Thực hành vi sinh y học - Phần I kỹ thuật - Bài 1 các sử dụng và bảo quản kính hiển vi

Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân tại nhà ở xa, nên bảo quảnphân bằng cách để phân trong các dung dịch định hình fixative để trứng giun, sán không p

PHẦN MỘT

KỸ THUẬT

Bài 1

CÁCH SỬ DỤNG VÀ BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

Đa số ký sinh trùng (KST) không thể nhận thấy bằng mắt thường mà cần có những dụng cụ quang học

để phóng đại chúng lên như kính lúp, kính hiển vi Tùy theo yêu cầu của kỹ thuật, kính hiển vi còn cần

có những phụ tùng để đo kích thước KST, tụ quang nền đen,…

1 NHẮC LẠI CẤU TRÚC CỦA KÍNH HIỂN VI

Kính hiển vi là một công cụ thường dùng và quan trọng nhất của một phòng xét nghiệm KST Kính hiển

vi có thể có những hình dạng khác nhau tùy theo mẫu sản xuất, nhưng cấu tạo cơ bản giống nhau, gồm

† Màng chắn ánh sáng: để cho ánh sáng qua nhiều hay ít để vào vật kính

‡ Gương tròn dùng để lấy ánh sáng, thường có 2 mặt:

– Mặt lõm: khi sử dụng vật kính x10, x40

– Mặt phẳng: khi sử dụng vật kính x100

Những loại kính dùng ánh sáng của bóng đèn gắn trong thân máy không có gương

ˆ Tiểu xa: dùng để giữ tiêu bản được gắn với một trục có một ốc dùng để di chuyển sang trái, sang phải

và một ốc dùng để di chuyển phía trước, về sau

‰ Thân kính mang ống kính, bàn mang mẫu vật, kính tụ quang, ốc vi cấp, ốc thứ cấp và gương

Š Chân: có chức năng giữ cho kính được vững và ổn định

Cấu tạo kính hiển vi quang học

2 CÁCH SỬ DỤNG KÍNH HIỂN VI

 Đặt tiêu bản lên bàn mang tiêu bản

‚ Điều chỉnh ánh sáng với gương tròn, kính tụ quang và màn chắn sáng

ƒ Xoay trục mang vật kính x10 vào đúng vị trí

„ Vặn ốc thứ cấp để thấy rõ vật

1

… Nếu cần quan sát với độ phóng đại lớn thì đổi qua vật kính lớn hơn x40, dùng ốc vi cấp để điều chỉnh đến khi thấy rõ vật Khi sử dụng vật kính x100, ta phải dùng dầu soi kính Nhỏ 1 giọt dầu lên tiêu bản rồiđổi qua vật kính x100.

3 CÁCH BẢO QUẢN KÍNH HIỂN VI

 Đặt kính hiển vi đúng chỗ, xa hơi nóng và chỗ ẩm ướt

‚ Cầm kính hiển vi bằng thân kính, tay kia đỡ chân của kính Phải để đứng kính hiển vi, không được để kính nghiêng

ƒ Cẩn thận không làm rơi chất ăn mòn hay bất cứ một dung dịch nào lên bàn kính

„ Không được để tay ướt hay bẩn lên kính hiển vi

… Lau thị kính và vật kính bằng giấy lau kính trước và sau khi dùng Khi soi với vật kính dầu, thấm giấy lau kính với một giọt xylen để lau vật kính Sau khi lau với xylen, phải lau khô ngay bằng giấy lau kính, nếu không xylen có thể làm bong những thấu kính gắn trong vật kính

Trư

† ớc khi cất kính hiển vi, để vật kính nhỏ ở vị trí quan sát và hạ thấp ống kính bằng ốc lớn Vặn nhẹ nhàng, đừng ấn mạnh ống kính Nếu cẩn thận hơn, hạ tụ quang kính xuống Nếu tụ quang kính bẩn, laubằng giấy lau kính khô

‡ Để gương nghiêng, mặt phẳng ra phía ngoài để tránh bụi

ˆ Che kính hiển vi bằng bao của kính Cất kính vào đúng chỗ của kính, để lui vào phía trong, đừng để mấp mé phía ngoài

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Trình bày cách sử dụng kính hiển vi để quan sát một mẫu phân tươi.

2 Khi sử dụng kính hiển vi để soi lam máu, anh (chị) cần chú ý đến yếu tố nào để có thể nhìn thấy rõ

KST sốt rét (KST SR) trên phết máu nhuộm?

3 Sau khi soi lam máu tìm KST SR, anh (chị) bảo quản kính hiển vi như thế nào trước khi cất vào tủ

1 DỤNG CỤ

– Kính hiển vi 2 mắt với các vật kính x 10, x 40, x 100

– Dầu

– Giấy lau kính

– Thước trắc vi thị kính (chia thành 50 đơn vị)

– Thước trắc vi nền với 2 độ chia 0,1 và 0,01mm

ƒ Di chuyển bàn kính sao cho 2 thước nằm chồng lên nhau, vạch 0 trên thước trắc vi thị kính trùng với vạch 0 trên thước trắc vi nền.

Nhìn phía bên ph

„ ải vạch 0 của thước trắc vi nền để tìm điểm mà 1 vạch của thước trắc vi thị kính trùngvới 1 vạch của thước trắc vi nền, điểm trùng này gọi là điểm Y Khoảng cách sẽ thay đổi tùy theo các vật kính sử dụng (x10, x40, x100)

… Đếm số vạch chia trên thước trắc vi thị kính, từ số 0 đến vạch trùng lắp (Y) Đếm số vạch chia

(0,1mm) trên thước trắc vi nền từ vạch 0 đến vạch trùng lắp (Y), Tính đoạn đếm được trên thước trắc vithị kính theo công thức sau:

N = Số vạch đếm được trên thước trắc vi nền (mm)

n = Số vạch đếm được trên thước trắc vi thị kính (mm)

Ví dụ: Ở vật kính x10, ta có N = 0,3mm, n = 40

Ví dụ: Đo chiều dài của trứng giun kim.

Đặt tiêu bản lên bàn kính, quan sát trứng với vật kính ´10, chiều dài của trứng giun kim tương ứng với 8khoảng chia của thước trắc vi thị kính

Ta đã có đơn vị thị kính ở vật kính x10 là 7,5mm, chiều dài của trứng giun kim sẽ là 7,5mm x 8 = 60mm

Lưu ý:

– Mỗi độ phóng đại của vật kính (x10, x40 và x100) có đơn vị thị kính khác nhau, vì mỗi vạch của thướctrắc vi nền sẽ thay đổi kích thước trong khi vạch của thước trắc vi thị kính vẫn duy trì kích thước cũ Vì vậy, cần phải chuẩn độ cho từng loại vật kính và ghi lại các đơn vị này lên kính hoặc tờ giấy dán gần kính để dễ tra cứu

– Khi muốn có số đo của KST thì chỉ cần nhân số vạch đo được với đơn vị thị kính để có kích thước thật

– Sau khi mỗi vật kính đã được chuẩn độ, ta không trao đổi thị kính chứa thước trắc vi và những vật kính của kính hiển vi này với thị kính hoặc vật kính của kính hiển vi khác Phải sử dụng vật kính và thị kính đã được chuẩn độ

– Nên chuẩn độ định kỳ để bảo đảm tính chính xác

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Tạo sao cần phải biết kích thước của KST?

2 Trình bày cách tính đơn vị thị kính.

3 Làm thế nào để đo kích thước của trứng giun đũa?

3

có thể không phát hiện được mầm bệnh

1.1 Chuẩn bị bệnh nhân trước khi lấy phân

Nhiều kết quả xét nghiệm phân là âm giả tạo do bệnh nhân không được hướng dẫn đầy đủ hay hướng dẫn không đúng cách Phải hướng dẫn bệnh nhân một cách cẩn thận; tốt nhất là phòng thí nghiệm đưa cho bác sĩ điều trị những bản in sẵn những chi tiết cần thiết để phát cho bệnh nhân được chỉ định xét nghiệm phân

Dặn bệnh nhân trong 3 ngày trước khi lấy bệnh phẩm, tránh dùng những loại thuốc và thực phẩm có thể làm cho việc nhận dạng KST khó khăn như:

– Thuốc: Bismuth, Magnesium, Kaolin, Baryte, thuốc đặt vào hậu môn có dầu, mỡ

– Thực phẩm nhiều cặn bã: ngũ cốc, bắp cải, salad, quả có nhiều hạt nhỏ, nhiều chất béo, dầu, mỡ.Bệnh nhân nên ăn chế độ ít chất bã như: bánh, đồ ăn loãng, trứng, sữa, gan,…

– Lượng phân cần lấy:

+ Thay đổi tùy theo mục đích và kỹ thuật xét nghiệm, thường chỉ cần khoảng 5 – 10 gam phân (khoảng bằng hạt lạc) để có thể đủ làm nhiều phương pháp

+ Trong một số trường hợp như tìm giun, đốt sán, các bệnh về bộ tiêu hoá phải lấy toàn bộ số lượng phân được thải ra để có thể thấy được KST và màng nhày hay mô bì bị tróc ra cùng với phân

1.2.2 Ngoài phòng xét nghiệm

Lấy phân ở ngoài phòng xét nghiệm là điều bất đắc dĩ, cần tôn trọng những nguyên tắc sau:

– Phải gửi đến phòng xét nghiệm trong thời gian ngắn nhất, đặc biệt là đơn bào, phân phải luôn được giữ ấm

– Không được giữ ở nhiệt độ lạnh quá

– Nếu ở xa: giữ hộp phân trong nước ấm 37oC và đồng thời lấy một chút phân cho vào một trong nhữngdung dịch cố định:

+ MIF: Merthiolate Iod Formol

PVA: Polyvinyl Alcohol

F2AM: Formol + Phenol + Alcool + Xanh Methylene

1.3 Thời gian xét nghiệm phân

Sau khi thu hồi bệnh phẩm cần xét nghiệm ngay, càng sớm càng tốt Thời gian từ khi lấy mẫu đến khi khảo sát:

– Phân bình thường cần xét nghiệm trong vòng 12 – 24 giờ hoặc có thể để 1 – 2 ngày trong tủ lạnh.– Phân mềm, nhão, lỏng hay có màng nhày và máu cần phải xem ngay trong vòng 30 phút sau khi lấy Trong trường hợp sau khi lấy phân mà chưa xét nghiệm ngay hoặc lấy phân tại nhà ở xa, nên bảo quảnphân bằng cách để phân trong các dung dịch định hình (fixative) để trứng giun, sán không phát triển, đơn bào không bị thoái hóa

2 HÓA CHẤT BẢO QUẢN PHÂN

– Để bảo quản hình thể và ngăn sự phát triển tiếp tục của trứng và ấu trùng giun, sán, phân được đựngtrong chất bảo quản ngay lập tức sau khi lấy (bệnh nhân lấy) hoặc khi phòng xét nghiệm nhận bệnh phẩm

– Một số chất cố định được ưa dùng là: formol, sodium acetat–acetic acid–formol (SAF), dung dịch Schaudinn, polyvinyl alcohol (PVA)

– Khi chọn phương pháp cố định, phải đảm bảo chất cố định được chọn phù hợp với kỹ thuật xét nghiệm sẽ làm Vì mỗi chất cố định có tính chất riêng, không thể dùng cho tất cả các loại kỹ thuật xét nghiệm

Ghi chú: Formaldehyd bán thị trường thường chỉ 37 – 40% HCHO, tuy nhiên vẫn được xem là 100%

Bào nang đơn bào, trứng nang của trùng bào tử, trứng giun, sán và ấu trùng được bảo quản lâu dài trong formol 10% Formol nóng (60OC) có thể dùng đối với bệnh phẩm có trứng giun, sán (vì trong formol lạnh, một vài loại trứng dày sẽ tiếp tục phát triển, gây nhiễm và sống trong một thời gian dài).Lấy vài gram phân trộn kỹ trong dung dịch formol 5 – 10%

– Không bảo quản thể hoạt động

– Hình dạng KST không đẹp trên phết nhuộm cố định

2.2 Sodium acetat – acetic acid formol (SAF)

SAF được dùng để bảo quản trứng và ấu trùng giun, sán, bào nang và thể hoạt động đơn bào, trứng

nang trùng bào tử và bào tử Microsporidia

Bệnh phẩm cố định trong SAF đều dùng được với phương pháp tập trung phân và làm phết nhuộm cố định Khi làm phết phân để nhuộm, nên trộn thêm albumin vào phân để tăng độ dính của bệnh phẩm vào lam kính

SAF được coi là chất cố định mềm hơn thủy ngân clorua Hình dạng KST sẽ không sắc nét bằng khi cố định trong dung dịch có thủy ngân clorua Kết hợp cố định SAF với nhuộm hematoxylin sắt cho hình dạng tốt hơn nhuộm Trichrome

– Thành phần:

Pha chế Albumin Mayer: trộn một thể tích lòng trắng trứng với một thể tích glycerin Cho một giọt hỗn

hợp này lên lam kính, cho thêm một giọt cặn lắng phân SAF, trộn đều, để khô ở nhiệt độ phòng 30 phút rồi nhuộm

Ưu điểm:

– Dùng cho tiêu bản tập trung và cố định

– Không có hợp chất thủy ngân

– Dễ pha chế, bảo quản lâu

– Cặn lắng có thể làm kỹ thuật miễn dịch men

Nhược điểm:

5

Dung dịch thủy ngân clorua bão hoà:

Dùng một cốc để chưng, đun sôi đến khi thủy ngân clorua tan Để yên vài giờ đến khi tạo tinh thể.Dung dịch cố định Schaudinn (dung dịch mẹ):

Thêm 5ml acid acetic lạnh vào 100ml dung dịch mẹ ngay khi sử dụng

Ưu điểm:

– Cố định tiêu bản từ mẫu phân tươi hoặc niêm mạc ruột

– Bảo quản tốt thể hoạt động và bào nang đơn bào

Nhược điểm:

– Không khuyến cáo dùng trong phương pháp tập trung

– Dung dịch có chứa thủy ngân clorua, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải

– Ít dính với bệnh phẩm lỏng hoặc nhày

2.4 Polyvinyl alcohol (PVA)

PVA là một nhựa dẻo phối hợp với dung dịch cố định Schaudinn Bột PVA được dùng như chất dính cho bệnh phẩm phân khi hỗn hợp phân – PVA được trải trên lam kính, còn việc cố định vẫn là dung dịch Schaudinn

Dung dịch cố định PVA được dùng để bảo quản tất cả các thể của KST đường ruột, nhất là bào nang

và thể hoạt động đơn bào cho những kỹ thuật chuyên sâu

PVA cũng được dùng để cố định bệnh phẩm cần gửi qua bưu điện đến những phòng thí nghiệm

chuyên sâu, rất tốt với bệnh phẩm lỏng và pha theo tỷ lệ 3 phần PVA với 1 phần phân

Cách pha chế:

Trộn các dịch lỏng vào cốc 500ml, thêm bột PVA vào (không khuấy) Đậy cốc bằng đĩa Petri lớn, giấy sáp hoặc lá kim loại, để qua đêm Đun từ từ đến 75oC, lấy cốc ra và khuấy trong khoảng 30 phút đến khi có dung dịch đồng nhất như sữa

Ưu điểm:

– Có thể làm tiêu bản cố định và phương pháp tập trung

– Bảo quản tốt bào nang và thể hoạt động đơn bào

– Bảo quản lâu (hàng năm) trong lọ kín ở nhiệt độ phòng

– Bệnh phẩm có thể gửi bằng bưu điện đến phòng thí nghiệm chuyên sâu

– Trứng Trichuris trichura và bào nang Giardia lambia trong phương pháp tập trung dễ nhận ra như

trong phương pháp formol–ether

Nhược điểm:

– Hình dạng ấu trùng Strongyloides stercoralis không đẹp như cố định bằng formol Trứng nang

Isospora belli có thể không quan sát được (formol tốt hơn).

– Dung dịch có chứa thủy ngân, nên đặt ra vấn đề xử lý nước thải

– Có thể trở nên trắng và sệt do mất nước hay do làm lạnh

– Khó pha chế trong phòng thí nghiệm

– Không thể dùng tiêu bản để làm kỹ thuật miễn dịch men

2.5 PVA cải tiến

PVA được cải tiến không chứa thủy ngân, mà thay vào đó người ta dùng sulfat đồng hoặc sulfat kẽm Sulfat đồng không cho kết quả tốt như thủy ngân clorua Sulfat kẽm được dùng trong nhuộm Trichrome

Ưu điểm:

– Dùng được cho phết nhuộm cố định và phương pháp tập trung

– Không chứa thủy ngân

– Cố định bằng sulfat kẽm cho kết quả tốt hơn vì thế nhiều người thích dùng PVA có chứa sulfat kẽm hơn sulfat đồng

Nhược điểm:

– Hình dạng của bào nang và thể hoạt động đơn bào khó thấy khi cố định bằng sulfat đồng, đặc biệt khi

so sánh với thủy ngân clorua

– Đặc điểm cấu tạo của đơn bào khi nhuộm không ổn định: có thể rõ, có thể không rõ Vì vậy, việc định

danh có thể gặp khó khăn, đặc biệt đối với những bào nang của đơn bào nhỏ như Endolimax nana

3 KỸ THUẬT LƯU GIỮ KÝ SINH TRÙNG TRONG BỆNH PHẨM

Giữ bệnh phẩm ở 40oC, có thể giữ được trứng giun, sán và bào nang đơn bào nhiều ngày, nhiều tuần

mà vẫn có thể định danh được dễ dàng Muốn giữ lâu phải dùng dung dịch định hình

3.1 Trứng, ấu trùng giun, sán và bào nang đơn bào

a) Lưu giữ trên tiêu bản làm từ phân ướt

– Để tránh loang phải dùng lam kính sạch, rửa sạch mỡ trong dung dịch đồng thể tích cồn – ether.– Để tránh khô do tiếp xúc với không khí, không bay hơi, người ta hàn tiêu bản bằng:

+ Vaselin: mẫu không giữ lâu hơn vài giờ, dùng để quan sát KST sống

+ Paraffine:

Loại paraffine dùng cho mô học, hơ nóng chảy hay để ở tủ ấm 56oC Phương pháp này dễ thực hiện nhưng tiêu bản dễ bị vỡ khi va chạm

+ Thuốc sơn móng tay:

* Phải để tiêu bản bốc hơi, khô bớt ở viền hàn, ấn xem còn hở không Sau đó hàn lần thứ 2 và để khô Phương pháp này giản dị không cần dụng cụ đặc biệt

* Nếu hàn kín, mẫu lưu giữ tốt, trứng giun, sán còn nguyên vẹn; ngược lại bào nang và dạng hoạt động lưu giữ không tốt

b) Lưu giữ KST lâu dài

Dùng dung dịch formol mà nồng độ tùy thuộc vào độ cứng của phân (phân rắn dùng formol 5%; phân sệt: formol 10%), phân có trứng giun có sức chịu đựng cao (20%, F2AM)

– Quy trình thực hiện:

Cho phân vào dung d ịch cố định theo thể tích:

1 thể tích phân + 3 thể tích dung dịch bảo quản

‚ Nghiền đều, lược qua lưới kim loại để loại những cặn bã lớn

ƒ Để 1 phút ở bình thủy tinh có chân để loại trừ những phần tử nặng

„ Đổ phần trên vào chai có nút và có nhãn

… Ghi KST có trong mẫu, ngày lấy mẫu, nồng độ dung dịch cố định

+ KST được giữ tốt ở cặn lắng trong chai

+ Để làm giảm sự bốc hơi của formol, thêm vào dung dịch bảo quản 10% glycerine

Đối với dạng hoạt động của amíp

+ Dùng dung dịch cố định và lưu giữ kể trên, dung dịch formol 10% chỉ giữ được amíp vài tuần, sau đó amíp sẽ bị ly giải

+ Dung dịch MIF: dung dịch này đắt tiền nhưng giữ được dạng hoạt động của amíp nhiều năm

+ Dung dịch PVA: giữ được dạng hoạt động của amíp và có thể làm phết nhuộm Hematoxyline sắt.Đối với dạng hoạt động của trùng roi đường ruột:

Những cách kể trên đều dùng được nhưng không tốt vì những dạng hoạt động thường thu tròn lại, không thấy được như khi quan sát trực tiếp Dung dịch tương đối tốt là MIF, F2AM

3.2 Giun, sán trưởng thành

a) Giun, sán tìm thấy đã chết trong phân

– Ít có giá trị vì chúng thường đã bị hủy hoại

– Hóa chất thường dùng là formol 5% hoặc cồn ethylic 700

b) Giun, sán còn sống trong phân

– Rửa bằng nước muối sinh lý

– Phương thức cố định thay đổi tùy theo loại giun, sán:

+ Giun:

* Lấy giun ra khỏi nước rửa để trong hộp Petri hay bát sứ

7

* Đổ ngay cồn ethylic 700 sôi (đun sôi cồn trong bình Erlenmeyer có khuấy từ) Cách cố định này làm giãn giun ngay lập tức.

* Giữ trong bình thủy tinh có nút mài Không đậy bằng nút bấc hay cao su vì sẽ làm hư mẫu mau chóng

Lưu ý:

* Không cố định bằng cồn lạnh

* Không làm chết giun trong NaCl 0,85%

* Không dùng dung dịch formol

* Lưu mẫu trong cồn 700, trong chai thủy tinh nút mài hoặc nút cao su

c) Loại giun có kích thước nhỏ

– Để từng lô giun trong ống nghiệm chứa cồn ethylic 700, đậy nút bông gòn không thấm nước, bao miệng

– Phải dán nhãn, viết ngày bằng bút mực tàu, bút mỡ

– Để cả lô vào bình có nắp, dưới lót bông thấm nước, đổ đầy cồn ethylic 700, đậy nắp Tránh cồn bay hơi (nắp phải có vòng cao su)

3.3 Những điều cần biết khi lưu giữ KST lâu dài

– Giun mất độ trong và màu tự nhiên: khi bị cố định trở nên đục và hơi trắng nhưng giữ được rất lâu trong cồn

– Trứng giun, sán thì dễ nhận nhưng không giống hệt như trong phân tươi Vài loại trứng như trứng giun đũa, trứng giun móc sẽ bị phân bào nếu dung dịch cố định không đủ nồng độ (dạng phân bào không bao giờ gặp trong phân tươi)

– Bào nang đơn bào ở dạng tươi thì nhân có màu kém Sau một thời gian lưu, những nhân này không nhuộm màu nhưng lại rõ hơn là ở trạng thái tươi

– Dạng hoạt động của amíp mất nhanh chóng độ chiết quang trong dung dịch formol

– Trong MIF, amíp không bị ly giải, nhận ra dễ Ngược lại, sau khi để trên lam kính và đậy bằng lá kính, màu của chúng biến mất, không thể dùng làm mẫu để lâu dài trên lam kính và lá kính

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Thế nào là thu thập phân đúng quy cách?

2 Đối với anh (chị), điều gì quan trọng trong khâu thu thập phân?

3 Theo anh (chị) hiện nay, các phòng xét nghiệm trong nước ta có chú trọng đến việc lấy bệnh

phẩm? và kết quả của việc có/không chú trọng đến việc lấy bệnh phẩm là gì?

4 Bảo quản bệnh phẩm có ích lợi gì?

5 Nêu tên những hóa chất bảo quản phân thường được dùng, cho biết ưu và nhược điểm của từng

hóa chất bảo quản được nêu

6 Cách bảo quản đơn bào khác với cách bảo quản giun, sán như thế nào?

7 Hóa chất bảo quản có ảnh hưởng gì đến KST khi KST được ngâm trong thời gian lâu dài?

Bài 4

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TÌM KÝ SINH TRÙNG

I ĐẠI CƯƠNG

Trong phòng xét nghiệm, khi nhận được bệnh phẩm, nếu là phân tươi không có chất bảo quản, chúng

ta cần quan sát bằng mắt (đại thể) trước để có được những nhận xét sơ bộ về mẫu phân, ghi nhận những đặc tính của mẫu phân, phân loại bệnh phẩm để xét nghiệm: mẫu phân lỏng, có chất nhày, máu phải xét nghiệm ngay

Không nên để phân ngoài trời, không có nắp đậy; không nên để lọ phân trên phiếu xét nghiệm hoặc để dồn mẫu vào cuối buổi mới xét nghiệm

Đối với phân được bảo quản trong dung dịch cố định thì quan sát đại thể không thực hiện được

Để phát hiện được KST chúng ta cần phải dùng kính hiển vi để quan sát (vi thể)

Quan sát vi thể có thể được thực hiện với kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp, tập trung KST trong phân,

kỹ thuật chuyên biệt, cấy và nhuộm cố định

II KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM PHÂN TRỰC TIẾP

Kỹ thuật xét nghiệm phân trực tiếp sử dụng phân hòa tan trong nước muối cho phép phát hiện sự di động của thể hoạt động đơn bào, trứng giun, sán, ấu trùng giun và các vật thể bất thường trong phân (hồng cầu, bạch cầu,…)

3 QUY TRÌNH LÀM TIÊU BẢN PHÂN

 Lấy một tấm lam kính sạch, khô Dùng viết chì sáp chia lam kính ra làm 3 phần Ghi tên bệnh nhân vào

ô nhỏ ở đầu lam kính

‚ Nhỏ lên lam kính 1 giọt NaCl 0,85% vào ô giữa, 1 giọt Lugol ở ô cuối

9

ƒ Dùng que gỗ lấy một ít phân bằng đầu que diêm, hòa tan phân vào giọt NaCl 0,85%.

„ Lấy phân lần thứ hai rồi hòa tan phân vào giọt Lugol

… Bỏ que gỗ vào dung dịch sát trùng

† Đậy lá kính lên 2 giọt phân

‡ Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển

4 TIÊU CHUẨN CỦA MỘT TIÊU BẢN TỐT

– Không quá dày: phân nhiều sẽ làm tiêu bản đục tối, che lấp KST, khó phát hiện

– Không quá mỏng: ít phân quá sẽ không tìm thấy KST, trừ khi chúng

quá nhiều

– Tiêu bản có độ dày vừa phải khi thấy được chữ in trên tờ báo đặt dưới tiêu bản

– Tiêu bản không có bọt khí, dung dịch phân không tràn ra quanh lá kính

5 KHẢO SÁT TIÊU BẢN DƯỚI KÍNH HIỂN VI

– Khảo sát tiêu bản phân bằng vật kính x10, khi muốn nhìn rõ chi tiết thì chuyển sang vật kính x40.– Khảo sát mẫu phân theo hình chữ chi (zic zac) để không bỏ sót vi trường nào

Lưu ý:

– Nên để ánh sáng vừa phải

– Mẫu phân được xét nghiệm càng sớm càng tốt, để lâu KST sẽ chết hoặc thay đổi hình dạng, khó xác định

– Mẫu phân tìm trứng giun, sán: không để quá 10 giờ

– Mẫu phân tìm đơn bào: không để quá 2 giờ

6 NHỮNG SAI LẦM NÊN TRÁNH

– Phết phân không đều, chỗ dày, chỗ mỏng

– Nếu phết phân loãng quá hoặc đặc quá, nên bỏ đi, làm lại phết phân khác

– Đậy lá kính làm tiêu bản có bọt khí

– Dung dịch phân tràn ra xung quanh lá kính

– Quên không đặt lá kính lên phết phân thì phết phân sẽ chóng khô, vật kính bị bẩn và màu nhuộm sẽ nhạt rất nhanh

– Dùng nước thường để hòa tan phân thay vì dùng dung dịch NaCl 0,85%, nước thường sẽ làm biến dạng hay hủy hoại thể hoạt động của đơn bào

– Dùng nhiều ánh sáng quá Nên để tụ kính gần với bàn kính Giảm ánh sáng bằng cách đóng bớt màng chắn sáng hay dùng kính lọc màu xanh da trời lấy ánh sáng

7 CÁCH TRẢ LỜI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM PHÂN

Trên phiếu trả lời kết quả xét nghiệm phân, phải ghi các nội dung sau:

– Đặc tính của phân: phân cứng, mềm, nhão, có khuôn, lỏng,…

– Màu sắc của phân: vàng, xanh, nâu, đen,…

– Các yếu tố bất thường thấy được bằng mắt: chất nhày, máu, đốt sán,…

– Kỹ thuật sử dụng: soi trực tiếp, kỹ thuật tập trung Willis,…

– Kết quả:

+ Âm tính: tìm không thấy trứng và bào nang của KST đường ruột

+ Dương tính, viết ra các chi tiết sau:

* Tên tiếng Việt và tên khoa học của KST

* Trứng, thể hoạt động, bào nang, ấu trùng

* Mật độ nhiễm trên tiêu bản:

Ví dụ: Tìm thấy trứng giun đũa (Ascaris lumbricoides): (+).

– Lam kính: cho vào dung dịch sát trùng, hấp khử trùng, rửa nước thường cho sạch, ngâm vào xà bông, rửa sạch, ngâm trong dung dịch acid sulfochromic 24 giờ Rửa lại bằng nước thường, tráng lại bằng nước cất, sấy khô.

– Lá kính: rửa tương tự như lam kính nhưng chỉ sấy khô ở 600C

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Mô tả kỹ thuật làm tiêu bản phân để soi trực tiếp tìm KST.

2 Nêu những sai lầm có thể gặp khi làm tiêu bản phân soi trực tiếp.

3 Trình bày cách ghi phiếu trả lời kết quả xét nghiệm phân.

Kỹ thuật làm tiêu bản phân

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất

để làm tiêu bản phân Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để làm tiêu bản phân

2 Ghi tên bệnh nhân lên lam kính Ghi rõ tên hoặc ký hiệu, đối chiếu với tên trên

phiếu xét nghiệm

3 Nhỏ lên lam kính 1 giọt NaCl

0,85% và 1 giọt Lugol Lượng dung dịch vừa đủ, 2 giọt nước không quá gần hoặc quá xa

4 Cho phân vào giọt NaCl 0,85%

và khuấy Lượng phân vừa đủ, khuấy tan đều, tiêu bản không quá dày, không quá mỏng

5 Cho phân vào giọt Lugol và

khuấy Lượng phân vừa đủ, khuấy tan đều, tiêu bản không quá dày, không quá mỏng

6 Đậy lá kính Không có bọt khí, bọt nước Dung dịch phân

không tràn ra mép lá kính

7 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển

vi Tìm KST Soi đúng theo quy trình và quy định.

1 PHƯƠNG PHÁP LÀM NỔI

Trong phương pháp làm nổi, dùng một dung dịch hoặc hỗn hợp có tỷ trọng cao hơn tỷ trọng của các bào nang, trứng giun, sán làm cho chúng nổi lên mặt nước, chất bã lắng xuống đáy ống nghiệm Tiêu bản soi sạch, ít cặn, nhưng có một số trứng giun, sán không nổi mà chìm xuống đáy như trứng giun đũa, trứng có nắp Vì vậy, với phương pháp làm nổi, cần soi luôn cặn để không bỏ sót KST

1.1 Kỹ thuật dùng nước muối bão hòa (Phương pháp Willis)

– Phương pháp này được dùng để tìm trứng các loại giun, sán trong phân: trứng giun móc (rất tốt), giun

đũa, giun tóc, trứng sán dải (dây) và sán dải (dây) Hymenolepis sp.

– Không dùng để tìm trứng sán lá, sán máng, ấu trùng giun lươn, bào nang và thể hoạt động của đơn bào

a) Nguyên tắc

Phân được hòa tan trong nước muối bão hòa Trứng giun, sán có tỷ trọng nhẹ hơn tỷ trọng của nước muối bão hòa nên nổi trên mặt nước, dính vào thủy tinh (lá kính) và được lấy ra để quan sát dưới kính hiển vi

+ Dung dịch nước muối bão hoà:

Hoặc cho muối vào trong nước cho đến khi muối không còn tan được nữa, ta có dung dịch nước muối bão hòa

+ Dung dịch cồn – ether

* Rửa lá kính sạch dầu, mỡ bằng cồn – ether :

 Đổ dung dịch cồn – ether vào hộp Petri

‚ Cho lá kính từng chiếc vào hộp Petri, ngâm trong 10 phút

ƒ Lấy ra lau khô từng chiếc và cất trong hộp Petri để dùng dần

d) Quy trình kỹ thuật

 Cho khoảng 5g phân vào lọ penicilin hoặc ống nghiệm

‚ Đổ vào lọ một ít nước muối bão hòa, khoảng 1/3 lọ

ƒ Dùng que khuấy tan phân trong nước muối

„ Cho thêm nước muối bão hòa vào đến khi mực nước ngang miệng lọ

… Vớt bỏ các cặn bã nổi lên mặt nước

† Nhỏ thêm vài giọt nước muối bão hòa vào lọ cho đến khi mặt nước cong vồng lên (không để nước muối tràn miệng lọ)

‡ Đậy lá kính lên miệng lọ, tránh có bọt khí giữa lá kính và mặt nước

ˆ Để yên trong khoảng 10 phút

‡ Nhấc thẳng lá kính lên (lá kính mang theo giọt nước muối ở mặt dưới) và đặt lên lam kính

ˆ Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Lưu ý:

– Nếu thời gian để ngắn quá trứng sẽ chưa nổi lên

– Nếu để lâu quá trứng sẽ ngấm nước muối và chìm xuống đáy

– Thời gian dài hay ngắn tùy theo độ cao của ống nghiệm hoặc chai lọ khi sử dụng Tốt nhất nên thử thời gian trứng nổi với ống nghiệm và chai lọ khác nhau.

1.2 Kỹ thuật dùng dung dịch Sulfat kẽm

– Phương pháp này dùng để tìm trứng các loại giun và bào nang đơn bào trong phân

– Không dùng để tìm trứng sán dây, sán lá, sán máng, ấu trùng giun lươn Không dùng với phân có nhiều mỡ

 Hòa tan 5g phân với 2 – 3ml nước trong ống nghiệm

‚ Thêm nước cho đủ 10ml

ƒ Lọc dung dịch trên qua tấm gạc vào ống ly tâm

„ Ly tâm 2000 vòng/phút trong 2 phút, đổ bỏ phần nước trong bên trên

… Cho vào ống ly tâm một ít dung dịch Sulfat kẽm, khuấy đều, tiếp tục cho thêm dung dịch Sulfat kẽm vào ống cho đến cách miệng ống nghiệm khoảng 2 – 3cm

 Dùng nước hoặc nước có pha glycerin 0,5%

‚ Khuấy đều phân trong ly có chân

13

ƒ Để lắng khoảng 1 giờ.

„ Đổ bỏ phần nước nổi bên trên

… Thêm nước, khuấy đều, để lắng 1 giờ, gạn bỏ phần nước nổi

† Lập lại nhiều lần cho đến khi nước bên trên trong hẳn

‡ Gạn bỏ phần nước nổi

ˆ Khuấy đều phần cặn, lấy 1 hoặc 2 giọt cặn khảo sát dưới kính hiển vi

2.2 Phương pháp ly tâm: Kỹ thuật dùng Formol – Ether

 Dùng que gỗ lấy khoảng 5g phân cho vào trong ống ly tâm

‚ Cho 7ml dung dịch formol 10% vào ống ly tâm

ƒ Hòa tan phân và lọc phân qua lưới lọc vào ống ly tâm khác hoặc vào cốc có mỏ

„ Ly tâm 2000 vòng/phút trong 1 – 2 phút Hút bỏ phần nước nổi Có thể lặp lại nhiều lần cho đến khi phần nước nổi trong

… Cho 10ml dung dịch formol 10% và 3ml ether vào trong ống ly tâm

† Đậy ống nghiệm bằng nút cao su, trộn đều bằng cách lắc mạnh trong vòng 10 giây

‡ Mở nắp cao su, cho ống nghiệm vào máy ly tâm, quay 2000 vòng/phút trong 1 – 2 phút

ˆ Lấy ống nghiệm ra khỏi máy ly tâm, chất dịch trong ống nghiệm được chia thành 4 lớp:

– Lớp trên cùng: ether

– Lớp thứ 2: một nút gồm các mảnh với chất béo dính vào thành ống

– Lớp thứ 3: formol

– Lớp thứ 4: cặn chứa KST

‰ Dùng que gỗ tách nhẹ nhàng lớp chất béo ra khỏi thành ống bằng cách xoáy theo hình xoắn

Š Đổ bỏ 3 lớp dung dịch trên cùng bằng một động tác nhanh gọn, dốc ngược ống ly tâm

Š Dùng ống hút Pasteur lấy 1 giọt cặn nhỏ lên lam kính và khảo sát dưới kính hiển vi (có thể khảo sát cặn với dung dịch Lugol)

Lưu ý:

Ether, ethyl acetat hoặc xăng là dung môi rất dễ bay hơi và dễ cháy nên để xa nguồn điện, nguồn lửa Bảo quản các chất này trong bình hoặc chai lọ rộng, để nơi thoáng mát Không đặt các bình chứa Ethervào tủ lạnh, hơi Ether sẽ thoát ra và gây nổ

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Mục đích của phương pháp tập trung KST trong phân là gì?

2 Có bao nhiêu phương pháp làm tập trung KST trong phân?

3 Nêu ưu và nhược điểm của kỹ thuật Willis và kỹ thuật dùng formol–ether.

4 Anh (chị) sẽ chọn kỹ thuật nào để làm tập trung phân? Cho biết lý do của sự chọn lựa này.

Xét nghiệm phân theo phương pháp tập trung Wills

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa

chất để làm tiêu bản phân

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để làm tiêu bản phân

2 Cho phân vào lọ xét

3 Đổ nước muối bão hòa vào

lọ xét nghiệm

Khoảng 1/3 lọ

4 Dùng que gỗ quấy phân

Vớt bỏ cặn to (nếu có) Phân tan đều trong nước muối bão hòa, không cócặn to

Đổ thêm muối bão hòa vào

bản lên lam kính Không có bọt khí, bọt nước.

Soi kính hiển vi tìm ký sinh

trùng Soi đúng theo quy trình và quy định.

Xét nghiệm phân theo phương pháp tập trung formol–ether

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm

tiêu bản phân Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để làm tiêu bản phân

2 Cho phân vào lọ xét nghiệm Lấy nhiều nơi trên khối phân

3 Đổ dung dịch formol 10% vào lọ xét

4 Dùng que gỗ quấy phân Lọc dung dịch

5 Quay ly tâm 2000 vòng/phút trong 1-2

phút, hút bỏ nước nổi Hút bỏ nước nổi không làm xáo trộn cặn

Lặp lại giai đoạn (5) nhiều lần Phần nước nổi phải trong

6 Đổ dung dịch formol 10% vào lọ xét

nghiệm Cho thêm ether

Lấy đúng 10ml formol và 3ml ether

7 Đậy nắp ống nghiệm và trộn đều phân

với formol và ether

Nắp phải đậy kín và lắc mạnh ống nghiệm trong 10 giây

8 Quay ly tâm 2000 vòng/phút trong 1-2

phút Lấy ống nghiệm ra khỏi máy ly tâm

Lấy cẩn thận, không làm xáo trộn các lớp dịch trong ống nghiệm

15

9 Tách bỏ lớp mỡ Lớp mỡ được tách khỏi thành ống

còn nguyên vẹn, không bị nát vụn

10 Trút bỏ phần nước nổi bằng cách dốc

nhanh ống nghiệm xuống

Sau khi đổ bỏ phần nước nổi, cặn không bị xáo trộn

11 Soi kính hiển vi tìm ký sinh trùng Soi đúng theo quy trình và quy định

Bài 6

CÁC KỸ THUẬT CHUYÊN BIỆT

ĐỂ PHÁT HIỆN KÝ SINH TRÙNG ĐƯỜNG RUỘT

Trong một số trường hợp, do đặc điểm sinh học riêng biệt của một số loại giun, sán, đơn bào mà các phương pháp xét nghiệm thông thường không thể hoặc thỉnh thoảng mới phát hiện mầm bệnh trong phân

Để khắc phục tình trạng này, người ta đã nghiên cứu đưa ra các phương pháp xét nghiệm đặc thù phù hợp với những đặc điểm sinh học của từng loại KST

1 XÉT NGHIỆM TÌM TRỨNG GIUN KIM

1.1 Phương pháp GRAHAM (Phương pháp băng dính trong)

a) Nguyên tắc

Trứng giun kim thường được tìm thấy ở các nếp nhăn hậu môn, rất hiếm khi tìm thấy trong phân Vì vậy, phết hậu môn bằng keo dính được dùng để thu thập trứng giun kim Kỹ thuật này phải được thực hiện buổi sáng sớm trước khi trẻ làm vệ sinh hậu môn

– Băng keo trong

– Cây đè lưỡi hoặc muỗng dài 10cm

‚ Đặt miếng lam kính đã dán băng keo lên cây đè lưỡi sao cho cạnh nhỏ của tấm lam kính cách bờ cây

đè lưỡi bằng 1/3 chiều dài của tấm lam kính

ƒ Gỡ băng dính ra khỏi lam kính và cuộn vòng qua đầu cây đè lưỡi, mặt dính để ra ngoài

„ Giữ chặt tất cả bằng bàn tay phải

… Tay trái vạch hậu môn của trẻ, tay phải cầm cây đè lưỡi có dán băng keo ấn nhẹ, lật qua lật lại cây đè lưỡi chung quanh rìa hậu môn

† Dán miếng băng keo lên mặt lam kính, dùng bông khô và sạch chà nhẹ miết chặt miếng băng keo xuống mặt lam kính

‡ Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST.

1.2 Phương pháp GRAHAM biến đổi

– Que tăm bông

– Nước muối NaCl 0,85%

– Găng tay

b) Quy trình kỹ thuật

 Dùng que tăm bông xoay chung quanh nếp nhăn hậu môn

‚ Cho que tăm bông vào trong ống nghiệm có chứa 0,5ml NaCl 0,85%, rửa kỹ que tăm bông vào trong dung dịch nước muối

ƒ Dùng ống hút Pasteur hút nước muối ra lam kính, đậy lá kính và khảo sát dưới kính hiển vi

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST.

2 TÌM ẤU TRÙNG GIUN LƯƠN (PHƯƠNG PHÁP BAERMANN)

2.1 Nguyên tắc

Ấu trùng giun lươn có ái tính với nhiệt độ và ẩm độ cao và bị thu hút về nơi có nước ấm

2.3 Quy trình kỹ thuật

a) Lắp đặt hệ thống dụng cụ

 Đặt phễu thủy tinh hoặc plastic lên giá

‚ Đặt lưới kim loại lên phễu

ƒ Lắp ống cao su vào phễu

„ Kẹp chặt ống cao su lại

b) Thao tác

 Trên lưới kim loại đặt 2 miếng gạc

‚ Nếu phân lỏng, lót dưới miếng gạc 2 lớp giấy thấm

ƒ Đổ khoảng 150g phân tươi lên miếng gạc trên phễu

„ Đổ vào phễu nước ấm 45oC sao cho nước vừa sấp miệng phễu và ngập phân.

… Dùng bóng đèn rọi vào phễu để giữ nhiệt độ của nước

† Để yên từ 1 – 3 giờ

‡ Mở kẹp khóa ống cao su hứng nước vào cốc thủy tinh

ˆ Dùng ống hút Pasteur hút nước vào ống ly tâm

Quay ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút.‰

Š Gạn bỏ phần nước nổi

Dùng ống hút Pasteur hút cặn

Khảo sát cặn dưới kính hiển vi tìm ấu trùng

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST.

Mẫu phân cũ từ 24 – 48 giờ đôi khi thấy ấu trùng giun móc

3 PHÁT HIỆN ĐẦU SÁN DẢI (SÁN DÂY) TRONG PHÂN

– Thuốc điều trị sán dải hiện nay rất hiệu quả nên việc tìm đầu sán dải trong phân cũng không cần thiết nữa Tuy nhiên, bệnh phẩm phân cũng nên được kiểm tra đầu sán và đốt sán mang trứng để định danhloài Khi thực hiện phải lấy cả bô phân để xét nghiệm

– Hòa phân với nước và cho qua hệ thống lọc với nhiều cỡ mắt lưới từ to đến nhỏ (sắp xếp mắt lưới từ

to đến nhỏ)

– Ly tâm bỏ phần nước nổi, lấy cặn tìm đầu sán bằng kính lúp hoặc kính hiển vi

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Các phương pháp xét nghiệm phân trực tiếp có thể phát hiện được trứng giun kim, ấu trùng giun

lươn không? Tại sao?

17

2 Mô tả thao tác thu thập trứng giun kim.

3 Kỹ thuật Baermann dùng để tìm ấu trùng giun lươn, có thể phát hiện được ấu trùng giun móc

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để cấy phân

2 Lắp đặt hệ thống cấy phân Đúng theo quy trình

3 Để 2 lớp gạc lên lưới Gạc phải phủ toàn bộ mặt lưới

4 Để phân lên lớp gạc Lượng phân lớn, nguyên bô phân

5 Đổ nước ấm lên phân Nước ấm khoảng 45oC, vừa ngập phân

6 Để yên từ 1 - 3 giờ Luôn giữ nước ấm trong suốt thời gian quy

vào ống ly tâm Không rơi vãi ra môi trường.

quanh

10 Bỏ nước nổi Nhỏ 1 giọt cặn lên

lam kính Đậy lá kính Không bọt khí, không tràn nước ra quanh lá kính

11 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi

Tìm KST

Soi đúng theo quy trình và quy định

Bài 7

CẤY PHÂN

– Cấy phân đặc biệt cần thiết để phát hiện nhiễm nhẹ giun móc, Strongyloides stercoralis và

Trichostrongylus spp và để định danh ký sinh trùng.

– Ấu trùng thường gặp nhất trong phân là giun lươn

– Tùy thời gian vận chuyển trong lòng ruột và điều kiện của bệnh nhân, có thể tìm thấy ấu trùng có thựcquản phình (rhabditiform) và hiếm hơn là ấu trùng có thực quản hình ống (filariform) Cũng vậy, nếu vì một lý do nào đó mà phân bị chậm tống xuất, trứng phôi và cả ấu trùng giun móc cũng có thể tìm thấy trong phân

– Có nhiều kỹ thuật cấy: cấy qua giấy lọc Harada–Mori, cấy giấy lọc hộp thạch, cấy than

1 KỸ THUẬT HARADA – MORI

1.1 Nguyên tắc

Một thanh giấy thấm có phân được cho vào ống nghiệm có ít nước ở đáy Nước thấm dần ngược lên thanh giấy trong khi ấu trùng giun di chuyển xuống đáy ống nghiệm

1.3 Quy trình kỹ thuật

 Cho khoảng 3ml nước vào ống nghiệm

‚ Trải phân lên miếng giấy thấm, cách 2 đầu khoảng 2 – 3cm

ƒ Đặt miếng giấy vào trong ống nghiệm sao cho nước chạm vào đầu dưới của miếng giấy nhưng khôngngập đến phân

„ Lấy giấy bọc đầu ống nghiệm lại, châm lỗ để cho không khí vào trong ống nghiệm.

… Để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, theo dõi hằng ngày, từ ngày 2 – 4

† Hút nước ở đáy ống nghiệm, nhỏ 1 giọt lên lam kính

‡ Nhỏ thêm 1 giọt dung dịch Lugol, đậy lá kính, để 1 phút

ˆ Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi với vật kính x10

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST.

2 CẤY PHÂN TRONG HỘP PETRI

Kỹ thuật này giống như kỹ thuật Harada–Mori, chỉ khác là dùng hộp Petri thay vì ống nghiệm

2.2 Quy trình kỹ thuật

 Cắt giấy thấm thành hình chữ nhật 7 – 15cm

‚ Cuốn chặt giấy thấm quanh ở miếng lam kính

ƒ Trải trên mặt giấy 1 gram phân

„ Để tất cả vào đáy hộp Petri có 10ml nước cất vô trùng và luôn giữ cho đáy hộp có 1 lớp nước trong suốt thời gian cấy

… Để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm, theo dõi hằng ngày, từ ngày 2 – 4

† Hút nước ở đáy hộp Petri, nhỏ 1 giọt lên lam kính

‡ Đậy lá kính và quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi

Chú ý: Phải luôn mang găng tay trong suốt quá trình thao tác, tránh bị nhiễm KST.

3 KẾT QUẢ

Nếu kết quả cấy dương tính:

– Đầu giờ thứ 48 có thể thấy:

+ Ấu trùng giun móc

+ Ấu trùng giun lươn

– Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 4:

+ Ấu trùng giun móc

+ Ấu trùng giun lươn và giun trưởng thành đực, cái

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

Về nguyên tắc, kỹ thuật cấy phân Harada–Mori có khác kỹ thuật Baermann không?

Kỹ thuật cấy phân Harada–Mori

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để làm

tiêu bản phân Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để cấy phân

2 Cho nước cất vào ống nghiệm Khoảng 3 - 5ml vào đáy ống nghiệm

3 Trải phân lên thanh giấy, cách đầu

5 Bọc giấy miệng ống nghiệm, châm lỗ

để không khí vào ống nghiệm

Bọc giấy kín, châm những lỗ nhỏ để ruồi, kiến không chui vào được

Để ống cấy ở nhiệt độ phòng trong 2 -

4 ngày

Đủ thời gian quy định, không để nước ngập phân, không để nước cạn

6 Tháo bỏ giấy bọc miệng, hút 1 giọt

nước nhỏ lên lam kính Đậy lá kính

Bỏ giấy vào dung dịch sát trùng

Nước không tràn ra quanh lá kính

7 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi Tìm

KST

Soi đúng theo quy trình và quy định

19

Bài 8

CÁC KỸ THUẬT NHUỘM MẪU PHÂN

Phương pháp soi tươi có giá trị rất lớn trong chẩn đoán các bệnh KST nói chung, nhưng không đủ cho việc nhận dạng đơn bào Vì vậy, cần phải bổ sung thêm kỹ thuật nhuộm trong các kỹ thuật chẩn đoán bệnh KST, đặc biệt là đối với đơn bào Nhuộm cố định là kỹ thuật quan trọng nhất để xác định nhiễm đơn bào đường ruột, vì nó giúp cho việc phân biệt các bộ phận hình thể khác nhau nhờ vào sự bắt màukhác nhau của những bộ phận đó Phết nhuộm này được xem với vật kính dầu (độ phóng đại 1000 lần)

Có nhiều cách nhuộm, phổ biến nhất là nhuộm Trichrome (Wheatley – Gomori), nhuộm Haematoxylin sắt và nhuộm Zeihl – Neelsen cải tiến

1 NHUỘM TRICHOME (GOMORI – WHEATLEY)

– Cách pha và bảo quản:

+ Cho 1,0ml acid acetic vào các chất nói trên

+ Để yên trong 15 – 30 phút ở nhiệt độ phòng

+ Cho 100ml nước cất vào, dung dịch có màu tím

+ Bảo quản trong lọ thủy tinh hoặc nhựa ở nhiệt độ phòng Giữ được trong 24 tháng

b) Dung dịch cồn ethylic–Iod

– Thành phần:

– Bảo quản trong lọ màu tối

– Khi dùng pha loãng với cồn ethylic 70o cho tới khi có màu trà đậm

– Giữ được khoảng 1 tuần hoặc tới khi nào thấy màu nhạt thì bỏ

c) Dung dịch Acid – Cồn ethylic

1.3 Quy trình nhuộm

Cố định tiêu bản phân là bước rất quan trọng trong quá trình nhuộm để có được tiêu bản đẹp Trước đây, người ta thường cố định tiêu bản phân bằng dung dịch Schaudinn vì nó định hình rất tốt thể hoạt động và bào nang của đơn bào, nhưng vì dung dịch Schaudinn có thủy ngân, rất độc, nên ngày nay người ta có thể dùng dung dịch Schaudinn để cố định hay bỏ tùy người sử dụng

a) Quy trình cố định tiêu bản bằng dung dịch Schaudinn

 Nhúng ngay phết phân vừa làm xong vào trong dung dịch Schaudinn, để 30 phút hoặc qua đêm, sau

đó lấy tiêu bản ra và nhúng lần lượt vào:

b) Quy trình không dùng dung dịch Schaudinn

Nhúng tiêu bản phân vào:

Quan sát dưới kính hiển vi với vật kính dầu x100, nền sẽ có màu đỏ hay xanh lá cây, đơn bào có màu xám nhạt hay lá cây xanh nhạt

1.4 Kết quả

– Thể hoạt động và bào nang của đơn bào được nhận thấy dễ dàng

– Trứng giun, sán và ấu trùng có thể khó nhận diện vì thuốc nhuộm đậm đặc

– Có thể nhận ra nấm men, sợi tơ nấm giả và các bạch cầu

– Không thấy được trùng bào tử như Cryptosporidium sp.

2 NHUỘM HAEMATOXYLIN SẮT (SPENCER– MONROE METHOD)

+ Iod tinh thể 1– 2g

+ Cồn ethylic 70o 100ml

– Bảo quản trong lọ màu tối

– Khi dùng, pha loãng với cồn ethylic 70o cho tới khi có màu trà đậm

– Giữ được khoảng 1 tới vài tuần hoặc tới khi nào thấy màu nhạt thì bỏ

d) Dung dịch Acid – cồn ethylic

+ Cồn ethylic 90o 99,5ml

+ Acid acetic băng 0,5ml

2.4 Quy trình nhuộm

2.5 Kết quả

– Thể hoạt động và bào nang của đơn bào được nhận thấy dễ dàng

– Trứng giun, sán và ấu trùng có thể khó được nhận diện vì thuốc nhuộm đậm đặc

– Có thể nhận ra nấm men, sợi tơ nấm giả và các bạch cầu

– Không thấy được trùng bào tử như Cryptosporidium sp.

– Các trùng bào tử đường ruột (Cryptosporidium, Cyclospora…) khó được xác định bằng cách soi phân

trực tiếp Vì vậy, người ta dùng phương pháp nhuộm để tạo sự tương phản giữa màu của KST và nền cặn bã phân

– Kỹ thuật nhuộm Ziehl–Neelsen cải tiến được dùng dựa trên đặc điểm kháng acid của các KST này Nguyên tắc của kỹ thuật này là nhuộm tiêu bản phân bằng carbon fuschin, sau đó tẩy màu và nhuộm nền tiêu bản bằng màu xanh Do có tính kháng acid nên các trùng bào tử giữ lại màu hồng của fuschin – Kỹ thuật nhuộm Ziehl–Neelsen cải tiến có thể áp dụng cho phân tươi, hoặc phân được cố định trong formol, hoặc các loại bệnh phẩm khác như dịch hút tá tràng, mật, đàm (đờm)

– Xanh Malachit 1% hoặc Xanh Methylen 1%

a) Pha Carbon Fuchsin

– Dung dịch A:

– Dung dịch B:

– Trộn 10ml dung dịch A với 90ml B lại với nhau

– Bảo quản được 1 năm ở nhiệt độ phòng

b) Pha dung dịch xanh Malachit

Có thể thay xanh Malachit bằng xanh Methylen.

Bảo quản được 1 năm ở nhiệt độ phòng

c) Pha dung dịch cồn – acid chlorhydric

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Tại sao phải nhuộm phân?

2 Có mấy phương pháp nhuộm phân?

3 Mô tả phương pháp nhuộm Trichome.

4 Nêu sự khác biệt giữa phương pháp nhuộm Trichome và Haematoxylin

Kỹ thuật nhuộm Ziehl–Neelsen cải tiến

phút Để khô ngoài không khí Đúng thời gian quy định.

5 Nhuộm với carbon–Fuchsin trong

5 phút Phủ thuốc nhuộm phết phân, không nghiêng đổ

6 Rửa lam kính với nước Nhúng vào sâu vào chậu nước, tránh cặn

bám vào tiêu bản

7 Tẩy màu bằng cồn–acid cho tới

khi màu không trôi ra nữa Nếu tẩy kỹ quá (thời gian tẩy kéo dài hoặc nồng độ acid đậm) sẽ làm cho KST không

còn bắt màu sau khi nhuộm

8 Rửa dưới vòi nước chảy Dòng nước chảy vừa phải, không quá

mạnh

9 Nhuộm với 1% xanh Malachit

trong 30 giây Rửa tiêu bản dưới

vòi nước Để cho khô

Đúng quy định

10 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi

Bài 9

ƯỚC LƯỢNG SỐ GIUN BẰNG CÁCH ĐẾM TRỨNG

23

Việc ước lượng số giun trong một bệnh nhân giúp cho bác sĩ lâm sàng biết cường độ nhiễm, quyết địnhkhả năng hóa trị liệu và đánh giá hiệu quả thuốc điều trị Tuy nhiên, chỉ có vài loại giun ký sinh ở người

mới có sự tương ứng giữa số lượng trứng trong phân và số giun có trong ruột như: Ascaris

lumbricoides, Trichuris trichiura, giun móc (Necator americanus và Ancylostoma duodenale).

Việc đếm trứng chỉ là ước đoán phải được thực hiện một cách cẩn thận

Có nhiều phương pháp đếm trứng như phương pháp Stoll, Brumpt, Kato–Katz Phương pháp được áp dụng thông dụng là phết dày Kato–Katz

1 KỸ THUẬT LÀM PHẾT DÀY KATO–KATZ

Phết dày Kato–Katz được xem là một kỹ thuật tốt để phát hiện bệnh sán máng Schistosoma mansoni

và một số giun, sán khác rất hiệu quả, hiện đang được Tổ chức Y tế thế giới chọn làm phương pháp chuẩn để phát hiện trứng giun, sán trong phân, đặc biệt là giun đũa, giun móc, giun tóc Phương pháp này không dùng để tìm ấu trùng, trứng giun kim hoặc đơn bào

Phết dày Kato–Katz là một kỹ thuật có tính chất định tính và định lượng do thể tích phân được xác định.Lượng phân dùng lớn nên dễ tìm thấy trứng giun, sán hơn xét nghiệm phân trực tiếp

1.1 Nguyên tắc: Phân được định lượng bằng hố đong có kích thước chuẩn, trải lên lam kính và đượclàm trong bởi lá kính bằng giấy cellophane thấm glycerin

1.2 Dụng cụ

– Kính hiển vi

– Que gỗ

– Lưới kim loại hoặc plastic (60 – 105 mắt lưới)

– Hố đong phân bằng kim loại không gỉ hoặc bằng plastic hay bìa cứng để được một thể tích phân nhất định

– Que gạt phân bằng nhựa

a) Pha chế dung dịch xanh Malachit 1%

Bảo quản trong lọ sậm màu, nút kín

b) Dung dịch sử dụng

– Thành phần:

Trộn đều hỗn hợp nói trên

– Có thể thay thế xanh Malachit 1% bằng xanh Methylen 3%

– Các mảnh giấy cellophane được ngâm vào dung dịch này 24 giờ trước khi sử dụng

1.4 Quy trình kỹ thuật

 Đặt một mẫu phân nhỏ trên giấy báo (hình 9.1a)

‚ Ấn lưới lên mẫu phân sao cho phân lọc qua lưới và tụ lên phía trên (hình 9.1b)

ƒ Đặt tấm hố đong lên lam kính (hình 9.1c)

„ Dùng que gạt lấy phân ở phía trên lưới cho phân đầy vào hố đong, gạt phần phân thừa trên hố

… Nhấc tấm hố đong ra sao cho phân ở trong hố được giữ lại trên lam kính

† Phủ lên phân một miếng giấy cellophane đã được ngâm dung dịch glycerin màu, lau khô glycerin còn trên mặt giấy cellophane (hình 9.1d)

‡ Lật úp tấm lam kính lên một mặt phẳng cứng, ấn xuống nhẹ nhàng để phân được trải mỏng đều (hình 9.1e)

ˆ Nhấc cẩn thận tấm lam kính bằng cách trượt nhẹ nhàng về một bên, tránh làm rách hoặc làm tách mảnh giấy cellophane

‰ Để yên từ 30 – 60 phút để phết phân trong (nếu muốn làm trong tiêu bản nhanh có thể để lam phân vào tủ ấm 40oC hoặc dưới ánh sáng mặt trời trong vài phút)

Š Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

1.5 Đọc kết quả

– Mẫu phân sẽ trong, trứng KST không bị trong sẽ thấy rõ trên nền màu xanh

– Phương pháp này quan sát dễ dàng các loại trứng giun

Lưu ý:

– Trứng giun móc, trứng sán máng (Schistosoma sp) vì vỏ mỏng nên dễ bị làm trong và dễ vỡ nếu để

lâu Trứng mất vỏ chỉ còn phôi khó nhận dạng Do đó nên quan sát sau khi phủ giấy cellophane 30 phút

– Phương pháp này không áp dụng cho phân lỏng

– Kỹ thuật này sử dụng phân tươi, cẩn thận khi làm xét nghiệm

1.6 Đếm trứng

Tính số trứng đếm được trong 1g phân:

– Gọi n là số trứng trong X (mg) phân

– Gọi N là số trứng có trong 1g phân = 1000mg

– Số trứng đếm được trong 1g phân:

Ví dụ:

Hố đong có thể tích: X = 50mg, n = 20

Số trứng đếm được trong 1g phân là:

– Trên thực tế, kích thước hố đong phân đã được tính toán để có thể chứa một lượng nhất định (X (mg)phân):

+ Đường kính 9mm dày 1mm chứa 50mg phân

+ Đường kính 6mm dày 1,5mm chứa 41,7mg phân

+ Đường kính 6,5mm dày 0,5mm chứa 20mg phân

Như vậy chỉ cần nhân số lượng trứng đếm được trong X (mg) phân với hệ số (1000mg/X (mg)) sẽ có được số trứng trong 1 gram phân

1.7 Đánh giá

– Kỹ thuật này đơn giản, nhanh, chính xác, có thể tiến hành hàng loạt trong điều tra và nghiên cứu Tuy nhiên, việc ước lượng số giun ký sinh chỉ có một giá trị hết sức tương đối vì giun, sán không đẻ theo nhịp độ đều đặn, trứng không được phân bố đều trong phân Phân có thể đặc hay lỏng, lượng phân thải

ra hằng ngày có thể nhiều hay ít

– Đánh giá cường độ nhiễm của giun đũa, giun tóc, giun móc theo số lượng giun ký sinh và số trứng đếm được trong 1 gram phân theo quy ước của Tổ chức Y tế thế giới (bảng 9.1)

Bảng 9.1

Loại giun Nhiễm

Số lượng giun

Số trứng /g phân

Số lượnggiun Số trứng /gphân Số lượnggiun Số trứng /g phân

Giun đũa ≤ 20 < 5000 6 -24 5000

-50000 > 25 > 50000

25

 Cho dung dịch NaOH N/10 vào bình Stoll đến vạch 56ml.

‚ Lấy khoảng 4g phân cho vào bình cho đến khi dung dịch NaOH lên đến vạch 60ml

ƒ Cho bi thủy tinh vào bình

„ Đậy nút bình lắc tròn và đều

… Để qua đêm

† Ngày hôm sau lấy ra lắc đều trước khi hút mẫu

‡ Dùng ống hút lấy 0,15ml dung dịch phân nhỏ lên lam kính đậy lá kính, tránh có bọt khí

ˆ Tiến hành đếm trứng trong toàn bộ lá kính

2.3 Tính kết quả

– Gọi n là số trứng đếm được trong 0,15ml

– Gọi N là số trứng có trong 60ml (tương đương 4g phân)

Số lượng trứng có trong 1g phân: n x 100

– Tùy theo trạng thái của phân, nhân kết quả với hệ số tương ứng:

– Lượng phân thải ra trung bình mỗi ngày thay đổi tùy theo độ tuổi:

Từ đó, tính số lượng trứng thải ra trong một ngày

Ví dụ: Lượng phân thải ra ở người lớn là 200g:

Số lượng trứng: n x 100 x 200

Từ số lượng tính toán được ta có thể ước lượng số giun ký sinh

Ký sinh trùng Số trứng đẻ/ngày Tỷ lệ đực/cái Tổng số KST

Giun đũa con cái mỗi ngày đẻ 200.000 trứng

Số lượng giun tính ra từ số lượng đã đếm được:

Nếu trong ruột bệnh nhân số lượng giun cái và giun đực bằng nhau thì số lượng giun có trong ruột bệnhnhân: X x 2

– Số lượng trứng đẻ mỗi ngày cũng không giống nhau.

– Tỷ lệ giun đực/cái không luôn luôn chính xác

– Không thể đánh giá đúng trạng thái của phân, cách tính hệ số của mỗi tác giả cũng khác nhau

– Lượng phân thải ra mỗi ngày cũng có nhiều thay đổi

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Anh (chị) cho biết mục đích của đếm trứng trong phân?

2 Đếm trứng có thể tính được cường độ nhiễm cho tất cả các loài giun, sán ký sinh người? Tại sao?

3 So sánh quy trình đếm trứng theo phương pháp Stoll và Kato–Katz.

4 Theo anh (chị), hiện nay có cần phải đếm trứng trong điều trị bệnh KST? Tại sao?

2 Lấy phân để trên rây sàng Đúng quy định

3 Cho phân vào hố đong, đặt trên lam

5 Đặt giấy Cellophane đã nhuộm màu

6 Dùng nút cao su ép lên mặt giấy

cellophan Phân phải dàn đều, mặt giấy tương đốiphẳng

7 Để tiêu bản trong phòng thí nghiệm Đủ thời gian quy định

8 Đặt tiêu bản lên bàn kính hiển vi Tìm

4 HÌNH THỂ CHẤT BÉO DƯỚI KÍNH HIỂN VI

– Acid béo: những hạt tròn như chất béo trung tính, hình kim dài, mảnh hoặc đám vô định hình

– Chất béo trung tính: những hạt tròn, không màu hay xanh lá cây, vàng, kích thước không đều

– Xà phòng: hình dạng thay đổi, khó nhận dạng, từng đám hạt, đám vô định hình, hình kim ngắn đứng riêng lẻ

5 PHƯƠNG PHÁP BAILENGER

Để phân biệt mỡ trung tính với acid béo, người ta dùng kỹ thuật nhuộm màu Có nhiều hóa chất để nhuộm nhưng chỉ những hóa chất nào giúp phân biệt được các loại chất béo thì mới được sử dụng và màu phải bền, lâu phai

 Dùng que xét nghiệm lấy một ít phân để lên lam kính

Nếu phân đặc, có thể pha loãng phân với ít nước

‚ Cho 1 giọt phẩm nhuộm lên lam kính, trộn đều với phân

ƒ Đậy lá kính lên, hơ nhẹ qua ngọn lửa

„ Khảo sát tiêu bản dưới kính hiển vi

5.5 Đọc kết quả

– Mỡ trung tính có màu tím nhạt

– Acid béo có màu đỏ tím

– Xà phòng có nhiều màu nhưng phần lớn có màu hồng và cam

– Dầu paraffine không bắt màu

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Anh (chị) cho biết ý nghĩa của mỡ trong phân.

2 Mô tả kỹ thuật Bailenger để phát hiện mỡ trong phân.

3 Mô tả các loại chất béo khi soi tươi và sau khi nhuộm.

– Phân có máu tươi: có xuất huyết ở đoạn cuối ruột già

– Phân đen: xuất huyết đoạn trên ống tiêu hóa (ruột non, dạ dày) Hồng cầu đã bị tiêu hóa, không còn nguyên vẹn; huyết sắc tố được phóng thích ra ngoài, lẫn với phân (máu ẩn) Trong trường hợp này, xácđịnh xuất huyết bằng kỹ thuật tìm huyết sắc tố trong phân

2 KỸ THUẬT TÌM HUYẾT SẮC TỐ TRONG PHÂN BẰNG CHẤT

AMINOPYRINE

2.1 Nguyên tắc

Khi huyết sắc tố tiếp xúc với hydrogen peroxide thì oxygen được phóng thích, oxygen này sẽ phản ứng

với chất Aminopyrine (Aminophenazone) làm hiện màu.

2.2 Chuẩn bị bệnh nhân cho xét nghiệm tìm máu trong phân

Một ngày trước khi làm xét nghiệm tìm máu trong phân, bệnh nhân không được:

– Ăn thịt

– Uống thuốc có chứa chất sắt

– Đánh răng mạnh gây chảy máu

– Mẫu chứng dương (dung dịch 1% máu tan trong nước)

– Mẫu chứng âm (nước cất)

2.5 Quy trình kỹ thuật

 Pha dung dịch aminopyrine (chỉ pha trước khi dùng):

– Cho 0,25g aminopyrine vào đáy ống nghiệm

– Đổ vào ống nghiệm 5ml cồn ethylic 95o

‚ Lấy một lượng phân cho vào ống ly tâm Thêm vào 7ml nước cất và đánh tan phân

ƒ Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút

„ Đổ phần nước nổi vào 1 ống nghiệm

… Nhỏ từ từ vào thành ống nghiệm đựng nước nổi các chất sau đây:

– 10 giọt dung dịch acid acetic

– 5ml dung dịch aminopyrine

– 10 giọt hydrogen peroxide

Chú ý: Không trộn lẫn các chất với nhau.

3 THỬ NGHIỆM PHÁT HIỆN MÁU TRONG PHÂN

Là một kỹ thuật phát hiện máu trong phân nhanh, đơn giản, có độ nhạy và chính xác khá cao

29

3.1 Nguyên tắc

Huyết sắc tố trong phân gắn vào kháng thể kháng huyết sắc tố được dán lên thanh giấy Phức hợp này được nhìn thấy nhờ chất nhuộm màu

3.2 Dụng cụ và hóa chất

– Thuốc thử mua trên thị trường (FOB, ACON), gồm có:

+ Thanh thử trong bao gói

+ Lọ nước pha loãng phân

3.3 Quy trình kỹ thuật

 Lấy phân của bệnh nhân vào lọ khô, sạch

‚ Dùng que xét nghiệm lấy phân, ít nhất ở 3 chỗ khác nhau trên mẫu phân

ƒ Cho que phân vào lọ chứa dung dịch pha loãng phân và trộn đều

„ Xé bao để lấy thanh thử ra

– Nếu chỉ có vạch của mẫu thử hiện lên = thử nghiệm không có giá trị

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Anh (chị) cho biết ý nghĩa sự hiện diện của máu trong phân.

2 Mô tả kỹ tìm máu trong phân bằng chất aminopyrine.

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG TRONG MÁU

Xét nghiệm máu có thể phát hiện được các đơn bào như Plasmodium, Trypanosoma, Babesia,

Leishmania donovani và ấu trùng giun chỉ

– Kỹ thuật xét nghiệm có thể soi tươi hoặc làm phết máu nhuộm

– Soi tươi cho phép thấy được sự chuyển động của KST trong máu

– Nhưng việc định danh thường phải nhờ đến phết máu nhuộm cố định

– Phết máu có thể làm từ máu toàn phần, tươi, có hoặc không chống đông hoặc cặn lắng từ các kỹ thuật khác

– Làn máu mỏng và giọt máu dày có những ưu điểm và nhược điểm, vì vậy trong chẩn đoán tìm KST

SR thường làm cả 2 loại tiêu bản làn máu mỏng và giọt máu dày trên cùng một bệnh nhân

+ Lượng KST ít do chỉ dùng một lượng máu nhỏ (vài ml)

+ Mất nhiều thời gian đọc lam máu và có thể không phát hiện được

– Giọt máu dày:

Ưu điểm: quan sát 1 lượng máu lớn nên tập trung nhiều KST

Nhược điểm: KST SR nằm lẫn với nhiều lớp hồng cầu bị phá vỡ nên khó được nhận ra, đòi hỏi người đọc lam máu phải có kinh nghiệm

– Tìm ấu trùng giun chỉ bạch huyết:

Tùy thuộc loài giun chỉ có chu kỳ ngày hay đêm mà lấy máu Ở Việt Nam, ấu trùng giun chỉ bạch huyết

có chu kỳ xuất hiện ở máu ngoại vi về đêm, nên thời gian lấy máu để tìm ấu trùng giun chỉ là vào khoảng từ 22 giờ đến 3 giờ sáng

‚ Đối với máu lấy từ tĩnh mạch với chất chống đông nên làm tiêu bản sớm vì nếu để qua 1 giờ thì hình dạng của KST SR có thể bị biến dạng và máu dễ bị bong ra và trôi mất trong quá trình nhuộm tiêu bản

3.2 Lấy máu đầu ngón tay

a) Vị trí lấy máu

– Ngón tay thứ 3 hoặc 4, bàn tay trái

– Đầu ngón tay, ở bên cạnh ngón tay

– Ở trẻ sơ sinh, có thể lấy máu ở gót chân

b) Cách lấy máu

 Phải dùng phương pháp vô trùng, tất cả dụng cụ đều phải được vô trùng trước

‚ Lấy máu từ bàn tay trái của bệnh nhân, để ngửa lòng bàn tay lên trên, chọn ngón tay thứ 3 hoặc thứ 4

ƒ Dùng một miếng bông và thấm cồn 70o để lau sạch đầu ngón tay Để khô hay lau khô với miếng gạc

đã khử trùng

„ Dùng kim chích máu vô trùng đâm vào chỗ đã chọn với một động tác nhanh và đủ mạnh để 1 giọt máutrào ra sau khi chích máu

… Dùng bông khô lau bỏ giọt máu đầu vì nó có thể lẫn với cồn còn sót lại

† Bóp nhẹ ngón tay để làm chảy giọt máu thứ 2

‡ Cầm 1 lam kính vào 2 cạnh, chạm nhẹ lên giọt máu ở đầu ngón tay, một giọt máu nhỏ sẽ dính vào miếng kính ở giữa lam kính để làm làn máu mỏng

ˆ Bóp nhẹ ngón tay để nặn thêm máu, lấy 3, 4 giọt máu vào 1 lam kính khác để làm giọt máu dày (lớn gấp ba giọt máu để làm phết máu mỏng)

‰ Dùng bông thấm cồn lau sạch phần máu còn lại ở ngón tay

31

Lưu ý:

– Không nên chích máu khi sát trùng chưa khô cồn, máu chảy lan ra

– Nếu đâm kim nông quá, nên chích lại, không nên cố nặn cho máu chảy ra

– Khi nào không lấy máu nữa mới dùng bông cồn để sát trùng tại chỗ lấy máu

– Có thể làm giọt máu dày và làn mỏng máu trên cùng 1 lam kính: vị trí giọt máu dày ở khoảng 1/3lam kính và làn máu mỏng ở 2/3 lam kính

4 KÉO LÀN MÁU MỎNG

 Cho 1 giọt máu lên 2/3 lam kính Đặt lam kính chứa 1 giọt máu lên mặt phẳng chắc chắn (hoặc cầm trên tay)

‚ Đặt 1 cạnh lam kéo máu lên lam kính có giọt máu thành một góc 45o.

ƒ Kéo từ từ cho lam kéo máu chạm vào giọt máu, để cho máu lan theo giao tuyến của hai lam kính

„ Chờ cho máu lan ra gần hết cạnh của lam kéo máu, đẩy nhanh đều và nhẹ tay lam kéo máu về phía đầu kia của lam kính chứa máu

… Nếu giọt máu vừa đủ thì phết máu sẽ không ra đến tận cùng của lam kính, mà ngừng lại trước đó khoảng 1cm, tạo ra đuôi máu

† Để khô tự nhiên, tránh bụi, tránh côn trùng ăn máu

Ghi tên b

‡ ệnh nhân ở phần dày của làn máu mỏng, trước chỗ đặt giọt máu.

² Làn máu mỏng đạt yêu cầu:

– Làn máu phải mỏng đều, không có vết sọc ngang, dọc, không loang lổ

– Làn máu có đuôi mỏng: Xem kính hiển vi thấy hồng cầu xếp cạnh nhau chứ không chồng lên nhau và cũng không cách xa nhau

² Nguyên nhân làm làn máu mỏng không đạt yêu cầu:

– Máu lấy nhiều quá kéo không tốt: tiêu bản không có đuôi máu

– Máu trải không đều: cạnh lam kéo máu không phẳng hoặc tiếp xúc giữa cạnh lam kéo máu và lam kính đựng máu không khít

– Kéo máu chậm, ngập ngừng hoặc máu bắt đầu đông: tiêu bản sẽ có những vệt dày, sọc – Tiêu bản có chỗ trống hoặc lỗ chỗ: lam kính bẩn, có mỡ hoặc ruồi, gián ăn

5 LÀM GIỌT MÁU DÀY

 Lấy giọt máu để lên 1/3 còn lại của lam, để 1 góc lam kéo vào giữa giọt máu Xoay theo vòng tròn

từ trung tâm ra ngoài, theo một chiều nhất định Khi có được một hình tròn đường kính từ 1 – 1,2cm, xoay góc lam kéo đi ngược vào trong rồi nhấc lam kéo lên

‚ Để khô lam máu trên mặt phẳng, tránh bụi và côn trùng

ƒ Thường phải để khô giọt máu dày trong khoảng 6 – 12 giờ hay cách đêm, nhưng khi cần gấp có thể

để khô trong tủ ủ 37oC, trong 1 giờ

² Giọt máu dày đạt yêu cầu:

– Phải đều hoặc mỏng dần về phía bìa giọt máu

– Hình dáng tương đối tròn

– Đường kính từ 1 – 1,2cm

– Không quá dày, giọt máu quá dày và quá to: lúc khô máu sẽ có những vệt nứt và dễ tróc khi nhuộm – Không quá mỏng: giọt máu quá mỏng, nhỏ (ít máu), mật độ KST thấp nên khó phát hiện

– Bề dày thích hợp, khi đặt tiêu bản lên tờ báo lúc còn ướt có thể thấy chữ in

² Có thể làm giọt máu dày và làn máu mỏng trên cùng một lam kính hoặc trên 2 lam kính khác nhau

² Khi làm tiêu bản kép, làn máu mỏng và giọt máu dày trên cùng 1 lam kính, hai giọt máu phải cách xa nhau sao cho khi cố định làn máu mỏng bằng cồn thì không ảnh hưởng đến giọt máu dày

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Anh (chị) cho biết giá trị của giọt máu dày và làn máu mỏng?

2 Nêu những ưu và khuyết điểm của giọt máu dày và làn máu mỏng.

3 Có thể lấy máu tĩnh mạch để làm tiêu bản tìm KST SR?

4 Mô tả cách lấy máu đầu ngón tay, cần chú ý khâu nào?

5 Như thế nào là một tiêu bản máu mỏng đẹp? Làm thế nào để có tiêu bản máu mỏng đẹp?

6 Tại sao giọt máu dày bong ra khi nhuộm?

7 Nêu những tiêu chuẩn của giọt máu dày đẹp

Cách lấy máu làm tiêu bản tìm ký sinh trùng sốt rét

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để lấy

máu Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để lấy máu và làm tiêu bản

2 Ghi tên hoặc số hiệu của bệnh nhân

lên lam kính và đối chiếu với phiếu

xét nghiệm

Tên bệnh nhân được ghi rõ ràng lên lam kính và đúng với tên trên phiếu xét nghiệm

3 Chọn vị trí lấy máu Đầu ngón tay giữa hoặc áp út hoặc gót

chân

4 Sát trùng đầu ngón tay lấy máu Phải sát trùng đúng quy cách và đúng vị

trí

Động tác phải nhanh, dứt khoát, mạnh vừa phải để 1 giọt máu trào ra da sau khi chích

7 Bóp nhẹ ngón tay để máu trào ra Lấy

máu đặt lên lam kính

Lấy 1 giọt, giọt máu tròn, gọn; lượng máu đủ để làm phết làn máu mỏng

8 Bóp nhẹ ngón tay để máu trào ra Lấy

máu đặt lên lam kính

Lấy lượng máu gấp 3 lần làm phết giọt máu dày

Kỹ thuật làm tiêu bản làn máu mỏng

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để lấy

máu Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để lấy máuvà làm tiêu bản

2 Ghi tên hoặc số hiệu của bệnh nhân

lên lam kính và đối chiếu với phiếu

xét nghiệm

Tên bệnh nhân được ghi rõ ràng lên lam kính và đúng với tên trên phiếu xét nghiệm

33

3 Chọn vị trí lấy máu Đầu ngón tay giữa hoặc áp út, hoặc gót

chân

4 Sát trùng đầu ngón tay lấy máu Phải sát trùng đúng quy cách và đúng vị

trí

Động tác phải nhanh, dứt khoát, mạnh vừa phải để 1 giọt máu trào ra da sau khi chích

7 Bóp nhẹ ngón tay để máu trào ra Lấy

máu đặt lên lam kính Lượng máu lấy vừa đủ để có đường kính khoảng 3mm

8 Đặt cạnh lam kính thứ hai tiếp xúc với

giọt máu theo góc 45O và kéo máu Máu phải được trải đều, đuôi giọt máu nằm ở cuối lam kính, tròn đều

9 Để giọt máu khô trên mặt phẳng,

tránh bụi, côn trùng Giọt máu khô tự nhiên, có màu đỏ đồngnhất, không có bụi, không bị nham nhở

Kỹ thuật làm tiêu bản giọt máu dày

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để lấy

máu Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để lấy máu và làm tiêu bản

2 Ghi tên hoặc số hiệu của bệnh nhân lên

lam kính và đối chiếu với phiếu xét

nghiệm

Tên bệnh nhân được ghi rõ ràng lên lam kính và đúng với tên trên phiếu xét nghiệm

3 Chọn vị trí lấy máu Đầu ngón tay giữa hoặc áp út, hoặc

gót chân

4 Sát trùng đầu ngón tay lấy máu Phải sát trùng đúng quy cách và đúng

vị trí

Động tác phải nhanh, dứt khoát, mạnh vừa phải để 1 giọt máu trào ra

da sau khi chích

7 Bóp nhẹ ngón tay để máu trào ra Lấy

máu đặt lên lam kính Lượng máu nhiều gấp 3 lần phết làn máu mỏng Giọt máu dày không quá

gần phết làn máu mỏng

8 Để một góc lam kéo vào giữa giọt máu

Xoay theo vòng tròn từ trung tâm ra

ngoài, theo một chiều nhất định

Máu phải được trải đều, giọt máu phảitròn, có đường kính từ 1,2 -1,5cm

9 Để giọt máu khô trên mặt phẳng, tránh

bụi, côn trùng Giọt máu khô tự nhiên, có màu đỏ đồng nhất, không có bụi, không bị

nham nhở

– Có nhiều cách nhuộm, trong đó có 2 cách nhuộm phổ biến nhất:

+ Nhuộm Wright, trong đó có sẵn chất cố định, việc nhuộm và cố định xảy ra đồng thời, do đó phết máu dày phải được làm vỡ hồng cầu trước khi nhuộm

+ Nhuộm Giemsa, chất cố định và thuốc nhuộm được tách riêng, vì vậy, phết máu mỏng phải được cố định với Methanol tuyệt đối trước khi nhuộm

– Ở Việt Nam, nhuộm Giemsa được dùng nhiều nhất

– Giá để nhuộm tiêu bản hoặc bình nhuộm

– Giá đựng lam kính để hong khô tiêu bản

Giemsa được cung cấp trên thị trường ở 2 dạng: dạng bột hoặc dung dịch đã pha sẵn

2.1 Cách pha dung dịch Giemsa mẹ từ dạng bột

– Thành phần:

– Cách pha:

Cho bột Giemsa vào trong cối với một ít Glycerin, dùng chày nghiền bột Giemsa với Glycerin cho tan hết bột thuốc nhuộm Sau đó cho thêm từ từ Glycerin vào nghiền nhiều lần cho tan đều, cuối cùng cho Methanol vào

Dung dịch Giemsa mẹ cần được đựng trong chai thủy tinh màu trung tính, bảo quản chỗ khô, mát và không có ánh sáng Khi dùng pha loãng dung dịch Giemsa mẹ theo nồng độ quy định

2.2 Dung dịch đệm

– Nước trung tính hoặc hơi kiềm (pH khoảng 7 – 7,2)

– Dung dịch đệm (dung dịch phosphat, pH = 7,2) gồm có:

Thời hạn sử dụng dung dịch đệm là vài tuần Khi nào thấy có cặn thì bỏ

3 KỸ THUẬT NHUỘM TIÊU BẢN

3.1 Chuẩn bị tiêu bản

a) Làn máu mỏng

Trước khi nhuộm phải cố định bằng Methanol Nhúng lam máu vào bình có Methanol hoặc dùng ống hút nhỏ Methanol để phủ kín làn máu mỏng, để tiêu bản khô

b) Giọt máu dày

Trước khi nhuộm phải phá vỡ hồng cầu, loại bỏ huyết sắc tố bằng dung dịch nhược trương vừa phải đủ

để phá vỡ hồng cầu nhưng phải giữ nguyên KST SR Dung dịch tẩy thường là dung dịch Giemsa pha loãng 1%, dung dịch đệm hay nước cất

35

Phủ dung dịch nhược trương lên giọt máu dày, quan sát tới khi màu hồng của máu trôi đi, để lại trên tiêu bản 1 giọt máu màu vàng nhạt là được.

3.2 Quy trình nhuộm tiêu bản

a) Nhuộm thường quy

Đ

 ặt giá nhuộm trên khay nhuộm, để khay ở chỗ phẳng, sau đó đặt lam máu lên giá nhuộm, mặt có máulên trên

Pha dung d

‚ ịch nhuộm Giemsa 3%: 3ml Giemsa mẹ + 97ml dung dịch đệm.

ƒ Phủ kín dung dịch nhuộm lên giọt máu

„ Thời gian nhuộm là 30 – 45 phút

… Rửa tiêu bản bằng nước cất hoặc nước trung tính: nhúng sâu tiêu bản đã nhuộm vào khay nước rửa, lấy tiêu bản ra nhẹ nhàng Rửa như vậy vài lần, đến khi nước rửa trong

† Cắm tiêu bản vào giá để hong khô tự nhiên, mặt máu quay xuống dưới để tránh bụi

‡ Chỉ khi nào tiêu bản thật khô mới soi dưới kính hiển vi hoặc cất bảo quản trong hộp đựng tiêu bản, muốn tiêu bản khô nhanh dùng quạt, không dùng nhiệt độ

Lưu ý khi rửa tiêu bản:

– Không nên hất đổ dung dịch nhuộm đi rồi mới nhúng tiêu bản vào khay rửa, như vậy cặn thuốc nhuộm có thể bám lên tiêu bản

– Tránh rửa tiêu bản giọt máu dày dưới vòi nước, vì có thể làm bong giọt máu

b) Nhuộm nhanh

– Quy trình nhuộm giống như trên, nhưng pha dung dịch nhuộm Giemsa 10%: 10ml Giemsa mẹ + 90ml dung dịch đệm

– Thời gian nhuộm là 5 – 10 phút

Có thể nhuộm tiêu bản trong bình nhuộm:

– Đổ đầy dung dịch nhuộm vào bình

– Xếp tiêu bản máu đã cố định (giọt máu mỏng) hoặc đã làm vỡ hồng cầu (giọt máu dày) vào bình để nhuộm

4 NHẬN XÉT TIÊU BẢN NHUỘM TỐT

Tiêu bản nhuộm tốt, khi xem dưới kính hiển vi thấy như sau:

– Tiêu bản sạch, không cặn, không bụi

– Hồng cầu bắt màu xanh tím hoặc xanh da trời, hoặc có màu hồng nhạt Nếu có hồng cầu bị nhiễm KST SR, thấy có những hạt sắc tố và hạt đặc hiệu (hạt Schuffner, hạt Maurer)

– Bạch cầu đơn nhân có màu xanh tím

– Tế bào chất của bạch cầu lympho có màu xanh lơ nhạt

– Bạch cầu ái toan có những hạt màu đồng đỏ rõ

– Bạch cầu đa nhân trung tính có những hạt to nhỏ, không đều, màu xanh lơ tới đỏ

– KST SR có hình thể rõ ràng: nhân thường bắt màu đỏ sẫm hoặc đỏ tía, tế bào chất bắt màu xanh lơ, hạt sắc tố của ký sinh trùng bắt màu tím sẫm hoặc màu nâu đen

5 BẢO QUẢN TIÊU BẢN

Tiêu bản nếu lưu lại lâu dài cần bảo quản tốt Khi soi KST SR xong phải lau sạch dầu trên tiêu bản bằngcách úp tiêu bản lên giấy thấm để loại bớt dầu, sau đó nhỏ 1 – 2 giọt xylen lên phía trên giọt máu rồi dùng khăn vải mềm, mỏng, sạch, lau nhẹ cho sạch Tiêu bản để chỗ không có ánh sáng, tốt nhất là để trong hộp gỗ

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Anh (chị) hãy liệt kê những dụng cụ cần để nhuộm tiêu bản máu bằng Giemsa.

2 Mô tả quy trình nhuộm Giemsa tiêu bản máu mỏng và dày.

3 Anh (chị) cho biết yếu tố nào làm cho tiêu bản nhuộm được đẹp, thấy rõ các chi tiết của KST SR.

4 Nêu tiêu chuẩn của một tiêu bản nhuộm đẹp.

Nhuộm tiêu bản giọt máu mỏng

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để

nhuộm tiêu bản máu

Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để nhuộm tiêu bản giọt máu dày

2 Cố định tiêu bản máu bằng cồn

Methanol

Nhúng trọn phần máu trải, không để lan

ra giọt máu dày

4 Nhuộm tiêu bản:

– Đặt tiêu bản lên giá nhuộm hoặc

vào bình nhuộm

– Phủ dung dịch Giemsa đã pha

loãng lên giọt máu

– Tiêu bản phải nằm bằng phẳng trên giá, không nghiêng

– Thuốc nhuộm phủ kín giọt máu, khôngtràn ra, chảy xuống khay

6 Rửa tiêu bản bằng nước trung tính,

hoặc nước cất/ nước máy Sạch cặn, không có váng kim loại.

7 Để tiêu bản khô trên giá đỡ Giọt máu khô tự nhiên, không bị trầy

sướt

Nhuộm tiêu bản giọt máu dày

1 Chuẩn bị dụng cụ và hóa chất để

nhuộm tiêu bản máu Dụng cụ và hóa chất đầy đủ để nhuộm tiêu bản giọt máu dày

2 Pha dung dịch tẩy phá vỡ hồng

3 Tẩy phá vỡ hồng cầu Tiêu bản máu sau khi bị phá vỡ hồng cầu có

màu trắng hơi đục hoặc có màu vàng nhạt

4 Pha dung dịch nhuộm Pha đúng công thức

5 Nhuộm tiêu bản:

– Đặt tiêu bản lên giá nhuộm

hoặc vào b́nh nhuộm

– Phủ dung dịch Giemsa đã pha

loãng lên giọt máu

– Tiêu bản phải nằm bằng phẳng trên giá, không nghiêng

– Thuốc nhuộm phủ kín giọt máu, không tràn

ra, chảy xuống khay

7 Rửa tiêu bản bằng nước trung

tính, hoặc nước cất/ nước máy Sạch cặn, không có váng kim loại.

8 Để tiêu bản khô trên giá đỡ Giọt máu khô tự nhiên, không bị bong tróc

hoặc trầy sướt

– Đủ ánh sáng.

– Dầu soi phải trong

– Thị kính, vật kính phải sạch, không bị mốc

– Trục đẩy, ốc vi cấp phải tốt, không bị nhờn

– Nâng tụ quang lên sát tiêu bản

– Dùng gương phẳng

– Mở rộng màng chắn sáng

2 ĐỌC TIÊU BẢN MÁU NHUỘM

2.1 Cách đọc tiêu bản máu nhuộm

– Khảo sát giọt máu dày trước, làn máu mỏng sau

– Quan sát tiêu bản ở độ phóng đại nhỏ (100 lần) trước để quét tìm giun chỉ Ấu trùng giun chỉ hiếm khi

có nhiều, thường chỉ có vài con trong mỗi phết máu

– Sau đó mới đổi sang độ phóng đại lớn để tìm KST SR và đơn bào khác

– Trong một tiêu bản có thể gặp nhiều chủng loại, vì vậy phải xem nhiều vi trường Đối với P.vivax, thường thấy nhiều giai đoạn phát triển, còn P falciparum, thường chỉ thấy 1 – 2 giai đoạn phát triển.

Có thể xem phết máu với các độ phóng đại khác nhau Tùy vào khả năng và kinh nghiệm của người đọc lam máu, việc kiểm tra phết máu thường mất 10 đến 20 phút để quan sát 100 – 300 vi trường ở độ phóng đại 1000 lần

2.2 Đọc tiêu bản giọt dày

– Trong giọt máu dày, tế bào máu tập trung nhiều nhất ở giữa Để tìm KST SR, tốt nhất nên đọc ở độ phóng đại 1000 lần

– Khảo sát toàn bộ giọt máu theo hình chữ chi để xem có KST SR hay không, phải quan sát kỹ ở vùng xung quanh giọt máu vì những vùng đó thường tập trung nhiều KST SR và sáng, dễ xem hơn

– Thời gian đọc thường từ 5 đến 10 phút (gần 100 vi trường với vật kính dầu)

– Hình thể KST SR trên tiêu bản giọt máu dày về cơ bản giống như hình thể KST SR trên tiêu bản làn máu mỏng Tuy nhiên do phương pháp làm tiêu bản khác nhau, phương pháp nhuộm khác nhau nên hình thể KST SR trên tiêu bản giọt máu dày có khác hơn một chút, không đẹp bằng ở tiêu bản làn máu mỏng và KST SR tập trung hơn

2.3 Đọc tiêu bản làn máu mỏng

– Khảo sát phần đuôi và hai bên rìa của làn máu để xác định rõ loại KST SR

– KST SR thường hiện diện ở bờ hoặc ở phía cuối của phết máu do quá trình làm phết máu Đồng thời,

ta nên kiểm tra KST SR ở phần cuối phết máu, nơi hồng cầu được tách riêng ra Ở nơi này, hình dạng

và kích thước của hồng cầu bị nhiễm được thấy rõ nhất

– Khi xem phải kết hợp 2 yếu tố: KST SR và hồng cầu bị ký sinh để xác định kết quả và loại KST SR

3 MỘT SỐ YẾU TỐ GÂY NHẦM LẪN KHI KHẢO SÁT TIÊU BẢN SỐT RÉT

Trong tiêu bản máu nhuộm Giemsa, có nhiều thành phần trong máu, trong thuốc nhuộm, nấm, bụi,… cóthể làm cho người đọc không xác định được Nếu nghi ngờ, nên làm lại tiêu bản khác hoặc gửi đến những nơi chuyên sâu để xác định

– Có thể nhầm cặn thuốc, mảnh hồng cầu bị vỡ, nấm, bụi, tiểu cầu nhỏ nằm riêng lẻ với thể tư dưỡng non

– Bạch cầu đa nhân, đám tiểu cầu nằm tụ lại dễ nhầm với thể phân liệt

– Hồng cầu nhân nhầm với thể tư dưỡng già, giao bào P.vivax.

– Bạch cầu đa nhân trung tính thoái hóa nhân dễ lầm với thể phân liệt, tư dưỡng già P.vivax.

– Bạch cầu đơn nhân, bạch cầu ái toan và lympho bào không ăn màu nhân dễ nhầm với thể giao bào

P vivax.

4 CÁCH TÍNH MẬT ĐỘ KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

Mật độ KST là số lượng KST đếm được trong một vi trường hoặc một thể tích máu nhất định Biết đượcmật độ nhiễm KST là rất cần thiết vì góp phần tiên lượng bệnh, đánh giá hiệu quả của điều trị Có 2 phương pháp dùng để tính mật độ KST SR:

– Đếm số lượng KST SR trong 1 microlit (1ml) máu

– Hệ thống dấu (+)

4.1 Đếm số KST SR trong 1µl máu

– Tổ chức Y tế thế giới đã lấy số bạch cầu = 8000/µl máu làm chuẩn

– Đếm KST SR trong 1µl máu tức là đếm KST SR trên 8000 bạch cầu (BC) trên giọt máu dày, sau đó tính ra số lượng KST SR trong 1µl máu.

– Để kỹ thuật đếm được chính xác, cần có các điều kiện sau:

+ Tiêu bản nhuộm đẹp

+ Chọn vùng đếm: BC rải đều, KST SR bắt màu đẹp

+ Nên sử dụng 2 máy đếm

+ Nên đếm 2 – 3 lần để lấy số trung bình

– Nếu sau khi đếm được 200 BC, số KST SR đếm được = 10, thì ngừng đếm và tính số lượng KST

Đếm KST SR trên tiêu bản giọt máu dày:

5 CÁCH TRẢ LỜI KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM TÌM KÝ SINH TRÙNG SỐT RÉT

– Nếu tìm thấy KST SR thì ghi kết quả theo thứ tự như sau:

Tên loài KST SR:

Các thể đã gặp:

Mật độ nhiễm:

– Nếu tìm không thấy KST thì ghi:

Tìm không thấy KST SR, hay ghi KST SR âm tính

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Anh (chị) chú ý đến những yếu tố nào khi sử dụng kính hiển vi để quan sát tiêu bản máu nhuộm?

2 Cho biết trình tự khảo sát tiêu bản máu nhuộm.

3 Tại sao phải xem giọt máu dày trước rồi mới xem giọt máu mỏng?

4 Anh (chị) cho biết những vật gì có thể gây nhầm lẫn KST SR với trên tiêu bản máu nhuộm?

5 Theo anh (chị), việc đếm KST SR trong tiêu bản máu có cần thiết cho chẩn đoán bệnh sốt rét? Tại

sao?

6 Có mấy cách đếm KST SR? Cách nào thường được dùng nhất?

7 Anh (chị) ghi những nội dung nào vào phiếu trả lời kết quả? Tại sao cần phải ghi đầy đủ những nội

dung kể trên?

Bài 15

KỸ THUẬT XÉT NGHIỆM TÌM GIUN CHỈ TRONG MÁU

1 CÁC KỸ THUẬT DƯỚI ĐÂY CÓ THỂ DÙNG ĐỂ TÌM ẤU TRÙNG GIUN CHỈ

– Soi trực tiếp xem sự di động của ấu trùng Bệnh phẩm: máu, dịch hạch bạch huyết hay cặn lắng nướctiểu

– Giọt máu dày, nhuộm Giemsa xem hình thể và cấu trúc nhân

– Kỹ thuật Knott tập trung ấu trùng

– Lọc qua màng với màng lọc Nuclepore, tốt trong nhiễm giun chỉ khi mật độ phôi giun chỉ trong máu thấp

– Thử nghiệm nhanh (test nhanh) để chẩn đoán bệnh giun chỉ: thao tác đơn giản và nhanh, có độ nhạy cao, nhưng đắt tiền và hiện nay chưa phổ biến rộng rãi

– Sinh thiết hạch bạch huyết tìm giun trưởng thành

39

– Thử nghiệm huyết thanh học.

Ở nước ta, kỹ thuật thường được dùng là giọt máu dày nhuộm Giemsa và kỹ thuật Knott

Cách làm giọt máu dày nhuộm Giemsa: đọc bài làm giọt máu dày nhuộm Giemsa tìm KST SR

Dưới đây là phần trình bày kỹ thuật Knott tìm ấu trùng giun chỉ trong máu

 Cho vào ống ly tâm 10ml dung dịch formol 2%

‚ Thêm vào 1ml máu tươi hoặc máu có chất chống đông

ƒ Trộn kỹ và ly tâm ở 300 vòng/phút trong 5 phút

„ Bỏ nước nổi

… Dùng ống hút Pasteur trộn đều cặn và lấy 1 giọt nhỏ lên lam kính

† Đậy lá kính lên giọt cặn

‡ Soi tìm ấu trùng giun chỉ dưới kính hiển vi với vật kính x10 và x40

ˆ Nếu tìm thấy ấu trùng giun chỉ thì làm tiêu bản giọt dày, nhuộm Giemsa để định danh

Ưu điểm:

+ Thao tác đơn giản

+ Cho kết quả nhanh

+ Rẻ tiền

Nhược điểm: Không thấy được chuyển động của ấu trùng, vì nó đã chết

CÂU HỎI LƯỢNG GIÁ

1 Anh (chị) cho biết những kỹ thuật dùng để phát hiện giun chỉ?

2 Mô tả quy trình thao tác kỹ thuật Knott.