Đánh giá nguồn gen và chọn tạo giống lúa nếp cẩm năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bẹnh bạc lá

Để góp phần vào việc chọn tạo giống lúa nếp cẩm, được sự cho phép của khoa Sau đại học, Bộ môn Công nghệ sinh học Ứng dụng - khoa Công nghệ sinh học, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Hữ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP

Chuyªn ngµnh : Di truyền và chọn giống cây trồng

Ng−êi h−íng dÉn khoa häc: PGS.TS PHAN HỮU TÔN

HÀ NỘI - 2012

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình do thực tôi chủ trì và thực hiện chính Những kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này

đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đã được chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận văn

Vũ Mạnh Dần

Tôi xin gửi lời cám ơn tới Th.S Tống Văn Hải và các quý thầy cô trong

Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện các thí nghiệm của đề tài

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Nguyễn Văn Đĩnh và các thầy cô Viện đào tạo sau đại học - Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian học tập cũng như khi hoàn thành và báo cáo luận văn

Cám ơn các nhà khoa học trong ngành, các bạn bè đồng nghiệp và gia đình đã động viên và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi bảo vệ luận văn này

Hà Nội, ngày tháng năm 2012

Tác giả luận văn

Vũ Mạnh Dần

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN 1

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CÁC BẢNG vi

DANH MỤC CÁC HÌNH vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU viii

I MỞ ĐẦU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục đích 2

1.3 Yêu cầu 2

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nguồn gen cây lúa và vấn đề bảo quản nguồn gen cây lúa 3

2.1.1 Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen lúa địa phương 3

2.1.2 Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen lúa nếp cẩm 6

2.2 Nghiên cứu về chất lượng gạo 8

2.2.1 Nghiên cứu về tính trạng mùi thơm 8

2.2.2 Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm 12

2.2.3 Chiều dài, rộng và tỷ lệ dài/rộng của hạt 13

2.3 Nghiên cứu về bệnh bạc lá 14

2.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa trong và ngoài nước 14

2.3.2.Tác hại của bệnh bạc lá lúa 16

2.3.3 Triệu chứng bệnh bạc lá lúa 17

2.3.4 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa 18

2.3.5 Quy luật phát sinh phát triển và các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá 19

2.3.6 Biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa 20

2.3.7 Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá 21

III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 30

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 30

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32

3.2 Nội dung nghiên cứu 32

3.3 Phương pháp nghiên cứu 32

3.3.1 Thí nghiệm ngoài đồng ruộng 32

3.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học quan trọng 33

3.3.3 Các thí nghiệm trong phòng 35

3.4 Xử lý số liệu 42

IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43

4.1 Sự phản ứng với độ dài chiếu sáng trong ngày 43

4.2 Kết quả đánh giá các đặc điểm nông sinh học 43

4.2.1 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng 43

4.2.2 Chiều cao cây, chiều dài bông, độ thoát cổ bông, độ cứng cây 46

4.2.3 Khả năng đẻ nhánh, tỉ lệ nhánh hữu hiệu 49

4.2.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 51

4.3 Kết quả đánh giá chất lượng 55

4.3.1 Kết quả kiểm tra chất lượng thương trường của gạo 55

4.3.2 Kết quả đánh giá mùi thơm và khả năng mang gen mùi thơm 59

4.4 Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 62

4.4.1 Kết quả lây nhiễm nhân tạo 62

4.4.2 Kết quả PCR kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá 65

4.4.3 So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 68

4.5 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu 71

4.5.1 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu chất lượng tốt 72

4.5.2 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá 72

V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 74

5.1 Kết luận 74

5.2 Đề nghị 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 77

DANH MỤC CÁC BẢNG

3.1 Chủng vi khuẩn (race) được phân lập và sử dụng 30

4.1 Thời gian sinh trưởng các mẫu giống lúa vụ xuân 2011 44

4.2 Chiều cao cây, chiều dài bông, độ thoát cổ bông và độ cứng cây 46

vụ xuân 2011 46

4.3 Số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu, tỷ lệ nhánh hữu hiệu 50

các mẫu giống vụ xuân 2011 50

4.4 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 52

của các mẫu giống vụ xuân 2011 52

4.5 Chiều dài, chiều rộng hạt gạo và tỷ lệ dài/rộng 56

của các mẫu giống lúa 56

4.6 Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm các mẫu giống 58

4.7 So sánh kết quả đánh giá mùi thơm bằng phương pháp sử dụng KOH 1,7% và kết quả kiểm tra gen fgr bằng phương pháp PCR. 62

4.8 Phản ứng của dòng đẳng gen với các chủng vi khuẩn 63

4.9 Tỷ lệ R/M/S theo từng chủng vi khuẩn với các mẫu giống lúa 65

4.10 So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR 69

và kết quả lây nhiễm nhân tạo của các mẫu giống lúa 69

4.11 Đặc điểm của 3 mẫu giống chất lượng tốt được chọn 72

4.12 Đặc điểm của 5 mẫu giống kháng bạc lá được chọn 73

DANH MỤC CÁC HÌNH

2.1 Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu 12

của Bradburry và cộng sự (2005) 12

4.1 Phản ứng của các giống với KOH 1,7% 59

4.2 Điện di sản phẩm PCR xác định mẫu giống mang gen thơm fgr 61

4.3 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IR24 63

4.4 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB4 64

4.5 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB5 64

4.6 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB7 64

4.7 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa4, sử dụng cặp mồi MP2 66

4.8 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa7, sử dụng cặp mồi P3 67

4.9 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556 trước cắt enzym DraI 67

4.10 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556 sau khi cắt enzyme DraI 68

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT VÀ KÍ HIỆU

- BAC: Bacterial Artificial Chromosome - nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn

- BAD2: Enzyme betaine aldehyde dehydrogenase 2

- EAP: External antisense primer - mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr

- ESP: External sense primer- mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr

- GBSS: Grainule bound starch synthase - enzyme tổng hợp amylose

- IFAP: Internal fragrant antisense primer - mồi nội biên của cặp mồi

I MỞ ĐẦU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Gạo nếp cẩm có màu đen (gạo đen) còn gọi là bổ huyết mễ, là loại gạo có hàm lượng giá trị dinh dưỡng cao như: Hàm lượng protein trong gạo nếp cẩm cao hơn 6,8%, chất béo cao hơn 20% so với gạo khác, ngoài ra trong gạo nếp

cẩm còn chứa carotin, 8 loại axít amin (đặc biệt là Anthocyanin) và các nguyên

tố vi lượng (sắt, kẽm) cần thiết cho cơ thể (United Press International - UPI,

2010) Hiện nay gạo nếp cẩm còn được dùng trong việc tạo ra các thương hiệu

rượu nổi tiếng, được ví như là một siêu thực phẩm, có tác dụng chống ung thư

(Hiệp hội hóa học quốc gia Mỹ tại Boston, 2010) cũng như các bệnh liên quan

đến tim mạch (Giáo sư David Capuzzi thuộc Trung tâm Y tế Jefferson Myrna tại

Philadelphia, Mỹ, 2010) Tuy vậy các giống lúa nếp cẩm hiện nay còn rất ít,

năng suất không cao, hoặc đã bị thoái hóa làm giảm chất lượng… Do vậy cần tạo ra giống lúa nếp cẩm năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu tốt với sâu bệnh, đặc biệt là bệnh bạc lá là việc làm rất được quan tâm hiện nay

Thành công của công tác chọn tạo giống phụ thuộc rất nhiều sự đa dạng, phong phú của vật liệu khởi đầu.Vật liệu khởi đầu càng nhiều và chất lượng càng tốt, cơ hội để tạo ra giống mới càng nhanh.Việt Nam là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa nên quỹ gen hay nguồn gen vô cùng phong phú Đặc biệt ở nước ta cũng tồn tại rất nhiều giống lúa nếp cẩm đặc sản, có những tính trạng nông sinh học quý, chống chịu tốt với sâu bệnh và là vật liệu rất quý cho công tác chọn tạo giống.Thế nhưng do không được quan tâm đúng mức, do sức ép của sự gia tăng dân số, cùng với quá trình hội nhập,

và cũng do tập quán canh tác thay đổi…đã làm nguồn gen nếp cẩm bị mất dần

đi Do vậy việc thu thập, bảo tồn, đánh giá khách quan và chính xác nguồn gen lúa nếp cẩm là rất cần thiết, qua đó giúp các nhà chọn tạo giống định

Để góp phần vào việc chọn tạo giống lúa nếp cẩm, được sự cho phép của khoa Sau đại học, Bộ môn Công nghệ sinh học Ứng dụng - khoa Công nghệ sinh học, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Phan Hữu Tôn, chúng tôi tiến

hành thực hiện đề tài: “Đánh giá nguồn gen và chọn tạo giống lúa nếp cẩm

năng suất cao, chất lượng tốt, kháng bệnh bạc lá”

1.2 Mục đích

- Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học; đánh giá chất lượng, khả năng mang gen quy định mùi thơm fgr; khả năng kháng và mang gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7 trong tập đoàn mẫu giống lúa nếp cẩm;

- Xây dựng cơ sở dữ liệu về nguồn gen các mẫu giống lúa nếp cẩm phục

vụ công tác chọn tạo giống mới;

- Tuyển chọn một số mẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bệnh bạc lá và năng suất cao

1.3 Yêu cầu

- Đánh giá các đặc điểm nông sinh học quan trọng và năng suất;

- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng;

- Xác định các mẫu giống có chứa gen kháng bệnh bạc lá và gen mùi thơm bằng kỹ thuật PCR;

- Tiến hành lây nhiễm nhân tạo và đánh giá khả năng kháng nhiễm của các giống nghiên cứu

- Tuyển chọn một số mẫu giống phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá

và có tiềm năng năng suất cao

1.4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Đánh giá được nguồn gen tập đoàn các mẫu giống lúa nếp cẩm có các đặc điểm nông sinh học làm vật liệu phục vụ công tác lai tạo;

- Xây dựng được cơ sở dữ liệu, từ đó để sử dụng cho các mục đích sau này

II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gen cây lúa và vấn đề bảo quản nguồn gen cây lúa

Cây lúa được xem như là cây trồng đầu tiên trên thế giới được công bố hoàn thành đọc chuỗi ký tự DNA, đó là bản đồ của mỗi gen định vị trên 12 nhiễm sắc thể đã được xác định (Phan Hữu Tôn và cs, 2005) Với hệ gen

phong phú Indica: 45.000 - 56.000 gen, Japonica 32.000 - 50.000 gen (2003),

đây là nguồn vật liệu khởi đầu quan trọng để các nhà chọn giống tiến hành lai tạo giống mới

2.1.1 Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen lúa địa phương

2.1.1.1 Đặc điểm của lúa địa phương

Các giống lúa địa phương được hình thành do quá trình chọn lọc tự nhiên và nhân tạo trong điều kiện địa phương, do vậy chúng có một số đặc điểm cơ bản, đó là: cho năng suất ổn định do thích nghi cao với điều kiện địa phương, có tính chống chịu tốt với một số sâu bệnh nguy hiểm và điều kiện bất thuận của tự nhiên Trong quần thể các giống lúa địa phương tồn tại rất nhiều gen quý như: các gen quy định tính kháng bệnh, gen quy định mùi thơm… Bên cạnh đó có một số nhược điểm như thời gian sinh trưởng dài, năng suất chưa cao…

2.1.1.2 Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen địa phương

Nguồn gen cây trồng của Việt Nam rất phong phú Theo thống kê nước

ta có tới 1810 giống ngô, 75 giống khoai lang, 33 giống đay, 114 giống lạc,

224 giống đậu đỗ, 48 giống dâu… Là một trong những cái nôi của cây lúa nước, cả nước có 2000 giống lúa cổ truyền, trong đó có 206 giống lúa nếp Theo Nguyễn Thị Trâm (1998) [20] cho rằng tại Việt Nam qua khảo sát về nguồn gen cây lúa cho thấy có 5 loại lúa dại mọc ở các vùng Tây Bắc, Nam Trung Bộ, Tây Nguyên và Đồng bằng sông Cửu Long Hiện vẫn còn những loài lúa hoang dại trong tự nhiên, qua quá trình chọn lọc, trồng cấy hàng

nghìn đời nên có khả năng thích nghi và chịu đựng tốt với môi trường đồng ruộng Đây thực sự là quỹ gen phong phú, đa dạng, một nguồn gen hết sức quý giá

Tháng 1 năm 2001, tập đoàn thương mại nông nghiệp Syngenta công bố việc hoàn thành đọc chuỗi ký tự gennom cây lúa, một công trình mang tính hợp tác quốc tế với khoảng 50.000 gen Bộ gennom cây lúa có 12 nhiễm sắc thể, bao gồm 430 triệu cặp base của phân tử DNA Trung bình mỗi gen có khoảng 3.000bp Nguồn gen phong phú này chủ yếu tồn tại trong các giống lúa địa phương có thích nghi cao với các điều kiện tự nhiên nhưng còn có một số đặc điểm như: thời gian sinh trưởng dài, năng suất chưa cao…Do vậy các giống địa phương dần được thay thế bằng các giống lúa lai có năng suất cao hơn Vấn đề đặt ra cho toàn nhân loại là phải thường xuyên tiến hành đánh giá, thu thập và bảo quản nguồn gen, dùng các biện pháp kỹ thuật thích hợp để lai tạo giống mới dựa trên những tính trạng tốt của các giống địa phương

IRRI đã hợp tác chính thức với Việt Nam từ năm 1975 trong chương trình thử nghiệm giống lúa quốc tế (IRTP) trước đây và nay là chương trình đánh giá nguồn gen cây lúa (INGER) Trong quá trình hợp tác, Việt Nam đã nhận được 279 tập đoàn lúa gồm hàng ngàn mẫu giống mang nhiều đặc điểm nông sinh học tốt, năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất thuận

Việt Nam đã tiến hành công tác bảo tồn nguồn gen từ những năm 1987, kết quả đã bảo tồn và lưu giữ được trên 13.500 giống thực vật tại Trung tâm tài nguyên thực vật (Lưu Ngọc Trình, 2000), trên 450 giống lúa có khả năng chịu hạn, chịu úng ngập và chống chịu sâu bệnh tốt (Trần Duy Quý, 2000), trên 480 giống cây ăn quả và rau (Vũ Mạnh Hải, 2000)

2.1.1.3 Các hướng sử dụng nguồn gen lúa địa phương

Bằng nhiều phương pháp khác nhau và tùy vào từng điều kiện cụ thể, người ta có nhiều cách để sử dụng nguồn gen địa phương làm sao để đạt kết quả tốt nhất

- Dùng phương pháp chọn lọc trực tiếp: Từ quần thể địa phương, các nhà khoa học tiến hành chọn lọc trực tiếp bằng cách chọn những cá thể tốt nhất với kiểu sinh thái địa lý và gây thành giống mới Ví dụ: Mộc tuyền được chọn từ giống Mộc Khâm (Nguyễn Văn Hiển và cs, 2002) [6]

- Dùng trong các tổ hợp lai: Các nhà khoa học sử dụng các giống lúa địa phương có giá trị thương phẩm tốt như chống chịu sâu bệnh, chống chịu tốt với điều kiện ngoại cảnh, mang gen mùi thơm để lai với các giống khác có tình trạng bổ sung như: như thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao nhằm tạo giống mới VD: NN8×813 tạo ra giống NN75-1: cơm trắng, ngon [17]

- Dùng phương pháp gây đột biến: Các giống lúa địa phương mang tính trạng quý nhưng còn có nhược điểm được sử dụng làm vật liệu gây đột biến nhằm cải tiến tính trạng mong muốn Ví dụ: đã gây đột biến tạo được dòng Nếp cái hoa vàng vừa mang gen mùi thơm, vừa cấy được cả hai vụ, khắc phục được nhược điểm phản ứng với ánh sáng ngày ngắn, dễ đổ…

Thế giới đã quan tâm đến việc bảo tồn quỹ gen cây trồng nói chung và cây lúa nói riêng từ nhiều thập kỷ trước Ngay từ năm 1924, Viện nghiên cứu cây trồng Liên xô cũ (Vir) được thành lập mà nhiệm vụ chính là thu thập, đánh giá và bảo quản nguồn gen cây trồng Theo số liệu đã công bố thì ngân hàng gen của Viện bảo tồn có tới 150000 mẫu giống cây trồng và cây thân dại được thu thập và cung cấp miễn phí cho các chương trình hợp tác [8]

Đến thập kỷ 60 nhiều Viện nghiên cứu cây trồng và Trung tâm nghiên cứu Quốc Tế được thành lập như Trung tâm nghiên cứu Ngô và Lúa mì Quốc

tế CIMMYT, Trung tâm khoai tây và cây có củ Quốc tế CIP, Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI

Viện nghiên cứu lúa Quốc tế IRRI được thành lập năm 1962 đã tiến hành thu thập nguồn gen cây lúa phục vụ cho công tác cải tiến giống lúa và đến năm

1977 chính thức khai trương ngân hàng gen cây lúa Quốc tế IRG (Internotional Ricl Genbank) Tại đây một tập đoàn lúa từ 110 quốc gia trên Thế giới được thu

thập, đánh giá mô tả, bảo tồn Trong bộ sưu tập đó có tới hơn 80.000 mẫu, trong

đó các giống lúa trồng Châu Á O.Sativa chiếm tới 95%, Oryzae Glaberrima

1,4%, có 21 loài hoang dại chiếm 2,9% Hiện nay còn 2.194 mẫu đang ở thời kỳ nhân hạt chuẩn bị đăng ký vào ngân hàng gen cây lúa [8]

IRRI đã hợp tác chính thức với Việt Nam từ năm 1975 trong chương trình thử nghiệm giống lúa Quốc tế (IRRI) trước đây và nay là chương trình đánh giá nguồn gen cây lúa (INGER) Trong quá trình hợp tác, Việt Nam đã ghi nhận được 297 tập đoàn giống lúa gồm hàng ngàn mẫu giống mang nhiều đặc điểm nông sinh học tốt, năng suất cao, chất lượng tốt, chống chịu sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất thuận như hạn, úng, chua, mặn, phèn [8]

Theo nhận định của Lưu Ngọc Trình (1977), trên lãnh thổ Việt Nam có 14.600 loại thực vật bậc cao, trong đó đang khai thác sử dụng 700 loài thuộc

10 chi thực vật Tại ngân hàng gen Quốc gia đã thu thập bảo quản 1.300 mẫu giống lúa, 8.000 mẫu cây trồng nông nghiệp ngắn ngày Trong thời kỳ trước mắt, ngân hàng gen các cây trồng bằng hạt sẽ tăng số lượng mẫu giống lên 6.500 Đây là nguồn vật liệu khởi đầu quan trọng để các nhà chọn giống tiến hành lai tạo giống mới

Năm 1988, Viện cây lương thực và cây thực phẩm đã thu thập tới 3.691 giống lúa, trong đó 3.186 mẫu thu từ 30 nước khác nhau trên Thế giới,

500 mẫu giống địa phương

Tại khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long, đợt khảo sát năm 1992 đã thu về 1447 mẫu giống lúa địa phương, trong đó 1.335 giống mùa trung và muộn, 112 giống mùa sớm, 50 giống lúa nổi và 4 loài lúa hoang dại (Bùi Chí Bửu và cộng sự 1992)

2.1.2 Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen lúa nếp cẩm

Lúa nếp cẩm là giống lúa nếp Cẩm nương địa phương được người nông dân chọn lọc và để giống, là loại gạo đặc trưng của miền núi Tây Bắc, hiện

nay vẫn đang được trồng tại một số nơi như: huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình, huyện Bảo Thắng tỉnh Lào Cai, huyện Đà Bắc tỉnh Hoà Bình, vùng Đồng bằng sông Cửu Long với 2 tỉnh Long An và Cần Thơ.vv… và được lưu trữ tại Ngân hàng Gen Cây trồng Quốc gia Từ ngân hàng Gen được các đơn vị cơ quan sử dụng làm nguồn vật liệu khởi đầu trong công tác lai tạo hay phục tráng lại các giống có đặc điểm, tính trạng quý [54]

Các giống lúa nếp cẩm phiến lá có sọc tím ở mép, lá nhẵn hoặc độ phủ lông trên phiến lá màu xanh trung bình hay dầy tùy giống, bẹ lá mầu tím, góc

lá ngang hoặc đứng

Hạt thóc to, trung bình tùy giống, hạt bầu, dài, không có râu hoặc có râu màu tím, vỏ trấu khía nâu, có lông ngắn trên vỏ trấu, mỏ hạt thóc màu tím hay màu vàng, mày vàng, vỏ lụa màu tím [54]

Khả năng đẻ nhánh trung bình, cây cứng trung bình, ít sâu bệnh, chịu hạn tốt, thích hợp với chân đất tốt, đất dốc, có thời gian sinh trưởng khá dài

Yếu tố quan trọng nhất và tạo nên thương hiệu cho Nếp Cẩm bởi giá trị dinh dưỡng của nó có chứa khoảng 70% tinh bột, với hàm lượng chất khoáng

ấn tượng với tỉ lệ đồng chứa 24ppm, kẽm 23.6, sắt 16.2 Ngoài ra trong gạo Cẩm chứa nhiều axítamin mà đặc biệt trong vỏ Nếp Cẩm được các nhà khoa học Mỹ chứng minh có chứa lượng lớn axit amin Anthocyanin có khả năng chống oxi hoá, chống viêm nhiễm hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư Ngoài ra ăn gạo nếp Cẩm kết hợp với một số thức ăn như rau xanh, hoa quả, thịt nạc sẽ có thể tăng sự hấp thu sắt cho cơ thể [54]

Ngoài ra gạo nếp Cẩm còn được sử dụng làm rượu cẩm trong các ngày

lễ tết như ngày lễ hội của người Tày tại Đà Bắc và được sử dụng như một loại thuốc bổ cho phụ nữ sau khi sinh nở, làm sính lễ trong một số ngày lễ hội của người dân tộc [54]

2.2 Nghiên cứu về chất lượng gạo

2.2.1 Nghiên cứu về tính trạng mùi thơm

2.2.1.1 Bản chất hóa học của mùi thơm

Mùi thơm của lúa là kết quả tạo thành bởi một loạt các hợp chất hóa học khác nhau (Widjaja và cộng sự, 1996) Bullard và Holguin, 1977, đã sử dụng phương pháp sắc ký khí để xác định thành phần hóa học tạo nên mùi thơm Họ thu được 70 chất và xác định chính xác được 30 chất trong số đó, nhưng theo quan điểm của họ thì không có một thành phần rõ ràng nào quy định tính thơm của gạo (Darrell và cs, 2000) [35]

Buttery và cộng sự, năm 1983, đã chỉ ra rằng 2-acetyl-1- pyrroline AP), một chất dễ bay hơi, chính là thành phần chính tạo nên mùi thơm của lúa [10] 2-AP xuất hiện trên tất cả các bộ phận của cây (thân, lá và hạt) ngoại trừ phần rễ (Buttery và cs, 1983; Lorieux và cs, 1996; Yoshihashi và cs, 2002) [32,33] 2-AP không hình thành trong quá trình thu hoạch và nấu chín mà hình thành trong quá trình sinh trưởng của cây Chính vì vậy mà mùi thơm của lúa có thể được xác định trên cả hạt và mô lá (Yoshiyashi và cs, 2002; Nguyen Loc Hien và cs, 2006) Kỹ thuật thu hoạch và bảo quản cũng ảnh hưởng đến lượng 2-acetyl-pyroline, từ đó ảnh hưởng đến mùi thơm của gạo (Goodwin và cs, 1994)

(2-2.2.1.2 Di truyền của tính trạng mùi thơm

Cho đến nay, rất nhiều quan điểm khác nhau về di truyền tính trạng mùi thơm đã được đưa ra, như là: Jodon, 1944, cho rằng tính trạng mùi thơm do 1 gen trội quy định, nhưng trước đó Kandam và Paatanka, 1938, lại cho rằng tính trạng này do 2 gen quy định Nagaraju, 1975, đưa ra quan điểm là có 3 gen tham gia quy định tính trạng mùi thơm Dhulappanavar, 1976, kết luận rằng tính trạng mùi thơm do 4 gen quy định

Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu đều kết luận rằng tính trạng mùi thơm của lúa do 1 gen quy định (Sood và Siddiq,1980; Shekhar và Reddy,

1981; Berner và Hoff, 1986; Bollich và cs, 1992; Ali và cs, 1993; Li và Gu, 1997; Sadhukhan và cs, 1997) Berner và Hoff , 1986, kết luận rằng 1 gen trội quy định tính trạng mùi thơm của lúa và gợi ý phương pháp xác định mùi thơm của hạt bằng cách nếm thử một nửa hạt gạo đồng thời giữ lại một nửa hạt có chứa phôi Li và Gu, 1997, nghiên cứu về di truyền và vị trí của gen quy định mùi thơm trên giống lúa Shenxiangjing và phát hiện ra mùi thơm được điều khiển bởi 1 gen lặn Ngoài ra, từ kết quả lai thuận nghịch giữa các giống lúa thơm, họ cũng đi đến kết luận rằng gen quy định mùi thơm di truyền đa allen Tiến hành lai chéo WX (một giống lúa thơm) với các dòng tam bội có nguồn gốc từ IR36 và WJ (cũng là một giống lúa thơm), Li và Gu kết luận gen quy định mùi thơm nằm trên nhiễm sắc thể số 8 Trước đó, sử dụng kỹ thuật RFLP, Ahn và cs, 1992, cũng đã định vị được gen này trên nhiễm sắc thể số 8 (R.K Singh và cs, 2000) [48]

Kato và Itani, 1996, tiến hành nghiên cứu về sự liên quan di truyền của mùi thơm và các tính trạng nông sinh học khác bằng cách nghiên cứu trên các

tổ hợp của thế hệ F8 bằng phương pháp chọn lọc một hạt của tổ hợp lai giữa BGT x Koshihiraki Sau khi so sánh sự khác biệt của các cặp tính trạng giữa nhóm có mùi thơm và nhóm không có mùi thơm, họ đưa ra kết luận gen quy định mùi thơm di truyền hoàn toàn độc lập

Khush và Dela Cruz, 1998, đã nhấn mạnh trong các nghiên cứu của họ là tính trạng mùi thơm của lúa là một tính trạng số lượng với một dãy biến dị rộng

L Bradbury và cs, 2005, đã công bố một nghiên cứu về vị trí, cấu trúc

và cơ chế của gen fgr quy định tính trạng mùi thơm của lúa Trong nghiên cứu

này, Bradburry và cộng sự đã phát hiện 8 đột biến mất đoạn và 3 SNPs trên exon của gene mã hóa tổng hợp betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BAD2) chính là nguyên nhân hình thành tính thơm trên các giống luá thơm Basmati (Louis M T Bradbury và cs, 2005) Các giống lúa không thơm sẽ có bản gen

mã hóa BAD2 đầy đủ, trong khi các giống lúa thơm sẽ có bản gen mã hóa

BAD2 chứa đột biến mất đoạn và các SNPs Hậu quả của sự thay đổi cấu trúc này sinh ra một mã dừng làm mất tác dụng của enzyme BAD2 Ngoài ra, các tác giả đã sử dụng các Bacterial Artificial Chromosome (nhiễm sắc thể nhân

tạo của vi khuẩn) để kiểm tra vị trí của gen fgr và đã phát hiện được vị trí

chính xác của gen này trên NST 8

Kết quả của nghiên cứu này đã được công nhận rộng rãi và được sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử trong chọn tạo các giống lúa thơm

2.2.1.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu mùi thơm của gạo

Đến nay, nhiều chỉ thị phân tử như SNPs (single nucleotide polymorphisms) hay SSRs (simple sequence repeats) có liên kết với tính thơm

đã được áp dụng trong chọn lọc giống lúa thơm (Cordeiro và cs, 2002) [34] Ahn và cs, 1992, đưa ra một chỉ thị phân tử kí hiệu là RG28 nằm trên

nhiễm sắc thể số 8 có liên kết gần với gen thơm (fgr) Họ cũng gợi ý rằng chỉ

thị phân tử này có thể áp dụng để dự đoán sớm sự có mặt của mùi thơm trên một giống lúa, đồng thời có thể phân biệt được tính trạng đồng hợp hay dị hợp thể của gen thơm và chỉ thị này rất hữu dụng trong việc phát hiện nhanh tính trạng thơm trong các dòng lai (Ahn và cs, 1993) [30] Sau đó, đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau với mục đích nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng chỉ thị này trong công tác chọn tạo giống lúa thơm Nghiên cứu của Li và cs,

1996, với kết luận tính trạng mùi thơm do 1 gen lặn nằm trên NST số 8 đã củng cố thêm quan điểm RG28 là một chỉ thị đặc hiệu cho gen thơm Pandey

và cs, 1994, 1995, nghiên cứu về liên kết giữa RG28 và thơm bằng cách nghiên cứu tổ hợp lai chéo giữa Pusa 751 (có mùi thơm) x IR72 (không thơm)

đã đưa ra kết luận RG28 có khoảng cách là 10cM với gen thơm thay vì 4,5cM như kết luận của Ahn (Pandey và cs, 1994, 1995) [47]

Các cặp mồi thiết kế từ RG28 đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiện nhanh lúa thơm (Lang và Buu, 2002; Cordeido và cs, 2002; Jin và cs,

2003) Tuy nhiên nhược điểm lớn nhất của các mồi này là chúng chỉ liên kết với gen thơm ở một mức độ nào đó nên không thể chính xác đến 100% (Garland và cs, 2000; Hien và cs, 2005; Louis M T Bradbury và cs, 2005).

L Bradbury và cộng sự, 2005 [32], nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế hình thành của gen thơm chính là cơ sở để thiết kế một loại mồi thật sự hoàn hảo cho việc xác định mùi thơm trên lúa Dựa trên cấu trúc phân tử của gen quy định tính trạng mùi thơm, một bộ mồi đã được thiết kế, gồm 2 cặp mồi cùng nhân lên trên 1 vùng của DNA mục tiêu, trong đó 1 cặp mồi này lại nhân

1 đoạn nằm trong đoạn nhân của cặp mồi kia

Bộ 4 mồi này gồm có: 1 cặp mồi nhân không đặc hiệu nhân lên đoạn nằm ngoài khu vực xuất hiện đột biến trong cả trường hợp thơm và không thơm và 1 cặp mồi còn lại phân biệt 2 allen của gen thơm

Hai mồi ngoại biên đóng vai trò như một nhân tố kiểm soát dương tính, nhân lên một đoạn khoảng 580bp nằm trên cả kiểu gen thơm (577bp) và kiểu gen không thơm (585bp) Từng chiếc riêng lẻ của cặp mồi nội biên (kí hiệu ESP và EAP) bắt cặp với các mồi ngoại biên (kí hiệu IFAP và INSP) để tạo ra các sản phẩm đặc trưng cho kiểu gen

Với mồi này, phản ứng PCR sẽ tạo được 4 đoạn nhân như sau: 1 đoạn 580bp sẽ xuất hiện ở cả hai trường hợp thơm và không thơm, 1 đoạn 355bp

xuất hiện ở trường hợp đồng hợp thể trội Fgr/Fgr (không thơm), một đoạn 257bp xuất hiện ở trường hợp đồng hợp thể lặn fgr/fgr (thơm) và đối với trường hợp dị hợp thể Fgr/fgr (không thơm) sẽ xuất hiện đồng thời cả 2 đoạn

355bp và 257bp

Bộ 4 mồi này có tính chính xác tới 100% do chúng được thiết kế từ trình

tự của chính gen mã hóa tổng hợp BAD2 (Robert Henr và Daniel Waters, 2006; Wakil Ahmad Sarhadi và cs, 2008)

Hoạt động của bộ 4 mồi được minh họa ở hình dưới:

Hình 2.1 Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu

của Bradburry và cộng sự (2005)

2.2.2 Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm

Nhiệt độ hóa hồ (rice starch geltinization temperature) là một chỉ tiêu quan trọng liên quan đến chất lượng nấu nướng do nó có liên quan chặt chẽ đến thời gian nấu chín và chất lượng của cơm (Maningat và cs, 1978) [43] Nhiệt độ hóa hồ là một tính trạng biểu thị nhiệt độ cần thiết để gạo thành cơm và không hoàn nguyên, gạo có nhiệt độ hóa hồ cao khi nấu cơm tốn nhiệt, cơm không ngon, độ trở hồ trung bình 70-740c là tiêu chuẩn tối ưu cho phẩm chất gạo tốt (Lê Cẩm Doan, Khush, (1998) [3]

Nghiên cứu của Heu và CTV (1976), cho thấy độ hóa hồ còn là tính trạng rất dễ thay đổi theo sự thay đổi trong giai đoạn hạt vào chắc Nghiên cứu của Lê Doãn Diên (1995) [2] đã kết luận: Các giống lúa mùa của nước ta đặc biệt là lúa Tám đều có nhiệt độ hóa hồ thấp hoặc trung bình Nhiều giống lúa chiêm và các giống lúa mới có nhiệt độ hóa hồ cao

Những nghiên cứu về bản chất phân tử của gen đã xác định rằng gen

chính quy định độ bền gel và độ phá hủy kiềm đều nằm gần locus Wx trên

NST6 (Umemotoet và cs, 2002; Gao và cs, 2003) Gen quy định độ phá hủy kiềm được chứng minh là mã hóa enzyme phân hủy tinh bột SSIIa (starch-soluble synthaseisoform), và một sự khác biệt về 1 cặp base chính là nguyên nhân của sự khác biệt về độ phá hủy kiềm của 2 nhóm Japonica và Indica

(Gao và cs, 2003; Nakamura và cs, 2005) Cho đến nay, người ta vẫn chưa xác định được có bao nhiêu alen của gen này tồn tại trên các giống lúa trồng Umemoto và cs, 2004, đã phân biệt được 4 alen của gen mã hóa SSIIa, tuy nhiên các alen này lại không có nhiệt độ hóa hồ đặc trưng Trong nghiên cứu

về bản chất phân tử của gen quy định nhiệt độ hóa hồ, Umemoto phát hiện ra

sự khác biệt về cấu trúc phân tử của các giống lúa có nhiệt hóa hồ khác nhau, theo đó trên exon 8 có 3 đột biến gồm có base A thành G (dẫn đến acid amin methionin-ATG thành valine-GTG), GC thành TT (dẫn đến acid leucine-CTC thành phenylalanine-TTC) và một SNPs (A/G) Khảo sát trên các mẫu giống lúa trồng, Umenmoto phát hiện có 4 dạng alen tồn tại là G/G/GC, A/G/GC, A/A/GC và A/G/TT Tiếp tục so sánh về nhiệt hóa hồ giữa các dạng, họ đưa

ra kết luận dạng G/GC có nhiệt hóa hồ cao, 2 dạng A/GC và G/TT có nhiệt hóa hồ thấp (Umemoto và cs, 2004) Từ kết quả nghiên cứu này một số chỉ thị phân tử đã được thiết kế và ứng dụng trong các chương trình chọn tạo giống chất lượng cao (R.K Singh và cs, 2000) [48]

2.2.3 Chiều dài, rộng và tỷ lệ dài/rộng của hạt

Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt gạo là những đặc tính quan trọng nhất là đối với các giống lúa chất lượng Gạo được phân loại theo mục đích thương mại thành dạng hạt ngắn, hạt vừa, hạt dài và hạt thon Tuy nhiên, trên thị trường dạng gạo thon dài là được ưa chuộng nhất

Hình dạng hạt gạo là đặc tính của giống tương đối ổn định, ít bị thay đổi

do điều kiện ngoại cảnh Tuy nhiên, nếu sau khi nở hoa, nhiệt độ hạ xuống thấp có thể làm giảm chiều dài nhưng không nhiều Nếu những cá thể có hình dạng dạt đẹp ở F2 thì ít biến đổi ở các thế hệ sau Vì vậy, trong các quần thể

từ F3 này các dòng thuần không có hy vọng chọn lọc được dạng hạt đẹp hơn F2 hoặc nguyên bản (Nguyễn Thị Trâm, 1998) [20]

Chiều dài và hình dạng hạt di truyền độc lập nên có thể tổ hợp hai tính trạng đó vào một giống Không có sự khác biệt di truyền nào gây cản trở sự

tái tổ hợp của tính trạng hạt thon dài với các tính trạng độ trong, độ bạc bụng, hàm lượng amylose trong nội nhũ, kiểu cây, thời gian sinh trưởng và năng suất [7]

Khi theo dõi nhiều tổ hợp thấy rằng chiều dài, chiều rộng, trọng lượng hạt ở F2 tương đương nhau và bằng giá trị trung gian giữa hai bố mẹ Vì thế muốn hạt F2 thon dài nên chọn cả hai bố mẹ A và R thon dài [19]

Phần lớn các nghiên cứu đều kết luận rằng chiều dài, chiều rộng của hạt chịu tác động tổng hợp của nhiều gen Hsieh và Wang, 1986, kết luận chiều dài

của hạt di truyền đa gen, được điều khiển bởi gen đa allen kí hiệu là Gl và mức

độ trội của các alen theo thứ tự Gl1>Gl2>gl, dạng hạt tròn trội so với dạng hạt dài và hình dạng hạt cũng do gen 3 allen Gs quy định Rao và Sang, 1989, đưa

ra kết luận chiều dài và chiều rộng của hạt gạo di truyền hoàn toàn độc lập, chịu sự điều khiển của các gen khác nhau (R.K Singh và cs, 2000 ) [48]

Takeda, 1984, nghiên cứu di truyền kích thước hạt trên giống lúa Fusayoshi của Nhật Bản và cho rằng tính trạng này do đa gen quy định và có

một gen trội không hoàn toàn kí hiệu là Lk-f là gen chính

Sau đó, trong nghiên cứu bằng phương pháp phân tích quần thể phân li Takeda và Saito, 1994, đã phát hiện ra chiều dài hạt được điều khiển bởi một

gen lặn kí hiệu lk-I (Phạm Văn Phượng, 2006)

2.3 Nghiên cứu về bệnh bạc lá

2.3.1 Tình hình nghiên cứu bệnh bạc lá lúa trong và ngoài nước

Bệnh bạc lá lúa được phát hiện đầu tiên ở Fukuoka - Nhật Bản năm 1884 -1885 Bệnh phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên thế giới, đặc biệt bệnh gây hại nặng ở các nước nhiệt đới khu vực Châu Á như: Nhật Bản, Philippin,Trung Quốc, Ấn Độ, Việt Nam [29]

Ở Nhật Bản, những nghiên cứu về nòi vi khuẩn Xanthomonas oryzae

pv.oryzae (X.oryzae) đã được tiến hành từ những năm 1957 khi phát hiện

giống Aisacase chống bệnh trở nên nhiễm bệnh Tentara và Hatinio (1977) đã

dùng 10 giống chỉ thị của Nhật Bản và IRRI xác định có 5 nhóm nòi X.oryzae

ở Nhật Bản, có 4 nhóm nòi ở Philippin và có 9 nhóm nòi ở Indonesia [30]

Những nghiên cứu ở Ấn Độ cho biết bệnh bạc lá được phát hiện vào năm 1940 (Raina và cộng sự, 1981) Nhưng đến năm 1965 thì người ta mới

xác định được đúng nguyên nhân gây bệnh là do vi khuẩn Xanthomonas

oryzae gây ra (Raina và cộng sự, 1981, Singh và cộng sự, 1985)

Theo IRRI (1982) ở Philippin có 3 nhóm chủng X.oryzae đều độc với

giống lúa IR8 và ít độc với DV85 Tại Thái Lan (1972 - 1977) có 3 nhóm chủng I, II, III (Eamchit và Mew,1982)

Từ các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá X.oyzae cho thấy mỗi vùng,

mỗi lãnh thổ lại có một số chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu các giống lúa và điều kiện tự nhiên của mỗi vùng (Tika B Adhikari, T.W Mew và CTV, 1999) [51]

Ở nước ta, bệnh bạc lá đã gây hại từ lâu trên các giống mùa cũ, những năm gần đây ở các tỉnh phía Bắc, bệnh bạc lá lúa đã thực sự trở thành đối tượng gây hại chủ yếu và phổ biến trên diện rộng với mức độ gây hại rất nặng, nhất là trên các giống lúa lai có nguồn gốc từ Trung Quốc Tùy theo từng vùng, từng năm, từng giống lúa mà mức độ bệnh thay đổi, ở nước ta từ năm 1957 đến nay

đã trải qua nhiều đợt dịch bệnh: Bắc Giang (1956 - 1957), Đông Triều (1961), đồng bằng sông Hồng (1968 - 1975) gây tổn thất lớn về sản lượng thu hoạch, giảm năng suất và chất lượng của nhiều giống lúa tốt [21]

Trong 3 năm 2001-2003, nhóm nghiên cứu bệnh bạc lá trường Đại học

Nông Nghiệp Hà Nội đã phân lập, bảo quản được 154 isolate vi khuẩn

X.oryzae ở 11 tỉnh phía Bắc Việt Nam trên 27 giống lúa, đồng thời xác định

được các gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu là Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-21

Năm 2005, TS Phan Hữu Tôn và CS đã ứng dụng các kỹ thuật chỉ thị

phân tử PCR đã phát hiện được 20 giống lúa chứa gen Xa-4, 8 giống chứa gen

xa-5, 12 giống chứa gen Xa-7 trong tổng số 309 mẫu giống lúa địa phương

Việt Nam, đã tạo ra giống N91, N46 có năng suất cao, phẩm chất tốt, chứa

gen kháng bệnh bạc lá là các giống hiện đang được ưa chuộng [25]

2.3.2.Tác hại của bệnh bạc lá lúa

Tác hại của bệnh nặng hay nhẹ tuỳ thuộc vào giống lúa, vào thời điểm nhiễm bệnh và mức độ nhiễm bệnh Bệnh chủ yếu làm cho lá mà đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanh chóng khô chết, bộ lá lúa xơ xác, ảnh hưởng xấu tới hiệu suất quang hợp tích lũy chất khô, làm giảm khối lượng hạt, tăng tỷ lệ hạt lép, dẫn đến giảm năng suất [11] Theo nghiên cứu của Tika, Mew & CS (1999), năng suất giảm chủ yếu do sự thay đổi về số nhánh, số hạt chắc trên bông và khối lượng 1000 hạt [14]

Tại Ấn Độ, hàng năm có tới hàng triệu ha bị bệnh nặng, năng suất giảm

từ 6 - 60% (theo Srivastava, 1972) [45] Ở Nhật Bản, trong những năm gần đây hàng năm có từ 300.000 - 400.000 ha lúa bị bệnh nặng, làm năng suất giảm 20 - 30%, có nơi tới 50% (Tagami và Mizukami, 1962) Năm 1986, tại Australia bệnh bạc lá làm năng suất giảm từ 30 - 50%, trung bình giảm 3,5 tấn/ha với biểu hiện hạt lửng nhiều hơn và giảm trọng lượng hạt (Ramsey và Mofffet, 1989) Thiệt hại ở Philippines và Indonesia cao hơn so với Nhật Bản

(Tagami và Mizukami, 1962)

Ở Việt Nam hàng năm có hơn 350.000 ha lúa bị nhiễm bạc lá nặng ở vụ mùa và ở cả vụ lúa xuân, trong đó có hàng trăm ha bị mất trắng như vụ mùa

2002 ở Đan Phượng, Phú Xuyên, Hà Tây, Bắc Ninh, Ninh Bình

Ở Việt Nam, hàng năm hơn 350.000 ha lúa bị nhiễm nặng ở vụ mùa và

ở cả vụ lúa xuân Theo thí nghiệm của viện Khoa học kỹ thuật nông nghiệp Việt Nam tại Văn Điển cho thấy giống lúa Trân Châu Lùn bị bệnh 100%, vụ mùa 1969 đạt năng suất 177 tạ/ha đến vụ mùa 1970 năng suất chỉ đạt 15 tạ/ha Năng suất lúa bị bệnh giảm so với ruộng bình thường không bị nhiễm bệnh là

40 - 60% (Mai Văn Quyền,1969 - 1970)[13] Bệnh gây hại nặng ở các tỉnh đồng bằng ven biển như: Hà Nam Ninh (cũ), Thái Bình với 18% diện tích giống NN8 bị nặng, năng suất giảm 30 - 60% (Theo Đường Hồng Dật, 1998) [4] Năm 1996, diện tích bị nhiễm bệnh ở các tỉnh Miền Bắc, Miền Trung là 304.700 ha (gấp 2,5 lần so với vụ mùa năm 1995), các giống bị nhiễm bệnh nặng là các giống lúa lai và lúa thuần Trung Quốc Tỷ lệ bị bệnh trên nhiều giống lên tới 90 - 100% (Viện Bảo vệ thực vật, 1998) [27]

2.3.3 Triệu chứng bệnh bạc lá lúa

Goto (1970) đã chỉ ra rằng vi khuẩn X.oryzae gây ra ba triệu chứng

điển hình của bệnh bạc lá lúa ở vùng nhiệt đới: bạc lá, héo xanh (Kresek) và vàng nhạt [37] Héo xanh và bạc lá là triệu chứng điển hình của sự nhiễm bệnh còn vàng nhạt là hậu quả của sự nhiễm bạc lá (GS.TS Vũ Triệu Mân 2001) và cũng có thể do độc tố của vi khuẩn sản sinh ra (Mew, 1978) [44]

Theo GS-TS Lê Lương Tề thì ở Việt Nam bệnh bạc lá lúa có triệu chứng điển hình nhất là bạc lá Các triệu chứng Kresek hoặc vàng nhợt không được nhắc đến ở Việt Nam, có lẽ những triệu chứng này ít xuất hiện và không gây hại nghiêm trọng nên chưa được nghiên cứu Tác giả còn cho biết triệu trứng bạc lá trên đồng bằng Sông Hồng trên các giống lúa mới chia làm hai dạng: Bạc lá vàng gợn sóng và bạc lá tái xanh [15]

Theo kết quả nghiên cứu, đánh giá của Bộ môn Bệnh cây - Đại học Nông nghiệp Hà Nội cho thấy loại hình triệu chứng bạc lá gợn vàng phổ biến trên hầu hết các giống và các mùa vụ, còn loại hình bạc lá héo xanh thường chỉ xuất hiện trên một số giống đặc biệt là đối với các giống lúa ngắn ngày, chịu phân, phiến lá to, thế lá đứng, ví dụ như giống T1, X1, NN27…[15]

Theo Tạ Minh Sơn thì trong cùng một điều kiện mức độ lây nhiễm như nhau thì các giống địa phương cây cao còn giữ được hình dạng lá bệnh, còn các giống nhập nội thấp cây thì là thường bị táp, dễ mủn nát [14]

Theo S.H.O.U: Bệnh này thường xuất hiện từ giai đoạn lúa đẻ nhánh đến trỗ, trường hợp bệnh nghiêm trọng còn xuất hiện cả trên mạ [49]

Đại thể là có thể căn cứ vào những triệu chứng trên để xác định bệnh Tuy nhiên nhiều vết bệnh quá cũ hoặc biến đổi quá nhiều theo giống và điều kiện bên ngoài, nhất là ở mạ có thể nhầm lẫn với hiện tượng khô đầu lá do sinh lý Do đó việc chuẩn đoán bệnh bạc lá vi khuẩn trong một số trường hợp muốn nhanh, sớm có thể phải chuẩn đoán bằng phương pháp giọt dịch như tại Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã khảo nghiệm bằng phương pháp ép

lá trong lam kính để phát hiện giọt dịch vi khuẩn [52]

2.3.4 Nguyên nhân gây bệnh bạc lá lúa

Nguyên nhân gây ra bệnh là do vi khuẩn Xanthomonas oryzae p.v

oryzae Trước đây vi khuẩn này còn được gọi với nhiều tên khác: Bacillus oryzae hori et Bokura (Bokura 1911), Pseudomonas oryzae uyeda et ishiyama

(Ishiyama 1922), Xanthomonas campestris p.v oryzae

Vi khuẩn có dạng hình gậy 2 đầu hơi tròn, có lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 x 0,5-0,9 µm Khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn,

bề mặt ướt, háo khí, nhuộm gram âm, không có khả năng khử NO3-, không dịch hoá gelatin, không tạo NH3, Indol, có khả năng tạo H2S

Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng là 26 - 300C, nhiệt độ tối thiểu 0-5 0C, tối đa 400C Nhiệt độ gây chết là 530C trong 10 phút, có thể sống trong phạm vi PH (5,7 - 8,5), thích hợp nhất PH (6,8 -7,2)

Vi khuẩn xâm nhiễm một cách thụ động qua thủy khổng, lỗ khí ở trên mút lá, mép lá và đặc biệt qua vết thương xây sát trên lá Khi đã tiếp xúc với

bề mặt lá có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng di động tiến vào bên trong các

lỗ khí, qua vết thương mà sinh sản nhân lên về số lượng, qua các bó mạch dẫn lan rộng đi Trong điều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt lá bệnh tiết ra những giọt keo vi khuẩn, thông qua sự va

chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió mà truyền lan tới lá, cây khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều đợt trong thời kỳ sinh trưởng Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp song với phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn hình thành với số lượng nhiều, đó chính là một trong những nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh sau những đợt mưa gió vào cuối vụ xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta

Ở nước ta phát hiện thấy vi khuẩn hại trên lúa và trên các ký chủ cỏ dại, cỏ môi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò Ở Nhật Bản có một số cỏ dại thuộc họ

hoà thảo (Leersia oryzoides và leersia sayanaka) là ký chủ phụ của vi khuẩn

bạc lá lúa, cho nên ở đây cỏ dại là nguồn dự trữ bệnh qua đông rất quan trọng Mặt khác đất và nước ruộng cũng là một phần dự trữ bệnh ban đầu Ở Trung Quốc những công trình nghiên cứu của Phương Trung Đạt khẳng định nguồn bệnh chủ yếu là ở hạt giống [11]

2.3.5 Quy luật phát sinh phát triển và các yếu tố ảnh hưởng tới sự phát sinh phát triển của bệnh bạc lá

Sự phát sinh phát triển của bệnh có liên quan đến khí hậu, thời tiết, tổng lượng mưa Ngoài ra ngập lụt, gió mạnh, mực nước tưới trong ruộng và nhiệt

độ cao trong thời gian sinh trưởng của cây lúa cũng làm tăng mức độ bị bệnh

Ở miền Bắc nước ta, bệnh bạc lá có thể phát sinh phát triển trong tất cả các mùa vụ Vào vụ Chiêm xuân, bệnh thường phát sinh trong tháng 3, tháng

4, nhưng phát sinh mạnh hơn vào cuối giai đoạn sinh trưởng của lúa vào cuối tháng 5, tháng 6 dương lịch khi lúa xuân đã trỗ và chín Tuy nhiên mức độ bệnh ở vụ xuân thường ít thiệt hại hơn so với vụ mùa Ở vụ mùa bệnh phát sinh vào tháng 8 (do mưa bão nhiều), đặc biệt là khi lúa bước vào giai đoạn làm đòng đến trỗ và chín sữa, do vậy ảnh hưởng lớn đến năng suất Đối với trà cấy muộn, lúa trỗ vào khoảng tháng 10 thì thiệt hại do bệnh gây ra là nhẹ hơn [15]

Nguồn bệnh là yếu tố quan trọng đầu tiên ảnh hưởng tới sự phát sinh của bệnh Đó là tàn dư gây bệnh trên đồng ruộng từ vụ trước để lại do làm đất không tốt hoặc cũng có thể tồn tại trên một số loại cỏ dại, trên rơm rạ, chúng tồn tại bên trong hoặc bên ngoài các cọng rơm Những nơi không có hoặc có

ít cỏ Leersia thì rơm rạ là nơi tồn tại quan trọng của vi khuẩn

Trong năm, bệnh xuất hiện từ tháng 4 đến tháng 10 Theo Devadath (1985) nhiệt độ tối thích cho bệnh phát triển là từ 27 - 300C, dưới 180C và trên 37,20C thì bệnh bị hạn chế [36]

Ẩm độ cũng là một nhân tố ảnh hưởng tới sự hình thành và phát triển của bệnh Ẩm độ từ 79,3% - 92,8% làm tăng sự phát triển của bệnh, còn ẩm

độ từ 60,3% - 77% thì hạn chế sự phát triển của bệnh (Devedath, 1985) [36]

Phân bón có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng phát triển của cây trồng Theo Tagami và Mizukami, đạm là yếu tố quan trọng đối với sự phát sinh phát triển bệnh Theo Vũ Công Khoái (2000) mức bón đạm tăng làm bệnh bạc lá lúa tăng [9] Theo Modal và Miah (1985), khi bón Kali tăng sẽ làm giảm mức độ nhiễm bệnh bạc lá [45]

2.3.6 Biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá lúa

Hiện nay đang áp dụng một số biện pháp phòng trừ bệnh bạc lá như: kỹ thuật canh tác, xử lí hạt giống trước khi gieo, sử dụng thuốc hóa học, sử dụng giống kháng bệnh

Các biện pháp canh tác bao gồm vệ sinh đồng ruộng, diệt trừ cỏ dại, tăng cường chăm sóc bón phân đúng cách, điều chỉnh mực nước hợp lý là các biện pháp kỹ thuật đơn giản, dễ làm tuy nhiên chỉ có tác dụng phòng bệnh mà không có khả năng dập dịch

Biện pháp hoá học có tác dụng nhanh nhưng không triệt để, ngoài ra còn gây ô nhiễm môi trường, mất cân bằng sinh thái, đôi khi còn để lại dư lượng trong sản phẩm gây hại đến sức khoẻ con người và vật nuôi

Hiện nay, hướng chọn giống lúa có khả năng kháng bệnh bạc lá đang được nhiều nhà chọn giống quan tâm, được xem là biện pháp phòng trừ hiệu quả cao và mang tính khả thi nhất

2.3.7 Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá

2.3.7.1 Cơ sở di truyền tính kháng bệnh bạc lá

a, Nghiên cứu về chủng nòi và sự phát triển của bệnh bạc lá

Trong những năm gần đây, bệnh bạc lá lúa phát triển trên diện rộng và càng trở nên nghiêm trọng Từ các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá

Xanthomonas oyzae pv oryzae cho thấy mỗi vùng, mỗi lãnh thổ lại có một số

chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng Sự có mặt của các chủng vi khuẩn bạc lá phụ thuộc vào cơ cấu giống lúa và điều kiện tự nhiên của mỗi vùng (Tika B Adhikari, T.W Mew và CTV, 1999) [51]

Năm 2005, Nguyễn Văn Viết và cs đã tiến hành nghiên cứu bệnh bạc lá

ở 15 tỉnh miền Bắc Kết quả nghiên cứu cho thấy các nhóm nòi bệnh thường xuất hiện đan xen, ở một địa phương có thể xuất hiện nhiều nhóm nòi, trái lại một nhóm nòi có thể hiện diện ở nhiều địa phương

Theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có 4 nòi sinh lý phổ biến ở miền Bắc nước ta Cũng theo PGS.TS Phan Hữu Tôn (2002-2005)[23] hiện nay bộ môn Công nghệ sinh học và phương pháp thí nghiệm đã phân lập được 10 chủng đang tồn tại ở Miền Bắc Việt Nam Trong

đó hai chủng 2 và 3 phổ biến ở vùng đồng bằng sông Hồng những chủng còn lại vẫn có tiềm năng gây nguy hiểm cho dù xuất hiện với tần suất thấp hơn nhưng chúng vẫn có khả năng gây bệnh cho các giống lúa (Phan Hữu Tôn, 2005) [25]

Và gần đây nhất, trong chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc

lá ở Miền Bắc của Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫu bệnh, ứng dụng công nghệ sinh học phân lập nuôi cấy đã xác

định được 16 chủng vi khuẩn Xanthonas oryzae p.v oryzae gây bệnh khác

nhau (Tạp chí KHKT, 2009)

Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở Miền Bắc nước ta đang tăng lên nhanh chóng và đa dạng hơn, vì vậy mà đòi hỏi phải tạo ra những giống lúa mang nhiều gen kháng bệnh có tính kháng ngang bền vững hơn

b, Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá

Các nhà khoa học Nhật Bản là những người đi đầu trong việc nghiên cứu tính di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá lúa Cho đến những năm 60, IRRI đã xác định được bản chất di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa là do gen quy định Nishimura (1961) khi nghiên cứu về sự luân chuyển các giống lúa trồng ở Nhật Bản, ông đã phát hiện khả năng kháng bệnh bạc lá ở hai giống lúa trồng là Kogyoku và Kaganeman được điều khiển bởi một gen trội nằm trên nhiễm sắc thể số 11 (theo thứ tự NST do ông quy định) [41]

Murty và CS, 1973, khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá của các giống lúa Sigadis, TKM6, BJ1, Wase Aikoku 3, PI 215936, Zenith và B589

A4-18-1 đã chỉ ra rằng các giống lúa này có ít nhất đến 3 Xa-gen kháng các

nhóm nòi vi khuẩn

Năm 1977, Petpisit và CS trình diễn thí nghiệm khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá lúa của các giống IR20, IR22, IR1529-680-3, đã xác

định và đặt tên một gen kháng trội là Xa-4 [16]

Những nghiên cứu có tính chất hệ thống về gen kháng bệnh bạc lá được thực hiện tại Nhật Bản và Viện nghiên cứu lúa quốc tế (IRRI) từ năm 1960 đến

nay kết quả đã xác định được 31 gen kháng bệnh bạc lá lúa ký hiệu từ Xa-1 đến

Xa-31 đồng thời người ta cũng đã thiết kế được các gen mồi (Primer) để xác

định và phát hiện các Xa-gen của các giống lúa khác nhau chưa được nghiên

cứu Các gen kháng được thu thập từ nhiều nguồn khác nhau: gen kháng nguyên thủy có sẵn trong các giống lúa trồng, gen kháng được tạo bởi đột biến

như xa19, xa20, Xa25, hoặc gen kháng có nguồn gốc từ các giống lúa dại như

Xa21, Xa23 từ O Longistaminata (K.S Lee & cộng sự) [42]

Ở miền Bắc Việt Nam, hiện có 4 gen kháng hữu hiệu đối với hầu hết các chủng

vi khuẩn bạc lá là Xa-4, xa-5, Xa-7, Xa-21 (theo Phan Hữu Tôn, 2006) [24, 26]

Theo Nino –Liu và CS, xa5 là gen kháng lặn, qui định tính kháng phổ

rộng (ít nhất đã được chứng minh trên nhiều race Xoo của Philippin và Việt

Nam) xa5 mã hóa tiểu phần γ của yếu tố phiên mã TFIIA (yếu tố phiên mã hoàn chỉnh ký hiệu là TFIIAγ) Tính kháng lặn của xa5 có thể được giải thích như sau : xa5 và Xa5 mã hóa các isoform của TFIIAγ (chỉ khác nhau ở aa số

39) và do đó có ái lực liên kết khác nhau với vùng hoạt hóa phiên mã (Activated Domain - AD) của AvrXa5 của vi khuẩn (AvrXa5 là một Avr

thuộc họ AvrBs3 của vi khuẩn) AvrXa5 liên kết với isoform TFIIAγ Xa5 (gen

trội trên giống nhiễm) dẫn tới hoạt hóa các gen của ký chủ có lợi cho sự gây

bệnh Trái lại AvrXa5 không liên kết với isoform TFIIAγ xa5 (gen lặn trên

giống kháng) dẫn tới các gen của ký chủ có lợi cho sự gây bệnh không được biểu hiện, hậu quả là cây kháng bệnh [46]

Khả năng kháng bệnh của một cá thể có thể do một gen trội, một gen lặn, một gen trội không hoàn toàn hoặc do các gen cùng liên kết quy định Vì vậy mức độ kháng bệnh bạc lá của các gen khác nhau [50] Các gen kháng bệnh

bạc lá là gen trội (Xa) hay gen lặn (xa) đều có ý nghĩa đối với việc chọn

giống Nhóm gen lặn chỉ biểu hiện được khả năng kháng khi ở dạng đồng hợp nên nhóm này chỉ có ý nghĩa với việc chọn giống lúa thuần, còn nhóm gen trội có ý nghĩa đối với cả việc chọn giống lúa lai và giống lúa thuần

Theo thuyết “gen đối gen” của Flor (1956) với mỗi gen kiểm soát tính

kháng bệnh của kí chủ thì có một gen đặc thù kiểm soát tính gây bệnh trong kí sinh Hay cứ mỗi một gen quy định tính độc (VIR – genes) của kí sinh thì cũng có một gen quy định tính kháng tương ứng trong cây kí chủ [53] Mỗi vùng địa lí khác nhau tồn tại những nòi sinh lí khác nhau, điều này giải thích được tại sao những giống kháng bệnh rất hiệu quả ở vùng này lại bị nhiễm bệnh nặng ở vùng khác Vì vậy, để chọn tạo giống kháng bệnh phù hợp với

từng vùng sinh thái khác nhau cần xác định được nòi sinh lí, khu vực phân bố

và khả năng kháng của gen đối với nòi đó [31] Tại mỗi vùng sinh thái khác

nhau, vi khuẩn Xanthomonas Oryzae tồn tại nhiều chủng khác nhau, có thể là

chủng phổ biến hay chủng ít phổ biến Do đó chiến lược chọn tạo giống kháng hiện nay là tổ hợp 2 hay nhiều gen kháng vào một giống để tăng phổ kháng cho giống và tăng độ bền của gen kháng

Cơ chế kháng bệnh: Mỗi giống có khả năng kháng dọc, kháng ngang

khác nhau là do loại gen kháng và lượng gen kháng quy định

Tính kháng dọc (vertical resistance) còn gọi là tính kháng chuyên biệt

đối với các nòi sinh lý, tính kháng không đồng nhất, tính kháng chất lượng, tính kháng không bền vững Nói cách khác một giống có thể kháng tuyệt đối với nòi này nhưng lại mẫn cảm với nòi khác của cùng một loài vi khuẩn gây bệnh Xét về mặt di truyền, tính kháng dọc đồng nghĩa với tính kháng đơn gen, kháng tuyệt đối

Ngược lại tính kháng ngang (horizontance resistance) là phản ứng

kháng tương đương nhau với hầu hết các nòi và được kiểm soát bởi nhiều gen Tính kháng này còn được gọi là tính kháng toàn phần, tính kháng đồng nhất, tính kháng đa gen [6]

Do sự khác nhau về bản chất di truyền nên khả năng kháng ngang và kháng dọc ảnh hưởng tới sự phát triển của bệnh rất khác nhau Kháng dọc có tác dụng làm giảm nguồn bệnh ban đầu và trì hoãn sự bùng nổ của dịch bệnh song thời gian tồn tại khả năng kháng dọc phụ thuộc vào sự đa dạng di truyền trong quần thể ký sinh Kháng ngang không làm giảm bớt nguồn bệnh ban đầu nhưng lại làm giảm tốc độ phát triển của dịch bệnh Do đó kháng ngang

có tính kháng bệnh bền vững hơn kháng dọc [6]

Tính kháng bệnh bền vững là khả năng duy trì tính kháng trong khoảng thời gian dài trong môi trường sống thuận lợi cho ký sinh gây bệnh (Johnson,

1984) Khả năng kháng bệnh bền vững có thể có được ở những giống chứa hai hay nhiều gen kháng đặc thù với từng nòi sinh lý Chỉ khi các nòi này đồng thời tạo nên nhiều đột biến độc lập mới có thể phá vỡ hàng rào kháng bệnh của giống đó [6] Thông qua phân tích di truyền, người ta có thể dựa trên kiểu hình của tính kháng bệnh bền vững để giải thích cơ sở di truyền của nó Trên thực tế tính kháng bệnh bền vững thường kết hợp với tính kháng không chuyên tính và có tính chất số lượng, nhưng sự hiểu biết về mối quan hệ này vẫn chưa rõ ràng trên cơ sở sinh hóa học Với kỹ thuật PCR, người ta có thể tìm kiếm những gen kháng chính, những gen như vậy có thể nhanh chóng được phân lập và đánh dấu phân tử Nhờ vậy, sự phối hợp lại các gen kháng

sẽ giúp cho tính kháng trở nên ổn định hơn Do đó, trong công tác chọn giống kháng bệnh, các nhà khoa học rất chú ý đến việc tìm nguồn gen kháng phong phú với mỗi nòi ở các vùng sinh thái khác nhau Từ đó, tổ hợp vào một giống

để tăng khả năng kháng bệnh bền vững của một giống, đây là mục tiêu chiến lược trong giai đoạn hiện nay

Việc xác định nguồn gen triển vọng của cây lúa cùng với những đặc tính có lợi là một hoạt động quan trọng trong chương trình cải tiến giống lúa Tiềm năng di truyền của các nguồn vật liệu lai tạo, dù được tạo ra bởi các phương pháp truyền thống hay bằng công nghệ hiện đại, đều được đánh giá qua các biểu hiện ngoại hình trong các môi trường thí nghiệm chứa các yếu tố cần quan tâm Vì vậy cần phải sử dụng các phương pháp đánh giá thận trọng, chính xác, nhanh và đủ tính thực tiễn

c, Các phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh

Dựa trên cơ sở của tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy định, cho đến nay phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất là phương pháp lai hữu tính, thông qua phương pháp này ta có thể chuyển những gen có khả năng kháng bệnh cao vào các giống có đặc tính

nông sinh học quý thông qua Backcross.Từ đó mà nhiều giống kháng bệnh đã được tạo ra Khả năng kháng bạc lá thường do đơn gen quy định, vì vậy việc

sử dụng phương pháp lai lại để chuyển gen kháng là rất hiệu quả Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng một giống lúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết để lai lại với một giống mang gen kháng hữu hiệu Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục, giống mới được tạo thành gần như mang toàn

bộ nguồn gen tốt của cây lai lại và mang thêm được gen kháng mong muốn Trong quá trình lai lại, có thể kết hợp với tự phối, chọn lọc các dạng phân ly

để đẩy nhanh quá trình

Phương pháp lai hữu tính được tiến hành đầu tiên ở Nhật Bản từ cây lúa chống bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1926 (Jennings và ctv,1979) [38] Đến nay trên Thế giới đã có rất nhiều nước áp dụng rộng rãi phương pháp này trên cả lúa thuần và lúa lai Đặc biệt Trung Quốc là một trong những nước áp dụng rộng rãi nhất phương pháp này, họ đã chuyển được một số gen

có khả năng chống bệnh cao vào một số giống quan trọng trong quy trình sản

xuất lúa lai 3 dòng Điển hình là gen Xa-21 có phổ kháng rộng đối với các nòi

vi khuẩn đã được chuyển thành công vào “Munghu63” là một dòng phục hồi được sử dụng rộng rãi trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng [5]

Phương pháp lây nhiễm nhân tạo được sử dụng để xác định con lai

có mang gen kháng hay không Nhưng bằng phương pháp này đôi khi khó phân biệt được các gen kháng khác nhau, nếu chúng cùng biểu hiện một số phổ kháng nhiễm với các chủng vi khuẩn tương ứng Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử PCR dựa trên các trình tự ADN liên kết chặt chẽ với gen kháng từ đó mà

có thể xác định các gen kháng dễ dàng và hiệu quả hơn Tại viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Bùi Chí Bửu cùng cộng sự đã sử dụng PCR

để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen

kháng Xa-4, xa5, xa13 với độ chính xác cao [1]

Ngoài ra, hiện nay còn có các nghiên cứu nhằm chuyển gen kháng bằng phương pháp cứu phôi và lai tế bào Bằng phương pháp cứu phôi Anude Border và cộng sự (1992) đã chuyển gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng (Theo

k.s Lee và cộng sự) Bằng cánh lai tế bào trần giữa lúa trồng Oryzae sativa L với nguồn cho gen kháng là lúa dại Oryzae (Meyeriana), Cheng-qui Yan và

cộng sự đã tiến hành thành công việc tạo dòng tế bào mang gen kháng bạc lá Kết quả thu được 29 dòng cây lai xoma, hình thái biểu hiện giống cả hai bên

bố mẹ, trong đó có 2 dòng biểu hiện tính kháng cao, 8 dòng biểu hiện tính kháng vừa (Cheng-qui Yan và cộng sự, 2004)

Bên cạnh đó còn có phương pháp gây đột biến Invitro cũng tạo ra tính kháng, làm thay đổi một số tính trạng nông sinh học cho giống, phương pháp này bước đầu đã được thực hiện và thành công ở trên cây lúa, ngô và khoai tây

2.3.7.2 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá

Sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã mang đến những bước tiến đáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh

bạc lá Vi khuẩn Xanthomonas oyzae pv oyzae có thể được xác định nhanh chóng bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử Adachi và T Oku, 2000, đề xuất

sử dụng 2 đoạn mồi XOR-F và XOR-R2 để nhân đoạn ADN, đoạn ADN này nằm giữa hai gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23S của ribosome vi khuẩn bạc lá (Phan Hữu Tôn, 2005) [25]

Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống

Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phương pháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thu thập được ở duyên hải Trung bộ và đồng bằng sông Cửu

Long Kết quả đã thu được 17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4,

4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14 Kiểm

tra độ tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen

kháng ở quần thể con lai giữa IR24/Barer đối với gen xa5 cho thấy độ chính

xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004) Đồng thời Bùi Chí Bửu và Cs cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử để kiểm tra tổ hợp BC4F4 của

IR24 với giống lúa địa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với độ chính

xác cao (NguyenVinh Phuc, 2005)

Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh Từ năm 2000, cùng với sự hợp tác của các chuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu

về bệnh bạc lá của trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội của Phan Hữu Tôn và

cs đã liên tục công bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng Nhóm nghiên cứu

đã sử dụng chỉ thị phân tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn để tiến hành thu thập, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở miền Bắc Đồng thời, để phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hành lây nhiễm trên các dòng đẳng gen nhằm kết luận gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở miền Bắc Cho đến nay, các gen

xa5, Xa7, Xa21 đã được xác định là các gen kháng hầu hết các chủng vi

khuẩn Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng được tiến hành đánh giá khả năng kháng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng kháng các chủng vi khuẩn ở Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004) [24]

Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm kiếm nguồn gen kháng từ các giống lúa địa phương bằng cả hai phương pháp lây nhiễm nhân tạo và PCR Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu đã công bố của Phan Hữu Tôn thì trên cơ sở điều tra 145 giống lúa địa phương đã phát

hiện được 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7 Năm 2004, trên cơ

sở tiếp tục điều tra 120 giống địa phương, Phan Hữu Tôn và cộng sự phát hiện

được thêm 8 giống lúa địa phương chứa gen xa5 Các kết quả nghiên cứu trên

đều nhằm mục đích phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc

lá ở miền Bắc Việt Nam (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004, 2007) [10]

Đến nay, bước đầu có thể khẳng định các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10,

xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa địa phương ở

Việt Nam Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan

trọng trong việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng được hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta Nhưng trong số các gen

kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn

xa5 Hiện chưa có nghiên cứu nào công bố việc phát hiện được gen Xa21 trên

các giống lúa trồng Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác định gen kháng và vi khuẩn bạc lá trong chọn tạo giống lúa kháng bệnh cho kết quả rất khả quan

III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1.1 Thí nghiệm ngoài đồng ruộng

- 70 mẫu giống lúa nếp cẩm được thu thập và bảo quản tại Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng -Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội và Trung Tâm tài nguyên thực vật -Viện khoa học Nông Nghiệp Việt Nam (Kí

hiệu, tên, nguồn gốc các mẫu giống được trình bày chi tiết tại Phụ lục 1);

- Các giống đối chứng TK90, Bắc thơm và IR64;

- Các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau, gồm dòng nhiễm chuẩn IR24, các dòng mang gen kháng chuẩn gồm IRBB4,

IRBB5 và IRBB7 lần lượt chứa gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7;

- 10 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá đang tồn tại ở miền Bắc Việt Nam được phân lập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng như sau:

Bảng 3.1 Chủng vi khuẩn (race) được phân lập và sử dụng

từ giống Địa điểm thu thập