Luận án tiến sĩ NGHIÊN CỨU CẮT MẠCH CHITOSAN BẰNG HIỆU ỨNG ĐỒNG VẬN H2O2BỨC XẠ GAMMA COBAN - 60 ĐỂ CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN (TT)

Oligochitosan còn gọi là chitosan oligosaccarit COS là sản phẩm giảm cấp của CTS, được chế tạo bằng biến tính cắt mạch CTS sử dụng các tác nhân cắt mạch như enzym, hóa học và bức xạ… Ch

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC HUẾ

ĐẶNG XUÂN DỰ

NGHIÊN CỨU CẮT MẠCH CHITOSAN BẰNG

COBAN - 60 ĐỂ CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN

Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và hóa lý

Mã số: 62.44.01.19

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HOÁ HỌC

HUẾ, NĂM 2015

Công trình được hoàn thành tại: Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học, Đại Học Huế

Người hướng dẫn khoa học: 1 PGS.TS Nguyễn Quốc Hiến

Có thể tìm hiểu luận án tại:

MỞ ĐẦU

Chitosan và oligochitosan là những polyme có nguồn gốc thiên nhiên được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của đời sống [29], [51], [117] Chitosan thông thường có khối lượng phân tử cao chỉ tan trong môi trường axit Điều này đã hạn chế khả năng ứng dụng của nó trong nhiều trường hợp [89] Vì vậy, vấn đề biến tính cắt mạch chitosan nhằm

mở rộng khả năng ứng dụng của loại polyme này là rất cần thiết

Nhiều phương pháp cắt mạch chitosan khác nhau đã được nghiên cứu và áp dụng Trong

đó, phương pháp hóa học sử dụng H2O2 và phương pháp chiếu xạ sử dụng tia γCo60 cắt mạch chitosan gần đây được tập trung nghiên cứu áp dụng vì cho hiệu suất cao, thân thiện với môi trường [38], [76] và có khả năng áp dụng với quy mô lớn [32] Tuy nhiên, nghiên cứu sử dụng kết hợp hai tác nhân này cho đến nay vẫn còn rất ít và chưa thật sự có hệ thống

Từ những thông tin trên, chúng tôi chọn và thực hiện đề tài: “Nghiên cứu cắt mạch

chitosan bằng hiệu ứng đồng vận H 2 O 2 /bức xạ gamma Coban–60 để chế tạo oligochitosan”.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 TỔNG QUAN VỀ CHITIN, CHITOSAN, OLIGOCHITOSAN

Chitin có tên khoa học là poly-(2,4)-2-acetamido-2-desoxy-β-D-glucose, thuộc về nhóm hợp chất polysaccarit

Chitosan (CTS) là dẫn xuất của chitin, được chế tạo phổ biến bằng cách đề axetyl hóa một phần từ chitin trong môi trường kiềm đặc

Oligochitosan còn gọi là chitosan oligosaccarit (COS) là sản phẩm giảm cấp của CTS, được chế tạo bằng biến tính cắt mạch CTS sử dụng các tác nhân cắt mạch như enzym, hóa học và bức xạ…

Chitin/CTS và dẫn xuất của chúng có những tính chất quan trọng như: khả năng tương hợp và phân hủy sinh học, chống oxi hóa, khả năng kháng khuẩn, kháng khối u và khả năng hấp thụ kim loại nặng… Do vậy, các polyme này đã được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như: nông nghiệp, dược phẩm, mỹ phẩm, thực phẩm chức năng, công nghệ sinh học và xử lý môi trường [3], [79], [86] Đặc biệt, nghiên cứu gần đây

cho thấy CTS tan trong nước rất có triển vọng để ứng dụng trong nghiên cứu in vivo [39],

COS được xem là chất kích thích kháng bệnh thực vật hiệu quả vì có những hoạt tính sinh học đặc biệt khác với CTS thông thường – có khối lượng phân tử (KLPT) cao [110]

1.2 SƠ LƯỢC VỀ PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH ĐỘ ĐỀ AXETYL VÀ KHỐI LƯỢNG PHÂN TỬ CHITOSAN

Có nhiều phương pháp xác định độ đề axetyl (ĐĐA) của CTS như: phân tích nguyên tố, dùng phổ UV, IR và NMR… Phương pháp phổ 1H-NMR được cho là rất chính xác trong việc tính ĐĐA [56] Tuy nhiên, phương pháp dùng phổ IR tính ĐĐA lại được sử dụng khá phổ biến Ưu điểm của phương pháp này là đơn giản, nhanh, cho kết quả khá chính xác và chi phí thấp hơn so với phương pháp phổ 1H-NMR [18] Trong luận án này, chúng tôi sử dụng phương pháp phổ IR để tính ĐĐA cho các mẫu CTS

KLPT trung bình của CTS thường được xác định bằng phương pháp đo độ nhớt và phương pháp sắc kí gel thấm qua (GPC) Hiện nay, xác định KLPT của CTS bằng GPC được sử dụng tại nhiều trung tâm nghiên cứu về vật liệu polysaccarit tự nhiên trong khu vực châu Á và trên thế giới Trong luận án này KLPT của CTS và dẫn xuất được đo bằng phương pháp GPC

1.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP BIẾN TÍNH CẮT MẠCH CHITOSAN

Hiện nay nhiều phương pháp biến tính cắt mạch CTS đã được áp dụng bao gồm: phương pháp hóa học, phương pháp sinh học sử dụng các enzym, phương pháp siêu âm, phương pháp chiếu xạ

Phương pháp chiếu xạ được xem là kỹ thuật hữu hiệu để cắt mạch chitosan trên quan điểm thân thiện với môi trường [38] và ít gây ra sự thay đổi trong cấu trúc chính của phân tử CTS [27]

1.4 CÔNG NGHỆ BỨC XẠ BIẾN TÍNH CẮT MẠCH CHITOSAN

Công nghệ bức xạ nghiên cứu các hiệu ứng vật lý, hóa học và sinh học khi bức xạ truyền năng lượng cho vật chất

Nguồn bức xạ phổ biến hiện nay là nguồn gamma phát ra từ đồng vị phóng xạ Cobalt -

60 và Cesium-137

Trong luận án này, chúng tôi sử dụng nguồn bức xạ γCo60 để cắt mạch bức xạ CTS Cơ chế cắt mạch bức xạ đã được Ulanski nghiên cứu khá chi tiết [100] Theo đó, gốc hydroxyl tạo ra trong quá trình phân ly bức xạ là tác nhân chính gây ra sự cắt mạch CTS

1.6 TỔNG QUAN CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU CẮT MẠCH CHITOSAN

COS và CTS KLPT thấp có nhiều ứng dụng nên việc nghiên cứu chế tạo các loại vật liệu này vẫn là hướng nghiên cứu hấp dẫn trong những năm gần đây Trong nước có 5 công trình, thế giới có 7 công trình là những nghiên cứu tiêu biểu gần với luận án

Qua phân tích các kết quả nghiên cứu trong và ngoài nước, chúng tôi nhận thấy những vấn đề sau đây cần được tiếp tục nghiên cứu:

1 Nghiên cứu giảm thời gian đề axetyl hóa chitin,

2 Nghiên cứu độ trương nước bão hòa của CTS,

3 Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận của bức xạ γCo60 và H2O2 cắt mạch CTS ở dạng trương

và dạng dung dịch,

4 Nghiên cứu bảo vệ nhóm amin và hạn chế sự oxi hóa mở vòng trong quá trình cắt mạch,

5 Nghiên cứu tăng nồng độ CTS phản ứng trong dung dịch,

6 Nghiên cứu ảnh hưởng của suất liều đến tốc độ cắt mạch CTS,

7 Nghiên cứu độ ổn định của sản phẩm cắt mạch sau quá trình chiếu xạ

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM

- Tăng nồng độ CTS trong dung dịch chiếu xạ, nghiên cứu hiệu ứng đồng vận tia γCo60 và

H2O2 cắt mạch CTS có ĐĐA ~70% và 90% chưa được công bố Tính hiệu suất cắt mạch bức

xạ (Gs) nhằm đánh giá hiệu quả sử dụng năng lượng bức xạ,

- Nghiên cứu độ trương nước bão hòa (ĐTNBH) của CTS để áp dụng cho quá trình chiếu xạ CTS ở dạng trương,

- Nghiên cứu chế tạo CTS KLPT thấp bằng tác dụng đồng vận của bức xạ γCo60/H2O2 và khảo sát một số yếu tố có ảnh hưởng đến quá trình cắt mạch như nồng độ H2O2, suất liều bức xạ, nhằm lựa chọn các thông số ban đầu cho quá trình cắt mạch CTS ở dạng trương dễ thu hồi sản phẩm,

- Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận tia γCo60 và H2O2 cắt mạch CTS ở dạng trương đối với CTS

có ĐĐA ~70 - 90% chưa được công bố,

- Nghiên cứu chế tạo COS và CTS KLPT thấp bằng H2O2 sử dụng phương pháp trực tiếp và gián đoạn nhằm bảo vệ nhóm amin và hạn chế khả năng oxi hóa mở vòng glucopyranose,

- Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn, chống oxi hóa và gia tăng khả năng kích kháng bệnh trên động vật của sản phẩm CTS cắt mạch

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp IR

- Phương pháp sắc kí gel thấm qua (GPC)

- Phương pháp phổ UV-vis

- Phương pháp nhiễu xạ tia X

- Phương pháp phân tích khối lượng

2.4 THỰC NGHIỆM

2.4.1 Chế tạo chitosan nguồn từ chitin

2.4.2 Cắt mạch chitosan nguồn bằng hydro peroxit

2.4.3 Hiệu ứng đồng vận chế tạo oligochitosan bằng chiếu xạ dung dịch

2.4.4 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan ở dạng trương

2.4.5 Khả năng chế tạo oligochitosan bằng H2O2 trong dung dịch

2.4.6 Ứng dụng sản phẩm cắt mạch chitosan

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 CHẾ TẠO CHITOSAN NGUỒN TỪ CHITIN

Hình 3.1 cho thấy sự thay đổi ĐĐA của CTS theo thời gian đề axetyl hóa Kết quả là CTS có ĐĐA ~ 83%, dễ dàng thu được sau khoảng 3 giờ phản ứng trong điều kiện 90°C, tỉ

lệ CTS: NaOH 50% = 1:10 (w/v) Sau 3 giờ, ĐĐA của CTS thay đổi không đáng kể

Hình 3.1 Ảnh hưởng của thời gian đề axetyl đến ĐĐA của CTS

Hình 3.2 CTS có ĐĐA 79% (a); 84% (b); 95,5% (c) chế tạo từ chitin

Để thu được CTS có ĐĐA ≥ 90% cho nghiên cứu, chúng tôi tiến hành bằng hai cách sau:

Cách 1: Sau 180 phút phản ứng ở 90°C, ngừng đun và để hỗn hợp nguội dần đến 12 giờ,

CTS thu được có ĐĐA ≈ 95%

Cách 2: Thực hiện phản ứng đề axetyl hóa lần 2 với CTS có ĐĐA ≈ 83% ở điều kiện phản

ứng như lần 1, thời gian phản ứng là 30 phút CTS thu được có ĐĐA ≈ 96%

Trong luận án này CTS có ĐĐA ≈ 79%, 84%, và 95,5% được chúng tôi chế tạo theo cách 1 nhằm tiết kiệm thời gian và hóa chất

3.2 CẮT MẠCH CHITOSAN NGUỒN BẰNG HYDRO PEROXIT

Do CTS nguồn có KLPT lớn, độ nhớt cao nên để chế tạo được dung dịch COS có nồng

độ khoảng 5%, cao hơn các công bố trước đây (1-3%) [32], chúng tôi đã cắt mạch CTS

bằng H2O2 để giảm KLPT và độ nhớt Điều kiện phản ứng là: pH = 9, CTS/H2O2 2% = 1/10 (w/v), thời gian phản ứng là 22, 35 và 40 giờ tương ứng với các loại CTS có ĐĐA 95,5%; 84% và 79% [7] Kết quả thu được ghi ở bảng 3.1.

Bảng 3.1 Sự thay đổi KLPT, ĐĐA và PI của CTS nguồn cắt mạch bằng hydro peroxit

CTS ban đầu Thời gian CTS giảm cấpĐĐA,% Mw, kDa PI (giờ) ĐĐA, % Mw, kDa PI

79,0 183 4,35 40 72,0 48,7 4,2184,0 163 3,77 35 80,3 50,0 3,7295,5 138 3,62 22 91,0 49,0 3,64 Bảng 3.1 cho thấy CTS bị cắt mạch theo thời gian kèm theo quá trình giảm ĐĐA Độ giảm ĐĐA lần lượt là 4,2%; 4,4% và 8,8% tương ứng với thời gian cắt mạch là 22, 35 và 40 giờ Các loại CTS thu được (hình 3.3) có KLPT ~ 50 kDa

Hình 3.3 CTS nguồn ĐĐA 72% (a); 80,3% (b) và 91,0 % (c)

3.3 HIỆU ỨNG ĐỒNG VẬN CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG CHIẾU XẠ DUNG DỊCH

3.3.1 Hiệu ứng đồng vận chế tạo oligochitosan đối với chitosan có độ đề axetyl ~ 91%

Hình 3.4 Sự phụ thuộc KLPT của CTS-91 trong dung dịch 5% theo liều xạ và thời gian

phản ứng (thời gian, giờ = kGy/1,33)

Hình 3.4 cho thấy với suất liều 1,33 kGy/h tốc độ cắt mạch CTS có ĐĐA ~ 91% (CTS-91) của tia γCo60 là nhanh hơn so với H2O2 0,5% Khi liều xạ lớn hơn 7 kGy, KLPT của CTS-91 cắt mạch bằng tác dụng đồng vận của tia γCo60/H2O2 0,5% suy giảm hầu như

dựa trên độ suy giảm khối lượng phân tử (ĐSGKLPT) do các tác nhân phản ứng gây ra và được trình bày ở bảng 3.2 Kết quả cho thấy hiệu ứng đồng vận giảm dần khi tăng liều xạ

Bảng 3.2 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch CTS-91 trong dung dịch 5% bằng tia γCo60 và H 2 O 2

0,5%

Mẫu CTS ĐSGKLPT, % = (Mw0 - Mw)×100/ Mw0

2,2 kGy (1,7 giờ)

7,6 kGy (5,7 giờ)

15,1 kGy (11,4 giờ)

19,8 kGy (14,9 giờ)

* Mẫu không chiếu xạ; ** Mẫu chiếu xạ (thời gian, giờ = kGy/1,33)

Cơ chế cắt mạch CTS hiệu quả bằng kết hợp đồng vận (tia γCo60 và H2O2) có thể được giải thích là do có sự phân li bức xạ của nước và H2O2 dưới tác dụng của tia γCo60 hình thành gốc tự do hydroxyl (•OH)có tính oxy hóa mạnh làm tăng hiệu quả cắt mạch CTS Cơ chế này đã được Ulanski và cộng sự đề xuất [100]:

Qua nghiên cứu cắt mạch CTS-91 cho thấy COS với Mw < 10 kDa có thể chế tạo hiệu quả bằng hiệu ứng đồng vận tia (γCo60 và H2O2 0,5%) ở liều thấp ~7 kGy COS thu được có

độ phân tán PI ≈ 1,3; có các nhóm cấu tạo chính hầu như không khác biệt so với CTS ban đầu ĐĐA của COS thu được ở 7 kGy giảm không đáng kể

Hình 3.5 Phổ FT-IR của CTS-91 (a) và sản phẩm cắt mạch bằng chiếu xạ dung dịch

3.3.2 Hiệu ứng đồng vận chế tạo oligochitosan đối với chitosan có độ đề axetyl ~ 80,3%

Hình 3.6 Sự phụ thuộc KLPT của CTS-80 cắt mạch trong dung dịch 5% theo liều xạ và

thời gian phản ứng (thời gian, giờ = kGy/1,33)

Hình 3.6 cho thấy sự kết hợp giữa tia γCo60 và H2O2 để cắt mạch CTS có ĐĐA ~ 80,3% (CTS-80) là rất hiệu quả ở liều xạ < 10 kGy Các nhóm chức chính cấu tạo nên sản phẩm cắt mạch CTS-80 phân tích bằng FT-IR (hình 3.7) cho kết quả hầu như không thay đổi so với CTS-80 ban đầu

Hình 3.7 Phổ FT-IR của CTS-80 (a) và sản phẩm cắt mạch bằng chiếu xạ trong dung dịch

Qua nghiên cứu cắt mạch CTS-80 trong dung dịch chúng tôi nhận thấy: Sự kết hợp H2O2

0,5% với chiếu xạ tia γCo60 đã làm giảm liều xạ khoảng 5 lần so với phương pháp cắt mạch

chỉ bằng chiếu xạ tia γCo60 COS có thể chế tạo hiệu quả bằng kết hợp tia γCo60 và H2O2 cắt mạch CTS-80 trong khoảng liều xạ < 10 kGy COS thu được có ĐĐA giảm khoảng 10%.

3.3.3 Hiệu ứng đồng vận chế tạo oligochitosan đối với chitosan có độ đề axetyl ~ 72%

Hình 3.8 cho thấy để chế tạo được COS từ CTS có ĐĐA~72% (CTS-72) cần liều xạ lớn hơn 17 kGy, cao hơn so với liều xạ cần thiết để chế tạo COS từ CTS-91 (7 kGy) và CTS-80 (9 kGy) Điều này chứng tỏ CTS có ĐĐA thấp khó bị cắt mạch hơn CTS có ĐĐA cao

Hình 3.8 Sự phụ thuộc KLPT của CTS-72 trong dung dịch 5% theo liều xạ và thời gian

phản ứng (thời gian, giờ = kGy/1,33)

Hình 3.9 Phổ FT-IR của CTS-72 (a) và sản phẩm cắt mạch bằng chiếu xạ trong dung dịch

FT-IR của sản phẩm cắt mạch xuất hiện hầu hết các pic đặc trưng của CTS-72 ban đầu (hình 3.9) Điều này cho thấy cấu tạo cơ bản của CTS không thay đổi trong khoảng liều xạ

áp dụng

Qua quá trình nghiên cứu cắt mạch CTS-72 ở dạng dung dịch chúng tôi nhận thấy: COS chế tạo từ CTS-72 trong dung dịch H2O2 0,5% ở liều xạ ~ 17 kGy có ĐĐA giảm khoảng 12% Cấu tạo cơ bản của COS không thay đổi so với CTS-72 ban đầu

Hình 3.10 Dung dịch 5% CTS-91 trước khi chiếu xạ (a) và sau chiếu xạ (b)

Hình 3.11 CTS -91 (a), sản phẩm cắt mạch CTS-91 (b), COS thu được từ CTS-91 (c),

CTS-80 (d) và CTS-72 (e)

Hình 3.10 và hình 3.11 cho thấy CTS sau khi cắt mạch chuyển sang màu vàng đậm hoặc màu nâu Sự thay đổi màu có thể là do sự tạo thành cấu trúc vòng glucopyranose chưa bão hòa chứa nhóm cacbonyl hay cacboxyl khi các gốc tự do tái kết hợp [105] Nhóm cacbonyl hình thành ở cuối mạch là kết quả của quá trình cắt mạch [95] CTS cắt mạch càng sâu cường độ hấp thu ở pic 290 nm càng mạnh

Hình 3.12 Phổ UV –vis của CTS-91 (a), sản phẩm cắt mạch CTS-91(b), COS thu được từ

CTS-72 (c), CTS-80 (d) và CTS-91 (e) nồng độ 0,1 % (w/v) trong dung dịch axit axetic

0,05%

Từ kết quả cắt mạch CTS trong dung dịch chúng tôi thu được một số nhận xét quan trọng sau:

- Bằng giải pháp cắt mạch CTS nguồn sử dụng H2O2 để giảm KLPT của CTS ban đầu xuống khoảng 50 kDa, độ nhớt của dung dịch CTS chiếu xạ giảm Kết quả là lần đầu tiên, chúng tôi đã chế tạo được dung dịch COS ở nồng độ 5% cao hơn hẳn so với các nghiên cứu trước đây chỉ từ 1-3%,

- COS có thể chế tạo hiệu quả bằng hiệu ứng đồng vận của tia γCo60 và H2O2 0,5% ở liều xạ tương đối thấp dưới 20 kGy,

- Hiệu ứng đồng vận của tia γCo60 và H2O2 0,5% giảm khi tăng liều xạ,

- Trong dung dịch, tác nhân tia γCo60 (1,33 kGy/h) cắt mạch hiệu quả hơn so với H2O2 0,5% trong cùng thời gian phản ứng,

- Hiệu suất cắt mạch bức xạ được gia tăng đáng kể khi có mặt H2O2 0,5% trong dung dịch chiếu xạ,

- CTS-91 dễ bị cắt mạch bức xạ hơn so với CTS-80 và CTS-72,

- Cắt mạch bằng tia γCo60 cho độ phân tán KLPT của polyme tương đối thấp hơn so với khi cắt mạch bằng H2O2 0,5%

3.4 HIỆU ỨNG ĐỒNG VẬN CẮT MẠCH CHITOSAN Ở DẠNG TRƯƠNG

3.4.1 Xác định một số thông số ban đầu của CTS cắt mạch ở dạng trương

Bảng 3.3 cho thấy độ ẩm của các mẫu CTS giảm dần khi tăng ĐĐA Độ trương nước bão hòa (ĐTNBH) của mẫu C70 và C80 lớn hơn đáng kể so với mẫu C90 Khi ĐĐA tăng lên 90% thì ĐTNBH giảm đi rõ rệt

Bảng 3.3 Độ ẩm và ĐTNBH các mẫu CTS

Kí hiệu mẫu CTS ĐĐA (%) Mw (kDa) Độ ẩm (%) ĐTNBH (%)

C90 91 166 13,9 ± 0,3 600 ± 40C80 83 176 14,0 ± 0,3 1170 ± 50C70 72 183 19,2 ± 0,4 1060 ± 60 ĐTNBH thấp nhất của CTS có ĐĐA từ 70 - 90% là 600%, tương ứng với tỉ lệ CTS/H2O =1/6 Để quá trình vận hành thiết bị được thuận lợi, CTS không bị tách nước trước khi chiếu xạ, chúng tôi chọn tỉ lệ CTS/H2O =1/5 cho tất cả các thí nghiệm

3.4.2 Cắt mạch chitosan bằng hiệu ứng đồng vận của H 2 O 2 /tia γCo 60 ở dạng trương và khảo sát ảnh hưởng của nồng độ, suất liều

Hình 3.13 Sự suy giảm KLPT của CTS trương trong nước và trong dung dịch H 2 O 2 theo

liều xạ

Hình 3.13 cho thấy KLPT của CTS trương trong H2O2 giảm nhanh trong khoảng liều xạ

từ 0 đến 7 kGy Sau đó sự suy giảm KLPT chậm dần khi tăng liều xạ Trong khi đó, KLPT của mẫu CTS trương trong nước giảm không đáng kể

Phổ FT-IR của sản phẩm cắt mạch xuất hiện hầu hết các nhóm đặc trưng như của CTS ban đầu (hình 3.14) Điều này cho thấy hầu như không có sự thay đổi về cấu tạo cơ bản của sản phẩm cắt mạch so với CTS ban đầu Nhóm cacboxyl hình thành đặc trưng cho phản ứng mở vòng glucopyranose ở pic 1730 cm-1 [76] không xuất hiện Điều này cho thấy phản ứng mở vòng glucopyranose không xảy ra

Hình 3.14 Phổ FT-IR của CTS ban đầu (a) và sản phẩm cắt mạch CTS ở dạng trương với

Giản đồ XRD của CTS ban đầu và sản phẩm cắt mạch CTS (hình 3.15) cho thấy các sản phẩm cắt mạch CTS cũng có 2 pic ở 2θ = 10,3o và 19,8o tương tự như các pic đặc trưng của CTS ban đầu [45] Điều này cho thấy cấu trúc tinh thể của CTS cắt mạch hầu như không thay đổi so với CTS ban đầu ở liều xạ 10 kGy

Hình 3.15 Giản đồ XRD của CTS ban đầu (a) và sản phẩm cắt mạch CTS ở dạng trương

Phổ UV-vis trên hình 3.16 cho thấy CTS ban đầu hầu như không hấp thụ trong khoảng bước sóng từ 240-320 nm Trong khi đó, CTS chiếu xạ có pic ở 299 nm mô tả sự dịch chuyển n → π* của liên kết đôi cacbon-oxi [34], đó là bằng chứng cho thấy sự có mặt của nhóm cacbonyl (C=O) trong cấu tạo của sản phẩm Nhóm cacbonyl có thể là sản phẩm chuyển hóa cuối mạch tại các vị trí C1 và C4 khi CTS bị cắt mạch [89]

Hình 3.16 Phổ UV-vis của dung dịch CTS 0,1% có KLPT khác nhau trong dung dịch axit

axetic 0,05%

Bảng 3.4 cho thấy suất liều càng thấp hiệu quả cắt mạch bức xạ càng cao và giá trị PI có

xu hướng giảm khi giảm suất liều Tuy nhiên, theo chúng tôi suất liều > 1 kGy/h nên được lựa chọn để áp dụng cho quy mô lớn nhằm tiết kiệm thời gian và tăng hiệu quả sử dụng thiết

bị chiếu xạ

Bảng 3.4 KLPT và PI của CTS cắt mạch dạng trương trong H 2 O 2 5% ở liều xạ 10 kGy với

suất liều khác nhau

Suất liều, kGy/h 3,6 1,8 0,9 0,45

Mw, kDa 35,2 28,3 26,9 26,3

PI 2,51 2,41 2,40 2,41

Hình 3.17 CTS ban đầu – dạng bột (a), CTS trương trong dung dịch H 2 O 2 5% (b) và CTS

cắt mạch bằng hiệu ứng đồng vận (c)

Từ phân tích kết quả thí nghiệm và so sánh với các tài liệu tham khảo chúng tôi nhận thấy nồng độ H2O2 5% là phù hợp cho quá trình cắt mạch CTS ở dạng trương Suất liều 1,33 kGy/h cũng được lựa chọn vì suất liều này được sử dụng phổ biến để chiếu xạ khử trùng thực phẩm tại Trung tâm VINAGAMMA

3.4.3 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan có độ đề axetyl ~ 91% ở dạng trương

Hình 3.18 Quan hệ giữa KLPT và liều xạ đối với CTS-91 cắt mạch ở dạng trương trong

Hình 3.18 cho thấy H2O2 5% cắt mạch hiệu quả hơn so với tia γCo60 Điều đáng chú ý là CTS ở dạng trương nước có độ suy giảm KLPT theo liều xạ là rất thấp so với khi chiếu xạ trong dung dịch Nguyên nhân có thể là do cơ chế cắt mạch của CTS ở trạng thái trương bị thay đổi do thiếu nước Ngoài sự phân li bức xạ của nước tạo ra gốc •OH đóng vai trò là tác nhân cắt mạch, phản ứng cắt mạch còn xảy ra do sự tiếp xúc trực tiếp của bức xạ lên chuỗi phân tử CTS [62], [45]

Bảng 3.5 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch CTS-91 bằng tia γCo60 và H 2 O 2 5%

Mẫu CTS ĐSGKLPT, % = (Mw0 - Mw)×100/ Mw0

3,7 kGy (2,8 giờ)

8,2 kGy (6,2 giờ)

12,0 kGy (9,0 giờ)

15,9 kGy (12,0 giờ)

22,7 kGy (17,1 giờ)

Hình 3.19 Phổ FT-IR của CTS-91(a) và sản phẩm cắt mạch CTS-91 ở dạng trương trong

Bảng 3.5 cho thấy CTS-91 cắt mạch ở dạng trương có hiệu ứng đồng vận đạt cực đại tại liều xạ ~ 9 kGy Hình 3.19 cho thấy hầu hết các nhóm đặc trưng của CTS đều xuất hiện trong FT-IR của sản phẩm cắt mạch Tuy nhiên, khi liều xạ > 12 kGy chúng tôi nhận thấy

có dấu hiệu xuất hiện nhóm cacboxyl – pic ở 1730 cm-1 [76] Điều này cho thấy CTS-91 chiếu xạ ở trạng thái trương trong H2O2 5% với liều xạ > 12 kGy có khả năng xảy ra phản ứng phá vỡ vòng glucopyranose

Hình 3.20 CTS-91 ban đầu (a); CTS-91 KLPT thấp (b)

Từ kết quả cắt mạch CTS-91 ở dạng trương chúng tôi nhận thấy: H2O2 5% cắt mạch CTS-91 hiệu quả hơn so với tia γCo60 Hiệu quả cắt mạch CTS-91 bằng tia γCo60 ở dạng

trương nước thấp hơn đáng kể so với khi cắt mạch trong dung dịch CTS-91 cắt mạch ở dạng trương có hiệu ứng đồng vận đạt cực đại ở liều xạ khoảng 9 kGy Khi tăng liều xạ > 12 kGy, CTS thu được có khả năng bị phá vỡ vòng glucopyranose.

3.4.4 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan có độ đề axetyl ~ 80% ở dạng trương

Hình 3.21 Quan hệ giữa KLPT và liều xạ đối với CTS-80 cắt mạch ở dạng trương trong

Hình 3.21 cho thấy CTS-80 trương trong nước theo tỉ lệ 1g CTS/5ml nước gần như không bị suy giảm KLPT khi tăng liều xạ tương tự như CTS-91 Phổ FT-IR trên hình 3.22 cho thấy sản phẩm cắt mạch CTS-80 có cấu tạo về cơ bản không thay đổi so với CTS-80 ban đầu

Hình 3.22 Phổ FT-IR của CTS-80 (a) và sản phẩm cắt mạch CTS-80 ở dạng trương trong

Qua nghiên cứu cắt mạch CTS-80 ở trạng thái trương chúng tôi nhận thấy hiệu ứng đồng vận (tia γCo60 và H2O2) đã làm gia tăng hiệu quả cắt mạch và đạt giá trị cực đại là ~ 17% ở liều xạ 20 kGy Sự kết hợp H2O2 và chiếu xạ tia γCo60 cho phép chế tạo hiệu quả CTS KLPT thấp (hình 3.23 b) và COS từ CTS ban đầu (hình 3.23 a) ở dạng trương ĐĐA của CTS cắt mạch ở liều xạ 15,5 kGy giảm khoảng 16%

Hình 3.23 CTS-80 ban đầu - 50 kDa (a); CTS-80 KLPT thấp – 11,7 kDa (b)

3.4.5 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan có độ đề axetyl ~72% ở dạng trương

Hình 3.24 Quan hệ giữa KLPT và liều xạ đối với CTS-72 cắt mạch ở dạng trương trong

Hình 3.24 cho thấy H2O2 5% cắt mạch CTS-72 khá hiệu quả Trong khi đó độ suy giảm KLPT của CTS-72 khi cắt mạch bằng tia γCo60 là khá thấp Sự kết hợp đồng vận tia γCo60

và H2O2 5% cho kết quả không thật sự vượt trội so với cắt mạch bằng H2O2 5% Hiệu ứng đồng vận tối đa đạt được khoảng 12% ở 14 kGy Giá trị này thấp hơn so với hiệu ứng đồng vận cắt mạch CTS-91 và CTS-80

Hình 3.25 Phổ FT-IR của CTS-72 ban đầu (a) và sản phẩm cắt mạch CTS-72 ở dạng trương

FT-IR trên hình 3.25 cho thấy sản phẩm cắt mạch CTS-72 có cấu trúc chính không thay đổi so với CTS ban đầu ĐĐA của CTS-72 cắt mạch ở liều xạ 20 kGy giảm so với CTS ban đầu khoảng 12% Độ suy giảm ĐĐA tương đối thấp hơn so với CTS-91 và CTS-80

Hình 3.26 CTS-72 ban đầu - 47,8 kDa (a); CTS-72 KLPT thấp - 13,3 kDa (b)

Qua thí nghiệm nghiên cứu hiệu ứng đồng vận cắt mạch CTS-72 chúng tôi nhận thấy: Áp dụng hiệu ứng đồng vận tia γCo60 và H2O2 5% có thể chế tạo được CTS KLPT thấp khoảng

13 kDa (hình 3.26 b) ở liều xạ khoảng 22 kGy Tác nhân H2O2 5% cắt mạch khá hiệu quả CTS-72, độ suy giảm KLPT của CTS-72 không đáng kể khi cắt mạch bằng tia γCo60 Hiệu ứng đồng vận cắt mạch CTS-72 cực đại đạt được tương đối thấp khoảng 12% Áp dụng hiệu ứng đồng vận cắt mạch CTS-72 ở trạng thái trương cho hiệu quả cắt mạch không thật sự vượt trội so với cắt mạch bằng H2O2 5% về mức độ suy giảm KLPT Tuy nhiên, phương pháp cắt mạch đồng vận có ưu điểm trong việc giảm độ đa phân tán của polyme cắt mạch

Hình 3.27 CTS sau khi cắt mạch bức xạ ở dạng trương

Hình 3.28 CTS-80 (a); CTS KLPT thấp cắt mạch từ CTS-72 (b); CTS-80 (c); CTS-91(d)

và COS chế tạo từ CTS-80 (e)

Hình 3.27 và hình 3.28 mô tả hỗn hợp CTS sau khi chiếu xạ cắt mạch ở dạng trương CTS-91 cắt mạch có màu sắc tương đối đậm hơn so với CTS-80 và CTS-72 cắt mạch Nguyên nhân sự thay đổi màu có thể là do sự hình thành cấu trúc vòng glucopyranose chưa bão hòa như chúng tôi thảo luận ở phần cắt mạch dung dịch

Qua nghiên cứu hiệu ứng đồng vận tia γCo60 và H2O2 5% ở dạng trương chúng tôi thu được một số kết luận quan trọng sau:

- Tác nhân H2O2 5% cắt mạch CTS ở dạng trương hiệu quả hơn so với tia γCo60 (1,33 kGy/h)

- Cắt mạch CTS bằng tia γCo60 ở dạng trương cho hiệu quả thấp hơn đáng kể so với khi cắt mạch bằng chiếu xạ dung dịch

- Hiệu ứng đồng vận cắt mạch CTS ở trạng thái trương đạt cực đại ở liều xạ khoảng 9, 20 và

14 kGy tương ứng với CTS có ĐĐA ban đầu là 91; 80,3 và 72%

- Hiệu suất cắt mạch bức xạ gia tăng đáng kể khi có mặt H2O2 Mức độ gia tăng hiệu suất cắt mạch giảm khi tăng liều xạ

- CTS KLPT thấp có thể chế tạo hiệu quả bằng kết hợp đồng vận tia γCo60 và H2O2 5% Cấu tạo và ĐĐA của sản phẩm thay đổi không đáng kể so với CTS ban đầu ở liều xạ < 12 kGy

- Đây là lần đầu tiên quá trình nghiên cứu cắt mạch CTS ở dạng trương được tiến hành Sản phẩm CTS KLPT thấp và COS sau chiếu xạ được thu hồi dễ dàng hơn so với chiếu xạ dung dịch vì vậy rất có triển vọng áp dụng ở quy mô công nghiệp Ngoài ra, CTS KLPT thấp có thể được ứng dụng trực tiếp hoặc làm nguyên liệu để chế tạo COS trong dung dịch với liều

xạ thấp

3.5 KHẢ NĂNG CHẾ TẠO OLIGOCHITOSAN BẰNG H 2 O 2 TRONG DUNG DỊCH

Hình 3.29 Sự phụ thuộc giữa KLPT và thời gian cắt mạch theo phương pháp 1

Hình 3.29 mô tả KLPT CTS giảm khi gia tăng thời gian cắt mạch theo phương pháp tăng nồng độ H2O2 (1%/1giờ) Kết quả hồi quy thu được phương trình:

M w = 34,665×e -0,349×t

Kết quả phân tích thống kê cho thấy ở mức kiểm định nghiêm ngặt mô hình hàm mũ này

mô tả tốt số liệu thực nghiệm Từ kết quả trên có thể dự đoán phản ứng cắt mạch tuân theo

mô hình động học bậc nhất

Hình 3.30 Sự phụ thuộc giữa KLPT và thời gian cắt mạch theo phương pháp 2

Hình 3.30 mô tả KLPT CTS giảm khi gia tăng thời gian cắt mạch theo phương pháp cắt mạch bằng H2O2 5% (cho vào 1 lần) Kết quả hồi qui phi tuyến thu được phương trình:

Mw = 21,566×t-0,368

Qua quá trình nghiên cứu cắt mạch CTS bằng H2O2 trong dung dịch chúng tôi nhận thấy: Với phương pháp 1 – H2O2 được đưa vào từng giai đoạn khác nhau, động học cắt mạch tuân theo mô hình động học bậc nhất Khi H2O2 được đưa vào cùng một lúc (theo phương pháp 2) phản ứng không tuân theo mô hình động học bậc nhất Phương pháp 1 có ưu thế hơn so với phương pháp 2 về phương diện hiệu quả cắt mạch, bảo vệ nhóm amin và ít làm thay đổi cấu trúc của sản phẩm Tuy nhiên, so với phương pháp chiếu xạ áp dụng hiệu ứng đồng vận của H2O2 và tia γCo60 thì chế tạo COS bằng phương pháp hóa học có độ suy giảm ĐĐA lớn hơn

3.6 ỨNG DỤNG SẢN PHẨM CHITOSAN CẮT MẠCH

3.6.1 Hiệu ứng chống oxi hóa

Hình 3.31 cho thấy CTS và COS có KLPT càng nhỏ hiệu suất bắt gốc tự do càng cao Tại thời gian phản ứng 90 phút, hiệu suất bắt gốc tự do là 69,9; 84,5; 89,2 và 99,3% tương ứng đối với KLPT CTS và COS là 45,0; 23,4; 9,9 và 4,7 kDa Nguyên nhân là do các nhóm –NH2 và –OH đóng vai trò quyết định hoạt tính chống oxy hóa [113] và trong CTS KLPT thấp chúng linh động hơn so với trong CTS có KLPT cao

Hình 3.31 Hiệu suất bắt gốc tự do của CTS và COS

3.6.2 Hiệu ứng kháng khuẩn

• Hiệu ứng kháng khuẩn của CTS KLPT thấp chế tạo bằng chiếu xạ

Các mẫu CTS KLPT 30 - 60 kDa được chế tạo bằng phương pháp chiếu xạ γCo60 CTS trương trong dung dịch H2O2 5% có hiệu ứng kháng khuẩn tốt với hiệu suất ~ 100%

• Hiệu ứng kháng khuẩn của CTS KLPT thấp và COS chế tạo bằng phương pháp hóa học CTS có KLPT Mw ~ 10-15 kDa chế tạo bằng phương pháp cắt mạch hóa học theo bậc có

khả năng kháng khuẩn tốt Nồng độ CTS KLPT 15 kDa thích hợp để kháng vi khuẩn E coli (gram âm) là 300 ppm, vi khuẩn S aureus (gram dương) là 200 ppm.

3.6.3 Hiệu ứng kích thích tăng trưởng và kháng bệnh trên gà

Khi có bổ sung CTS KLPT 15 ~ kDa (CTSM15) vào thức ăn, gà có sức đề kháng tốt hơn khi thời tiết thay đổi hoặc khi tiêm vắc-xin phòng dịch Do ít bị nhiễm bệnh nên gà có tốc

độ lớn ổn định Kết quả phân tích cho thấy CTSM15 nồng độ 200 - 400 ppm bổ sung vào thức ăn của gà cho hiệu quả kháng bệnh và tăng trưởng tốt nhất

KẾT LUẬN CHÍNH CỦA LUẬN ÁN Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống về hiệu ứng đồng vận của tia γCo60 và H2O2 cắt mạch chitosan với các độ đề axetyl khác nhau: 70, 80 và 90% Kết quả thu được khi nghiên cứu hiệu ứng đồng vận cắt mạch chitosan ở trạng thái trương, cắt mạch trong dung dịch với nồng độ 5% chitosan và cắt mạch bằng H2O2 theo bậc

là những kết quả mới chưa được công bố Luận án đóng góp cho việc phát triển ứng dụng

chế tạo dung dịch oligochitosan ở nồng độ cao 5% hướng tới sản xuất với quy mô lớn (trước đây chỉ 1 - 3%) Từ nội dung nghiên cứu của luận án chúng tôi đạt được một số kết quả sau:

1 Chitosan có độ đề axetyl khá cao 83% đã được chế tạo trong điều kiện NaOH 50%, nhiệt

độ 90°C chỉ sau 3 giờ phản ứng Độ đề axetyl có thể được gia tăng lên đến 95,5% bằng cách

để nguội hỗn hợp phản ứng sau 12 giờ

2 Dung dịch oligochitosan 5% được chế tạo bằng kết hợp đồng vận của tia γCo60 và H2O2

0,5% ở liều xạ thấp dưới 20 kGy Hiệu ứng đồng vận giảm khi tăng liều xạ Liều xạ cần để chế tạo oligochitosan từ chitosan ban đầu có độ đề axetyl là 91, 80 và 72% tương ứng là 7, 9

và 17 kGy Hiệu suất cắt mạch bức xạ được gia tăng đáng kể khi có mặt H2O2 trong dung dịch chiếu xạ Chitosan có độ đề axetyl càng cao thì hiệu suất cắt mạch bức xạ và hằng số tốc độ cắt mạch bức xạ càng cao Độ đề axetyl của oligochitosan suy giảm so với chitosan ban đầu dưới 12% tùy thuộc vào liều xạ

3 Chitosan khối lượng phân tử 30 – 45 kDa được chế tạo hiệu quả bằng chiếu xạ chitosan (Mw ~ 91,7 kDa, ĐĐA ~ 91,3%) ở dạng trương trong dung dịch H2O2 trong khoảng liều xạ thấp 2,5 – 10 kGy Nồng độ H2O2 5% là phù hợp cho quá trình cắt mạch chitosan ở trạng thái trương trên phương diện hạn chế sự thay đổi cấu trúc và giảm độ đề axetyl của sản phẩm Suất liều càng thấp hiệu quả cắt mạch càng cao

4 Lần đầu tiên chitosan khối lượng phân tử thấp và oligochitosan được chế tạo bằng hiệu ứng đồng vận ở dạng trương Tác nhân H2O2 5% cắt mạch chitosan hiệu quả hơn so với tia γCo60 (1,33 kGy/h) Hiệu suất cắt mạch chitosan bằng tia γCo60 ở trạng thái trương thấp hơn đáng kể so với trạng thái dung dịch Chitosan cắt mạch ở dạng trương có hiệu ứng đồng vận đạt cực đại ở liều xạ khoảng 9, 20 và 14 kGy tương ứng với chitosan ban đầu có độ đề axetyl khoảng 91, 80 và 72% Cấu trúc và độ đề axetyl của sản phẩm cắt mạch thay đổi không đáng kể so với chitosan ban đầu ở liều xạ < 12 kGy

5 Phương pháp cắt mạch gia tăng nồng độ H2O2 theo thời gian tuân theo mô hình động học bậc nhất Phương pháp này có ưu thế hơn so với việc sử dụng H2O2 ở nồng độ cao ngay từ đầu về mặt hiệu quả cắt mạch cũng như bảo vệ nhóm amin Tuy nhiên, xét về hiệu quả cắt mạch thì phương pháp này vẫn kém hơn so với phương pháp sử dụng hiệu ứng đồng vận tia γCo60 và H2O2

6 Chitosan khối lượng phân tử càng nhỏ thể hiện hoạt tính chống oxi hóa càng cao Hoạt tính kháng khuẩn của chitosan khối lượng phân tử thấp cao hơn so với oligochitosan Chitosan khối lượng phân tử 30 - 60 kDa thể hiện hoạt tính kháng khuẩn tốt với hiệu suất kháng khuẩn ~100% Khối lượng phân tử khoảng 15 kDa là phù hợp để gia tăng sức

đề kháng và trọng lượng cho gà Nồng độ thích hợp để bổ sung vào thức ăn cho gà là

200 - 400 ppm

DANH MỤC CÁC BÀI BÁO LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN

I Tạp chí khoa học

1 Đặng Xuân Dự , Đinh Quang Khiếu, Diệp Khanh, Nguyễn Quốc Hiến (2013),

chế tạo oligochitosan, Tạp chí Hóa Học, Số 51(2C), tr 627 – 631.

2 Đặng Xuân Dự , Nguyễn Thị Thu Hương, Võ Quang Mai, Trần Thái Hòa, Nguyễn

Quốc Hiến (2013), Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận tia γ/H 2 O 2 cắt mạch chitosan ở dạng trương trong nước, Tạp chí Hóa Học, Số 51(3AB), tr 169 – 172.

3 Trần Thái Hòa, Đặng Xuân Dự, Nguyễn Quốc Hiến, Nguyễn Thị Thanh Hải, Đinh

Quang Khiếu (2013), Nghiên cứu điều chế oligochitosan bằng phương pháp cắt

tr 955 – 959

4 Đặng Xuân Dự (2013), Xác định độ trương nước bão hòa của một số loại

Chitosan có độ đề axetyl khác nhau được chế tạo từ vỏ tôm, Tạp chí Đại học Sài

Gòn, số 13, tr 92 – 99

5 Dang Xuan Du , Bui Phuoc Phuc, Tran Thi Thuy, Le Anh Quoc, Dang Van Phu,

Nguyen Quoc Hien (2013), Study on gamma-irradiation degradation of chitosan

and Technology, Vol 3, pp 33-39

6 Dang Xuan Du , Vo Quang Mai, Nguyen Ngoc Duy, Dang Van Phu, Nguyen

Quoc Hien (2014), Degradation of chitosan by γ-irradiation of chitosan swollen

in hydrogen peroxide solution, Journal of Science and Technology, 52(4),

pp 441 – 450

7 Đặng Xuân Dự , Diệp Khanh, Trần Thị Anh Thư, Võ Quang Mai (2015), Nghiên

cứu tác dụng đồng vận của tia Gamma Co-60 và hydroperoxit cắt mạch chitosan

có độ đề axetyl khoảng 70% ở trạng thái trương, Tạp chí Đại học Sài Gòn, 1(26),

tr 21-31

1 Đặng Xuân Dự , Trần Thái Hòa, Võ Quang Mai, Lê Công Nhân, Nguyễn Ngọc Duy,

Đặng Văn Phú, Nguyễn Quốc Hiến (2013), Nghiên cứu gia tăng hiệu suất cắt mạch

trình và Tóm tắt báo cáo Hội Nghị Khoa học và công nghệ hạt nhân toàn quốc lần thứ 10, tr 224

2 Đặng Xuân Dự , Trần Thái Hòa, Nguyễn Thị Thu Hương, Võ Quang Mai, Nguyễn

Quốc Hiến (2013), Nghiên cứu hiệu ứng đồng vận tia γ/H 2 O 2 cắt mạch chitosan ở dạng trương trong nước, Danh mục Hội thảo Khoa học cán bộ trẻ các trường Đại học

Sư Phạm toàn quốc lần thứ 3, NXB Đà Nẵng, tr 10