bài báo cáo hoàn chỉnh kỹ thuật PCR

PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN đặc trưng mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men.bài cáo được làm bằng file powerpoint thuyết trình về kỹ thuật PCR hoàn chỉnh đầy đủ mà chi tiết, súc tích

1. Lịch sử

3. PCR cải tiến.

 PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn ADN đặc trưng mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men.

 Kỹ thuật này do KARL MULLIS phát minh vào năm 1985 Ông đạt giải nobel hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này Mullis

đã phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA Polymerase 28/12/1944

 Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở phản ứng sinh tổng hợp ADN Là phản ứng gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba bước:

Target Sequence Target Sequence

Target Sequence

Target Sequence

Primer 1 Primer 2

5’ 3’

5’ 5’

3’

5’

3’

3’

Target Sequen ce

Target Sequen ce

Primer 1 Primer 2

5’ 3’

5’ 5’

Target Sequence

Target Sequence

No of No Amplicon Cycles Copies of Target

 Kết thúc quá trình PCR, các đoạn DNA được nhân bản lên nhiều lần (gọi là các đơn vị khuếch đại theo hàm mũ)

 Dùng phương pháp điện di để kiểm tra kích thước cũng như độ tinh sạch, đồng nhất của DNA đã khuếch đại

 Sản phẩm của PCR có thể dùng để tạo dòng và biểu hiện vào trong vector

 DNA polymerase: Taq polymerase

 Các nucleotide môi trường: dNTPs

 Trong thực nghiệm, kích thước của các đoạn cần

khuếch đại có giới hạn

 Sự ngoại nhiễm là vấn đề đặt ra lớn nhất đối với PCR

 Sự sai sót do Taq Polymerase gây ra

 Mồi: một trình tự DNA hay RNA ngắn, bắt cặp với một mạch

khuôn DNA và có mang một đầu 3’OH tự do giúp DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới.

 Mồi là một đoạn Oligonucleotide được thiết kế theo yêu cầu

từ nhiều nguồn thương mại khác nhau.

 Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất trong phương pháp PCR

 Cách xác định trình tự mồi: từ 2 nguồn

• Chuỗi amino acid.

• Chuỗi ADN đã xác định.

Các yêu cầu của mồi:

 Tính đặc hiệu, đặc trưng (Specificity)

 Tính ổn định (Stability)

 Tính tương thích (Compatibility)

 Lưu ý khi thiết kế:

 Nhiệt độ nóng chảy (Tm)

 Chiều dài mồi

 Quá ngắn không đặc hiệu

 Quá dài giảm hiệu quả lai

 Thường từ 18-25

DNA polymerase

 Phải phù hợp để đạt hiệu quả cao nhất Trước đây, DNA polymerase: đoạn Klenow được sử dụng, nhưng nó không chịu được nhiệt độ cao và đòi hỏi thêm vào enzyme mới cho mỗi pha kéo dài của chu kỳ nhiệt → kém hiệu quả và số lượng enzyme cần nhiều

 Enzyme chịu nhiệt: phản ứng PCR đặc hiệu hơn

 Tùy mục đích sử dụng:

Enzyme chịu nhiệt : Thermus thermophilus (rTth), Thermus

lithoralis (Vent), Pyrococcus furiosus (Pfu)

 Enzyme có hoạt tính sửa sai (proofreading): Ultima, Vent, Deep Vent, Pfu, Nhờ vậy mà người dùng có rất nhiều chọn lựa

Taq polymerase từ Thermus aquaticus được dùng

nhiều

 RT-PCR (reverse transcription-PCR) là một phương pháp nhạy cảm cho phép nghiên cứu các mRNA có hàm lượng thấp.

 RT-PCR bao gồm hai bước chính:

 Phiên mã ngược(RT), trong đó RNA được phiên mã ngược →cDNA bằng cách sử dụng reverse transcriptase (hoạt tính polymerase

5’→3’)

 Phản ứng PCR lần hai khuếch đại cDNA

Target Sequen ce

Primer

5’

3’ 5’

3’

Target RNA S equence

Primer

5’

3’ 5’

3’

rTth DNA Polymerase

Target RNA S equence

cDNA

Target RNA Sequence

cDNA

PCR Step 1 - Denaturation by Heat

PCR Step 2 - Annealing of Primer to cDNA

PCR Step 3 - rTth DNA Polymerase Catalyses Primer Extension

End of 1 st PCR Cycle - Yields a Double-Stranded DNA Copy (Amplicon) of the Target Sequence

cDNA Primer

 Tăng độ nhạy và độ chính xác của phản ứng PCR.

 Sử dụng 02 cặp mồi

 Cặp mồi ngoài  Sản phẩm PCR lần 1

 Cặp mồi trong  sản phẩm PCR lần 2 ngắn hơn

 Khuếch đại trình tự kế cận với trình tự DNA đã biết trước.

 Thiết kế mồi dựa trên trình

tự DNA đã biết trước

 Dùng RE cắt và DNA

ligase nối lại

 Dựa trên kỹ thuật PCR nhằm đánh giá tính đa hình của các đoạn DNA được nhân bản ngẫu nhiên

 Sử dụng các mồi được tổng hợp ngẫu nhiên từ 9-12 base

 DNA template chạy RAPD-PCR

→nhiều đoạn DNA:

A và B

 Nếu bị đột biến làm xuất hiện hay mất đi

vị trí bắt cặp ngẫu nhiên: B

Điện di phát hiện sản

phẩm

Mồi của RAPD-PCR:

• Phải có sự định hướng chuyên biệt

• Phải có khoảng cách hợp

lý giữa các mồi với nhau

Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD:

Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công,

Thao tác đơn giản

Thời gian thực hiện nhanh

Khả năng nhân bản cao

Những hạn chế của kỹ thuật RAPD :

- Kỹ thuật RAPD có độ chính xác không cao không ổn định

 PCR có thể được sử dụng để nhân dòng vô tính các trình

tự đã biết

 PCR dùng để nhân dòng gen vô tính từ một sinh vật bằng cách sử dụng đoạn mồi nếu có vài dữ kiện có sẵn mà đoạn gen yêu cầu

 Sử dụng trong pháp y và chẩn đoán như: kiểm tra huyết thống hoặc kiểm tra các rối loạn di truyền cho thai nhi

 Ứng dụng rộng rãi trong công nghệ gen.