phân tích trình tự ITS và matK cây họ Gừng Zingiberaceae

luận văn nói về quá trình phân tích trình tự gen ITS và matK để phân loại bằng Sử dụng phương pháp PCR – RAPD khảo sát đa dạng di truyền,dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự DNA vùng ITS, vùng trnK – matK và kết hợp vùng ITS và trnK – matK

MỤC LỤC

DANH MỤC CHỮ KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT III DANH MỤC BẢNG V DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ VI

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1.1 Đặc điểm hình thái 2

1.1.2 Phân bố 3

1.1.3 Giá trị sử dụng 3

1.1.4 Phân loại thực vật 4

1.2.1 Marker phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu bộ gene thực vật 6

1.2.2 Ứng dụng marker phân tử trong nghiên cứu cây họ Gừng 8

1.3.1 Trình tự DNA và phân loại thực vật 9

1.3.2 Định danh cây họ Gừng 14

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 16

2.3.1 Chiết tách và tinh sạch DNA 19

2.3.2 Kiểm tra dịch chiết DNA 20

2.3.3 Điện di 21

2.3.4 PCR-RAPD các mẫu ngải 21

2.3.5 PCR và giải trình tự vùng ITS 24

2.3.6 PCR và giải trình tự vùng trnK 25

2.3.7 Phân tích di truyền 27

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 29

3.1.1 Kết quả PCR-RAPD 29

3.1.2 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu ngải 29

3.2.1 Phân tích vùng ITS 34

3.2.2 Phân tích vùng trnK - matK 35

3.2.3 Xây dựng cây phát sinh loài 37

1.1 Khái quát về họ Gừng (Zingiberaceae) 2

2.2 Thiết bị 18

2.3 Phương pháp nghiên cứu 19

3.1 Đa dạng di truyền các mẫu ngải bằng kỹ thuật PCR - RAPD 29

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 51

TÀI LIỆU THAM KHẢO 52

PHỤ LỤC 57

3.3 Định danh khoa học 47

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 49

4.1 Kết luận 49

4.2 Đề nghị 50

Phụ lục A Hình ảnh một số mẫu ngải 57

Phụ lục B Hình PCR-RAPD với các mồi 59

Phụ lục C Trình tự ITS các mẫu thực nghiệm 61

Phụ lục D Trình tự trnK - matK các mẫu thực nghiệm 66

DANH MỤC CHỮ KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

AFLP Amplified fragment length polymorphism

AP - PCR Arbitrary primed polymerase chain reaction

cpDNA Chloroplast geneome, bộ gene lục lạp

DAF DNA amplification fingerprinting

DNA Deoxyribonucleic acid

DNase Deoxyribonuclease

dNTPs Deoxynucleotide triphosphate

EDTA Ethylenediamine tetraacetate

ISSR Inter simple sequence repeat

ITS Internal transcribed spacer

matK maturaseK, gene mã hóa cho megakaryocyte - associated tyrosine kinase Mega Molecular evolutionary genetics analysis

ML Maximum likelihood

MP Maximum parsimony

mtDNA Mitochondrial DNA, DNA ti thể

nDNA Nuclear DNA, DNA nhân

NJ Neighbour joining

nrDNA Nuclear ribosomal DNA, DNA ribosome nhân

NTSYSpc Numerical taxonomy and multivariate analysis system for personal computer

OD Optical density

ORF Open reading frame, khung đọc mở

OTU Operational taxonomic units

PCR Polymerase chain reaction

PVP Polyvinylpyrrolidone

RAPD Random amplification of polymorphic DNA

rDNA Ribosomal DNA

RFLP Restriction fragment length polymorphism

RNA Ribonucleic acid

Rnase Ribonuclease

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SM Simple matching coefficient

SSR Simple sequence repeat

TAE Tris – acetic acid – EDTA

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1.1 Phân bố họ Gừng ở Châu Á 3

Bảng 1.2 Phân loại họ Gừng theo W John Kress 4

Bảng 1.3 Các mã vạch DNA thực vật được đề nghị 14

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu 16

Bảng 2.2 Các mồi sử dụng trong phân tích RAPD 22

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng PCR-RAPD 23

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR-RAPD 23

Bảng 2.5 Các mồi sử dụng khuếch đại và giải trình tự đoạn ITS 24

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR vùng ITS 25

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR vùng ITS 25

Bảng 2.8 Các mồi sử dụng khuyếch đại và giải trình tự vùng trnK 26

Bảng 2.9 Thành phần của phản ứng khuếch đại vùng trnK 27

Bảng 2.10 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng khuếch đại vùng trnK 27

Bảng 3.1 Các mồi RAPD chọn lọc, số sản phẩm khuếch đại, số băng đa hình và tỉ lệ phần trăm đa hình 30

Bảng 3.2 Tỉ lệ tương đồng giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng đơn giản (SM coefficient) 31

Bảng 3.3 Phân nhóm di truyền các mẫu ngải 33

Bảng 3.4 Các thông số trình tự ITS và matK 37

Bảng 3.5 Định danh các mẫu ngải 48

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Các vùng gene dùng trong phân tích phân loại thực vật ở các mức độ

khác nhau 10

Hình 1.2 Sơ đồ vùng ITS 12

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả các phương pháp dùng để định danh thực vật ở mức loài 14 Hình 1.4 Sơ đồ các mã vạch DNA được đề cử để xác định loài thực vật 15

Hình 2.1 Sơ đồ mô tả vị trí các mồi dùng trong giải trình tự đoạn ITS 25

Hình 2.2 Sơ đồ mô tả vị trí các mồi dùng trong giải trình tự đoạn trnK 26

Hình 3.1 Sơ đồ cây thể hiện mối tương quan về di truyền giữa 25 mẫu ngải trên cơ sở kiểu gene 32

Hình 3.2 Sản phẩm khuyếch đại vùng ITS 34

Hình 3.3 Sản phẩm khuyếch đại vùng trnK 36

Hình 3.4 Cây phát sinh loài có gốc trình tự ITS 40

Hình 3.5 Cây phát sinh loài có gốc trình tự matK 42

Hình 3.6 Cây phát sinh loài có gốc kết hợp trình tự ITS và matK 44

MỞ ĐẦU

Họ Gừng (Zingiberaceae) ở Việt Nam rất phong phú, có từ 17 đến 20 chi và trên

100 loài [3] Các cây họ Gừng được sử dụng từ lâu đời, làm gia vị hoặc làm thuốc,

bộ phận dùng thường là thân rễ Với sự phát triển của khoa học, người ta đã nghiêncứu và chứng minh được các tác dụng dược lý quý giá của các cây họ Gừng

Các nghiên cứu ban đầu về cây thuốc có khả năng chữa ung thư ở Việt Nam chothấy có 50 loài thuộc 36 chi và 24 họ có khả năng chữa ung thư, trong đó

Zingiberaceae là đa dạng nhất (16%) [8] Ngoài ra, trong một nghiên cứu sàng lọc

tác dụng kháng ung thư trên 77 cây thuốc Việt Nam thu thập từ vùng Bảy Núi, AnGiang và Lâm Đồng cho thấy 15 dịch chiết của 6 cây có khả năng kháng ung thư

trên một số dòng tế bào, trong đó có các loài nằm trong chi Alpinia thuộc họ Gừng

[43]

Ở vùng Bảy Núi, bên cạnh gừng, nghệ, riềng, đồng bào còn trồng và sử dụng một sốcây ngải thuộc họ Gừng để chữa các chứng đau bụng khí, viêm đại tràng, bó chữatrật chân Thực tế các loài ngải nói riêng, họ Gừng nói chung rất phong phú, lại cóđặc điểm hình thái khá giống nhau, phân bố ở các vùng khác nhau với tên gọi khácnhau, nên nếu chỉ dựa vào đặc điểm hình thái thực vật, vi phẫu, hoá học (kiểu hình)thì chưa đủ để xác định, rất dễ bị nhầm lẫn Để góp phần xây dựng cơ sở dữ liệuphục vụ công tác bảo tồn nguồn gene cũng như phát triển nguồn dược liệu nhiềutiềm năng này, chúng tôi tiến hành đề tài khảo sát đa dạng di truyền một số cây

thuốc họ Gừng (Zingiberaceae) ở vùng Bảy Núi – An Giang.

Nội dung nghiên cứu của đề tài:

1 Sử dụng phương pháp PCR – RAPD khảo sát đa dạng di truyền

2 Xây dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự DNA vùng ITS, vùng trnK – matK và kết hợp vùng ITS và trnK – matK.

3 Bước đầu định danh các mẫu ngải dựa vào trình tự ITS và matK.

Mở đầu

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Khái quát về họ Gừng (Zingiberaceae)

1.1.1 Đặc điểm hình thái

Các cây trong họ Gừng (Zingiberaceae) gồm những cây thân thảo sống lâu năm Rễ

nhỏ, hình sợi; đôi khi đầu rễ phình to lên thành dạng củ Thân rễ to, nạc, nằmngang, chứa nhiều chất dự trữ, có khi rất ngắn hoặc chỉ mang hoa Các bẹ lá ôm

chặt lấy nhau tạo thành thân giả, rất ngắn hoặc không có (Distichochlamys, Kaempferia…) hay cao 1 - 3 m, đôi khi cao tới 4 - 5 m (Alpinia, Amomum…),

không phân nhánh Cây thường có mùi thơm hoặc mùi hắc như một số loài trong

chi Zingiber Lá đơn, mọc cách, các lá xếp thành hai hàng, thường hướng lên trên, đôi khi nằm ngang gần như song song với mặt đất (Kaempferia galanga,

K pulchra); có khi lá chỉ là bẹ lá dạng vảy Lá gồm các phần: bẹ lá, cuống lá, lưỡi

lá và phiến lá Bẹ lá mở đến gốc, phần dưới bẹ lá thường ôm chặt lấy nhau thànhthân giả Cuống lá có thể có hay không có, ngắn hay dài (có thể dài tới 25 cm), hìnhlòng máng nông hoặc sâu Lưỡi lá (thìa lá) là phần giữa bẹ lá và cuống lá, từ bẹ lákéo dài lên Lưỡi dày hay mỏng dạng màng, đầu nguyên hay xẻ hai, cụt ngang, dài

1 - 2 mm tới vài cm Phiến lá: hình mác, hình trứng hẹp, bầu dục, ít khi gần tròn

(K pulchra), gốc phiến nhọn, hình nêm hay gần tròn; đầu phiến thường nhọn, đôi

khi thót nhỏ thành dạng đuôi, hiếm khi tròn Thông thường phiến lá màu xanh,nhưng ở một vài loài trong một số chi mặt trên lá có đốm trắng loang lổ

(Stahlianthus) hay dọc gân chính mặt trên nâu đỏ (Curcuma) hoặc mặt dưới nâu đỏ (Distichochlamys, Stahlianthus, Zingiber) Cụm hoa mọc trên ngọn thân có lá hay

từ thân rễ sát mặt đất, tách biệt với thân có lá, hoặc từ giữa các bẹ lá Cụm hoa dạngchùy, chùm hay bông Cuống cụm hoa mọc từ thân rễ ở một số chi được bao phủbởi các bẹ lá dạng vảy thưa hay dày Cụm hoa thường không phân nhánh, trừ một

số ít loài trong các chi Globba, Alpinia, Elettaria, Elettariopsis [2].

Mở đầu

Trong bộ Gừng (Zingiberales) ở Việt Nam, họ Gừng (Zingiberaceae) là họ có số

lượng loài nhiều nhất Đây là một họ có nhiều đại diện có giá trị làm thuốc chữabệnh, nhiều loài được sử dụng làm gia vị, làm cảnh [2]

Các cây thuộc họ Gừng được sử dụng làm thuốc theo các bài thuốc dân gian như

Riềng (Alpinia officinarum Han.) dùng làm gia vị và làm thuốc Nghệ (Curcuma domestica-Val hay C Longa L.) có thân rễ làm gia vị, làm thuốc chữa bệnh dạ dày,

bệnh vàng da, dùng cho phụ nữ sau khi sinh đẻ Gừng (Zingiber officinale Rosc.) cóthân rễ thơm cay, dùng làm gia vị, làm mứt và làm thuốc, có tác dụng hưng phấn, dễtiêu Gừng gió (Z zerumbet Sm ex L.) có thân rễ vị đắng và cay, cũng được dùnglàm thuốc Ở rừng Việt Nam, còn gặp một số cây mọc ở tầng thấp như Ré (Alpinia

speciosa K Chum.) có cánh môi vàng viền đỏ, quả mọng hình cầu, cây dùng lấy

Tổng quan

sợi Thảo quả (Amomum tsaoko Roxb.) và Sa nhân (A villosum Lour.) là hai loại

cây dùng làm thuốc, được khai thác nhiều để xuất khẩu, gặp nhiều ở các rừng miềnBắc Việt Nam

1.1.4 Phân loại thực vật

Hệ thống phân loại

Giới (Kingdom) Thực vật (Plantae)

Tại hội nghị chuyên đề lần III về Zingiberaceae tổ chức tại Thái Lan từ ngày 7 - 12

tháng 7 năm 2002 , Dr W John Kress đã đề nghị một cách phân loại họ Gừng mới,dựa trên những nghiên cứu gần đây, bao gồm các phân tích về đặc điểm phân tử vàhình thái Ông đã đề nghị chia họ Gừng thành 4 phân họ lớn, gồm 6 tông và 53 chi,được thể hiện ở Bảng 1.2

Bảng 1.2 Phân loại họ Gừng theo W John Kress [23]

Tông Alpinieae

Tông Riedelieae

Tông Zingibereae

Tông Globbeae

Tổng quan

*Haplochorema Zingiber Distichochlamys Scaphochlamys Cornukaempferia

*Parakaempferia Caulokaempferia (Incertae

Chi 1 Alpinia Roxb – Riềng, Sẹ

Chi 2 Amomum Roxb nom cons – Sa nhân, thảo quả

Chi 3 Boesenbergia Kuntze – Bồng nga truật

Chi 4 Caulokaempferia K Larsen – Đại bao khương

Chi 5 Cauley (Benth.) Royle ex Hook f – Cầu ly

Chi 6 Curcuma L nom cons – Nghệ

Chi 7 Distichochlamys M F Newman – Gừng đen

Chi 8 Elettaria (L.) Maton – Trúc sa, tiểu đậu khấu

Tổng quan

Chi 9 Elettariopsis Baker – Tiểu đậu

Chi 10 Etlingera Giseke – Ét ling

Chi 11 Gagnepainia K Schum – Găng ba

Chi 12 Geostachys (Baker) Ridl – Địa sa

Chi 13 Globba L – Lô ba

Chi 14 Hedychium Koen – Ngải tiên, bạch diệp

Chi 15 Hornstedtia Retz – Giả sa nhân

Chi 16 Kaempferia L – Địa liền, thiền liền

Chi 17 Siliquamomum Baill – Sa nhân giác

Chi 18 Stahlianthus Ktunze – Tam thất gừng

Chi 19 Zingiber Boehm – Gừng, khương

1.2 Marker phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền họ Gừng

1.2.1 Marker phân tử và ứng dụng trong nghiên cứu bộ gene thực vật

Có rất nhiều kĩ thuật phân tử dùng để phân tích đa hình DNA Nhìn chung chúng cóthể chia làm 3 loại là: các phương pháp dựa trên kĩ thuật lai, các phương pháp dựatrên PCR và các phương pháp dựa trên giải trình tự [9]

Tổng quan

1.2.1.1 Các phương pháp dựa trên kĩ thuật lai

Các phương pháp dựa trên kĩ thuật lai gồm RFLP (restriction fragment lengthpolymorphisms) và VNTR (variable number tandem repeat) Các mồi đánh dấuđược lai trên màng lai chứa enzyme cắt giới hạn DNA Sự hiện diện hay vắng mặtcủa các băng trong kết quả lai giúp tìm ra tỉ lệ đa hình [9]

1.2.1.2 Các phương pháp dựa trên PCR

Các kĩ thuật dựa trên khái niệm này gồm các PCR mồi ngẫu nhiên (AP-PCR), sự đahình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu nhiên (RAPD) và dấu vân tay khuếch đạiDNA (DAF) [33] Ngoài ra còn có ISSRs, SSR, AFLP… Hiện nay, các markerthường được sử dụng nhất là RAPD [9]

RAPD là một trong những công cụ đơn giản, kinh tế và mạnh nhất để khảo sát cácbiến đổi di truyền Trong các nghiên cứu đã công bố, kĩ thuật RAPD thường cho sốlượng locus đa hình lớn, khá dễ thu được ngay cả với các loài không có sẵn thôngtin di truyền So với các marker quần thể khác, marker RAPD cho kết quả khátương đồng với AFLP, ISSR và allozyme Các marker RAPD được sử dụng khá phổbiến, trong 307 nghiên cứu (từ năm 1993-2003), để đánh giá đa dạng di truyền cùngloài [16]

Tuy đơn giản và rẻ tiền, nhưng kết quả đa hình từ RAPD lại rất dễ bị ảnh hưởng bởicác yếu tố của phản ứng PCR, đòi hỏi độ tinh sạch của khuôn DNA cao DNAkhuôn có lẫn RNA, ethanol, polysaccharide, phenolics cũng là những nguyênnhân dẫn đến sự đa hình RAPD chỉ phát hiện tính trạng trội nên những gene mangtính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình, gây khó khăn và không xác định được cáthể dị hợp tử Ngoài ra, độ lặp lại của RAPD không cao khi tiến hành tại các phòngthí nghiệm khác nhau Những nhược điểm trên đòi hỏi chúng ta phải thực hiện việctối ưu hóa điều kiện phản ứng trước khi sử dụng phương pháp này Do đó, kỹ thuậtRAPD thường được kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng

di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao

Tổng quan

1.2.1.3 Các phương pháp dựa trên giải trình tự

Nhiều thông tin có thể thu được từ trình tự DNA Trình tự DNA có thể được sửdụng để nghiên cứu mối liên hệ phát sinh loài giữa các loài khác nhau Trình tựcũng cho phép phát hiện các loài mới hay các loài khác thường Một ứng dụng ưuviệt khác là xác định loài tranh cãi bằng cách so sánh trình tự này với trình tự đãđược công bố trên cơ sở dữ liệu (như GenBank) Tuy nhiên để giải trình tự, chúng

ta cần biết trước trình tự để thiết kế mồi khuếch đại vùng gene mong muốn

Sự đa hình và biến đổi trong trình tự DNA có thể xảy ra do sự thay thế, thêm hoặcbớt các nucleotide Các biến đổi này có thể được phát hiện một cách trực tiếp và cóthể thu được thông tin về một locus Biến đổi di truyền ở mức độ một nucleotidexảy ra khắp nơi Giải trình tự trực tiếp có thể xác định được đa hình đơn nucleotide

ở từng loài nghiên cứu

Một chiến lược khác của giải trình tự là phân tích sự đa dạng của trình tự ITS củarDNA Vùng ITS của rDNA 18S-26S cung cấp một trình tự hữu ích để nghiên cứu

sự phát sinh loài của nhiều họ thực vật hạt kín Các trình tự DNA khác như trnK của

DNA lục lạp và vùng 5S rDNA cũng là các công cụ nhận định [9]

Các vùng khác nhau trong bộ gene có tỉ lệ tiến hóa khác nhau, có thể sử dụng đểđịnh danh ở các mức độ phân loại khác nhau Các vùng không mã hóa cho proteincó áp lực chọn lọc thấp nên tính đa dạng tăng và có thể dựa vào các vùng này để xácđịnh loài thực vật Các vùng này thường là các vùng gene rRNA, các gene ti thể, lụclạp [33] Các gene này có khoảng hơn 100 bản sao, nên các phương pháp sử dụngchúng có tính nhạy cao và thuận tiện cho việc khuếch đại Đây cũng là một thuậnlợi cho PCR các mẫu dược liệu [33]

1.2.2 Ứng dụng marker phân tử trong nghiên cứu cây họ Gừng

1.2.2.1 Các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây họ Gừng trên thế giới

Áp dụng phân tích DNA để khảo sát phân loại và nhận diện các cây họ Gừng đãđược nhiều nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm Phân tích RAPD được dùng

Tổng quan

nghiên cứu đánh giá đa dạng di truyền DNA trên Nghệ C aerugeneosa Roxb ở Thái Lan [32], trên cây Riềng nếp (Alpinia spp.) [29], trên chi Curcuma ở Bangladesh [16], giữa các loài thuộc chi Boesenbergia [28] Phân tích đa dạng di truyền loài Curcuma zedoaria (Christm.) Roscoe ở Bangladesh bằng RAPD cho thấy các quần

thể này duy trì tính đa dạng cao, có sự khác biệt giữa các vùng trồng [16] RAPD

marker cũng được dùng để nghiên cứu nhận định và khảo sát mối quan hệ di truyền

8 dòng Gừng ở Ấn Độ [39]

Bên cạnh RAPD, các nhà nghiên cứu Ấn Độ đã chứng minh trình tự vùng internal

transcribed spacer (ITS) của ribosome nhân và gene matK (các nucleotide vị trí giữa

115 đến 130, 680 đến 690 và 1455 đến 1465 của gene matK) thuộc gene trnK có thể

dùng làm mã vạch DNA (DNA barcoding) cho cây họ Gừng [11]

1.2.2.2 Các nghiên cứu về đa dạng di truyền cây họ Gừng trong nước

Ở trong nước, các nghiên cứu về về họ Gừng đã được tiến hành từ rất lâu, chủ yếutập trung vào phân tích thành phần hóa học và khảo sát một số tác dụng sinh học.Nghiên cứu về tính đa dạng của họ Gừng cũng được tiến hành nhưng không nhiều.Một số nghiên cứu tiêu biểu như: khảo sát mối quan hệ di truyền và hàm lượngcurcumin một số loài Nghệ từ các vùng khác nhau của Việt Nam [7], nghiên cứuđặc điểm vi học, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của tinh dầu 3 câyngải sậy ở An Giang là Ngải sậy củ lớn, Ngải sậy củ nhỏ và Ngải sậy Campuchia[6]

Qua các tài liệu thu thập được, có thể nói rằng nghiên cứu về nhận định loài, xâydựng cây phát sinh loài, khảo sát tính đa dạng của các cây thuộc họ Gừng đã đượcthực hiện rất nhiều trên thế giới Thái Lan, một nước thuộc Đông Nam Á gần nước

ta, cũng đã có rất nhiều công bố về đa dạng di truyền họ Gừng ở mức độ phân tử.Tuy nhiên, vấn đề này ở nước ta vẫn chưa được phát triển mạnh

1.3 Nghiên cứu phát sinh loài họ Gừng

1.3.1 Trình tự DNA và phân loại thực vật

Tổng quan

1.3.1.1 Sơ lược về phân loại thực vật dựa vào trình tự DNA

Không giống như động vật, ngoài bộ gene nhân (nDNA) và ti thể (mtDNA), thựcvật còn có có một bộ gene bổ sung là bộ gene lạp lục (cpDNA) DNA nhân, lục lạp

và ti thể đều được sử dụng trong phân tích phát sinh loài Tùy vào mức độ phân tích

mà mỗi vùng gene và mỗi phương pháp được áp dụng phù hợp Do tính phức tạp vàlặp đi lặp lại, chỉ có một số gene thuộc nDNA như 18S, 26S, vùng ITS….được sửdụng Vùng 18S và vùng 5.8S thường được sử dụng để xác định ở mức bộ hoặc họ;vùng 26S thường được dùng để xác định ở mức dưới họ cho đến loài; vùng ITS vàvùng 5S spacer thường được dùng để phân tích ở mức loài cho tới mức dưới loài(Hình 1.1) [33]

Bộ gene ti thể phù hợp cho phân biệt ở mức loài vì chúng có đặc điểm là cấu trúc

kích thước, cấu hình, và trật tự gene thay đổi nhanh chóng Gene cytochrome b và

vùng control thường được sử dụng ở mức từ loài đến dưới loài Trước đây chúngthường được sử dụng ở mức loài và gần đây chúng thường được sử dụng hơn ở mứcdưới loài (Hình 1.1) [33]

Hình 1.1 Các vùng gene dùng trong phân tích phân loại thực vật ở các mức độ

khác nhau [33]

Tổng quan

DNA lục lạp, ký hiệu là cpDNA (chloroplast DNA), là DNA sợi đôi, có chiều dàitrong khoảng 35 - 217 kb tùy loài thực vật, trong đó phần đông các loài có DNA dàikhoảng 115 - 165 kb Trong mỗi tế bào thực vật có chứa 1000 – 10000 bản saocpDNA Các gene thuộc cpDNA có tính bảo tồn cao và có thể được chia thành 3nhóm như sau: Nhóm một là các gene mã hóa những yếu tố thuộc hệ thống quang

hợp như phytosystem (psaA, psaB, psbA, psbB ), cytochrome b6f (petA, petB ), ATP synthase (atpA, atpB ), Rubisco (rbcL) và NAD(P)H dehydrogenease (ndhA, ndhB ); Nhóm hai là các gene mã hóa cho các rRNA (rrn16, rrn5 ), trnA (trnH, trnK ), RNA polymerase (rpoA, rpoB ), các gene tiểu phần ribosome (rps2, rps3 ); Và nhóm ba gồm các khung đọc mở ORF gọi là ycfs (chưa rõ chức năng)

và các gene mã hóa protein như matK, cemA [34].

Có rất nhiều gene cpDNA tham gia trong phân tích phân loại thực vật như: 16S,

rbcL, atpβ, ndhF, intron trnL và matK …trải rộng từ bộ cho đến mức dưới loài Vùng 16S phù hợp ở mức bộ, trong khi rbcL, atpβ và ndhF phù hợp từ mức bộ đến mức loài Vùng intron trnL, spacer trnL-trnF và matK có thể áp dụng trong một

biên độ rộng từ bộ cho tới dưới loài Trước đây chúng thường được sử dụng từ mức

họ cho tới mức loài; hiện nay chúng thường được sử dụng từ mức họ cho đến phụ

loài Vùng atpβ-rbcL có thể được sử dụng từ mức chi đến mức dưới loài, nhưng

chúng cũng thường được sử dụng từ mức chi đến mức phụ loài (Hình 1.1) [33]

Gene rbcL được sử dụng nhiều để dựng cây phát sinh loài ở các hạt Tuy nhiên, đối

với mối quan hệ di truyền ở mức dưới loài thì sự phân tích trên gene này gặp nhiềuhạn chế Vì vậy, việc cần phải tìm một vùng DNA khác tiến hóa nhanh hơn gene

rbcL để xây dựng cây phát sinh loài ở mức dưới loài và gene matK là một gene đầy

hứa hẹn cho mục tiêu này [14]

1.3.1.2 Vùng ITS

ITS (internal transcribed spacer) là một đoạn RNA không có chức năng, nằm giữacác RNA cấu trúc của ribosome thường được dịch mã Cấu trúc vùng ITS gồm ITS1

Tổng quan

– 5.8S – ITS2 (Hình 1.2) Trong quá trình trưởng thành của rRNA, phần ITS bị cắt

và nhanh chóng phân hủy

Hình 1.2 Sơ đồ vùng ITS [37].

Một lợi thế của vùng ITS là nó bao gồm 2 locus riêng biệt (ITS1 và ITS2) được nốivới nhau qua locus 5.8S Vùng 5.8S khá bảo tồn, trên thực tế có đủ tín hiệu phátsinh loài phân biệt ở mức bộ và ngành Do đó các locus 5.8S có thể phục vụ như làmột điểm neo liên kết quan trọng để so sánh trình tự trong cả phát sinh loài và nhậndiện Tiện ích của vùng bảo tồn như 5.8S tạo thuận lợi cho việc so sánh cơ sở dữliệu, đặc biệt là khi so sánh một chuỗi không tương đồng với thư viện trình tự [21]

1.3.1.3 Vùng gene matK

Gene matK (gene mã hóa cho maturaseK) được phát hiện đầu tiên bởi Sugita và cộng sự (1985) trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) khi giải trình tự vùng gene trnK mã hóa cho tRNALys (UUU) của lục lạp Nó gồm 1 đoạn ORF chứa 509 codon nằm trong intron của gene trnK và dường như chưa rõ chức năng [14]

Đã có một số nghiên cứu sử dụng trình tự gene matK để xây dựng cây phát sinh loài như: Saxifragaceae (Johnson và Soltis, 1994, 1995; Johnson et al., 1996), Polemoniaceae (Steele và Vilgalys, 1994; Johnson và Soltis, 1995), Orchidaceae (Jarrell và Clegg, 1995), Myrtaceae (Gadek et al 1996), Poaceae (Liang và Hilu 1996), Apiaceae (Plunkett et al 1996) và thực vật có hoa (Hilu và Liang, 1997) Thông qua các phân tích chi tiết trên trình tự gene matK có trên GenBank và các nghiên cứu sơ bộ (Liang và Hilu, 1996; Hilu và Liang, 1997), cho thấy gene matK

có tính đa dạng hơn những gene khác có trong lục lạp [14]

Tổng quan

1.3.1.4.Giới thiệu sơ lược về cây phát sinh loài (phylogeney)

Phylogeney xuất phát từ sự kết hợp hai từ gốc Hy Lạp Phylo nghĩa là trực hệ(tuyến tính của một dòng họ) và genesis tức là nguồn gốc – tạm dịch phylogeney là

sự phát sinh loài

Trong ngành molecular phylogeney, người ta nghiên cứu mối quan hệ giữa các loàisinh vật thông qua các bằng chứng phân tử, cụ thể là trình tự DNA và protein Nhưvậy, sự phân kỳ di truyền được đánh giá thông qua sự khác biệt giữa các trình tự, làkết quả của quá trình tiến hóa phân tử theo tiến trình thời gian Bằng cách sử dụngcông cụ máy tính, các chuỗi dữ liệu sẽ mô phỏng tiến trình tiến hóa và phân tíchtiến trình phát sinh loài

1.3.1.5 Nghiên cứu phát sinh loài họ Gừng bằng trình tự ITS và matK

Trình tự ITS được sử dụng để tiến hành phân tích xây dựng cây phát sinh loài trên

Roscoea [26], xác định nhanh các đột biến trên Aframomum [13]; xây dựng cây phát sinh loài trên tông Zingibereae dựa trên trình tự ITS (nrDNA) và trình tự trnL - F

Paul S Manos và Kelly P Steele (1997) đã nghiên cứu xây dựng cây phát sinh loài

Hamamelididae dựa trên dữ liệu trình tự DNA lục lạp, cụ thể là trên gene matK So sánh việc phân tích trình tự của gene matK với các trình tự của gene rbcL đã được công bố trước đây cho thấy rằng cây phát sinh loài tạo ra từ trình tự của matK có độ

phân giải tốt hơn và tính ổn định cao hơn [30]

Tổng quan

1.3.2 Định danh cây họ Gừng

Hình 1.3 Sơ đồ mô tả các phương pháp dùng để định danh thực vật ở mức loài [33].

Mã vạch DNA (DNA barcoding) là trình tự của một chuỗi DNA ngắn, có cùngnguồn gốc tổ tiên (orthologous), được đề xuất và khởi xướng để tạo điều kiệnnghiên cứu đa dạng sinh học, xác định người chưa thành niên, giới tính liên kết,phân tích pháp y [21], [22]

Tại hội nghị “The Second International Barcode of Life Conference” được tổ chứctại Đài loan (16 - 21/12/2007), các nhà khoa học đã đưa ra các mã vạch DNA sửdụng trên thực vật (Bảng 1.3 và Hình 1.4) Tuy nhiên các nhà khoa học vẫn chưathống nhất chọn vùng gene hay vùng spacer nào cho tất cả các loài thực vật

Bảng 1.3 Các mã vạch DNA thực vật được đề nghị [12].

Chase và cộng sự matK, rpoC1, rpoB

Chase và cộng sự matK, rpoC1 trnH - psbA

Kim và cộng sự matK, atpF/H trnH - psbA

Kim và cộng sự matK, atpF/H psbK/I

Tổng quan

Nhận định mẫu các loài chưa biết

Mức loài

Giải trình tự các vùng đặc hiệu cho loàiLai vi bản trải

SCAR /

ARMS

Hình 1.4 Sơ đồ các mã vạch DNA được đề cử để xác định loài thực vật [10].

Như vậy có 7 vùng DNA plastid gồm spacer atpF - atpH , gene matK, gene rbcL, gene rpoB, gene rpoC1, spacer psbK – psbI, và spacer trnH – psbA được chọn làm

ứng cử viên làm mã vạch DNA cho thực vật trên đất liền; trong đó, có bốn vùng là

các phần của gene mã hóa (gene matK, gene rbcL, gene rpoB và gene rpoC1), và

ba vùng đệm không mã hóa cho protein (atpF - atpH, trnH - psbA, và psbK - psbI) Qua khảo sát đã chọn ra được 3 vùng plastid là: rbcL (dễ sử dụng nhưng khó phân biệt); matK (khả năng phân biệt và mã hóa cao hơn, gần với CO1, nhưng tính phổ quát thấp) và trnH - psbA (có tính phổ quát, có khả năng phân biệt cao nhưng chiều

dài hay thay đổi [10]

Tổng quan

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Mẫu nghiên cứu

Các mẫu nghiên cứu gồm 25 mẫu ngải hiện có ở vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên,tỉnh An Giang; trong đó có một số mẫu đã được Trung tâm Sâm và Dược liệuThành Phố Hồ Chí Minh thu thập, nhân giống; một số do công ty DOMESCO cungcấp Các mẫu này bao gồm củ tươi hoặc cây nguyên vẹn Ngoài ra, chúng tôi sử

dụng 28 loài có trình tự ITS và/hoặc trnK – matK trên GenBank để phân tích; trong

đó có 25 loài thuộc nhóm trong và 3 loài thuộc nhóm ngoài (Bảng 2.1) (xem thêmphụ lục A)

Bảng 2.1 Danh sách các mẫu vật liệu được sử dụng trong nghiên cứu

A Các mẫu thực nghiệm

Stt Ký hiệu mẫu Nguồn cung cấp

14 N18 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

15 N19 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

16 N20 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

17 N21 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

18 N22 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

19 N23 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

20 N24 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

21 N25 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

22 N26 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

Vật liệu và phương pháp

23 N27 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

24 N28 Bảy Núi, Tịnh Biên, An Giang

B Các mẫu có trình tự ITS và trnK - matK trên GenBank

Tên loài Accession number

32 Boesenbergia aff burttiana Sakai

378

AB097226

43 Smithatris supraneanae W.J Kress

49 Zingiber sp Takano cult 21 (KYO) AB049291

* nhóm ngoài

Vật liệu và phương pháp

Máy đo pH Digimed DM-21

Bộ thiết bị điện di ngang, gel agarose, Advance Mupid EXu

Bộ thiết bị đọc gel Dolphin Doc (Wealtec)

Máy PCR BioRad MyCycle

Máy đo quang phổ UV-VIS

Micropipette và các loại đầu tip tương ứng từ hãng BIOHIT: 0.1 - 3µL,

2 - 20 µL, 10 - 100 µL, 20 - 200 µL, 100 - 1000 µL, 1 - 10mL

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Chiết tách và tinh sạch DNA

 Nguyên vật liệu

Nitơ lỏng (Sovigaz)

Tris - HCl: cân Tris - base ở nồng độ cần dùng, hòa tan trong 80% lượngnước, thêm HCl, dùng máy đo pH để chỉnh dung dịch về pH 8,0; thêm nướcvừa đủ Lưu ý nhiệt độ tăng 1oC thì pH giảm khoảng 0,03 đơn vị

EDTA 0,5 M pH 8: hòa tan Na2EDTA trong nước, điều chỉnh pH đến 8 bằngNaOH, thêm nước vừa đủ 1 lít

Isopropanol

Vật liệu và phương pháp

Nuclei lysis buffer (N.L.B): 1,4 M NaCl; 0,1 M Tris - HCl (pH 8.0); 20 mMEDTA; 2% PVP - 40; 1% 2 - mercaptoethanol.

Extraction buffer (CTAB 2%, PVP 2%, NaCl 5M, Tris - HCl 1M, EDTA0.5M)

Chloroform : isoamylalcohol (24:1)

Cồn tuyệt đối và cồn 70%

TE0,1 (10 mM Tris Cl, pH 7,4 và 0,1 mM EDTA) : phối hợp 0,5 mL Tris HCl 2 M; pH 7,4 và 20 ml EDTA 0,5 M (pH 8); thêm 99,48 mL nước Tiệttrùng bằng lò hấp, bảo quản ở nhiệt độ phòng

-RNase 10 mg/mL: hòa tan 10 mg/mL -RNase trong TE, đun sôi 10 phút đểdiệt DNase Chia thành các phần nhỏ và bảo quản -20 oC

 Tiến hành chiết DNA từ lá [16]

1 Cân lượng mẫu khoảng 100 mg

2 Nghiền mịn mẫu với nitơ lỏng bằng bộ cối chày rồi cho vào tuýp 1,5 mL

3 Thêm 600 µL dung dịch đệm chiết N.L.B và 3 L RNase, ủ 60 oC trong 1giờ, lắc tay định kỳ

4 Thêm đồng lượng Chloroform : Isoamylalcohol, lắc mạnh trong 1 phút, sauđó để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

5 Ly tâm 10000 vòng/phút, trong 10 phút, sau đó lấy dịch nổi (lớp trên) sangtuýp mới

6 Thêm đồng lượng Chloroform : Isoamylalcohol, lắc mạnh trong 1 phút, sauđó để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

7 Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, sau đó lấy dịch nổi (lớp trên) sangtuýp mới

8 Cho vào 2/3 thể tích isopropanol, lắc đều, ủ ở -20 oC trong 1 giờ, sau đó lytâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, rồi bỏ isopropanol lấy phần cắn

9 Rửa cắn với 1 mL ethanol 70%, sau đó ly tâm 10000 vòng/phút trong 1 phút,

để khô cồn

Vật liệu và phương pháp

10 Hòa tan cắn trong 50 µL dung dịch bảo quản đệm TE0,1 và bảo quản ở-20 oC.

 Tiến hành chiết DNA từ củ [1]

1 Cân lượng mẫu khoảng 100 mg

2 Nghiền mịn mẫu với nitơ lỏng bằng bộ cối chày rồi cho vào tuýp 1,5 mL

3 Thêm 600 L dịch EB, lắc liên tục trong đá khoảng trong 5 phút Sau đó, lytâm 10000 vòng/phút, trong 10 phút, lấy phần cắn

4 Tương tự từ bước 3 đến bước 10 như ở qui trình li trích DNA từ lá

2.3.2 Kiểm tra dịch chiết DNA

Pha loãng dịch chiết DNA trong nước cất để đạt độ pha loãng 300 lần

Tiến hành đo quang ở 3 bước sóng: 230 nm (A230), 260 nm (A260), và 280 nm (A280)

Cách tính nồng độ DNA khi đo quang

Dung dịch đệm TAE 1X: pha từ dung dịch mẹ TAE 50X

Agarose tinh khiết dùng cho điện di (Merck)

Dung dịch ethidium bromide 10 mg/mL

Dung dịch đệm nạp mẫu (loading buffer) 10X (Promega)

Thang DNA chuẩn 1 Kb hoặc 100 bp (Promega)

 Tiến hành

Vật liệu và phương pháp

Đổ gel: cân agarose vào 60 mL đệm TAE 1X, đun đến khi tan hoàn toàn, lắcđều và làm nguội đến 50 oC, thêm ethidium bromide đạt nồng độ cuối là 1

¢g/mL, trộn đều và đổ vào khuôn, gắn lược vào, để yên trong khoảng 30phút cho thạch đông

Đặt khuôn gel vào máng điện di có chứa TAE sao cho dung dịch đệm ngập trêngel khoảng 1 cm, giếng lược của bản thạch đặt về phía cực âm

Pha các mẫu DNA với lượng thích hợp dung dịch đệm tải 10X, nạp mẫu vào cácgiếng, chạy song song với thang DNA chuẩn

Chạy ở dòng điện 100 Volt, 30 - 60 phút

Quan sát các băng DNA trên hộp đèn cực tím bước sóng 254 nm

2.3.4 PCR-RAPD các mẫu ngải

 Nguyên vật liệu

25 mẫu ngải

Hóa chất PCR

Mồi: danh sách các mồi được liệt kê trong Bảng 2.2, do IDT cung cấp

Bảng 2.2 Các mồi sử dụng trong phân tích RAPD [1], [7], [16], [18], [28], [39]

Vật liệu và phương pháp

11 OPN 09 5’-TGC CGG CTT G - 3’

24 OPB 14 5’ - TCC GCT CYG G - 3’

 Tiến hành

- Pha các thành phần phản ứng trong tuýp 0,2 mL như trong Bảng 2.3

- Chạy máy PCR theo chương trình ở Bảng 2.4

- Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 2%

có nhuộm với ethidium bromide nồng độ cuối 1 mg/mL Điện di được thựchiện trong 45 phút, ở 60 V, trong dung dịch TAE 1X, sử dụng thang chuẩn

DNA khuôn 50 ng

Bảng 2.4 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR-RAPD

2.3.5 PCR và giải trình tự vùng ITS

 Nguyên vật liệu

25 mẫu ngải

Hóa chất PCR

Mồi: danh sách các mồi được liệt kê trong Bảng 2.5, do IDT cung cấp

Bảng 2.5 Các mồi sử dụng khuếch đại và giải trình tự đoạn ITS [27]

1 ITS2 - 5P 5’- GGA AGG AGA AGT CGT AAC AAG G -3’

2 ITS2 - 8P 5’- CAC GCT TCT CCA GAC TAC A -3’

3 ITS2 - 2K 5’- GGC ACA ACT TGC GTT CAA AG -3’

4 ITS2 - 3P 5’- GCA TCG ATG AAG AAC GTA GC -3’

 Tiến hành

- Pha các thành phần phản ứng trong tuýp 0,2 mL như trong Bảng 2.6

- Chạy máy PCR theo chương trình ở Bảng 2.7

- Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

có nhuộm với ethidium bromide nồng độ cuối 1 mg/mL Điện di được thựchiện trong 20 phút, ở 90 V, trong dung dịch TAE 1X, sử dụng thang chuẩn

100 bp

- Sản phẩm PCR sau kiểm tra được tinh chế bằng bộ kit Wizard SV Gel và

PCR Clean-up System (Promega) và giải trình tự (tại Công ty Nam Khoa)bằng 4 mồi gồm 2 mồi PCR và thêm 2 mồi là ITS2 - 2K và ITS2 - 3P

Vật liệu và phương pháp

Hình 2.1 Sơ đồ mô tả vị trí các mồi dùng trong giải trình tự đoạn ITS.

Bảng 2.7 Chu trình nhiệt trong phản ứng PCR vùng ITS

Mồi: danh sách các mồi được liệt kê trong Bảng 2.8, do IDT cung cấp

Bảng 2.8 Các mồi sử dụng khuyếch đại và giải trình tự vùng trnK [21], [22], [23].

ITS8P

STT Mồi Trình tự

4 mIF 5’- GTT CAG TAC TTG TGA AAC GTT -3’

5 mIR 5’- CGT TTC ACA AGT ACT GAA CTA -3’

6 m8Fa 5’- TAC TTC GAC TTT CCT GTG CC -3’

 Tiến hành

- Pha các thành phần phản ứng trong tuýp 0,2 mL như trong Bảng 2.9

- Chạy máy PCR theo chương trình ở Bảng 2.10

- Kết quả PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%

có nhuộm với ethidium bromide 1 mg/mL Điện di được thực hiện trong 20phút, ở 100 V, trong dung dịch TAE 1X, sử dụng thang chuẩn 1 kb

- Sản phẩm PCR sau kiểm tra được tinh chế bằng bộ kit Wizard SV Gel và

PCR Clean-up System (Promega) và giải trình tự (tại Công ty Nam Khoa)bằng 6 mồi gồm 2 mồi PCR và thêm 4 mồi là mIF, mIR, m8Fa, m8R

Hình 2.2 Sơ đồ mô tả vị trí các mồi dùng trong giải trình tự đoạn trnK.

Bảng 2.9 Thành phần của phản ứng khuếch đại vùng trnK.

Bảng 2.10 Chu trình luân nhiệt cho phản ứng khuếch đại vùng trnK.

2.3.7.1 Phân tích đa hình từ RAPD

Thiết lập ma trận nhị phân từ kết quả PCR – RAPD với nguyên tắc “1” nghĩa là có

sự xuất hiện vạch khuếch đại, “0” là không có vạch khuếch đại Chỉ các băng rõ, ổnđịnh và lặp lại có kích thước 150 - 2500 bp được dùng trong phân tích dữ liệu Cácvạch mờ được loại bỏ

Để hiển thị mối quan hệ di truyền giữa các mẫu khảo sát, 1 sơ đồ hình cây được xâydựng dựa trên chỉ số tương ứng đơn giản SM (simple matching coefficient) và xếp

Vật liệu và phương pháp

nhóm các mẫu theo phương pháp UPGMA (unweighted pair group method witharithmetic mean), sử dụng phần mềm NTSYS - pc 2.1.

2.3.7.2 Phân tích trình tự và dựng cây phát sinh loài dựa vào trình tự ITS và

- Đọc contig các trình tự ITS và trnK của 25 mẫu ngải sau khi giải bằng cách

so sánh các trình tự ngược và xuôi (SeqMan)

- Xác định vùng matK thuộc gene trnK (SeqBuilder).

2 Sắp xếp thẳng hàng các trình tự (Mega 4.0)

- Gióng hàng (align) vùng ITS và matK bằng chương trình clustal - W với các

thông số thiết lập cho DNA là gap opening penalty = 15 [26], [27], [11],[42], gap extention penalty = 6,66

- Đồng nhất hóa mẫu

3 Chọn mô hình tiến hóa, các phương pháp dựng cây

- Chọn mô hình tiến hóa (jmodeltest 0.1).

- Dựng cây bằng phương pháp maximum parsimony (MP) (seaview).

- Dựng cây bằng phương pháp maximum likelihood (ML) (seaview).

- Dựng cây bằng phương pháp neighbour joining (NJ) (Mega 4.0).

4 Phân tích sự phát sinh loài

- Đọc cây tiến hóa.

- Kiểm tra cây tiến hóa (giá trị bootstrap, chiều dài cây…).

5 Hiển thị kết quả cây phát sinh loài (treeview)

Vật liệu và phương pháp

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Đa dạng di truyền các mẫu ngải bằng kỹ thuật PCR - RAPD

3.1.1 Kết quả PCR-RAPD

Với 24 mồi khảo sát, chúng tôi chọn ra được 8 mồi cho băng đa hình rõ với tất cảcác mẫu ngải Các mồi đó là: OPE 07, OPN 09, OPP 08, OPX 01, OPX 04, OPX 14, OPX 15 và OPZ 03 Để phát hiện sự đa hình, 08 mồi sau sàng lọc đã được

sử dụng trong phản ứng PCR trên DNA tổng số thu được từ các mẫu của 25 cây họGừng Kết quả phân tích đa hình được trình bày trong Bảng 3.1 Tổng số băngkhuếch đại thu được sau phản ứng PCR là 1448 băng Trung bình mỗi mồi khuếchđại được 181 băng Số băng khuếch đại dao động trong khoảng từ 137 đến 231băng/mồi Tỉ lệ băng đa hình là 100% Tuy tỉ lệ băng đa hình cao, nhưng không mồinào có thể được sử dụng làm marker để nhận diện các mẫu khác nhau (xem thêmphụ lục B)

3.1.2 Phân tích mối quan hệ di truyền giữa các mẫu ngải

Tỉ lệ tương đồng giữa các mẫu được trình bày trong Bảng 3.2 Các mẫu có hệ sốtương đồng ở mức độ khá, từ 57% đến 76% Thấp nhất là mối tương quan giữa mẫuN29 với mẫu N1 và N4 (57%) và cao nhất là mối tương quan giữa mẫu N22 và mẫuN13 (76%) (Bảng 3.2) Sơ đồ hình cây (Hình 3.1) thể hiện mối tương quan về ditruyền giữa các mẫu ngải Sơ đồ này dựa trên hệ số tương ứng đơn giản SM, xếpnhóm bằng thuật toán UPGMA theo phương pháp SAHN Ở mức độ tương đồng là63%, 25 mẫu ngải này có thể được chia thành 2 nhóm lớn Nhóm I gồm 1 cá thểduy nhất là N4, nhóm II bao gồm 24 mẫu còn lại (Bảng 3.3)

Kết quả và bàn luận

Bảng 3.1 Các mồi RAPD chọn lọc, số sản phẩm khuếch đại, số băng đa hình và tỉ

Bảng 3.2 Tỉ lệ tương đồng giữa các mẫu khảo sát dựa trên hệ số tương ứng đơn giản (SM coefficient).

N1 N2 N3 N4 N5 N6 N7 N8 N9 N10 N11 N12 N13 N18 N19 N20 N21 N22 N23 N24 N25 N26 N27 N28 N29 N1 1.00

Kết quả và bàn luận

N10

N1 N2 N3 N24 N13 N21 N18 N19 N23 N20 N28 N7 N8 N9 N10 N11 N22 N25 N27 N26 N12 N5 N6 N29 N4

Hình 3.1 Sơ đồ cây thể hiện mối tương quan về di truyền giữa 25 mẫu ngải trên cơ sở kiểu gene.

Bảng 3.3 Phân nhóm di truyền các mẫu ngải.

Nhóm Phân

nhóm

Phân nhómphụ

Tiểu nhóm A bao gồm 2 mẫu là N1 và N2 với mức độ tương đồng giữa chúng là73,6% Tiểu nhóm B gồm 9 mẫu là: N3, N13, N18, N19, N20, N21, N23, N24 vàN28 Trong 9 mẫu này thì mức độ tương đồng cao nhất là giữa 2 mẫu N13 và N21.Tiểu nhóm C cũng bao gồm 9 mẫu: N7, N8, N9, N10, N11, N22, N25, N26 và N27.Mức độ tương đồng cao nhất trong nhóm này là giữa 2 mẫu N7 và N8 (75%) Như vậy, qua đánh giá sơ bộ ban đầu bằng phương pháp PCR - RAPD, chúng tôi cómột số nhận định như sau:

Các mẫu ngải này khác nhau rất nhiều về kiểu gene

Kết quả và bàn luận