Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 - 2013

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AH1N1pdm09 Danh pháp chuẩn quốc tế – A/H1N1/09 đại dịch The novel influenza AH1N1vi rút which is causing of human influenza pandemic in 2009 CDC Centers for Di

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

- -

NGUYỄN THỊ KIM PHƯƠNG

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH

TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI – 2015

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

VIỆN VỆ SINH DỊCH TỄ TRUNG ƯƠNG

- -

NGUYỄN THỊ KIM PHƯƠNG

MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM VI RÚT HỌC CỦA VI RÚT CÚM A/H1N1/09 ĐẠI DỊCH

TẠI VIỆT NAM, 2009 - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan bản luận án này là công trình nghiên cứu nghiêm túc, trung thực Tất cả số liệu và kết quả trong luận án chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Nghiên cứu sinh

Nguyễn Thị Kim Phương

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn:

- Khoa Đào tạo và Quản lý khoa học, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

- Ban Giám đốc, Trung tâm cúm Quốc gia, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương

- Ban Giám đốc Bệnh viện, Khoa Vi sinh vật – Bệnh viện TWQĐ 108

Đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất tới nhà khoa học

PGS.TS.Lê Thị Quỳnh Mai người Thầy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, truyền đạt

kinh nghiệm quý báu cho tôi từ những bước đi đầu tiên trong lĩnh vực vi rút học và luôn khuyến khích tôi tích cực nghiên cứu tiếp cận những kiến thức nâng cao để tôi

hoàn thành luận án Tôi xin gửi lời cảm ơn đặc biệt tới Thầy PGS.TS.Trần Hải Anh đã sửa chữa chi tiết, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình

nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn Chủ nhiệm và các thành viên nghiên cứu trong đề tài cấp nhà nước về Cúm A/H1N1/09 đại dịch (Mã số ĐTĐL2009G/55), Phòng Thí nghiệm Cúm Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã giúp đỡ tôi trong suốt quá trình nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự giúp đỡ của TS Tsutomu Kageyama Trung tâm

Cúm thuộc Viện Quốc gia các bệnh Truyền nhiễm Nhật Bản (NIID) hỗ trợ kỹ thuật ban đầu của nghiên cứu

Tôi xin trân trọng cảm ơn TS Nguyễn Lê Khánh Hằng, TS Hoàng Vũ Mai Phương, ThS Nguyễn Cơ Thạch, ThS Lê Thị Thanh cùng các bạn đồng nghiệp

công tác tại Phòng Thí nghiệm cúm - Khoa Vi rút - Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương đã nhiệt tình giúp đỡ và ủng hộ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận án

Tôi xin gửi đến mọi thành viên trong gia đình, những người thân yêu, những bạn bè đồng nghiệp đã luôn động viên chia sẻ về mọi mặt để tôi vượt qua mọi khó

khăn trong quá trình nghiên cứu đạt được thành quả ngày hôm nay

Hà Nội, tháng 01 năm 2015 NGUYỄN THỊ KIM PHƯƠNG

MỤC LỤC

Lời cam đoan ii

Lời cảm ơn iii

Mục lục iv

Danh mục các ký hiệu, các chữ viết tắt vii

Danh mục các bảng ix

Danh mục các hình vẽ, biểu đồ, sơ đồ x

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 3

1.1 Vi rút cúm 3

1.1.1 Đặc điểm vi rút học 3

1.1.2 Quá trình nhân lên của vi rút cúm A 10

1.2 Đại dịch cúm A/H1N1/09 13

1.2.1 Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 trên thế giới 13

1.2.2 Phản ứng của TCYTTG trước diễn biến của đại dịch A/H1N1/09 19

1.2.3 Tình hình đại dịch cúm A/H1N1/09 tại Việt Nam 20

1.2.4 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 21

1.3 Các phương pháp chẩn đoán vi rút cúm A(H1N1)pdm09 PTN 24

1.3.1 Phân lập vi rút 24

1.3.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền 26

1.3.3 Phương pháp phát hiện kháng thể 30

1.4 Vắc xin 32

1.4.1 Các loại vắc xin cúm 33

1.4.2 Đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm 37

1.4.3 Phản ứng phụ của vắc xin cúm mùa và cúm đại dịch 38

Trang

1.4.4 Lựa chọn chủng vi rút dự tuyển vắc xin 38

CHƯƠNG II – ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 41

2.1 Đối tượng nghiên cứu 41

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 41

2.1.2 Tiêu chuẩn lựa chọn chủng cúm A(H1N1)pdm09 41

2.2 Phương pháp nghiên cứu: 41

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu: 41

2.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu: 41

2.2.3 Cỡ mẫu trong nghiên cứu 42

2.2.4 Các biến số nghiên cứu 42

2.2.5 Vật liệu và kĩ thuật xét nghiệm 43

2.2.6 Trang thiết bị và dụng cụ tiêu hao 60

2.3 Vấn đề Y đức trong nghiên cứu 60

CHƯƠNG III – KẾT QUẢ 61

3.1 Lựa chọn chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu 61

3.2 Kết quả PCR phân tách và khuếch đại 6 phân đoạn gen 62

3.2.1 Đặc điểm di truyền gen HA(Haemagglutinin) 63

3.2.2 Đặc điểm di truyền gen NA(Neuraminidase) 69

3.2.3 Đặc điểm di truyền các gen M, NS, PB1 và PB2 74

3.3 Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 84

3.3.1 Kết quả thử nghiệm HI trên các vi rút phân lập trong nghiên cứu 84

3.3.2 Phân bố sự thay đổi đặc tính kháng nguyên theo thời gian và các thay đổi axit amin trong protein HA liên quan 85

3.4 Các đột biến liên quan đến thay đổi đặc điểm kháng nguyên hoặc giảm độ nhạy cảm của vi rút với thuốc kháng vi rút oseltamivir 86

3.4.1 Phát hiện đột biến bằng phân tích trình tự nucleotide 87

3.4.2 Kết quả thử nghiệm sinh học đánh giá ảnh hưởng của đột biến đến

biểu hiện kiểu hình của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 89

3.5 Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 90

3.6 Thử nghiệm ngưng kết hồng cầu (Haemagglutinin Assay –HA) 93

CHƯƠNG IV – BÀN LUẬN 95

4.1 Sự lưu hành của cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam, 2009 -2013 95

4.2 Lựa chọn vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu 96

4.3 Kết quả phân tách, khuếch đại và giải trình tự 6 phân đoạn gen 97

4.4 Kết quả phân tích cây gia hệ HA, NA, M, NS, PB1 và PB2 98

4.5 Kết quả phân tích protein HA, NA, M1, M2 , NS1, NS2, PB1, PB2 101

4.5.1 Protein HA 101

4.5.2 Protein NA 106

4.5.3 Các protein M1, M2 , NS1, NS2, PB1 và PB2 108

4.6 Đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 109

4.7 Kết quả thử nghiệm ức chế neuraminidase (NAI) 112

4.8 Lựa chọn chủng vắc xin dự tuyển cho phát triển vắc xin 113

KẾT LUẬN 118

KIẾN NGHỊ 120 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A(H1N1)pdm09 (Danh pháp chuẩn quốc tế) – A/H1N1/09 đại dịch

(The novel influenza A(H1N1)vi rút which is causing of human influenza pandemic in 2009)

CDC Centers for Disease Control

(Trung tâm kiểm soát bệnh tật và dự phòng Mỹ) CPE Cytopathogenic effect (Gây hủy hoại tế bào)

ELISA Enzyme-linked immunosorbent assays

(Phản ứng hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức nông lâm thế giới)

GISRS Global Influenza Surveillance and Response System

(Hệ thống giám sát cúm toàn cầu)

HI Hemagglutinin Inhibition Assay (Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu)

IC50 Inhibition Concentration 50% (Nồng độ ức chế 50%)

IFA Immunofluorescent Assay (Thử nghiệm miễn dịch huỳnh quang)

ILI Influenza Like Illness (Bệnh giống cúm)

IQR Interquartile Range (Khoảng tứ phân vị)

ISIRV International Society for Influenza and other Respiratory Virus Diseases

(Hiệp hội quốc tế về bệnh cúm và các bệnh vi rút gây viêm đường hô hấp khác)

IVAC Institute of Vaccines And Medical Biological

(Viện vắc xin và sinh phẩm Y tế, Nha trang) MDCK Mardin Darby Canin Kidney cell (Tế bào thận chó thường trực)

MN Microneutralization Assay (Phản ứng trung hoà vi lượng)

NAI Neuraminidase Inhibition Assay

( Thử nghiệm ức chế enzyme Neuraminidase) NIBSC Nationnal Institute for Biological Standards and Control

(Viện Quốc gia về tiêu chuẩn và Kiểm soát sinh học Vương quốc Anh)

NLS Nuclear Localization Signal (Tín hiệu định vị nhân)

PCR Polymerase Chain Reaction (Phương pháp khuếch đại gen)

Polivac Viện nghiên cứu sản xuất vắc xin, Hà Nội

RT- PCR Reserve Transcriptase - Polymerase Chain Reaction

(Phương pháp khuếch đại gen phiên mã ngược) RT-LAMP Reverse Transcription-Loop-mediated Isothermal Amplification

(Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược) SARS Severe Acute Respiratory Syndrome

(Hội chứng hô hấp cấp tính nặng) Sequence Phương pháp xác định trình tự gen

VABIOTECH Company for vaccine and biologycal production No1

(Công ty TNHH một thành viên vắc xin và sinh phẩm số 1) WHO

TCYTTG

World Health Organization

Tổ chức Y tế Thế giới

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm 8

Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động của trường học trong giai đoạn A(H1N1)pdm09 tại Mexico 14

Bảng 2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 42

Bảng 2.2 Bảng nhận định kết quả IC50 của vi rút cúm 56

Bảng 3.1 Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 sử dụng trong nghiên cứu ……61

Bảng 3.2 Kết quả tổng hợp 6 phân đoạn gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 bằng phản ứng PCR 63

Bảng 3.3 Sự thay đổi (đột biến) axit amin trên protein HA 67

Bảng 3.4 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein HA 68

Bảng 3.5 Sự thay đổi (đột biến ) axit amin trên protein NA 72

Bảng 3.6 Tần suất thay đổi (đột biến) trên protein NA 73

Bảng 3.7 So sánh sự tương đồng về axit amin trong các protein M1,M2, NS1, NS2, PB1 và PB2 của vi rút trong nghiên cứu 82

Bảng 3.8 Tần suất thay đổi axit amin thường gặp trong protein 83

Bảng 3.9 Kết quả hiệu giá HI của các vi rút A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam, 2009-2013 84

Bảng 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian 85

Bảng 3.11 Hiệu giá HI của các vi rút mang đột biến G155E và N156K 89

Bảng 3.12 Kết quả thử nghiệm NAI với vi rút mang đột biến H275Y 90

Bảng 3.13 Kết quả lựa chọn vi rút dự tuyển vắc xin bằng đánh giá độ tương đồng về di truyền học trên gen HA và NA 91

Bảng 3.14 Độ tương đồng nucleotide trong gen HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 nhóm 6C 92

Bảng 3.15 Kết quả HA và HI của các vi rút trong nhóm lựa chọn 93

Trang

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm 5

Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm 6

Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase 9

Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm 13

Hình 1.5 Diễn biến dịch tại khu vực các bang thuộc Bắc, Trung và Tây nam Mexico từ 1/4/2009 – 31/12/2009 15

Hình 1.6 Phân bố dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ (7/5/2009) 16

Hình 1.7 Các quốc gia chịu ảnh hưởng của đại dịch và sự phân bố các trường hợp tử vong 18

Hình 1.8 Biểu đồ dịch tễ học cúm A(H1N1)pdm09 trên toàn cầu 19

Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 22

Hình 1.10 Nguyên lý giải trình tự gen 29

Hình 2.1 Quy trình giải trình tự gen 47

Hình 2.2 Thang trọng lượng phân tử chuẩn 1 kb- Invitrogen 52

Hình 2.3 Kết quả HI xác định hiệu giá vi rút A(H1N1)pdm09 với kháng huyết thanh chuẩn A/California/07/09 59

Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm PCR gen HA và NA sử dụng cặp mồi khuếch đại phù hợp cho giải trình tự gen 62

Hình 3.2 Cây gia hệ HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam, 2009-2013 65

Hình 3.3 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen HA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin A/California/07/09 (Mega 5 sofwave) 66

Hình 3.4 Cây gia hệ NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam, 2009-2013 70

Trang

Hình 3.5 Số nucleotide trung bình thay đổi trên gen NA của các nhóm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong nghiên cứu và vi rút vắc xin 71Hình 3.6 Cây gia hệ M của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam, 2009-2013 75Hình 3.7 Cây gia hệ NS của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam, 2009-2013 77Hình 3.8 Cây gia hệ PB1 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam, 2009-2013 79Hình 3.9 Cây gia hệ PB2 của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam, 2009-2013 81Hình 3.10 Thay đổi hiệu giá HI của vi rút nghiên cứu theo thời gian 86Hình 3.11 Đột biến G155E, N156K và D222N trên protein HA của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 88Hình 3.12 Đột biến H275Y trên protein NA của vi rút cúm A(H1N1)pdm0988Hình 3.13 Kết quả khuếch đại của vi rút trong nhóm lựa chọn vắc xin dự tuyển 94Hình 4.1 Bản đồ đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 110

DANH MỤC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Quy trình lựa chọn vi rút vắc xin dự tuyển 40

ĐẶT VẤN ĐỀ

Vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được phát hiện lần đầu tiên vào đầu tháng 3 năm 2009 tại Mexico nhanh chóng lan rộng ra phạm vi toàn cầu và đã phát triển thành đại dịch cúm đầu tiên của thế kỷ 21[80], [109] Theo số liệu thống kê của TCYTTG, ngày 06/08/2010 đại dịch cúm đã lan rộng 214 quốc gia và vùng lãnh thổ, gây tử vong cho 18.449 trường hợp [120], [121] Tương tự các đại dịch cúm

đã xảy ra ở giai đoạn trước, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục lưu hành cùng với các vi rút cúm A/H3N2 và vi rút cúm B gây ra các dịch cúm mùa hàng năm [109], [119]

Việt Nam là nước thứ 54 trên thế giới thông báo các trường hợp nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09, trường hợp nhiễm đầu tiên được ghi nhận vào ngày 31/5/2009 [2] Dịch cúm bắt đầu lan rộng trong cộng đồng vào tháng 7/2009 và trong giai đoạn tháng 8 đến tháng 9/2009 có 85 – 95% tổng số các trường hợp nhiễm cúm được ghi nhận tại Việt Nam là căn nguyên do cúm A(H1N1)pdm09 Theo thống kê của Bộ Y tế, tổng số 11.104 trường hợp nhiễm với 53 trường hợp

tử vong báo cáo tại Việt Nam (28/12/2009) [4]

Trong giai đoạn 2010 – 2013, theo số liệu của chương trình giám sát cúm quốc gia (NISS) tại các điểm nghiên cứu vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được ghi nhận với tỷ lệ là 46,6 % trong tổng số các trường hợp nhiễm vi rút cúm năm

2009 và giảm với tỷ lệ 28 % trong năm 2010 khi có sự đồng lưu hành của vi rút cúm A/H3N2 Tại năm 2011, vi rút cúm A(H1N1)pdm09 tiếp tục gây dịch với tỷ

lệ 74,1% và đạt 30% trong năm 2013 Kể từ khi xuất hiện đại dịch cúm năm

2009 và tiếp tục trong gây dịch các năm tiếp theo, những phân tích về di truyền học đã phát hiện một số thay đổi (đột biến) liên quan đến sự đa dạng của biểu hiện lâm sàng, độc lực và đáp ứng miễn dịch [8], [22]

Những sự thay đổi được ghi nhận như tăng tiến triển viêm phổi nặng, có thể gây tử vong liên quan đến sự thay đổi của axit amin tại vị trí 222 trên protein HA (D222/G/E/N), đột biến I129K tại khu vực thụ cảm thể bám trên gai HA sẽ làm

tăng ái lực gắn bám của vi rút vào tế bào biểu mô đường hô hấp [8], [11] Các đột biến I117V, I223R và H275Y trên protein NA là nguyên nhân của hiện tượng vi rút giảm độ nhạy hoặc kháng thuốc oseltamivir cũng được ghi nhận [68], [71] Ngoài ra, một số thay đổi trên các protein NP, PA và PB2 đã ảnh hưởng tới độc tính của vi rút hoặc làm tăng khả năng nhân lên của vi rút trong tế bào chủ Hơn thế nữa, khả năng tiềm tàng của hiện tượng trao đổi và tích hợp (reassortment) của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 với các vi rút cúm A khác có thể

sẽ tăng độc tính hoặc nguy cơ tạo ra một vi rút cúm mới [5], [14], [18]

Hiện tại, vắc xin cúm mùa thương mại có khả năng phòng nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 và các thông tin về dịch tễ học, vi rút học vẫn được yêu cầu cập nhật thường xuyên trong hệ thống giám sát cúm toàn cầu (GISRS) của TCYTTG Tại Việt Nam, vắc xin phòng chống cúm mùa đang được phát triển tại một số đơn vị sản xuất vắc xin và sử dụng các vi rút dự tuyển theo khuyến cáo của TCYTTG, trong khi đó một số nước như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc, Australia lựa chọn các vi rút cúm lưu hành tại nước mình để phát triển vắc xin để đảm bảo sự tương đồng cao về di truyền, đặc tính kháng nguyên nâng cao hiệu quả cao của vắc xin phòng bệnh [24], [39], [117]

Để chủ động trong công tác phòng chống cúm đồng thời góp phần vào chiến lược phát triển vắc xin cúm tại Việt Nam, chúng tôi tiến hành nghiên cứu

“Một số đặc điểm vi rút học của vi rút cúm A/H1N1/09 đại dịch tại Việt Nam, 2009 – 2013” với các mục tiêu:

1 Phân tích đặc điểm di truyền học của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09 lưu hành tại Việt Nam giai đoạn 2009 – 2013

2 Xác định đặc tính kháng nguyên của các chủng vi rút cúm A(H1N1)pdm09

3 Đề xuất chủng vi rút dự tuyển cho vắc xin phòng cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam

CHƯƠNG I – TỔNG QUAN 1.1 Vi rút cúm

Vi rút cúm là một vi rút đặc biệt trong nhóm vi rút gây bệnh đường hô hấp cho người liên quan đến sự đa dạng về kháng nguyên, gây bệnh có tính chất mùa và ảnh hưởng trên một phạm vi toàn cầu với sự xuất hiện của đại dịch

1.1.1 Đặc điểm vi rút học

1.1.1.1 Phân loại

Vi rút cúm thuộc họ Orthomyxoviridae, bao gồm 5 nhóm vi rút: Vi rút cúm A, vi rút cúm B, vi rút cúm C, vi rút Thogoto và vi rút Isa Trong đó vi rút cúm A, B, C gây bệnh cho người Vi rút cúm A lưu hành phổ biến trên gia cầm, người và các động vật khác như lợn, ngựa là căn nguyên gây nên các đại dịch lớn trên toàn cầu Vi rút cúm B thường gây bệnh nhẹ thường chỉ gây nên các vụ dịch vừa và nhỏ, đặc biệt trẻ em Vi rút cúm C có gây bệnh, ghi nhận với số lượng nhỏ [6], [18], [61], [122], [123]

Vi rút cúm A được chia thành các phân týp dựa vào cấu trúc kháng nguyên bề mặt HA (Haemagglutinin) và NA (Neuramindase) Sử dụng HA để xác định phân týp của vi rút cúm A, các nhà khoa học đã xác định được 17 loại hemagglutinin khác nhau từ H1 đến H17, trong đó H17 được xác định từ

vi rút phân lập từ dơi [101] Kháng nguyên NA được chia thành 9 phân týp khác nhau từ N1 đến N9 Như vậy nếu ghép cặp 17 phân týp HA với 9 cặp phân týp NA thì sẽ được 153 phân týp cúm A khác nhau [18], [122], [123]

Vi rút cúm A gây bệnh cho người chủ yếu là vi rút cúm có kháng nguyên

bề mặt là H1, H2, H3 và N1 hoặc N2 Gần đây, một số phân týp cúm mới, có nguồn gốc từ gia cầm đã gây bệnh cho người đó là vi rút cúm A/H5N1ghi nhận tại Hồng Kông 1997 và một loạt các trường hợp nhiễm cúm tại Trung

Quốc, Đài Loan và Hồng Kông được báo cáo là phân týp vi rút mới A/H7N9 được ghi nhận năm 2013-2014 [32], [33], [49]

1.1.1.2 Cấu tạo chung

Dưới kính hiển vi điện tử vi rút cúm có dạng hình cầu, hình trứng hoặc một số ít có dạng hình sợi đường kính 20nm và dài từ 200-300nm, đường kính trung bình 80-120nm Bên trong vi rút có cấu tạo phức tạp gồm protein capsid và các sợi ARN liên kết với nhau thành các nucleocapsid có cấu trúc đối xứng xoắn Vỏ của vi rút được cấu tạo bởi 2 lớp lipid, trên bề mặt 2 lớp

vỏ lipid này là khoảng 500 chồi gai khác nhau nhú lên từ bề mặt của vi rút, mỗi chồi gai có độ dài từ 10-14nm Các chồi gai này được cấu tạo bởi các glycoprotein, là hai loại kháng nguyên quan trọng là Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) Hai kháng nguyên HA và NA quyết định đến khả năng gây bệnh của vi rút cúm, có bản chất là glycoprotein (HA) hoặc enzyme (NA) [6], [116], [122], [123]

Protein HA còn gọi là tố ngưng kết hồng cầu (NKHC): giúp vi rút bám vào thụ cảm thể niêm mạc đường hô hấp, phân tách thành protein HA1 và HA2, trở thành vi rút hoạt động và xâm nhập vào trong tế bào [29] Hemagglutinin có thể bám vào màng hồng cầu của một số loài động vật (gà tây, chuột lang…), gây ra hiện tượng kết dính hồng cầu, có thể nhìn thấy được bằng mắt thường Kỹ thuật ngưng kết hồng cầu (Haemaglutinine Assay) dựa trên nguyên lý này để phát hiện vi rút cúm Kháng thể kháng HA có tầm quan trọng trong cơ chế miễn dịch bảo vệ cơ thể Sự có mặt của kháng thể này làm bất hoạt protein HA, đồng nghĩa với việc trung hòa vi rút làm cho vi rút không còn khả năng bám vào niêm mạc đường hô hấp, do đó mất khả năng gây bệnh Protein NA có bản chất là enzyme, có tác dụng làm loãng chất nhầy

ở đường hô hấp, nhờ đó làm cho vi rút tiếp xúc với tế bào niêm mạc và xâm nhập vào bên trong tế bào dễ dàng hơn Hơn nữa, enzyme này còn giúp cho

việc giải phóng các virion trong quá trình nhân lên trong tế bào Kháng thể tương ứng với kháng nguyên NA cũng có tác dụng bảo vệ cơ thể nhưng yếu hơn kháng thể tương ứng kháng nguyên HA

Protein M bao gồm M1 nằm dưới lớp lipit kép và liên kết với RNP của lõi vi rút, là protein có nhiều nhất trong virion Protein M1 có vai trò quan trọng trong việc lắp ráp các thành phần để tạo nên hạt vi rút, tạo điều kiện cho

vi rút nảy chồi Phần xuyên màng là protein M2 hoạt động như một kênh ion xuyên màng có trách nhiệm bơm ion H+ từ nội bào vào trong vi rút làm phá

vỡ mối liên kết protein-protein trên protein nền M1, giải phóng các RNP của

vi rút vào trong nội bào của tế bào cảm nhiễm (Hình 1.1) Protein NS2 tạo thành phức hợp với protein M1 là mối liên hệ cần thiết trong chu trình sống của vi rút để giải phóng phức hợp RNP từ nhân

Hình 1.1 Cấu trúc của vi rút cúm

http://www.pasteur.ac.ir/researchDepartment/flu/images/flu_structure.gif

Bên trong vi rút có cấu tạo gồm các sợi ARN đơn âm, liên kết với các protein NP và 3 enzyme polymerase PA, PB1, PB2 tạo thành phức hệ ribonucleoprotein có chức năng sao chép và phiên mã Nucleoprotein (NP) và

3 enzyme polymerase (PB1, PB2, PA) là thành phần chủ yếu của phức hợp Ribonucleoprotein (RNP) xoắn ở bên trong của vi rút (Hình 1.2)

NS

NA

HA

Hình 1.2 Cấu trúc phức hợp RNP của vi rút cúm

Nguồn: Paul Digard, Dept Pathology, University of Camb

1.1.1.3 Cấu trúc phân tử và chức năng

Genome của vi rút A, B là ARN sợi đơn âm gồm 8 phân đoạn, riêng vi rút cúm C gồm 7 phân đoạn, có chiều dài khoảng 10 đến 15 kb Hệ gen của vi rút cúm gồm 8 phân đoạn ARN mã hoá cho 10 protein đã biết Mỗi phân đoạn

mã hóa cho 1 hoặc 2 protein cấu trúc hoặc không cấu trúc: 7 protein cấu trúc PB1, PB2, PA, HA, NA, NP và M1 và 3 protein không cấu trúc (Nonstructureral) NS1, NS2 và M2 đối với vi rút cúm A và NB đối với vi rút cúm B[63], [76]

Protein HA là glycoprotein gồm 562-566 axit amin đƣợc mã hóa bởi

1742-1778 nucleotide, có trọng lƣợng phân tử khoảng 76.000 Dalton Haemagglutinin đóng vai trò nhƣ thụ thể bằng cách gắn vào sialic acid (N-acetyl-neuraminic acid) trên bề mặt tế bào cảm nhiễm và vào bên trong tế bào bằng quá trình thực bào Protein HA đƣợc tổng hợp ở dạng tiền thân là chuỗi polypeptide HA0 Điều kiện pH thấp các enzyme phân tách protein dạng trysin và fusin, cấu trúc của HA0 thành HA1 và HA2, kết với nhau qua cầu nối disulphua Protein HA2 (gồm 221-222 axit amin) vẫn gắn với màng vi rút

và protein HA1 (gồm 319-326 axit amin) có các khu vực thụ cảm thể (receptor binding) tạo điều kiện cho màng tế bào cảm nhiễm và màng vi rút hòa vào nhau, vi rút có thể bám gắn trên bề mặt tế bào cảm nhiễm bắt đầu cho

quá trình thâm nhập vào tế bào [29] Protein HA là một trong thành phần kháng nguyên bề mặt của vi rút cúm, những thay đổi trên protein HA gây ra hiện tượng chuyển dịch - trôi kháng nguyên (antigenic drift) là nguyên nhân gây những vụ dịch cúm theo mùa Những biến đổi lớn (antigennic shift) ở protein HA làm thay đổi đặc tính kháng nguyên của vi rút cúm A, hệ quả là giảm hoặc ức chế sự gắn kết với các kháng thể trung hòa được tạo ra từ các kháng nguyên trước đó (miễn dịch tự nhiên hoặc vắc xin) Sự trao đổi và tích hợp các phân đoạn gen xảy ra khi một tế bào bị nhiễm 2 vi rút cúm A khác nhau, dẫn đến sự hình thành của một loại vi rút mới mà quần thể không có miễn dịch có thể gây đại dịch trong tương lai

Protein NA được mã hóa bởi 1413 nucleotide (453 axit amin) có cấu trúc

tứ đồng phân (tetramer), trọng lượng phân tử trung bình 220.000 Dalton Phần chính của phân tử NA đều nằm ở mặt ngoài vi rút, neuraminidase hoạt động giống như một enzyme, nó cắt axit sialic ra khỏi các phân tử glycoprotein, glycolipid ở bề mặt tế bào chủ, giúp cho vi rút cúm bám vào tế bảo chủ để thực hiện quá trình thâm nhiễm Khi vi rút được nhân lên trong tế bào chủ, hoạt động ezyme của Neuraminidase sẽ tác động và axit sialic của glycoprotein tế bào chủ, giúp giải phóng vi rút Những thay đổi nhỏ cũng có thể xảy ra với NA, một số đột biến có liên quan đến hiện tượng giảm độ nhạy hoặc kháng các thuốc kháng vi rút theo cơ chế ức chế Neuramidase Các đột biến đã được xác định gồm: I117V, H274Y, H275Y, I222K, E119V, N294S (R - arginine; K - lysine; H - histidine; Y- tyrosine; E - glutamic acid; V - valine) có thể dẫn đến sự kháng không chỉ đối với oseltamivir mà còn đối với zanamivir và thuốc khác mới [15], [50], [51], [59] Để xác định ảnh hưởng của đột biến này, các thử nghiệm sinh học trong phòng thí nghiệm như thử nghiệm ức chế Neuraminidase (Neuraminidase Inhibition assay - NAI) hoặc

thử nghiệm trên động vật (in vivo) được áp dụng

Bảng 1.1 Các phân đoạn ARN và chức năng của vi rút cúm [94]

Phân

đoạn

Kích thước

thông tin (mARN)

Haemagglutinin: mang tính đặc hiệu týp, kháng nguyên HA gây ngưng kết hồng cầu, có vai trò quyết định trong việc gắn vi rút vào tế bào chủ, dung hợp giải phóng phức hợp ribonucleoprotein, mở đầu quá trình nhân lên của vi rút

Nucleoprotein: là thành phần protein chủ yếu của phức hợp RNP, chứa 1 trong các kháng nguyên đặc hiệu týp

Neuraminidase: phá vỡ liên kết giữa vi rút

và tế bào chủ để giải phóng vi rút ra khỏi

M2

Tích màng protein M2 hoạt động như 1 kênh bơm ion để làm giảm hoặc để duy trì

pH của thể nội bào (endosome)

Protein M2 và M1 được mã hóa từ phân đoạn gen M, khi vi rút thâm

nhập vào tế bào thông qua thể thực bào, hoạt tính của kênh ion M2 được gia tăng để cho các ion tràn vào bên trong, dẫn đến pH thấp tạo điều kiện cho protein HA hòa với lớp màng trong của màng nội bào Các ribonucleoprotein được phóng thích vào trong bào tương của tế bào và được vận chuyển tới nhân khởi đầu cho sự tổng hợp RNA vi rút Hoạt tính của protein M2 bị ức chế bởi amantadine, rimantadine [66]

Protein NS1 có vai trò trong hoạt động của vi rút cúm được cho là ức chế

sự chuyển ra ngoài nhân phần poly-A, làm cho mRNA ưu tiên được chuyển vận vào ty thể (ribosome) và sau đó dịch mã NS1 cũng ức chế sự cắt dán tiền mRNA (pre-mRNA) và ức chế sự đáp ứng interferon trong các tế bào nhiễm

vi rút, làm cho quá trình nhân lên của vi rút được dễ dàng NS2 là một phân tử nhỏ có trọng lượng 11.000 Trong hạt vi rút, NS2 có thể gắn kết với protein M1 Người ta cho rằng nó có chức năng là giúp đỡ cho sự vận chuyển các RNP vừa được tổng hợp từ nhân đi vào bào tương để làm cho vi rút sinh sản nhanh hơn [123], [127] Các protein NS1 và NS2 có chức năng điều hòa để thúc đẩy sự tổng hợp các thành phần của vi rút trong tế bào bị nhiễm

Hình 1.3 Quá trình phiên mã của Polymerase

Nguồn: http://biology.kenyon.edu/BMB/Jmol2010/RNAP/Image1.jpg

Các protein PB1, PB2 và PA là các polymerase được mã hoá từ các phân

đoạn gen PB1, PB2, PA chịu trách nhiệm tạo ra các RNA và RNA polymerase Phức hợp PA-PB1-PB2 ở trong nhân tế bào cảm nhiễm có nhiệm

vụ khởi đầu và kích hoạt quá trình tổng hợp mRNA của vi rút (Hình 1.2) Khi khởi đầu quá trình tổng hợp mRNA của vi rút, PB2 gắn vào đầu 5’ của mRNA của tế bào chủ, PA endonuclease cắt một đoạn 10 - 15 nucleotide để

sử dụng làm mồi tổng hợp mRNA để sau đó mRNA di chuyển ra tế bào chất thực hiện quá trình phiên mã (Hình 1.3) Trong quá trình hoạt động của vi rút cúm, một số đột biến xác định xảy ra trên gen PB2 có liên quan chặt chẽ với khả năng thích nghi của vi rút, điều này đặc biệt với vi rút cúm gia cầm H5N1 Vị trí 627 trên vi rút cúm người là Lysin trong khi trên vi rút cúm gia cầm là Glutamin, đột biến E627K trên vi rút cúm gia cầm làm tăng khả năng thích nghi với điều kiện sống của vi rút Trên gia cầm, vi rút tồn tại và nhân lên ở nhiệt độ tối ưu là 37oC, khi mang gen đột biến, vi rút cúm gia cầm có khả năng thích nghi và phát triển được trên tế bào đường hô hấp trên của người với nhiệt độ tối ưu là 33oC, làm tăng khả năng cảm nhiễm của vi rút cúm gia cầm với vật chủ mới [96] Ngoài ra, PB2 được cho là có liên hệ mật thiết với các thụ cảm thể trên bề mặt nhân của tế bào chủ, tạo điều kiện tốt cho sự di chuyển của RNA vi rút vào trong nhân tế bào Riêng với vi rút cúm

A, đoạn RNA số 2 mã hoá cho hai protein: PB1có kích thước 757 axit amin

và một protein có kích thước nhỏ PB1-F2 87 axit amin có chức năng thúc đẩy quá trình chết của tế bào chủ mà không tìm thấy dạng tương tự trong hệ gen của vi rút cúm B và C [74], [127]

1.1.2 Quá trình nhân lên của vi rút cúm A

Quá trình nhân lên của vi rút cúm A có thể chia thành các giai đoạn sau: (1) gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ, (2) phiên mã và sao chép genome

vi rút, (3) giải phóng vRNP ra khỏi nhân và (4) quá trình đóng gói, nảy chồi

và giải phóng vi rút thế hệ mới [57], [62], [90]

1.1.2.1 Quá trình gắn màng và xâm nhập vào tế bào chủ

Gai HA của vi rút sẽ phát hiện và bám gắn vào thụ cảm thể tương ứng của tế bào chủ Phân tử HA tiền thân, HA0 được tạo thành từ hai tiểu đơn vị: HA1, có vùng gắn thụ cảm thể và HA2 có peptide dung hợp; HA1 và HA2 liên kết với nhau bằng liên kết disulfua Thụ cảm thể của vi rút cúm có cấu trúc axitsialic liên kết với đường galactose của glycoprotein/glycolipid của tế bào chủ bằng liên kết alpha 2, 3 (vi rút cúm người) hoặc alpha 2, 6 (vi rút cúm gia cầm) Hai dạng liên kết này rất quan trọng đối với tính đặc hiệu của liên kết HA – thụ cảm thể ở những loài khác nhau Sau quá trình gắn bám vào màng tế bào chủ, vi rút sẽ xâm nhập vào tế bào bằng cách tạo bọng Trong endosome, ở điều kiện pH thấp (khoảng 5,5), phân tử HA0 sẽ bị thay đổi cấu trúc giúp bộc lộ peptide dung hợp HA2 Peptide dung hợp gắn vào màng endosome khiến cho màng vi rút và màng endosome hoà vào nhau Môi trường axit trong endosome không những tạo điều kiện để quá trình dung hợp diễn ra mà còn tác động đến kênh ion M2 Ion H+ sẽ đi vào vi rút qua kênh M2, làm axit hoá lõi vi rút, giải phóng vRNP khỏi M1, các phân tử vRNP tự

do này được giải phóng vào tế bào chất của tế bào chủ [28]

Các protein cấu thành vRNP là NP, PA, PB1 và PB2 đồng thời là các tín hiệu định vị nhân [81] Các tín hiệu định vị nhân này của vi rút liên kết với các thành phần của hệ thống xâm nhập vào nhân tế bào và do đó vRNP đi vào nhân tế bào chủ

1.1.2.2 Quá trình phiên mã vào sao chép ARN vi rút (vRNA)

Khác với nhiều vi rút khác có hệ gen là sợi ARN âm, quá trình phiên mã ARN vi rút cúm diễn ra trong nhân Người ta nhận thấy rằng trong quá trình phiên mã của vi rút cúm có cơ chế được gọi là cap-snatching: PB2 của vi rút

có hoạt tính endonuclease sẽ cắt các sợi ARN đã được gắn mũ methylguanosine) của tế bào chủ ở một gốc purin cách đầu tận cùng 5’ 10 –

(7-13 nucleotide, đoạn ARN này sẽ được sử dụng để khởi đầu quá trình phiên

mã Quá trình khởi đầu, kéo dài, kết thúc và gắn polyA đều được xúc tác bởi phức hệ protein PB2, PB1, PA và NP Các sợi mRNA có chiều dài ngắn hơn các đoạn vRNA, mRNA sau khi được tổng hợp trong nhân tế bào sẽ được vận chuyển ra tế bào chất để tổng hợp các protein của vi rút Các protein màng

HA, NA, M1 và M2 sẽ được vận chuyển đến màng sinh chất của tế bào trong khi các protein NP, PA, PB1 và PB2 được chuyển vào trong nhân để cùng với các vRNA(-) tạo thành các vRNP(-) mới [90]

1.1.2.3 Giải phóng vRNP ra khỏi nhân tế bào

Trong nhân tế bào, chỉ các vRNP (-) được vận chuyển qua lỗ màng nhân

ra tế bào chất thông qua con đường vận chuyển phụ thuộc CRM1 Đầu tận cùng C của protein M1 liên kết với vRNP, đầu tận cùng N của M1 có một NLS và liên kết với NS2, NS2 liên kết với CRM1 Phức hệ gồm M1, vRNP(-)

và NS2 sẽ được vận chuyển từ nhân ra tế bào chất nhờ khả năng liên kết của NS2 với CRM1

1.1.2.4 Đóng gói, nảy chồi và giải phóng vi rút thế hệ mới

Vi rút cúm sử dụng màng sinh chất của tế bào chủ để tạo thành các hạt vi rút hoàn chỉnh rồi rời khỏi tế bào và tiếp tục gây nhiễm các tế bào lân cận Quá trình đóng gói vi rút diễn ra tại vị trí màng sinh chất có các protein HA,

NA và M2 của vi rút

Người ta đưa ra hai mô hình giả thuyết cho quá trình đóng gói các phân đoạn ARN vi rút: mô hình đóng gói ngẫu nhiên và mô hình đóng gói đặc hiệu Theo mô hình đóng gói ngẫu nhiên, các đoạn vRNA sẽ được đóng gói một cách ngẫu nhiên bên trong virion Mô hình đóng gói đặc hiệu dựa trên cơ sở các tín hiệu đóng gói vi rút được xác định là các vùng mã hoá và không mã

hoá ở đầu 5’ và 3’ trên một số đoạn vRNA và do đó quá trình đóng gói vi rút

là đặc hiệu Protein M1 đóng vai trò quan trọng trong quá trình đóng gói và nảy chồi hạt vi rút Hạt vi rút chỉ đƣợc giải phóng ra ngoài màng sinh chất tế bào chủ khi liên kết giữa acid sialic và glycoprotein/glycolipid đƣợc cắt đứt Quá trình này đƣợc thực hiện nhờ neuraminidase trên bề mặt vi rút

Hình 1.4 Chu trình nhân lên của vi rút cúm

1.2.1.2 Diễn biến đại dịch cúm

 Dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mexico

Từ 17 đến 26 tháng 4, có 1455 trường hợp nghi ngờ nhiễm cúm với các triệu chứng viêm phổi nặng và 84 trường hợp tử vong được báo cáo Sự lưu hành của bệnh được xác nhận trong 24/32 bang thuộc Mexico và tập trung chủ yếu tại quận Federal, Mexico và bang San Luis de Potosi Bệnh nhân chủ yếu là những thanh niên trẻ và khoẻ mạnh, rất ít trường hợp ghi nhận tại trẻ

em dưới 3 tuổi và trên 60 tuổi Những báo cáo về các trường hợp nhập viện vì viêm phổi nặng và tử vong tại Mexico đã cảnh báo cho các cán bộ y tế địa phương về sự xuất hiện một tỷ lệ bất thường của bệnh viêm đường hô hấp và tại thời điểm đó đại dịch cúm chưa được đề cập [25]

Bảng 1.2 Diễn biến dịch liên quan đến phát hiện, kiểm soát hoạt động

của trường học tại Mexico [25]

5/4 - 8/4/2009 Kỳ nghỉ xuân của các học sinh (khoảng 34 triệu học sinh)

từ cấp 1 đến đại học)

12/4/2009

Mexico thông báo về dịch bệnh viêm đường hô hấp cấp cho

Tổ chức Y tế Thế giới khu vực Mỹ La tinh (Pan-American Heath Organization – PAHO)

17/4/2009 Bộ Y tế cảnh báo dịch

23/4/2009

Cơ quan Y tế công cộng Canada xác nhận trường hợp nhiễm

vi rút cúm mới A/H1N1có nguồn gốc từ lợn (novel swine –origin A/H1N1)

24/4-11/5/2009

Đóng cửa toàn bộ các cấp trường học tại các khu vực đô thị, quận của thành phố Mexico Rạp chiếu phim, nhà hàng, sân vận động, nhà thờ cũng tạm thời đóng cửa tại khu vực đô thị của thành phố Mexico

27/4-11/5/2009 Trường học đóng cửa trên toàn quốc

3/7/2009 Bắt đầu kỳ nghỉ hè

Thêm vào đó các hoạt động can thiệp đƣợc bổ sung tại thành phố Mexico và khu vực xung quanh bao gồm đóng cửa các nhà hàng, rạp chiếu phim và hủy bỏ các buổi họp công cộng lớn

Hình 1.5 Diễn biến dịch tại khu vực các bang thuộc Bắc, Trung và

Tây nam Mexico từ 1/4/2009 – 31/12/2009

15/4/2009, CDC- Atlanta, Mỹ nhận được mẫu bệnh phẩm này và xác định vi rút cúm A/H1N1 mới có nguồn gốc từ lợn là tác nhân gây bệnh cho bệnh nhân tại California Ngay lập tức, CDC thông báo tới Cơ quan Y tế công cộng California và tiến hành điều tra với sự tham gia của chuyên gia thuộc Y tế công cộng và cơ quan thú y khu vực [19]

Ngày 28/3/2009 tại bang California một bé gái 9 tuổi (không có liên quan dịch tễ với trường hợp trước) xuất hiện ho, sốt Hai ngày sau, bé được đưa đến một phòng khám ngoại trú là thành viên của chương trình giám sát cúm thường xuyên của Mỹ Bệnh nhân được điều trị bằng Amoxicillin –clavulanate và đã phục hồi hoàn toàn Mẫu bệnh phẩm dịch mũi họng được gửi đến Trung tâm nghiên cứu Hải quân tại San Diego cũng được xác định dương tính với vi rút cúm A nhưng không định týp được Bệnh phẩm được gửi đến CDC-Atlanta, Mỹ ngày 17/4/2009 và được khẳng định căn nguyên là

vi rút cúm mới A/H1N1 có nguồn gốc từ lợn [17], [19]

Ngày 17/4/2009, thông tin về 2 vi rút cúm mới A/H1N1 có nguồn gốc từ lợn gây bệnh cho người tại Mỹ được thông báo tới TCYTTG [31]

Hình 1.6 Phân bố dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại Mỹ (7/5/2009) [31]

(Nguồn: DOI: 10.1056/NEJMoa0903810)

Đến 6/5/2009, có tổng số 1.487 trường hợp được khẳng định nhiễm vi rút cúm mới A(H1N1)pdm09 tại 43 bang của Mỹ, trong đó 35 trường hợp phải nhập viện và 2 trường hợp tử vong Bệnh nhân mắc bệnh được ghi nhận

từ 3 tháng tuổi đến 81 tuổi (tuổi trung bình là 15) [31]

 Dịch cúm A(H1N1)pdm09 tại một số nước khác

Từ 26/4 đến 6/5/2009, TCYTTG báo cáo có 309 trường hợp nhiễm cúm được khẳng định tại 21 quốc gia trên toàn thế giới ngoài Mỹ và Mexico [111]:

- Trong số 178 trường hợp được điều tra có 145 (82%) trường hợp có yếu tố

dịch tễ liên quan đến việc qua lại Mexico trong thời gian gần đó

- Các trường hợp không có yếu tố dịch tễ đến Mexico, có 17 trường hợp

(52%) có tiếp xúc với những người đi du lịch về từ Mexico

- Các nước Canada, Đức, Tây Ban Nha, Anh có báo cáo khẳng định về sự lây

nhiễm từ người - người chu kỳ thứ 2 (không có tiếp xúc hoặc đi qua vùng dịch)

Các trường hợp nhiễm vi rút cúm mới A/H1N1 tại các quốc gia này ở độ tuổi trung bình là 27 (phân bố từ 2-62 tuổi) Phần lớn các trường hợp nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 tại các quốc gia này không diễn biến phức tạp, không

tử vong, chỉ có 4 trường hợp phải nhập viện [17] Đến ngày 31/5/2009 có 22

quốc gia của châu Mỹ thông báo có sự xuất hiện của cúm mới A(H1N1)pdm09 với tổng số mắc là 16.018 người và 115 trường hợp tử vong

nhiều so với số ca ghi nhận được nhưng tỷ lệ chết/mắc do cúm A(H1N1)pdm09 sẽ không vượt quá 0,35% [34]

Hình 1.7 Các quốc gia chịu ảnh hưởng của đại dịch và sự phân bố các

trường hợp tử vong [121]

So với các đại dịch cúm trước đây, số tử vong ghi nhận trong đại dịch cúm A(H1N1)pdm09này ít hơn nhiều Có nhiều yếu tố dẫn đến sự khác biệt này là do:

− Những hiểu biết về bệnh cúm và các đại dịch cúm trong thế kỷ XX đã cung cấp những thông tin khoa học giúp cho việc xây dựng kế hoạch phòng

chống đại dịch cúm hiệu quả hơn

− Thế giới đã có kinh nghiệm, chuẩn bị kế hoạch đáp ứng với đại dịch cúm

qua dịch SARS và cúm A/H5N1 trong các năm trước đó

− Các hướng dẫn về phòng chống đại dịch cúm được ban hành kịp thời đã giúp các quốc gia xây dựng kế hoạch phòng chống đại dịch cúm hiệu quả

hơn

− Độc lực của vi rút cúm A(H1N1)pdm09: Cho đến nay, vi rút chưa đột biến

để trở thành dạng có độc lực cao và chưa có hiện tượng kháng oseltamivir nên các trường hợp bệnh chủ yếu ở thể nhẹ, đáp ứng tốt với thuốc kháng vi rút

− Cơ sở hạ tầng, hệ thống y tế và điều kiện kinh tế, văn hóa, xã hội của các

quốc gia đã cải thiện hơn trước giúp cho chất lượng các dịch vụ y tế, chất

lượng cuộc sống được cải thiện hơn trước

1.2.2 Phản ứng của TCYTTG trước diễn biến dịch cúm A(H1N1)pdm09 có

nguồn gốc từ lợn

Phối hợp chặt chẽ với CDC-Atlanta (Mỹ), cơ quan Y tế công cộng

Canada (PHAC), Bộ Y tế Mexico, TCYTTG theo dõi chặt chẽ các diễn biến

của dịch cúm mới A/H1N1 có nguồn gốc từ lợn và đưa ra các cảnh báo kịp

4-25/4: TCYTTG thông báo về nguy cơ bùng phát dịch trên toàn cầu

5-26/4: TCYTTG xác định mức cảnh báo đại dịch tại mức độ 3

6- 26/4: Mỹ tuyên bố tình trạng khẩn cấp về sức khỏe cộng đồng

7- 27/4: TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 4

8- 29/4 : TCYTTG tăng mức cảnh báo đại dịch lên mức độ 5

Ngày 27 tháng 4 năm 2009, TCYTTG cảnh báo đại dịch cúm ở mức độ 4

vì đã xác định được dấu hiệu bệnh lây từ người sang người [112] Hai ngày sau đó, TCYTTG đã nâng mức cảnh báo đại dịch lên cấp độ 5 vì dịch đã xuất hiện trên một quy mô lớn hơn nhưng sự lây truyền từ người sang người vẫn ở giới hạn ít nhất hai nước trong một khu vực [110] Ngày 11 tháng 6 năm

2009, lần đầu tiên sau 41 năm, TCYTTG đã công bố đại dịch cúm ở cấp độ 6

do sự lan truyền được xác định ở cộng đồng tại Bắc Mỹ, Đông Á và Châu Đại dương Đại dịch cũng được xác định là ở giai đoạn đầu với tính nghiêm trọng

ở mức độ trung bình [114] Các công tác nỗ lực của TCYTTG trong phòng chống và hạn chế ảnh hưởng của đại dịch cúm được tiến hành với hàng loạt các hướng dẫn trong chẩn đoán sớm, cách ly, giám sát và điều trị nhiễm cúm A(H1N1)pdm09 được ấn hành Vắc xin cúm A(H1N1)pdm09 cũng được tiến hành nghiên cứu và phát triển, chỉ sau 6 tháng kể từ khi xuất hiện đại dịch đến cuối tháng 9/2009 vắc xin bất hoạt đã được áp dụng tại một số nước trên thế giới như Australia (Panvax H1N1vaccine)

Trong năm 2009- 2010, một số nước đã chứng kiến làn sóng thứ 2 và thứ

3 của đại dịch này trước khi đại dịch thoái lui Đến ngày 10 tháng 8 năm

2010, TCYTTG chính thức công bố đại dịch cúm A(H1N1)pdm09 đã chuyển sang giai đoạn hậu đại dịch [119]

1.2.3 Tình hình cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam

1.2.3.1 Diễn biến cúm A(H1N1)pdm09

Việt Nam là nước thứ 54 thông báo các trường hợp nhiễm cúm A(H1N1)pdm09, ca nhiễm đầu tiên tại Việt Nam ngày 31/5/2009, người bệnh

là một thanh niên 23 tuổi du học tại Mỹ về Việt Nam trên chuyến bay UA869 quá cảnh qua Hồng Kông về cửa khẩu sân bay Tân Sơn Nhất ngày 26/04/2009 [2] Một tuần sau, cúm A(H1N1)pdm09 xuất hiện ca đầu tiên tại khu vực miền Bắc là nam giới, 34 tuổi khởi phát ngày 8/6/2009 tại Hà Nội, du

lịch từ Mỹ qua cửa khẩu sân bay Nội Bài ngày 10/6/2009 [1] Sau đó liên tục phát hiện các ca bệnh mới nhập cảnh từ Mỹ, Hàn Quốc có tiền sử tiếp xúc gần với bệnh nhân trước đó và xuất hiện các chùm ca bệnh trên diện rộng, ngày 11/06/2009 TCYTTG chính thức thông báo cúm A(H1N1)pdm09 ở cấp

độ 6 Sau 7 tuần khống chế thành công dịch ở các ca bệnh xâm nhập rải rác từ các nước và vùng có dịch nhập cảnh vào Việt Nam, từ giữa tháng 7/2009 dịch bắt đầu có dấu hiệu lan ra cộng đồng, tăng số người mắc tại các nơi tập trung đông người như trường học, cơ quan công sở và nơi công cộng [1] Tính đến ngày 7 tháng 8 năm 2009, Việt Nam ghi nhận thêm 35 trường hợp dương tính với cúm A(H1N1)pdm09 (Miền Nam: 18 ca, miền Bắc: 08 ca, miền Trung: 04

ca, Tây Nguyên: 05 ca) [3]

1.2.3.2 Tỉ lệ mắc và tử vong

Cho đến trung tuần tháng 9 năm 2009, số ca bệnh cúm A(H1N1)pdm09 tăng lên rất nhanh Ngày 3 tháng 8 năm 2009 Việt Nam ghi nhận ca tử vong đầu tiên do cúm A(H1N1)pdm09 Đến tháng 6 năm 2011, cả nước ghi nhận

66 trường hợp tử vong có liên quan đến nhiễm cúm A(H1N1)pdm09, tuy nhiên số ca bệnh ghi nhận được trên thực tế có thể sẽ cao hơn nhiều lần, tính

từ đầu vụ dịch cho đến trung tuần tháng 9/2009, tỷ lệ chết/mắc do cúm A(H1N1)pdm09 tại Việt Nam là 0,17% Vào thời điểm này các ca bệnh được giám sát và xét nghiệm chặt chẽ nên số ca bệnh ghi nhận được phản ánh số mắc trong cộng đồng [4]

cấu trúc bộ gen hoàn toàn mới gồm có: 6 phân đoạn gen (PB2, PB1, PA, HA,

NP và NS) tương tự với vi rút cúm lưu hành trên lợn năm 1998 tại Bắc Mỹ Phân đoạn gen NA và M rất giống gen của vi rút cúm lưu hành trên lợn tại châu Âu-Á (H1N1 và H3N2)

Sự sắp xếp và tích hợp gen của vi rút cúm mới này chưa từng phát hiện tại châu Mỹ cũng như trên toàn thế giới trước đây Thêm vào đó, bộ gen của

vi rút cúm lợn đã biết lưu hành tại khu vực bắc Mỹ năm 1998 được xác định

là trao đổi và tích hợp bậc 3 (triple-reassortment) do nó bao gồm: Các phân đoạn gen có nguồn gốc từ lợn cổ điển: HA, NA, M, NS Các phân đoạn gen

có nguồn gốc từ cúm gia cầm dòng Bắc Mỹ: PB2, PA Phân đoạn gen cúm người A/H3N2

Hình 1.9 Cấu trúc bộ gen của vi rút cúm A(H1N1)pdm09 [31]

Nguồn: www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19525932

Kết quả phân tích trên cho thấy vi rút A(H1N1)pdm09 là vi rút cúm có trao đổi và tích hợp bậc 4 Sự tham gia của các gen M và NA từ các dòng vi rút cúm lợn Á-Âu đã tạo ra một phân týp vi rút cúm A hoàn toàn mới, thể hiện sự trao đổi giữa các loài và đã đáp ứng đầy đủ về vi rút học trong cơ chế gây đại dịch cúm ở người Tuy nhiên vi rút cúm này vẫn có xuất phát điểm là

sự tiến hóa của vi rút cúm đại dịch H1N1/1918 [31], [42], [43]

Trong vòng 91 năm kể từ đại dịch 1918, vi rút cúm A/H1N1 luôn luôn lưu hành trên gia cầm, lợn và người Sự lây truyền chéo giữa các loài đã xảy

ra và kết quả là xảy ra một số vụ dịch nhỏ, lẻ tẻ Tuy nhiên sự vắng bóng của

vi rút cúm A/H1N1 trên người năm 1957 cũng được ghi nhận và có thể lý giải

về sự cạnh tranh của vi rút cúm gây đại dịch H2N2 Đến năm 1977, vi rút này lại tái nổi trội và không có sự liên quan đến các vi rút cúm A ở các loài khác Đến năm 2009, vi rút cúm A/H1N1 mới đã xuất hiện và gây thành đại dịch cúm đầu tiên trong thế kỷ 21 [43], [80]

1.2.4.2 Chuẩn hóa thuật ngữ của vi rút cúm gây đại dịch năm 2009

Sau hơn 2 năm sau đại dịch cúm 2009, vi rút căn nguyên của đại dịch có rất nhiều tên gọi được sử dụng Tên thông dụng được phổ biến trong truyền thông và phần lớn công chúng là cúm lợn “swine flu” Sử dụng thuật ngữ đó

đã gây ra sự tức giận của nông dân và không đảm bảo sự đặc hiệu, ngoài ra có rất nhiều các vi rút cúm lợn khác đang lưu hành và luôn có khả năng trở thành

vi rút mới gây nguy hiểm tiếp theo Nếu sử dụng thuật ngữ A/H1N1 đơn giản

sẽ không thể phân biệt được với các vi rút cúm mùa A/H1N1 trước đó Thuật ngữ cúm A/H1N1 mới “novel H1N1” hoặc A/H1N1/09 cũng không đảm bảo

sự rõ ràng hơn khi nói đến vi rút cúm gây đại dịch năm 2009

Khi TCYTTG thông báo kết thúc đại dịch, vi rút cúm A/H1N1 gây đại dịch năm 2009 đã trở thành một vi rút cúm mùa tiếp tục lưu hành cùng các vi rút cúm mùa khác (A/H3N2 và B) Tuy nhiên, danh pháp của vi rút này vẫn chưa được chuẩn hóa dẫn đến việc sử dụng rất nhiều tên cho cùng một vi rút

Để giảm thiểu sự lẫn lộn trong khoa học, truyền thông và khẳng định sự khác biệt với các vi rút cúm mùa A/H1N1 lưu hành trước đại dịch cúm A/H1N1 năm 2009, ngày 26/9/2011 hội đồng tư vấn kỹ thuật cho thành phần vắc xin Nam bán cầu năm 2012 của TCYTTG đã thống nhất đặt tên cho vi rút cúm

này là A(H1N1)pdm09 [65]

1.3 Các phương pháp chẩn đoán và nghiên cứu nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 trong phòng thí nghiệm

Ngay sau khi xuất hiện và gây dịch tại Mexico tháng 3/2009, các phương pháp xét nghiệm khẳng định nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 đã được phát triển dựa trên các phương pháp đã được áp dụng phổ biến như là RT-PCR, realtime RT-PCR, phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu, phân lập vi rút, giải

trình tự chuỗi nucleotide…

1.3.1 Phân lập vi rút

Phân lập vi rút được xác định là “tiêu chuẩn vàng” trong chẩn đoán

nhiễm vi rút cúm Vi rút phân lập trong vụ dịch được sử dụng để nghiên cứu

về các đặc điểm sinh học, đặc điểm di truyền, đặc tính kháng nguyên, thông qua các thông tin đó cho phép dự báo được sự lưu hành của vi rút cúm trong giai đoạn tiếp theo và góp phần để lựa chọn thành phần vắc xin cúm hàng năm Đối vi rút cúm mùa (cúm A/H3N2, A/H1N1, B…) việc phân lập vi rút được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn cấp độ 2 Đối với vi rút cúm gia cầm (cúm A/H5N1, H9N2…) là vi rút nguy hiểm mức độ 3 (theo phân loại của TCYTTG) nên việc phân lập vi rút yêu cầu được tiến hành trong phòng thí nghiệm an toàn sinh học cấp độ 3 Hiện nay, có 2 hệ thống phân lập được TCYTTG khuyến cáo là phân lập trên trứng gà có phôi đạt tiêu chuẩn (Specific Pathogenic Free – SPF) 10-11 ngày tuổi và trên dòng tế bào thận

chó thường trực (Mardin- Darby Canine Kidney cells – MDCK)

Nguyên lý: Vi rút cúm có thể hồi phục và khuếch đại trên tế bào cảm

nhiễm và trứng gà có phôi, trong điều kiện nuôi cấy phù hợp, vì vậy phải đảm bảo về yêu cầu an toàn sinh học

* Phân lập vi rút trên trứng: Vi rút cúm được phân lập đầu tiên trên

trứng gà năm 1936 Sau khi cấy vi rút vào khoang niệu hoặc khoang ối, trứng được ủ ở 330

C trong vòng 48h Dịch niệu hoặc dịch ối thu được sau khi gặt

trứng được kiểm tra hiệu giá bằng thử nghiệm ngưng kết hồng cầu gà 0,5% hoặc hồng cầu ngựa 1% [20] Một số vi rút cúm A có thể phân lập trực tiếp bằng việc gây nhiễm vào khoang niệu nhưng có những chủng vi rút cúm A phải gây nhiễm trên dịch ối sau đó mới thích ứng lên khoang niệu trứng gà

Vi rút cúm A/H5N1 thường gây chết trứng sau 24h hoặc 48h gây nhiễm bệnh phẩm

* Phân lập trên tế bào cảm thụ MDCK [85]: Vi rút cúm có thể nhân lên

trên các dòng tế bào tiên phát như tế bào thận khỉ, thận chuột đất, thận bê hoặc trên dòng tế bào thường trực như MDCK, Vero MDCK là dòng tế bào thích hợp nhất để phân lập vi rút cúm trên người Khi phân lập vi rút trên các dòng tế bào thường trực phải bổ sung trypsin (TPCK) – protease ngoại sinh Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng trypsin TPCK có ảnh hưởng tới sự phân tách phân tử HA thành HA1 và HA2, đóng vai trò quan trọng trong việc xâm nhập của vi rút vào tế bào cảm thụ Tuy nhiên, đối với các dòng tế bào tiên phát thì protease là yếu tố nội sinh, vì vậy vi rút cúm vẫn có khả năng nhân lên mà

không cần phải bổ sung trypsin trong quá trình nuôi cấy

Ưu điểm: Phân lập và nuôi cấy vi rút cho phép đánh giá được đặc điểm

vi rút học, đặc tính kháng nguyên, khả năng tiềm tàng của sự biến chủng vi rút Phân lập vi rút cúm trên tế bào là đơn giản, thuận tiện, có khả năng phân lập được một số lượng lớn mẫu bệnh phẩm Tuy nhiên, tùy theo mục đích nghiên cứu để lựa chọn phương pháp phân lập Phân lập trên trứng vẫn là lựa chọn tối ưu cho các nhà sản xuất vắc xin trên thế giới vì nó có khả năng khuếch đại một lượng lớn vi rút với hiệu giá cao và vắc xin cúm hiện tại đang được sản xuất trên trứng gà có phôi [48], [86] Tuy nhiên, việc sản xuất vắc

xin trên tế bào MDCK và Vero cũng đang được nghiên cứu [13], [64]

Nhược điểm: Tỉ lệ phân lập phụ thuộc nhiều chất lượng bệnh phẩm, thời

gian lấy mẫu, bảo quản và môi trường nuôi cấy

Vi rút sau khi phân lập được định týp (xác định đặc tính kháng nguyên) bằng phản ứng ngăn ngưng kết hồng cầu

1.3.2 Phương pháp phát hiện vật liệu di truyền

Quy trình xét nghiệm nhiễm vi rút A(H1N1)pdm09 dựa trên xét nghiệm phát hiện vật liệu di truyền bằng phương pháp sinh học phân tử là phản ứng chuỗi polymerase (PCR) hoặc phản ứng chuỗi polymerase thời gian thực (realtime RT-PCR) Qui trình xét nghiệm này được áp dụng cho việc xác định cúm B, cúm A và các phân týp cúm A trong mẫu bệnh phẩm hoặc dịch nuôi cấy Hiện nay, PCR đã trở thành một công cụ được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực của y sinh học Các quy trình RT- PCR hoặc realtime RT-PCR chẩn đoán nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09 được phát triển bởi các PTN chuẩn thức của TCYTTG: CDC, Atlanta; NIID, Nhật bản; VIIRL, Australia

và được giới thiệu trong “Hướng dẫn chẩn đoán nhiễm vi rút cúm A(H1N1)pdm09” của TCYYTG [16]

1.3.2.1 Phản ứng di truyền phân tử (RT-PCR)

Nguyên lý: Phản ứng sao chép ngược chuỗi polymerase RT-PCR

(Reverse transcriptase - Polymerase Chain Reaction) đã được áp dụng và phát triển cho phần lớn các vi rút có vật liệu di truyền là ARN Phương pháp này

có khả năng xác định nhanh sự nhiễm vi rút, thông qua xác định vật liệu di truyền của vi rút bằng khả năng phát hiện đoạn ARN đặc hiệu của vi rút cúm

trong mẫu bệnh phẩm lâm sàng

Ưu điểm: Là phương pháp nhanh nhạy, có độ đặc hiệu cao và chính xác

khi được kiểm soát tốt

Nhược điểm: Phương pháp RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và sinh phẩm

với giá thành tương đối cao và cần kỹ thuật thực hiện thành thạo, hơn nữa, các dụng cụ và nơi thực hiện xét nghiệm phải tách biệt theo từng giai đoạn của

phản ứng RT-PCR để tránh nhiễm chéo tạo dương tính giả

Cho tới nay, RT-PCR vẫn được coi là phương pháp tối ưu để phát hiện

vi rút cúm, là một trong hai tiêu chuẩn trong chẩn đoán phòng thí nghiệm để khẳng định các trường hợp nhiễm cúm theo qui định của TCYTTG

Trong trường hợp kết quả của phương pháp RT-PCR không cho kết quả

rõ ràng hoặc trong trường hợp cần khẳng định chính xác kết quả, PTN sẽ xét nghiệm bằng phương pháp Realtime RT-PCR

1.3.2.2 Phương pháp Real time RT-PCR

Nguyên lý: Khác với RT-PCR thông thường, phương pháp này sử dụng

một mẫu dò phát huỳnh quang (probe) có khả năng phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu trong quá trình tổng hợp sản phẩm Real time RT-PCR sử dụng cặp mồi và chất hóa học phát huỳnh quang hoặc probe có đánh dấu huỳnh quang (SYBR Green I, molecular beacon, hybridization probe và Taqman probe) cho phép phát hiện chính xác số bản sao ADN của vi rút từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng theo thời gian thật (real-time) [44], [54], [70] Phương pháp Real time RT-PCR được ứng dụng để định lượng ADN, ARN, chẩn đoán các vi rút gây bệnh như vi rút cúm, viêm gan…[37], [38] Phương pháp Real time RT-PCR không cần điện di sản phẩm như phương pháp RT-PCR thông thường nên phương pháp Real time RT-PCR được mô tả như một hệ thống “đóng”

Ưu điểm: Phương pháp này rất đặc hiệu và có độ tin cậy cao Phương

pháp nhanh, nhạy, có độ chính xác giảm thiểu nguy cơ tạp nhiễm

Nhược điểm: Phương pháp Real time RT-PCR yêu cầu trang thiết bị và

sinh phẩm với giá thành tương đối cao Do phương pháp có độ nhạy cao nên cần có kỹ năng thao tác chuẩn xác, tránh nhiễm chéo trong quá trình thực hiện

Nếu trong trường hợp phương pháp Realtime RT- PCR vẫn cho kết quả không rõ thì mẫu bệnh phẩm này sẽ được lặp lại từ bước tách chiết mẫu và có thể chạy song song hai phương pháp RT-PCR và Realtime PCR; hoặc PTN có

thể yêu cầu lấy lại bệnh phẩm và xét nghiệm theo thường quy của phòng từ bước nhận bệnh phẩm

1.3.2.3 Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng phiên mã ngược (RT-LAMP)

Nguyên lý: Phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt qua trung gian vòng

phiên mã ngược RT-LAMP (Reverse transcriptase - Loop - mediated isothermal amplification) là một phương pháp mới để khuếch đại ADN trong điều kiện đẳng nhiệt, do đó loại bỏ được sự thay đổi các chu kỳ nhiệt trong phương pháp RT-PCR thông thường Phản ứng khuếch đại ADN thực hiện tại

630C trong 60 phút và cố định sản phẩm tại 800C trong 2 phút trong hệ thống máy Loopamp-real time LA-200 (Kyoto – Nhật Bản) Vì vậy, thời gian tiến hành phản ứng sẽ được rút ngắn [78], [83] Trong một phản ứng đã sử dụng 6 loại mồi bao gồm 2 mồi trong, 2 mồi ngoài và 2 mồi dạng vòng đã làm tăng

độ nhạy của phản ứng

Ưu điểm: Phương pháp này có thể phát hiện vi rút cúm trong giai đoạn

sớm của bệnh, được thực hiện trong khoảng thời gian ngắn (30 phút - 1 giờ)

là có thể có kết quả

Nhược điểm: Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp này cần được

đánh giá thông qua một số lượng lớn mẫu thu thập ở bệnh nhân nhiễm cúm Hiện nay, phương pháp này cũng đang được phát triển để chẩn đoán

nhanh một số bệnh truyền nhiễm khác do vi rút như vi rút SARS-CoV, vi rút

viêm gan B, vi rút viêm não Nhật Bản [99]