THIẾT KẾ MỘT QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHO CÁ TRA CÓ CHỨC NĂNG HỖ TRỢ TIÊU HÓA, ĐỐI KHÁNG SINH HỌC Edwardsiella ictaluri

Bài thuyết trình THIẾT KẾ MỘT QUY TRÌNH NGHIÊN CỨU VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHO CÁ TRA CÓ CHỨC NĂNG HỖ TRỢ TIÊU HÓA, ĐỐI KHÁNG SINH HỌC Edwardsiella ictaluri.Bài thuyết trình có nội dung dễ hiểu, hình ảnh sinh động, sơ đồ cụ thể, phù hợp cho sinh viên nghành công nghệ sinh học.Trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra (P. hypophthalmus) ở đồng bằng sông Cửu Long phát triển rất mạnh đã đưa năng suất nuôi tăng lên đáng kể. Tuy nhiên, không thể tránh khỏi những rũi ro xảy ra dịch bệnh trong môi trường nuôi.Do đó, để đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, người nuôi không ngừng sử dụng hoá chất và kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản để phòng và điều trị bệnh gây tổn hại đến môi trường và làm tăng sức đề kháng của các vi sinh vật gây bệnh Chính vì vậy, việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc vi khuẩn có lợi để kiểm soát mầm bệnh, tăng sức đề kháng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường ao nuôi ngày càng được xem là một giải pháp thay thế cho điều trị kháng sinh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vi khuẩn Bacillus có tiềm năng làm probiotic và là tác nhân kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thuỷ sản. Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng những chủng vi khuẩn Bacillus subtilis phân lập từ ao nuôi cá tra để sản xuất chế phẩm cho cá tra có chức năng hỗ trợ tiêu hóa, làm tác nhân đối kháng sinh học Edwardsiella ictalluri,là tác nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).

Edwardsiella ictaluri

IV Quy trình sản xuất III Phương pháp nghiên cứu

II Khái quát về đối tượng nghiên cứu

Chủng vi khuẩn Bacillus spp (Pangasianodon hypophthalmus) Bệnh gan thận mủ trên cá tra

I Đặt vấn đề

• Trong những năm gần đây nghề nuôi cá tra (P hypophthalmus) ở đồng bằng sông

Cửu Long phát triển rất mạnh đã đưa năng suất nuôi tăng lên đáng kể Tuy nhiên, không thể tránh khỏi những rũi ro xảy ra dịch bệnh trong môi trường nuôi

• Do đó, để đạt được sản lượng và lợi nhuận cao nhất, người nuôi không ngừng sử dụng hoá chất và kháng sinh trong nuôi trồng thuỷ sản để phòng và điều trị bệnh gây tổn hại đến môi trường và làm tăng sức đề kháng của các vi sinh vật gây bệnh

• Chính vì vậy, việc sử dụng các chế phẩm sinh học hoặc vi khuẩn có lợi để kiểm soát mầm bệnh, tăng sức đề kháng và giải quyết vấn đề ô nhiễm môi trường ao nuôi ngày càng được xem là một giải pháp thay thế cho điều trị kháng sinh

• Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng, vi khuẩn Bacillus có tiềm năng làm probiotic và

là tác nhân kiểm soát sinh học trong nuôi trồng thuỷ sản

• Trong bài nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng những chủng vi khuẩn Bacillus

subtilis phân lập từ ao nuôi cá tra để sản xuất chế phẩm cho cá tra có chức năng

hỗ trợ tiêu hóa, làm tác nhân đối kháng sinh học Edwardsiella ictalluri,là tác

nhân gây bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus).

I ĐẶT VẤN ĐỀ

1 Bệnh gan thận mủ trên cá tra (Pangasianodon hypophthalmus )

- Edwardsiella ictaluri là một vi khuẩn gram âm, hình que, oxidase âm

tính, có tiên mao, có thể lên men.

Hình 1.1: Cá tra Hình 1.2: Biểu hiện bệnh lý

II KHÁI QUÁT VỀ ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2 Chủng vi khuẩn Bacillus spp :

• Nguồn phân lập: Các chủng vi khuẩn Bacillus có hoạt tính

probiotic được phân lập từ mẫu nước, bùn đáy ao và ruột cá tra.

• Đặc điểm hình thái: Bacillus là trực khuẩn nhỏ, hai đầu

tròn, G+, đứng đơn lẻ hoặc thành chuỗi ngắn Vi khuẩn có khả năng di động, có 8 - 12 lông, sinh bào tử hình bầu dục.

• Đặc điểm nuôi cấy và điều kiện phát triển:

– Hiếu khí, nhiệt độ tối ưu là 37C

– Nhu cầu O2: Bacillus là vi khuẩn hiếu khí nhưng lại có khả năng phát triển yếu trong môi trường thiếu oxy

– Độ pH: Bacillus thích hợp nhất với pH = 7,0 - 7,4.

Bacillus subtilis

• Đặc tính cần có của vi khuẩn Bacillus dùng làm chế phẩm cho

cá tra có chức năng đối kháng sinh học Edwardsiela ictaluri ???

– Chúng có khả năng đối kháng với E.ictaluri;

– Thích nghi rộng ở các điều kiện môi trường như nhiệt độ, pH và nồng độ muối;

– Có khả năng chịu đựng trong môi trường có pH thấp và muối

mật

– Không có khả năng dung huyết (tiêu huyết)

– Có khả năng sinh ra enzyme ngoại bào.

– Không mang gen đề kháng kháng sinh có thể truyền được.

=> Tiềm năng dùng làm probiotic và cần được nghiên cứu khả

năng bảo vệ cá tra kháng bệnh gan thận mủ nhằm kiểm soát bệnh này.

Phân lập vi khuẩn Bacillus

Thử nghiệm đối kháng với E.ictaluri

Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào

Thử nghiệm khả năng chịu muối và chịu pH trong môi trường nuôi

Thử nghiệm khả năng chịu đựng pH acid dạ dày và khả năng chịu muối mật

Thử nghiệm khả năng sinh enzyme hemolysin

Thử nghiệm khả năng nhạy/ kháng với kháng sinh (MIC)

III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phân lập vi khuẩn Bacillus

• Các mẫu phân lập được pha loãng tới độ pha loãng cần thiết rồi được xử lý nhiệt ở

800C trong 15 phút, sau đó được cấy gạt lên môi trường thạch dinh dưỡng(môi

trường Nutrient Agar (NA) Nuôi ở nhiệt độ 28 – 300C trong 24 giờ Các khuẩn lạc mọc lên được kiểm tra dưới kính hiển vi và kiểm tra các đặc điểm khác, nếu phù hợp cới các đặc điểm của Bacillus thì cấy truyền sang thạch nghiêng để bảo quản

• Các chủng thu được định danh sơ bộ bằng phương pháp thường quy, bắt màu Gram (+), sinh bào tử, oxydase (+) và catalase (+)

Thử nghiệm khả năng đối kháng với E ictaluri

Phương pháp kiểm tra sơ bộ (phương pháp Kolmen và Boerner)

Thử nghiệm khả năng sinh enzyme ngoại bào

Sơ đồ: Thử nghiệm khả năng phân giải tinh bột

Sơ đồ: Thử nghiệm khả năng phân giải lipid

Thử nghiệm khả năng chịu pH

• Khoảng pH được khảo sát từ 4-10.

• Điều chỉnh độ pH của môi trường người ta dùng HCl 10 % hay

NaCl 10 % Ngoài ra có thể dùng một số hoá chất khác như: H3PO4, H2SO4, KOH, NaHCO3, Na2CO3

• Muốn kiểm tra độ pH của môi trường ta nên dùng máy đo pH

=> Phương pháp này nhanh nhạy và cho độ chính xác cao

• Trong phòng thí nghiệm có thể dùng chỉ thị màu xanh bromotomol hay giấy quỳ để đo pH.

=> Phương pháp này tiện lợi, nhanh nhưng không cho độ chính xác cao.

=> Vi khuẩn được xem là có khả năng chịu pH khi có khả năng tăng trưởng và làm đục môi trường nuôi cấy.

trưởng sau 2h thì vi khuẩn

Bacillus có khả năng chịu

được pH acid dạ dày

Thử nghiệm

khả năng chịu

muối mật

=> Nếu vi khuẩn Bacillus vẫn tăng trưởng tốt ở nồng độ

muối mật như trên thì

tủ lệ sống sót khi đi qua

ruột non và ruột già

cao

Thử nghiệm khả năng sinh enzyme hemolysin

• Kết quả cho thấy vi khuẩn

Bacillus không có khả năng dung

huyết thì có thể ứng dụng và an

toàn cho người khi bị lây nhiễm

qua chuỗi thức ăn Nếu bị dung

huyết thì không được sử dụng

Môi trường thạch máu Blood Agar (BA), có bổ sung 5%

máu cừu

Ủ ở 30oC trong 24 giờ

Dùng que cấy vòng lấy VK

cấy lên môi trường

Đọc kết quả

Thử nghiệm khả năng nhạy/ kháng

với kháng sinh (MIC)

• Phương pháp kháng sinh đồ:

Nguyên tắc: Khi đặt đĩa kháng

sinh trên môi trường đã trải

khuẩn, kháng sinh từ đĩa giấy

khuếch tán ra môi trường và ức

chế sự phát triển của vi khuẩn tạo

thành vòng vô khuẩn Dựa vào

đường kính vòng vô khuẩn xung

quanh đĩa kháng sinh để biện luận

vi khuẩn đề kháng, trung gian

hoặc nhạy cảm theo tiêu chuẩn.

Biện luận kháng sinh đồ (S, I, R) dựa vào

đường kính vòng vô khuẩn

=> Nếu vi khuẩn kháng lại kháng sinh thì vi khuẩn đó phải

Định danh chủng vi khuẩn

• Các chủng vi khuẩn tuyển

chọn được định danh bằng

các thử nghiệm sinh hoá

theo khóa phân loại Bergey

(1994) [10] và định danh

bằng phương pháp giải

trình tự gene mã hoá 16S

rRNA.

IV QUY

TRÌNH

SẢN XUẤT

TÀI LIỆU THAM KHẢO

• Nguyễn Hoàng Tuấn Duy và cs, 2013 Phân lập và sàng lọc vi khuẩn Bacillus spp có hoạt tính

probiotic dùng cho cá tra nuôi Hội nghị CNSH toàn quốc tại khu vực phía Nam

• Nguyễn Văn Minh và cs, 2013 Khả năng kiểm soát sinh học Edwardsiella ictaluri gây bệnh của một

số chủng Bacillus spp phân lập từ ao nuôi cá tra Hội nghị khoa học công nghệ quốc tế ISCE2013.

• Lê Xuân Phương, Thí nghiệm vi sinh vật học, trang 77.

• Nguyễn Văn Minh, Thực tập vi sinh cơ sở, trang 47 – 58.

• Dương Nhật Linh, Kiểm soát sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật (PDF), trang 19 – 21.

• Hồ Thị Trường Thy, Khào sát một số đặc tính chủng bacillus subtilis b20.1 làm cơ sở cho việc sản

xuất probiotic phòng bệnh gan thận mũ do edwardseilla ictaluti trên cá tra (pangasius hypophthalmus)

nuôi thâm canh, Bộ môn bệnh học thủy sản, khoa thủy sản trường Đại học nông lâm TPHCM

• Ngô Gia Tự, Bùi Thị Việt Hà, Nghiên cứu enzyme ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập

và khả năng ứng dụng của chúng trong xử lý nước thải, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ 25 (2009) 101 -106.

www.nihe.org.vn/new-vn/thuong-quy-va-huong-dan-ky-thuat/936/Ky-thuat-khoanh-giay-khang-sinh-k huech-tan.vhtm

hang-sinh-toi-thieu-uc-che-vi-khuan-MIC.vhtm