguyên O là kháng nguyên tạo ra sự đáp ứng miễn

dịch ban đầu mạnh, nhưng sau yếu dần và không gây đáp ứng miễn dịch nhớ.Kháng nguyên O vừa tương tác với tế bào lympho B tạo kháng thể vừa hoạthoá hệ thống bổ thể Tuy nhiên, nếu như lượng độc tố giải phóng quá lớn,các phản ứng viêm cấp xảy ra quá mạnh gây tổn thương tổ chức mô của cơthể chủ [3, 33] Vì vậy, kháng nguyên O thường không sử dụng để lựa chọnlàm nguồn kháng nguyên tái tổ hợp

Một kháng nguyên có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch cao của S typhimurium là kháng nguyên roi Với cấu trúc đơn giản chỉ bao gồm protein,

kháng nguyên này được coi là lý tưởng trong việc nghiên cứu tạo vacxin tái tổhợp Gần đây, Stephen J cùng cộng sự đã xác định khả năng sinh đáp ứngmiễn dịch của kháng nguyên thông qua việc xác định hàm lượng IFN- sinh ra

trong suốt quá trình lây nhiễm vi khuẩn gây bệnh IFN- là một loại cytokin do

tế bào CD4+ tiết ra để hoạt hóa các đại thực bào và tăng cường khả năng bảo vệ

cơ thể trước sự xâm nhập của vi khuẩn gây bệnh

Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng kháng nguyên H có khả năng gâyđáp ứng miễn dịch mạnh, đặc biệt có khả năng tạo miễn dịch nhớ, miễn dịch

bảo hộ giúp gia cầm chống lại Salmonella Chúng ta đã biết ở S typhimurium kháng nguyên H được biểu hiện ở hai pha đó là fliC và fljB cơ chế hoạt động

của hai pha này đã được nói đến ở phần 1.2.1.1.3 Bình thường kháng nguyên

roi ở pha fliC hoạt động tương đối mạnh trong các cơ thể gia cầm và gây ra

nhiều bệnh cho gia cầm, nhiều nhất là bệnh về đường ruột, từ đó lây lan sangngười qua đường ăn uống và hô hấp

Tuy nhiên khi cơ thể có kháng thể chống lại flic thì vi khuẩn chuyển

sang biểu hiện gen fljB để tạo roi giúp vi khuẩn di động, bám dính vào niêmmạc ruột, xâm nhiễm vào cơ thể Đây là một trong những cơ chế trốn hệ miễndịch của cơ thể chủ

Vì vậy, để ngăn chặn vi khuẩn nhiễm gia cầm, điều quan trọng là phải gây

miễn dịch chủ động cho gia cầm, để tạo kháng thể chống cả fliC, fljB Vì thế khi

vi khuẩn đi vào ruột chúng lập tức bị kháng thể nhận ra và bắt giữ roi, do đóchúng mất khả năng di động bám dính vào ruột để gây bệnh

1.3 Vacxin

1.3.1 Khái quát về vacxin

Hơn một ngàn năm trước, con người đã biết đến cách phòng bệnh đơngiản mà không kém phần hiệu quả, đó là sử dụng vẩy da từ vết thương củangười bệnh để gây nhiễm cho người lành, nhờ đó mà ngăn chặn được dịchbệnh Tuy nhiên ở thời điểm đó chưa biết đến “vacxin” hay “sự tiêm chủng”,nhưng họ đã áp dụng nguyên tắc phòng bệnh của việc tiêm chủng một cáchngẫu nhiên thông qua một số hiện tượng mà họ gặp phải

Đến năm 1796, một sự kiện quan trọng đã được ghi nhận như một dấumốc đánh dấu sự ra đời của ngành vacxin học James Phipps, một cậu bé támtuổi sống tại làng quê nước Anh đã được bác sĩ Edward Jenner tiêm chủng đểchống lại được dịch bệnh đậu mùa đang lây lan rộng khắp [65] Sự kiện này đã

mở ra cho ngành Y học trong việc tìm ra các phương pháp phòng bệnh hiệu quả Tuy nhiên, phải đến gần một thế kỷ sau, Luis Pasteur (1879- 1881)mới chế tạo thành công 3 loại vacxin giảm độc lực (attenuated vaccine) chốngbệnh lỵ ở gà, bệnh than và bệnh dại, ông đã áp dụng thành công khi thửnghiệm phương pháp điều trị bệnh dại trên cơ thể người: bé Josehp Meister đãđược cứu sống Với những thành công ấy, Pasteur đã đặt nền móng đánh dấumột mốc quan trọng cho sự phát triển môn khoa học: miễn dịch học [3]

Ngày nay, với sự tiến bộ khoa học và kỹ thuật, nhiều cơ chế và nguyên

lý của miễn dịch đã được sáng tỏ Vì vậy, những hiểu biết về vacxin cũngngày càng hoàn thiện Việc gây miễn dịch chủ động (tiêm chủng phòng bệnh)

đã được hiểu biết một cách đầy đủ hơn và luôn là lựa chọn hàng đầu, trongcuộc sống chống lại các bệnh dịch do các vi sinh vật gây nên Nhiều thế hệvacxin đã ra đời và ngày càng hoàn thiện hơn, nhưng mục đích và hiệu quả sửdụng vẫn còn là vấn đề phải nói tới Việc sử dụng vi sinh vật để làm nguồnkháng nguyên toàn bộ để gây đáp ứng miễn dịch đã không đáp ứng được yêucầu về hiệu quả cũng như độ an toàn với cơ thể sử dụng Người ta quan tâmđến việc tạo ra một vacxin mới, đơn giản hơn mà lại cho các đặc điểm vượttrội hơn cả về mặt gây đáp ứng miễn dịch và độ an toàn khi sử dụng Vì vậy

mà một thế hệ vacxin mới đã ra đời, đó là vacxin tái tổ hợp được sản xuất dựatrên cơ sở kháng nguyên thành phần Có nhiều định nghĩa khác nhau vềvacxin, nhưng tựu chung lại có thể hiểu vacxin là một phần hay toàn phần củatác nhân gây bệnh Dưới tác động của con người các thành phần của tác nhân

gây bệnh được làm mất khả năng gây bệnh, khi đưa vào cơ thể, các tác nhân

ấy có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch giúp bảo vệ cơ thể

Điều kiện của một vacxin phải đảm bảo 4 đặc tính sau:

 Tính sinh miễn dịch hay tính mẫn cảm

 Tính kháng nguyên hay tính sinh kháng thể

 Tính không độc

 Tính hiệu lực

1.3.2 Phân loại vacxin

Người ta đã dựa vào thành phần kháng nguyên và phương pháp chếtạo vacxin để chia ra các thế hệ vacxin khác nhau Loại vacxin kinh điển nhất

là vacxin chết hay vacxin bất hoạt (inactivated vacxin) được tạo ra trên cơ sởgiết chết vi sinh vật gây bệnh, bằng tác nhân vật lý, hoá học, nhưng vẫn giữđược khả năng đáp ứng miễn dịch Loại vacxin này đã được sử dụng rộng rãivào cuối thế kỷ XIX, nhưng nó đã bộc lộ những nhược điểm không thể khắcphục về độ an toàn và hiệu quả phòng bệnh

Tiếp đến là vacxin sống nhược độc hay vacxin sống giảm độc lực(attenuated vaccine) loại vacxin này được điều chế bằng cách làm yếu hay bấthoạt các vi sinh vật gây bệnh, nhưng vẫn còn khả năng gây đáp ứng miễn dịchghi nhớ Tuy loại vacxin này có hiệu quả phòng bệnh cao hơn loại vacxinchết, nhưng lại có nhiều mặt hạn chế như khả năng phục hồi độc tính, khảnăng đột biến trở thành dạng khác nguy hiểm hơn, vì vậy, vacxin sống nhượcđộc cũng không đáp ứng được tính an toàn trong việc sử dụng trên quy môlớn Mặc dù từ trước đến nay vacxin giảm độc lực là dạng vacxin được ứngdụng và sử dụng nhiều nhất Một số loại vacxin giảm độc lực điển hình là:vacxin chủng lao BCG, vacxin chủng sởi, vacxin chủng bại liệt Sabin [27].Trước tình hình đó, bên cạnh vacxin cổ điển, nhiều vacxin thế hệ mới đãđược ra đời, trên cơ sở sử dụng một số các protein đơn lẻ có khả năng đáp

ứng miễn dịch đặc hiệu làm nguồn kháng nguyên thành phần Bằng việc sửdụng một số kỹ thuật trong sinh học phân tử, người ta đã tìm ra vùng mã hóacho kháng nguyên đặc hiệu Từ đó, các gen này được đưa vào các chủng biểuhiện để tiến hành sản xuất hàng loạt kháng nguyên tái tổ hợp trên cơ sở sửdụng công nghệ ADN tái tổ hợp Công nghệ ADN tái tổ hợp không những tiếtkiểm thời gian nghiên cứu mà còn giúp giảm thiểu về mặt kinh tế khi ứngdụng sản xuất vacxin thành phẩm trên quy mô công nghiệp Mặt khác côngnghệ này còn cho phép tạo ra các vacxin đa chức năng, nhờ vào việc kết hợpcác tiểu đơn vị chứa epitop kháng nguyên đặc hiệu của nhiều loài do vậy mởrộng phạm vi tác dụng Loại vacxin này cho ưu điểm vượt trội cả về hiệu quảcũng như độ an toàn khi sử dụng bởi tính đặc hiệu và tính không gây độc với

cơ thể Nhờ tính ưu việt đó mà hiện nay vacxin tái tổ hợp đang là vấn đề đượcquan tâm nghiên cứu hàng đầu và sẽ được sử dụng rộng rãi trong một tươnglai không xa Có thể kể đến một số loại vacxin thế hệ mới như:

 Vacxin dưới đơn vị (subunit): chứa kháng nguyên đã tinh chế nên antoàn hơn Tuy nhiên, kháng nguyên của vacxin này có thể mất cấu trúc tự nhiênnên sự đáp ứng miễn dịch tạo ra không có khả năng bảo vệ cơ thể trước nhân tốgây bệnh [3]

 Vacxin peptit (peptid vacxin): là dạng các chuỗi peptit được phân lập

từ MHC của tế bào chủ Dạng vacxin peptit thường để kích ứng sự miễn dịchchứ không trực tiếp tạo ra sự đáp ứng miễn dịch đặc hiệu Vacxin dạng nàythường sử dụng để chống ký sinh trùng [31,60]

 Vacxin cộng hợp (Conjugate vaccine): là dạng vacxin dựa trên sự kếthợp của một protein mang với kháng nguyên (thường là polysaccarit) Dựavào cơ chế của hiện tượng opsoni hoá, khả năng đáp ứng miễn dịch của kháng

nguyên được tăng cường [60] Ví dụ như polysaccarit của Heamophilus influenzae B được kết hợp với giải độc tố bạch hầu để tăng khả năng miễn

dịch ở trẻ nhỏ

 Vacxin ADN (DNA vaccine): Đây cũng là một dạng vacxin mới đãđược ghi nhận về tính hiệu quả và độ an toàn cao Cũng tương tự như vacxintái tổ hợp, gen lựa chọn để tạo vacxin cũng cần phải chọn lọc và tiến hànhtách dòng Tuy nhiên, vacxin loại này không sự dụng protein mà lại sử dụngDNA làm liệu pháp vacxin Với loại vacxin này, cả đáp ứng miễn dịch tế bàocũng được kích ứng [31, 32, 43, 60] Vacxin tái tổ hợp (recombinant vaccine):

là dạng vacxin tạo ra bằng cách được sử dụng trực tiếp như là vacxin hoặc cóthể tinh sạch như là vacxin dưới đơn vị Kháng nguyên tái tổ hợp được tạo rabằng việc biểu hiện trong tế bào động vật, nấm men, virut hay vi khuẩn

Một hướng tạo vacxin tái tổ hợp đã và đang được quan tâm nghiên cứunhiều hiện nay là vacxin virut lai

Trong các loại vacxin trên mặc dù có một số khó khăn trong quá trìnhlựa chọn kháng nguyên, tách dòng và biểu hiện nhưng dạng vacxin sử dụngkháng nguyên tái tổ hợp vẫn là dạng vacxin có độ an toàn cao, dễ sử dụng, dễbảo quản và cho giá thành rẻ [43, 60]

Ngoài ra, dựa vào chủng sinh vật gây bệnh, có thể chia vacxin thành cácdạng như sau:

+ Vacxin virut

Virut là dạng ký sinh nội bào, về cấu trúc chúng chỉ gồm có vỏ bọc vànhân (ARN hoặc ADN) Muốn tồn tại và phát triển virut phải kí sinh trong tếbào vật chủ Chúng sử dụng chính nguyên liệu của tế bào chủ để tổng hợp nêncác phân tử sinh học cho bản thân Vì vậy, nhiệm vụ của liệu pháp vacxin làngăn cản sự nhân lên của virut và tiêu huỷ chúng

Bình thường, hệ miễn dịch bẩm sinh của cơ thể cũng có khả năng tự bảo

vệ khi nhiễm virut bằng cách tiết IFN-ỏ hoặc dung giải các tế bào nhiễm virutnhờ các tế bào aturebill Tuy nhiên, trước sự phát triển nhanh của virut, hệmiễn dịch bẩm sinh thường không lại kịp thời sự lây nhiễm của virut Vì vậy,

để bảo vệ chống lại sự lây nhiễm, sự phát triển bệnh do virut gây ra, người ta

sử dụng vacxin Điểm cơ bản của liệu pháp vacxin là việc kích thích miễndịch thích ứng của cơ thể chủ, từ đó giúp cơ thể chủ tạo khả năng bảo vệtrước các tác nhân gây nhiễm Kết quả do vacxin tạo ra là các dòng tế bàolympho B, T có khả năng nhận biết đặc hiệu các protein của virut, từ đó ngănchặn sự lây nhiễm của virut từ tế bào nhiễm sang tế bào bình thường trong cơthể chủ.

Miễn dịch thích ứng bảo vệ cơ thể chống lại virut có thể tạo ra nhờ việctiêm chủng vào cơ thể chủ chủng virut gây bệnh nhưng đã được bất hoạt khảnăng gây bệnh hoặc bộc lộ protein virut đã được xác định với cơ thể chủ Tuỳthuộc vào phương thức tác động khác nhau mà có các loại vacxin khác nhau.Nhưng về bản chất đều là phương thức tạo “trí nhớ” miễn dịch hoặc đáp ứngmiễn dịch “nhắc lại” khi cơ thể chủ gặp lại virut gây bệnh Đáp ứng miễn dịchchống virut nhờ tiêm chủng vacxin được coi là “chủ động” Đáp ứng miễndịch “thụ động” chống virut là do việc cung cấp trực tiếp kháng thể IgGkháng virut Sự đáp ứng miễn dịch “thụ động” này thường cần thiết đối với trẻnhỏ để cung cấp globulin miễn dịch khi trẻ nhiễm virut gây bệnh Ví dụ nhưtiêm kháng huyết thanh (chứa kháng thể) chống bệnh dại, bệnh thuỷ đậu Vìđáp ứng miễn dịch chủ động bằng vacxin là sự bắt chước tạo trí nhớ miễn dịchnên đáp ứng miễn dịch chủ động thường bền hơn đáp ứng miễn dịch thụ động[16]

Có thể sử dụng nhiều cách thức khác nhau để tạo vacxin virut Mỗi cáchthức ấy phụ thuộc vào nguồn bệnh, mục đích của con người Vacxin sốngnhược độc chống virut như vacxin chống bệnh sốt vàng, bệnh đậu mùa…đãtrở thành liệu pháp miễn dịch không thể thiếu Cơ sở cho việc chế tạo vacxinsống nhược độc là làm mất tính độc của chủng virut, nhưng vẫn giữ được khảnăng kích thích đáp ứng miễn dịch thích ứng Tính độc trong vacxin có thểlàm mất đi dựa trên cơ chế cách ly vật chủ, sự thay đổi điều kiện trong quátrình nuôi cấy virut, hay sự đột biến gen gây tính độc Tuy nhiên, khi sử dụng

loại vacxin này, khả năng nguy hiểm không mong muốn cho cơ thể chủ có thểxẩy ra Đại đa số khi tiêm vacxin loại này thường tạo ra triệu chứng sốt nhẹ ở

cơ thể chủ Thậm chí, trong một số trường hợp, khi tính độc của chủng viruthồi phục, vật chủ có thể bị tử vong [16]

Các loại vacxin virut không gây nhiễm như: vacxin cúm, vacxin bại liệt,vacxin virut viêm gan A, B, vacxin virut viêm não Nhật Bản Các vacxin nàyđều thuộc vacxin chết, vacxin dưới đơn vị, vacxin tái tổ hợp Mặc dù khảnăng tái gây bênh được loại bỏ nhưng khả năng kích thích miễn dịch thíchứng của của loại vacxin này lại giảm Chính vì vậy, để tăng cường khả năngkích thích này, các vacxin virut không gây nhiễm thường phải bổ sung tá chất.+ Vacxin vi khuẩn

Liệu pháp vacxin vi khuẩn cũng dựa trên nguyên tắc sự kích thích tạođáp ứng miễn dịch chống lại bệnh do vi khuẩn mà không gây bệnh cho vậtchủ Các vacxin loại này thường sử dụng vi khuẩn đã bị thay đổi (bất hoạt haylàm giảm độc lực), hoặc sử dụng một phần của vi khuẩn để kích thích miễndịch Kết quả của việc sử dụng vacxin này là ngăn chặn sự lây nhiễm hoặchạn chế những hậu quả do nhiễm vi khuẩn gây ra

Trong cơ thể chủ có hai dạng vi khuẩn tồn tại: vi khuẩn nội bào và vikhuẩn ngoại bào [3] Vì vậy, liệu pháp vacxin được nghiên cứu dựa trên khảnăng gây bệnh và khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể chủ đối với mỗi loại

vi khuẩn Đối vi khuẩn ngoại bào, kháng thể giữ một vai trò quan trọng trongviệc ngăn chặn khả năng lan rộng của kháng nguyên, trung hoà độc tố vikhuẩn Nhờ cơ chế trình diện kháng nguyên của đại thực bào cùng với phân

tử MHC II (hệ thống gen kiểm soát đáp ứng miễn dịch nằm trong hệ phù hợp

tổ chức chính) giúp tạo ra dòng tế bào lympho B có khả năng tiết IgG đặchiệu với kháng nguyên vi khuẩn Bằng nhiều nghiên cứu, người ta thấy rằng,kháng nguyên roi, kháng nguyên thân, và độc tố của vi khuẩn là những khángnguyên tạo đáp ứng miễn dịch mạnh nhất Dựa trên cơ sở ấy, nhiều loại

vacxin chống vi khuẩn đã ra đời BCG (Bacille Calmette và Guerin) là mộtloại vacxin giảm độc lực dùng để phòng lao cho trẻ em 10-14 tuổi Chủng vi

khuẩn Mycobacter tạo ra vacxin được phát triển ở bò và được sử dụng như vacxin phòng lao Với bệnh thương hàn người ta, đã tìm ra chủng S typhimurium Ty21 có thể được dùng làm vacxin giảm độc lực qua đường

uống Bệnh bạch hầu, uốn ván lại dựa trên sự trung hoà độc tố của vi khuẩngây bệnh bởi các vacxin dưới đơn vị Các vacxin ấy nhờ có mức độ thuầnnhất và tinh khiết hơn toàn bộ vi khuẩn nên tính mẫn cảm, tính sinh khángnguyên và tính hiệu lực đều cao hơn [55]

Hiện nay, bằng sự tiến bộ của công nghệ sinh học, người ta phân lậpđược các gen mã hoá cho kháng nguyên vi khuẩn Các gen này được tiếnhành dựa vào các hệ biểu hiện mạnh để biểu hiện ra các kháng nguyên tái tổhợp So với việc tinh chế kháng nguyên dưới đơn vị, các kháng nguyên tái tổhợp cho lượng nhiều hơn mà vẫn giữ được tính an toàn và hiệu quả sử dụng.Tuy nhiên, vacxin này chưa được phát triển rộng rãi

+ Vacxin ký sinh trùng

Tương tự như các vacxin vi khuẩn, vacxin chống ký sinh trùng cũng cónhững đặc điểm như khả năng tạo miễn dịch lâu dài bảo vệ cơ thể chủ, khảnăng an toàn… Tuy nhiên, đối với việc sản xuất vacxin ký sinh trùng, có rấtnhiều khó khăn nảy sinh Khác với vacxin chống vi khuẩn và virut, vacxin kýsinh trùng rất phức tạp bởi hệ thống kháng nguyên luôn thay đổi trong chu kỳsống, những cơ chế tự bảo vệ tinh vi của chúng trước sự đáp ứng miễn dịchcủa cơ thể Tổ chức Y tế thế giới đã nhận định, bệnh do ký sinh trùng gây ra

là một trong 7 bệnh lây nhiễm nguy hiểm và cần phải nghiên cứu vacxin đểphòng chống bệnh Mặc dù vậy, cho đến nay, vẫn chưa có vacxin nào thực sự

có giá trị để chống ký sinh trùng ở người [27]

Một trong những vacxin ký sinh trùng nghiên cứu sớm nhất phải kể đến

là dạng vacxin có nguồn gốc từ sinh vật gây bệnh Vacxin chết đã được

nghiên cứu nhưng không cho kết quả khả quan Mặc dù khả năng gây độcđược loại trừ nhưng khi bất hoạt ký sinh trùng, hệ kháng nguyên cũng bị mất

đi đặc tính tự nhiên vốn có Do đó, đáp ứng của hệ miễn dịch không đủ cơ sở

để bảo vệ cơ thể Để khắc phục thiếu sót đó, vacxin giảm độc lực cũng đãđược nghiên cứu Bằng việc xử lý ký sinh trùng bằng các tác nhân vật lý hayhóa học, vacxin này được tạo ra Tuy nhiên, những thử nghiệm về loại vacxinnày cho thấy khả năng tạo đáp ứng miễn dịch không đủ lâu dài để bảo vệ cơthể chủ

Mỗi phương thức tạo vacxin đều có những hạn chế nhất định Bằng việctinh chế, các kháng nguyên của ký sinh trùng khi đã tinh sạch được sử dụng

để kích ứng hệ miễn dịch tạo kháng thể đạt kết quả cao, nhưng khả năng bảo

vệ cơ thể lại kém Hơn nữa, vacxin trong quá trình tinh chế có thể gây ranhững hậu quả không mong muốn với cơ thể chủ Vacxin tái tổ hợp có thểkhắc phục được những khiếm khuyết do quá trình tinh chế có thể gây ranhưng sự biểu hiện kháng nguyên tái tổ hợp lại gặp khó khăn trong quá trìnhlựa chọn kháng nguyên để biểu hiện và sự hình thành đúng cấu trúc khángnguyên sau khi biểu hiện Mặc dù vacxin nào cũng có ưu nhược điểm, nhưngriêng vacxin tái tổ hợp có nhiều ưu điểm hơn và ngày càng làm sáng tỏ hơnnhững vấn đề nảy sinh trong quá trình đáp ứng miễn dịch

1.4 Phân lập và biểu hiện gen

1.4.1 Phân lập gen

Có hai cách chủ yếu được sử dụng để phân lập gen là: phân lập gen từ

thư viện gen trong trường hợp gen quan tâm chưa biết trình tự và phân lậpbằng kĩ thuật PCR khi đã biết trình tự của gen quan tâm

1.4.1.1 Phân lập gen từ ngân hàng gen

Đặc trưng trong cấu trúc hệ gen của sinh vật nhân sơ gồm các gen mã

hoá liên tục không phân đoạn, còn ở sinh vật nhân chuẩn gen cấu trúc lànhững vùng mã hoá (exon) nằm xen kẽ với vùng không mã hoá (intron) Do

đó để phân lập từ sinh vật nhân sơ hay sinh vật nhân chuẩn người ta phải sửdụng các phương pháp khác nhau để tạo ngân hàng gen [4, 21]

Với sinh vật nhân sơ thì nguyên tắc chung của lập ngân hàng gen là ADN

hệ gen được cắt bằng enzim hạn chế để tạo ra các đoạn có kích thước nhỏ và sau

đó các đoạn nhỏ này đưa vào vector Các vector mang các dòng gen ADN đíchđược nhận biết, tách chiết và xác định trình tự cũng như đặc điểm của chúng.Còn với sinh vật nhân chuẩn: Nếu gen phân lập là gen được điều khiển

sử biểu hiện thì quá trình tạo ngân hàng gen được tiến hành tương tự như đốivới sinh vật nhân sơ, nếu gen quan tâm là gen cấu trúc thì phải thông quamARN để tạo ngân hàng cDNA Sau khi có ngân hàng gen, quá trình phân lập

có thể được tiến hành theo nhiều cách khác nhau như: Lai ADN, phân tíchmiễn dịch, phân tích hoạt động của enzim…

1.4.1.2 Phân lập gen bằng kỹ thuật PCR

Đối với các gen mà đã biết trình tự của gen trong cùng nhóm và đượcphân lập từ cùng một nguồn sinh vật thì việc phân lập gen trở nên đơn giảnhơn rất nhiều Bằng kỹ thuật PCR, đoạn gen cần phân lập nằm trong trình tựđích được nhân lên một cách chính xác và thu được một số bản sao lớn với độthuần khiết cao và dễ dàng được đưa vào vector tách dòng, phục vụ cho bướctiếp theo [1]

1.4.2 Biểu hiện gen

1.4.2.1 Hệ biểu hiện gen trong E coli

E coli thuộc loại vi khuẩn gram âm, có khả năng sinh trưởng nhanh với

tốc độ cao trong môi trường nuôi cấy đơn giản và điều đặc biệt là chúng cókhả năng thu nhận các yếu tố di truyền vận động từ môi trường ngoài nhưplasmid, phage,… Các yếu tố này có thể tồn tại và tái bản nhiều lần trong tế

bào E coli Chính vì vậy E coli đó được cải biến để sử dụng như một vật chủ

hữu hiệu trong kĩ thuật tách dòng cũng như trong biểu hiện gen

Nhiều nghiên cứu cho thấy hiệu suất tổng hợp protein tái tổ hợp đạt được

là rất cao đối với nhiều loại protein ngoại lai trong tế bào E coli Các plasmit

được chọn thường chứa promotor mạnh, được điều khiển chặt chẽ trong quátrình tổng hợp protein ngoại lai Ngoài ra, plasmit phải có số lượng bản saolớn và tồn tại ổn định trong tế bào chủ Tính bền vững của plasmit khôngnhững phụ thuộc vào đặc tính di truyền của tế bào chủ, gen nằm trong plasmit

mà còn phụ thuộc điều kiện nuôi cấy Chính vì vậy E coli vẫn là một trong

những chủng được sử dụng rộng rãi nhất trong việc tạo ra những phân tửProtein tái tổ hợp

1.4.2.2 Hệ vector biểu hiện pET32a(+)

Cấu trúc chung của một hệ biểu hiện trong E coli cần có những đặc

điểm như chứa đựng promoter mạnh, phù hợp với tế bào biểu hiện, chứa đựngtrình tự khởi đầu và trình tự kết thúc phiên mã, chứa vùng đa nối với vị trí cắtduy nhất trong vector đối với từng enzim hạn chế, chứa một đoạn peptid tín hiệu

để làm dấu hiệu cho sự tiết của protein tái tổ hợp ra ngoài tế bào chất và mangmột vài dấu chuẩn chọn lọc để phục vụ cho mục đích sàng lọc thể biến nạp.Tương tự như vector tách dòng, vector biểu hiện pET32(+) có đầy đủ cácyếu tố di truyền đảm bảo chức năng cơ bản của một plasmit như: sao mã,phiên mã độc lập và ổn định qua các thế hệ tế bào Ngoài ra, hệ vector pET-32(+) còn có nhiều đặc điểm quan trọng, vượt trội hơn so với các hệ biểu hiệnkhác như:

Gen ngoại lai được điều khiển bởi promoter T7- đây là promotor mạnh

và có tính đặc hiệu cao, có khả năng biểu hiện protein ngoại lai lớn chiếm 30% tổng số protein tế bào, có độ nhạy cao với các chất cảm ứng nên có thểđiều khiển dễ dàng sự biểu hiện của gen ngoại lai Không giống như các

10-promotor khác có nguồn gốc từ tế bào E coli, T7 ARN polymeraza là một

enzim hoạt động rất mạnh, có tốc độ kéo dài chuỗi nhanh gấp 5 lần so với các

ARN polymeraza có nguồn gốc từ E coli.

Trên vector đã thiết kế một đoạn gen Trx mã hoá protein Thioredoxin Thioredoxin được phân lập đầu tiên từ E coli và tìm thấy ở nấm, virut, vi khuẩn, thực vật… Trong hệ biểu hiện E coli, Thioredoxin chiếm khoảng 40%

tổng protein của tế bào Thioredoxin góp phần làm tăng khả năng biểu hiệncủa gen ngoại lai khi dung hợp với nó Ngoài ra vị trí cắt của enterokinazađược thiết kế trước vùng đa điểm cắt để tách protein tái tổ hợp ra khỏiThioredoxin [1]

Tất cả các ưu điểm trên cho thấy pET-32a(+) không chỉ thiết kế riêngcho việc biểu hiện gen ngoại lai mà còn thuận lợi cho việc tinh sạch trong quátrình thu nhận protein tái tổ hợp Do đó chúng tôi đã lựa chọn vector này để

biểu hiện cho protein tái tổ hợp của gen ngoại lai fljB mã hoá cho kháng nguyên roi H: 1,2 của vi khuẩn S typhimurium.

1.4.2.3 Chủng biểu hiện E coli BL21

Trong quá trình biểu hiện protein ngoại lai, người ta thường gặp phảimột số vấn đề về chủng biểu hiện đó là: các protein sau khi được biểu hiện bịcác protease nội bào phân giải Để bảo vệ protein ngoại lai người ta sử dụngđoạn peptit tín hiệu để đưa các protein này ra ngoài khoang chu chất, tuynhiên không phải lúc nào cũng thực hiện được Do vậy, hiện nay người ta sửdụng biện pháp phổ biến là tạo các chủng biểu hiện mang các gen đột biến

làm mất khả năng tổng hợp các protease Chủng biểu hiện E coli BL21 là một chủng đột biến như vậy Tế bào E coli BL21 chứa đột biến lon proteaza

(một proteaza nội bào) và ompT proteaza (một proteaza ngoại bào) không còn

có khả năng thuỷ phân protein Như vậy, cả protein nội bào và ngoại bào ở E coli BL21 đều bất hoạt

Ngoài những đặc điểm trên thì trong ADN hệ gen của E coli BL21 có chứa

gen mã hoá cho T7 ARN polymeraza Đây là gen nguồn từ bacteriophage T7

được đưa vào hệ gen của E coli BL21 đặt dưới sự điều khiển của promoter lac Chính nhờ những cải biến này mà E coli BL21 đó trở thành vật chủ hữu

hiệu trong việc biểu hiện gen ngoại lai, đặc biệt là những gen được đưa vào hệvector pET

Chương 2 Nguyên liệu và phương pháp 2.1 Nguyên liệu

3 Chủng S typhimurium là chủng vi khuẩn mang gen fljB mã hóa kháng

nguyên roi do viện Thú Y trung ương cung cấp

2.1.2 Plasmit

1 Plasmit pCR2.1 (Invitrogen) được sử dụng để tách dòng gen

2 Plasmit pET-32a(+) (Novagen) được sử dụng để biểu hiện gen trong

E coli BL21

2.1.3 Môi trường nuôi cấy

-Môi trường LB lỏng: 0,5% Yeast extract; 1% Bacto –pepton; 1% NaCl-Môi trường thạch: môi trường lỏng LB bổ sung thêm 1,5% Bacto - aga-Môi trường có chất cảm ứng IPTG: môi trường LB + 0,1mM IPTG-Môi trường chọn lọc: môi trường LB + ampixilin 100 g/ml

Các môi trường được khử trùng ở áp suất 1at trong 30 phút

2.1.4 Các dung dịch

- Dung dịch I: Tris-HCl 50 mM, pH = 8; EDTA 10 mM, pH = 8;glucoza 50 mM

- Dung dịch II: NaOH 0,2 M; SDS 1%

- Dung dịch III: kali axetat 3 M; axit acetic 11,5%; natri axetat 3M

- TE: Tris –HCl 10mM; EDTA 1mM; pH 8

- Dung dịch phenol/chloroform/isoamylalcolhol (25:24:1)

- Dung dịch nhuộm gel ethidium bromit (EtBr) 0,5 l/ml.

- Đệm pha mẫu ADN: 0,25% Bromophenol blue; 0,25% xylen cyanolFF; 30% glyxerol trong nước

- Dung dịch CaCl2 0,1 M được vô trùng

- Dung dịch xử lí phá vỡ tế bào (sample buffer) đặc 2 lần, với các thànhphần có nồng độ cuối cùng: 0,1 M Tris; 24% (w/v) glyxerol, 8% (w/v) SDS,0,2 M DTT; 0,02% comassie blue G-250

- Dung dịch đệm điện di: 25 mM TrisCl, 0,192 M glycine, 0,1% (w/v)SDS; pH 8,4

- Dung dịch nhuộm gel polyacrylamit dùng để điện di protein: 0,1%(w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) metanol, 10% (v/v) axit axetic

- Dung dịch tẩy gel: 30% (v/v) metanol, 10% (v/v) axit axetic

2.1.5 Hoá chất, enzim, máy móc

- Hoá chất: SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); X-Gal (sigma, Mỹ);Phenol, Metanol, Isoamylalcohol, EtBr, Glyxerol, Etanol, Chloroform (Roth,Đức); Agar (Fluka, Đức); d-NTP (promega, Mỹ); Ampicillin (Merk, Đức);Agaroza (Gibco, Mỹ); MgSO4 (BioLabs, Mỹ)

- Enzym: Các loại enzim hạn chế (BioLabs, Mỹ); Taq-ADN polymeraza(BioLabs, Mỹ); Ribonucleaza (sigma, Mỹ); Phosphataza kiềm, T4-ADNligaza (BioLabs, Mỹ)

- Máy móc và thiết bị: máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh(Sorvall RC5B, Mỹ); máy ổn nhiệt (Mỹ); máy điện di, ADN trên gel agaroza

(Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); bộ KIT tinh sạch DNA từgel agaroza 1%.

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Phương pháp tách chiết ADN hệ gen của vi khuẩn

* Nguyên tắc

Vi khuẩn Salmonella được nuôi cấy trong môi trường LB lỏng ở

37oC qua đêm đến khi OD600 = 0,5 Tế bào vi khuẩn được phá vỡ bằnglyzozim và SDS Protein bám ADN và một số protein khác được phân giảibằng proteinaza K Protein có khối lượng lớn còn lại sau khi xử lý vớienzym được loại bỏ bằng cách ly tâm, protein nhỏ hoà tan vào dung dịchphenol/chloroform/isoamylalcohol nằm ở pha dưới ADN hệ gen ở pha trênđược tủa lại bằng cồn và được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gelagarose 0,8%

* Quy trình

- Nuôi cấy lắc một khuẩn lạc vi khuẩn S typhimurium trong 10 ml

môi trường LB lỏng ở 37oC, tốc độ máy lắc 200 vòng/phút qua đêm

- Đổ dịch nuôi cấy vào các ống eppendorf 1,5 ml, ly tâm 5000vòng/phút trong 5 phút, thu lấy tế bào

- Bổ sung 576 l dung dịch TE, để trên đá và lắc đều cho tan hết tếbào

- Protein được loại bằng phenol/chloroform/isoamylalcolhol (25: 24:1)

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, dùng pipet nhẹ nhàng hútdịch nổi để chuyển sang một ống eppendorf mới

- ADN được tủa bằng hai lần thể tích etanol 100%, ủ mẫu ở nhiệt

độ 4oC trong 20 phút

- Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi, thu phầntủa là ADN hệ gen

- Rửa lại tủa bằng etanol 70%, làm khô tủa bằng máy Speed Vac

- Hòa tan tủa bằng 40 l TE có bổ sung 0,4 l ARNaza 10 mg/ml

- Điện di kiểm tra 1,5 l dung dịch ADN hệ gen trên agaroza 0,8%

2.2.2 Khuếch đại gen fljB bằng kỹ thuật PCR

* Nguyên tắc

Trên cơ sở đoạn ADN khuôn, quá trình tổng hợp ADN diễn ra nhờ phảnứng cấp bậc trước làm tiền đề cho phản ứng cấp bậc sau với cường độ tăngtrưởng theo cấp số nhân dưới sự xúc tác của enzim ADN polimeraza

* Thành phần PCR * Chương trình chạy PCR

- Dịch đệm 10 lần 2,5 l Bước 1: 94oC- 3phút

- dNTP 2,5 mM 2,5 l Bước 2: 94oC- 1phút

- MgCl2 25 mM 2,0 l Bước 3: 50oC-1phút

- Mồi fljBf -5, 10 M 2,0 l Bước 4:72oC-1phút 40 giây

- Mồi fljBr- 3, 10 M 2,0 l Bước5: lặp lại 25 lần từ bước 2

- ADN khuôn (~1g/ml) 2,0 l Bước 6: 72oC - 6phút

- Enzim taq ADN polymeraza 0,3 l Bước 7: 4oC - 3 giờ

- Nước khử ion vô trùng : 6,7 l

Hỗn hợp phản ứng được trộn đều, ủ ở nhiệt độ và thời gian thích hợpcủa enzym, thường phản ứng được tiến hành ở 37oC trong 2 giờ Sản phẩmphản ứng cắt được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agaroza 0,8%

2.2.4 Quá trình tinh sạch ADN từ gel agaroza bằng cột QUIAGEN

Hiện nay, để tinh sạch ADN, các phòng thí nghiệm sinh học phân tửthường sử dụng bộ kít riêng Nó bao gồm các thành phần chính là đệm gắnADN, cột thu nhận ADN, đệm rửa Nguyên tắc để thu nhận ADN của cácthành phần này như sau:

- Cắt phần gel có chứa băng ADN theo tính toán cho vào eppendorf 1,5

ml mới Cân sản phẩm: (cứ 0,1g thạch bổ sung 100 ỡl đệm PQ) Hỗn hợp nàyđược ủ ở 50oC trong khoảng 10 cho đến khi thạch tan hết

-Hút dịch cho lên cột thu ADN đã được đặt lên một ống thu và để ởnhiệt độ phòng trong 1 phút

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 30 giây, loại bỏ dịch bên dưới ống thu,lúc này ADN đã được giữ lại trên cột thu ADN

- Bổ sung 500ỡl wash buffer (PE chứa 70% ethanol) lên cột thu, để 30giây ở nhiệt độ phòng

- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 30 giây, loại bỏ dịch dưới ống thu, lytâm tiếp 6000 vòng/phút trong 1 phút để làm khô cột

- Chuyển cột thu sang 1 eppendorf mới và bổ sung 40 l H2O, để1 phút

ở điều kiện nhiệt độ phòng, để ADN tan hoàn toàn vào nước

- Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, thu ADN vào eppendorf

2.2.5 Phản ứng nối ghép gen ngoại lai vào plasmit

* Nguyên tắc

Các nucleotide nằm ở đầu dính của một sợi ADN đơn có khả năng hìnhthành cầu nối hydro với các nucleotide bổ sung nằm trên đầu dính của đoạnADN khác Nhờ sự xúc tác ADN ligaza, cầu nối phosphodieste được hình

thành giữa hai nucleotde sát cạnh nhau của hai đoạn ADN này Kết quả là mộtliên kết este hình thành giữa gốc phosphat đầu 5’ của đoạn DNA này với gốchidroxyl đầu 3’ của đoạn kia đồng thời giải phóng ra một phân tử nước

* Quy trình

Thành phần phản ứng như sau:

- Đệm 10 lần cho T4 ADN ligaza : 2 l

- H2O khử ion + ADN tham gia phản ứng : 15 l

Hỗn hợp phản ứng được ủ qua đêm ở 16oC

2.2.6 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào E coli bằng sốc nhiệt

* Nguyên tắc

Dưới tác dụng của CaCl2, thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trởnên xốp, tạo điều kiện cho ADN plasmit có thể chui qua các lỗ trên màng tếbào vào tế bào chất khi thay đổi nhiệt độ đột ngột

* Quy trình

* Tạo tế bào khả biến

- Cấy chuyển một khuẩn lạc E coli DH5ỏ vào 5 ml môi trường LB lỏng,

- Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút Hoà tan tế bào thu được trong 50

ml CaCl2 100 mM (vô trùng) ủ mẫu 15 phút và ly tâm thu tế bào ở 3500vòng/phút trong 10 phút

- Hoà tủa trong 25 ml CaCl2 100mM, ủ mẫu trong 60 phút trên đá

- Ly tâm 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC

- Hoà tế bào trong 0,5 ml CaCl2 100 mM, bổ sung 15% glycerol

- Hút 0,1 ml dịch tế bào trên vào mỗi ống eppendorf và bảo quản ở – 75oC

* Biến nạp

- Tế bào khả biến được lấy ra từ tủ - 75oC, làm tan trên đá trong khoảng

30 phút Sau đó bổ sung sản phẩm ghép gen vào mỗi tế bào khả biến, đảonhẹ nhàng để ADN phân bố đều trong dịch tế bào khả biến Sau đó đểmẫu trên đá trong thời gian 30 phút

- Mẫu được chuyển sang bể ổn nhiệt có nhiệt độ 42oC và ủ trong 1 phút 30giây Sau đó mẫu được lấy ra để trên đá 2 phút

- Bổ sung 0,9 ml LB, lắc hỗn hợp tế bào ở 37oC trong 60 phút

- Hút 100 ỡl dịch tế bào cấy trải trên đĩa môi trường LB chọn lọc có bổsung IPTG 40 ỡg/ml và X- Gal 40 ỡg/ml, ủ ở 37oC qua đêm

2.2.7 Tách chiết ADN plasmit từ E coli

* Nguyên tắc :

Các tế bào E coli mang plasmit sau khi nuôi cấy đến pha cân bằng thì

được ly tâm thu lại Thành và màng tế bào được phá vỡ bằng kiềm và chất tạosức căng bề mặt Sau đó ADN hệ gen và protein được tủa lại bằng muối kaliaxetat và SDS, phần tủa bị loại bỏ khỏi ADN plasmit bằng ly tâm ADNplasmit được tủa lại bằng etanol

* Quy trình

-Cấy chuyển một khuẩn lạc của tế bào E coli vào ống penixillin chứa 2

ml môi trường LBA, nuôi cấy lắc qua đêm ở 37oC, 2000 vòng/phút

-Hút 1,5 ml dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf ly tâm 5000 vòng/phúttrong 5 phút, thu tế bào

-Hòa đều tế bào thu được với 100 l Sol I bằng máy voltex, sau đó để ởnhiệt độ phòng trong 5phút

-Bổ sung 200 l Sol II Đảo nhẹ nhàng để tránh đứt gãy ADN nhiễm sắcthể, đặt trên đá 5 phút

-Bổ sung tiếp 150 l Sol III và đảo nhanh trong 10 giây Trong hỗn hợpxuất hiện tủa trắng

- Bổ sung 450 l dung dịch hỗn hợp cholorofom: isoamylalcohol (24: 1)trộn đều

- ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút để loại protein và ADN nhiễmsắc thể

-Hút nhẹ nhàng pha trên khoảng 400 ỡl sang ống eppendorf mới, bổ sungthêm 400 l dung dịch hỗn hợp cholorofom: isoamylalcohol, ly tâm 14000vòng/phút trong 10 phút và tiếp tục hút nhẹ nhàng ở pha trên Bằng cách này

sẽ hút được nhiều hơn dung dịch ADN plasmit

- ADN được tủa bằng hai lần thể tích cồn tuyệt đối 100% Để dung dịch

ở - 20oC trong trong 30 phút

-Ly tâm thu ADN ở 13000 vòng/phút trong 10 phút Phần kết tủa đượcrửa với cồn 70%, tiếp đến ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút Thu tủa vàlàm khô bằng máy Speed Vac

- ADN plasmit được hòa vào 40 l đệm TE

- ARN lẫn trong sản phẩm tách chiết ADN được loại bỏ bằng ARNazanồng độ 100l/ml ủ ở 37oC trong 30 phút, giữ mẫu ở -20oC

- ADN plasmit đã tách được điện di kiểm tra trên gel agaroza 0,8%

2.2.8 Cảm ứng, biểu hiện protein tái tổ hợp

- Cấy lắc qua đêm một khuẩn lạc E coli trong 2 ml LB có bổ sung

Ampixilin đến nồng độ cuối cùng 100 g/ml (LBA)

- Chuyển 30 l dịch nuôi cấy sang 100 ml LBA lắc trong 2 giờ ở 37oCđến OD600 đạt khoảng 0,8

- Tiếp theo, tiến hành cảm ứng tế bào bằng IPTG với nồng độ cuối cùng

là 1mM