Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long

TÓM TẮT Đề tài “Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện tại phòng

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HUỲNH VĂN TIỀN MSHV: 62031104

ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN

TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC

VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO

Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH VI SINH VẬT HỌC

2015

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

HUỲNH VĂN TIỀN MSHV: 62031104

ĐA DẠNG DI TRUYỀN VI KHUẨN

TỔNG HỢP CHẤT KẾT TỤ SINH HỌC

VÀ ỨNG DỤNG XỬ LÝ NƯỚC THẢI SAU BIOGAS CỦA TRẠI CHĂN NUÔI HEO

Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG

LUẬN ÁN TIẾN SĨ NGÀNH: VI SINH VẬT HỌC

MÃ NGÀNH: 62 42 01 07

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS TRƯƠNG TRỌNG NGÔN PGS TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG

2015

LỜI CẢM TẠ

Tôi xin chân thành cảm ơn:

PGS.TS Trương Trọng Ngôn, GS.TS Cao Ngọc Điệp, PGS TS

Hà Thanh Toàn và PGS TS Ngô Thị Phương Dung đã dành thời gian quý báu tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành luận án

Quý Thầy Cô giảng dạy chương trình nghiên cứu sinh chuyên ngành Vi sinh vật học, trường Đại học Cần Thơ đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý báu trong thời gian học tập

Cán bộ phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật và Sinh học Phân tử của Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận án

Cám ơn gia đình và tất cả bạn bè đã động viên và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thời gian thực hiện đề tài!

Tác giả

HUỲNH VĂN TIỀN

CỘNG HÕA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

Độc lập – Tự do – Hạnh phúc

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của NCS Huỳnh Văn Tiền với sự hướng dẫn của PGS TS Trương Trọng Ngôn và PGS TS Ngô Thị Phương Dung Các số liệu và kết quả trình bày trong luận văn là trung thực, chưa từng được công bố riêng lẻ bởi tác giả khác trong bất kỳ công trình nào trước đây

Người hướng dẫn khoa học

PGS TS TRƯƠNG TRỌNG NGÔN

PGS TS NGÔ THỊ PHƯƠNG DUNG

Tác giả luận văn

HUỲNH VĂN TIỀN

MỤC LỤC

Trang

Lời cảm tạ i

Lời cam đoan ii

Mục lục iii

Danh sách bảng vii

Danh sách hình x

Danh mục từ viết tắt xiii

Tóm tắt xv

Abstract xvii

Chương 1: Giới thiệu 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 2

1.2.1 Mục tiêu đề tài 2

1.2.2 Nội dung nghiên cứu 2

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án 3

1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học 4

Chương 2: Tổng quan tài liệu 5

2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo 5

2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo 5

2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới 5

2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam 6

2.2 Xử lý nước thải trong chăn nuôi 7

2.2.1 Các chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước 7

2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải 8

2.3 Kết tụ sinh học trong nước 9

2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant) 9

2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 18

2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng kết tụ của vi khuẩn 23

2.3.4 Ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải 29

2.3.5 Quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

trong xử lý nước thải 31

Chương 3: Phương pháp nghiên cứu 33

3.1 Phương tiện nghiên cứu 33

3.1.1 Thời gian 33

3.1.2 Địa điểm 33

3.1.3 Vật liệu 33

3.1.4 Thiết bị 34

3.1.4 Hóa chất 34

3.2 Phương pháp nghiên cứu 35

3.2.1 Chuẩn bị mẫu 35

3.2.2 Phân lập và làm thuần 36

3.2.3 Phân tích và xử lý số liệu 38

3.3 Nội dung nghiên cứu 38

3.3.1 Sơ đồ nghiên cứu tổng quát 38

3.3.2 Phân lập và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kế tụ sinh học 40

3.3.3 Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng sinh học phân tử 41

3.3.4 Phân tích các chỉ số đa dạng di truyền dựa trên trình tự 16S rRNA 46

3.3.5 Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tổng hợp chất kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn được tuyển chọn 47

3.3.6 Ly trích chất kết tụ sinh học 53

3.3.7 Thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải chăn nuôi heo sau biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 54

3.7.8 Ứng dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học xử lý nước thải sau biogas 55

Chương 4: Kết quả và thảo luận 56

4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học… 56

4.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 57

4.2.1 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 57

4.2.2 Đặc điểm của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 58

4.3 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh

học 59

4.3.1 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh

học protein 59 4.3.2 Tỷ lệ kết tụ của các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh

học polysaccharide 59

4.4 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi

khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao ở các tỉnh đồng

bằng sông Cửu Long 61

4.4.1 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi

khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 61 4.4.2 Đặc điểm sinh học và mối quan hệ di truyền giữa các chủng vi

khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 68

4.5 Phân tích đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất

kết tụ sinh học 74

4.5.1 Đa dạng về chủng giữa của các loài vi khuẩn tổng hợp chất

kết tụ sinh học dựa vào chỉ số Shannon 76 4.5.2 Đa dạng di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học 77

4.6 Xác định các điều kiện tối ƣu cho khả năng tổng hợp chất kết

tụ sinh học của chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P

(protein) và chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai KG12S

(polysaccharide) 91

4.6.1 Mối tương quan giữa thời gian nuôi ủ, tỷ lệ kết tụ và mật độ

vi khuẩn 91 4.6.2 Nhiệt độ nuôi ủ 93 4.6.3 Giá trị pH 94 4.6.4 Sự tương tác giữa các điều kiện nuôi sinh khối về thời gian,

pH và nhiệt độ của hai chủng vi khuẩn 97 4.6.5 Nguồn carbon, nguồn nitrogen và khoáng vô cơ 101 4.6.6 Xác định ảnh hưởng tương tác của 3 yếu tố dinh dưỡng đến

hiệu quả kết tụ sinh học 102 4.6.7 Ion kim loại bổ sung 106 4.6.8 Nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung 108 4.6.9 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số vi khuẩn và

tỷ lệ kết tụ của 2 chủng vi khuẩn sau khi tối ưu 109 4.6.10 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn

protein 110

4.6.11 Kết quả sử dụng các điều kiện tối ưu của hai chủng vi khuẩn

polysaccharide 111

4.6.12 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học cao được chọn thử nghiệm hiệu suất ứng dụng 112

4.7 Ly trích chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ hai chủng vi khuẩn Bacillus megaterium LA51P và Bacillus aryabhattai KG12S và thử nghiệm hiệu quả kết tụ sinh học 113

4.7.1 Kết quả ly trích 113

4.7.2 Hiệu suất kết tụ sinh học 114

4.8 Thử nghiệm hiệu quả xử lý nước thải sau biogas từ trại chăn nuôi heo 115

4.8.1 Các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ (%) các chủng vi khuẩn khi thử nghiệm ở nước thải ngoài thực tế 115

4.8.2 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 10 lít 119

4.8.3 Thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của 2 chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 100 lít 121

4.9 Hiệu quả xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở thể tích 1 m 3 và 40 m 3 122

4.9.1 Hiệu suất xử lý ở thể tích 1 m3 122

4.9.2 Hiệu suất xử lý ở thể tích 40 m3 122

Chương 5: Kết luận và đề xuất 125

5.1 Kết luận 125

5.2 Đề xuất 126

Tài liệu tham khảo 127

Phụ lục 145

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn

khác nhau từ năm 2007 – 2013 16 Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn sản xuất chất kết tụ

sinh học 19 Bảng 2.3 Một số cặp mồi sử dụng để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất

kết tụ sinh học 20 Bảng 2.4 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen đến hiệu quả tổng

hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Klebsiella sp 26

Bảng 2.5 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ đến

hiệu quả tổng hợp chất kết tụ sinh học đến vi khuẩn Serratia

fiacria 27

Bảng 2.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại đến sự kết tụ của các vi sinh

vật tổng hợp chất kết tụ sinh học 27 Bảng 2.7 Liều lượng của các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

khác nhau cho tỷ lệ kết tụ (%) ở dung dịch kaolin 29 Bảng 2.8 Ảnh hưởng của liều lượng, nhiệt độ và pH lên khả năng kết

tụ của chất kết tụ M-1 29 Bảng 2.9 Kết quả xử lý nước thải tinh bột bởi các nhân tố kết tụ 30 Bảng 2.10 Hiệu quả xử lý các loại nước thải bởi chất kết tụ sinh học từ

vi khuẩn Serratia ficaria 31

Bảng 3.1 Một số chỉ tiêu của nước thải tại trại chăn nuôi heo (sau

biogas) ở huyện Bình Minh, tỉnh Vĩnh Long 34 Bảng 3.2 Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 35 Bảng 3.3 Thành phần cho 1 mẫu DNA thực hiện phản ứng PCR 42 Bảng 3.4 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí

nghiệm 1 47 Bảng 3.5 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí

nghiệm 2a 49 Bảng 3.6 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí

nghiệm 2b 49 Bảng 3.7 Nghiệm thức bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên trong thí

nghiệm 3 50 Bảng 3.8 Nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát sự tương tác 3 yếu tố

thời gian, pH và nhiệt độ ủ đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi

khuẩn 50 Bảng 3.9 Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 3 yếu

tố nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ 51

Bảng 3.10 Nghiệm thức khảo sát ảnh hưởng của các tỷ lệ carbon,

nitrogen và khoáng vô cơ 51 Bảng 3.11 Bố trí thí nghiệm thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải ở

điều kiện phòng thí nghiệm 54 Bảng 4.1 Số mẫu phân lập và số dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp

chất kết tụ sinh học 56 Bảng 4.2 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein có

tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL 59 Bảng 4.3 Các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide

có tỷ lệ kết tụ sinh học cao ở các tỉnh ĐBSCL 60 Bảng 4.4 Đặc điểm sinh học của 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết

tụ sinh học protein 62

Bảng 4.5 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 18 dòng vi khuẩn với

các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene 64 Bảng 4.6 Kết quả định danh 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học protein 67 Bảng 4.7 Đặc điểm sinh học của 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết

tụ sinh học polysaccharide 69

Bảng 4.8 Kết quả so sánh trình tự 16S rRNA của 16 dòng vi khuẩn so

với các dòng vi khuẩn trên ngân hàng gene 71 Bảng 4.9 Kết quả định danh 16 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học polysaccharide 73 Bảng 4.10 Kết quả định danh các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học dựa trên cây phả hệ mối quan hệ di truyền 75 Bảng 4.11 Chỉ số đa dạng giữa các loài trong quần thể vi khuẩn tổng

hợp chất kết tụ sinh học 76 Bảng 4.12 Chỉ số đa dạng giữa các chủng trong quần thể vi khuẩn

tổng hợp chất kết tụ sinh học 77 Bảng 4.13 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học 83 Bảng 4.14 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn 85 Bảng 4.15 Giá trị Pi và Theta ở 2 nhóm vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học Bacillus megaterium và Bacillus aryabhattai 87 Bảng 4.16 Các giá trị về chỉ số haplotypes của 2 nhóm vi khuẩn tổng

hợp chất kết tụ sinh học Bacillus megaterium và Bacillus

Bảng 4.19 Mã di truyền chuỗi nucleotide 90 Bảng 4.20 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào vi

khuẩn và chỉ số OD660 92 Bảng 4.21 Ảnh hưởng của thời gian, độ pH và nhiệt độ đến tỷ lệ kết tụ

của 2 chủng vi khuẩn 98 Bảng 4.22 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của

yếu tố nhiệt độ, thời gian và pH đến chủng vi khuẩn

Bacillus aryhadtai KG12S 100 Bảng 4.23 Ảnh hưởng của nguồn carbon, nitrogen và khoáng vô cơ

đến tỷ lệ kết tụ của hai chủng vi khuẩn 102 Bảng 4.24 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ tinh bột, glutamate và

CaCl2 đến tỷ lệ kết tụ sinh học 103 Bảng 4.25 Ảnh hưởng của sự thay đổi nồng độ glucose, glutamate và

K2HPO4 + KH2PO4 đến tỷ lệ kết tụ sinh học 103 Bảng 4.26 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3

nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus

megaterium LA51P 105 Bảng 4.27 Phương trình hồi quy nhiều biến về mối tương quan của 3

nhân tố dinh dưởng của chủng vi khuẩn Bacillus aryhadtai

KG12S 106 Bảng 4.28 Mối tương quan giữa thời gian nuôi cấy, mật số tế bào của

hai chủng vi khuẩn sau khi tối ưu 110 Bảng 4.29 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất

protein ở điều kiện tối ưu 111 Bảng 4.30 Tỷ lệ kết tụ kaolin của các chủng vi khuẩn có bản chất

polysaccharide ở điều kiện tối ưu 112 Bảng 4.31 Đặc điểm sinh hóa 2 chủng vi khuẩn cho tỷ lệ kết tụ sin học

cao ở 2 môi trường phân lập 113 Bảng 4.32 Kết quả phân lập các dòng vi khuẩn từ các mẫu chất thải

sau biogas của các trại chăn nuôi heo 116 Bảng 4.33 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas của các

chủng vi khuẩn ở thể tích 10 lít 120 Bảng 4.34 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau

hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 100 lít 121 Bảng 4.35 Kết quả phân tích các chỉ tiêu hiệu suất xử lý chất thải sau

hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 1 m3

122 Bảng 4.36 Kết quả phân tích các chỉ tiêu trong nước thải sau hệ thống

biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở thể tích 40 m3 sau xử lý 123

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1 Mô hình quản lý chất thải rắn chăn nuôi trên thế giới 6

Hình 2.2 Xử lý nguồn chất thải chăn nuôi ở Việt Nam 8

Hình 2.3 Công thức cấu tạo kaolin 10

Hình 2.4 Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500 12

Hình 2.5 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S rDNA của vi khuẩn 8-37-0-1 17

Hình 2.6 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S rDNA của vi khuẩn Klebsiella sp 17

Hình 2.7 Quy trình phân lập, nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 18

Hình 2.8 Đa hình đơn nucleotide (SNPs) và haplotype 21

Hình 2.9 Quy trình ứng dụng chỉ số SNP trong công nghệ sinh học 22

Hình 2.10 Quy trình phân lập, tuyển chọn và ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học vào xử lý nước thải 32

Hình 3.1 Xác định mật số vi khuẩn bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt 37

Hình 3.2 Sơ đồ tổng quát các bước nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 39

Hình 3.3 Pha loãng mẫu phân lập (A), tách ròng khuẩn lạc (B) các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 40

Hình 3.4 Tóm tắt các bước nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bằng kỹ thuật sinh học phân tử 41

Hình 3.5 Chu kỳ gia nhiệt (thực hiện phản ứng PCR) 43

Hình 3.6 Phương pháp xác định tỷ lệ kết tụ sinh học bằng dung dịch kaolin 48

Hình 4.1 Hình dạng khuẩn lạc của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 57

Hình 4.2 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 61

Hình 4.3 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein 65

Hình 4.4 Khuẩn lạc của dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 68

Hình 4.5 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 72

Hình 4.6 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học 78

Hình 4.7 Giá trị đa dạng nuleotide (Pi) biến đổi theo trình tự chuỗi

nucleotide 79 Hình 4.8 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng

hợp chất kết tụ sinh học protein 81 Hình 4.9 Cây phả hệ mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn tổng

hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide 82 Hình 4.10 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi

nucleotide 18 chủng vi khuẩn tổng hợp Protein 84 Hình 4.11 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi

nucleotide 16 chủng vi khuẩn tổng hợp polysaccharide 84 Hình 4.12 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi

nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus megaterium

strain 87

Hình 4.13 Biến đổi giá trị Pi ở các giá trị khác nhau theo trình tự chuỗi

nucleotide 7 chủng vi khuẩn của loài Bacillus aryabhattai

strain 87

Hình 4.14 Ảnh hưởng của thời gian nuôi sinh khối đến hiệu quả kết tụ

sinh học của 2 chủng vi khuẩn 91 Hình 4.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến hiệu quả kết tụ sinh

học của hai chủng vi khuẩn 94 Hình 4.16 Ảnh hưởng của pH môi trường nuôi sinh khối đến hiệu quả

kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn 95 Hình 4.17 Ảnh hưởng của pH môi trường kaolin đến hiệu quả kết tụ

sinh học của hai chủng vi khuẩn 96 Hình 4.18 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết

tụ theo thời gian = 120 giờ, pH = X (5 - 7) và nhiệt độ = Y

(30 - 34) 99 Hình 4.19 Đồ thị mặt đáp ứng và đồ thị đường đồng mức của tỷ lệ kết

tụ ở nhiệt độ = 33oC, Thời gian = X (96 - 144) và pH = Y

(5 - 7) 99 Hình 4.20 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh

học của hai chủng vi khuẩn 107 Hình 4.21 Ảnh hưởng của nồng độ dịch vi khuẩn bổ sung đến khả

năng kết tụ sinh học của hai chủng vi khuẩn 108 Hình 4.22 Khối lượng chất kết tụ ly trích từ 100 ml dịch nuôi sinh

khối của hai chủng vi khuẩn 114 Hình 4.23 Tỷ lệ kết tụ của dịch sinh khối vi khuẩn và chất kết tụ sinh

học của hai chủng vi khuẩn 115

Hình 4.24 Mối quan hệ thuận giữa pH chất thải và số dòng vi khuẩn

tổng hợp chất kết tụ sinh học 117 Hình 4.25 Ảnh hưởng của các muối kim loại đến hiệu quả kết tụ sinh

học của các chủng vi khuẩn 118 Hình 4.26 Nghiệm thức phối hợp chất trợ lắng với dịch vi khuẩn 118 Hình 4.27 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể

tích 8 lít 119 Hình 4.28 Thử nghiệm xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại

chăn nuôi heo 119 Hình 4.29 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo biogas ở thể tích 1

m3 122 Hình 4.30 Mô hình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

xử lý nước thải sau biogas trại chăn nuôi heo 124 Hình 4.31 Hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas ở thể

tích 40 m3 124 Hình 4.32 Sơ đồ quy trình ứng dụng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas 126

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

BLAST Basic Local Alignment Search Tool

EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid

EPS Exopolysaccharides

FTIR Fourier Transform Infrared

ITS Internal Transcribed Spacer

LSD Least Significant Difference

MEGA Molecular Evolutionary Genetics Analysis

NCBI National Center for Biotechnology Information

NC & PT Nghiên Cứu và Phát Triển

PAM Nonionic Polyacrylamide

PCR Polymerase Chain Reaction

Pi Polymorphism in information

rDNA Ribosomal deoxyribonucleic acid

rRNA Ribosomal ribonucleic acid

SBR Sequencing Batch Reactor

SDS Sodium Dodecyl Sulfate

SEM Scanning Electron Microscope SNP Single Nucleotide Polymorphism

TSS Total Suspended Solids

UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket

WHO World Health Organization

XPS X-ray Photoelectron Spectroscopy

TÓM TẮT

Đề tài “Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở đồng bằng sông Cửu Long” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường thuộc Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ và các phòng thí nghiệm có liên quan từ tháng 10/2010 đến tháng 08/2014

Mục tiêu luận án là (i) phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao từ nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở các tỉnh đồng bằng sông Cửu Long; (ii) đánh giá đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn đã tuyển chọn; (iii) tiến hành tối ưu hóa điều kiện tổng hợp chất kết tụ sinh học của 2 dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ sinh học cao nhất, đặc trưng cho từng môi trường phân lập và ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas

Kết quả phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trên 2 môi trường chọn lọc có tỷ lệ kết tụ từ 1,21 - 80,28% Khảo sát 34 dòng

vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được tuyển chọn, có tỷ lệ kết tụ từ 21,34 - 80,28% cho thấy đa số khuẩn lạc hình tròn, có bề mặt ướt và nhày nhớt, tế bào vi khuẩn chủ yếu có dạng hình que, chuyển động và thuộc nhóm Gram dương Xây dựng cây phả hệ di truyền dựa vào trình tự gen 16S rRNA bằng phương pháp Maximum-Likelihood, đánh giá đa dạng nucleotide thông qua chỉ số đa hình trình tự nucleotide (Pi), đa hình chiều dài nucleotide (Theta)

và số Haplotype Kết quả xác định mối quan hệ di truyền 18 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein, có 14/18 dòng vi khuẩn tương đồng 97-

99% với các chủng thuộc loài Bacillus megaterium; có 3/18 dòng vi khuẩn tương đồng 98-99% với các chủng thuộc loài Bacillus aryabhattai; dòng vi khuẩn còn lại tương đồng 100% với chủng thuộc chi Bacillus sp Qua khảo

sát 16 dòng vi khuẩn tổng hợp hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide có

11/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Bacillus; 3/16 dòng vi khuẩn tương đồng với chi Klebsiella; 2/16 dòng vi khuẩn thuộc chi Sphingobacterium Xác

định mối quan hệ di truyền các chủng vi khuẩn, có 24/34 chủng vi khuẩn

tương đồng 99-100% thuộc loài Bacillus megaterium và loài Bacillus

aryabhattai; 10/34 chủng tương đồng 98-100% thuộc loài Klebsiella pneumoniae, Bacillus amyloliquefaciens và Sphingobacterium sp và các chỉ

số đa dạng nucleotide giữa các chủng vi khuẩn này lần lượt là Pi = 0,090, Theta = 0,156 và Haplotypes = 16 Từ các kết quả trên cho thấy sự đa dạng di truyền của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cũng như sự đa dạng sinh học của vi khuẩn trong tự nhiên Kết quả tối ưu điều kiện tổng hợp

chất kết tụ sinh học của 2 chủng vi khuẩn đặc trưng cho 2 môi trường phân

lập: (1) Điều kiện tối ưu cho chủng vi khuẩn Bacillus megaterium strain

LA51P: pH môi trường nuôi cấy 5,7, nhiệt độ 29oC và thời gian 124 giờ với thành phần môi trường tối ưu gồm tinh bột (0,85%), glutamate (6,6%) và CaCl2 (0,9%) cho tỷ lệ kết tụ 95,78% với dung dịch kaolin ở pH 7, sau 5 phút

để lắng, bổ sung dung dịch MgSO4 (0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi khuẩn Khối lượng chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu là 4,9g/l cho tỷ lệ kết tụ tương đương với dịch vi khuẩn (2) Điều kiện tối ưu cho

chủng vi khuẩn Bacillus aryabhattai strain KG12S: pH môi trường nuôi cấy

5,9, nhiệt độ 29oC và thời gian 122 giờ với thành phần môi trường tối ưu cho khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học gồm glucose (1,12%), glutamate (5,7%), K2HPO4 (0,4%) và KH2PO4 (0,8%) cho tỷ lệ kết tụ 96,87% với dung dịch kaolin sau 5 phút để lắng, bổ sung dung dịch CaCl2 (0,1%) và 0,2% dịch nuôi sinh khối vi khuẩn Chất kết tụ sinh học được ly trích ở môi trường tối ưu

là 4,8g/l và tỷ lệ kết tụ với dung dịch kaolin tương đương với dịch vi khuẩn Ứng dụng 2 chủng vi khuẩn trong thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải sau hệ thống biogas của trại chăn nuôi heo đều cho hiệu quả tốt, ở thể tích 40

m3 các chỉ tiêu phân tích COD (< 75 mg/l), TSS (< 50 mg/l) và BOD (< 30 mg/l) đạt tiêu chuẩn A theo quy chuẩn QCVN_40/2011/BTNMT

Từ khóa: Bacillus sp, đa dạng di truyền của vi khuẩn, kết tụ sinh học, nước thải sau biogas, tỷ lệ kết tụ, vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

The thesis “Analysis genetic diversity of bioflocculant-producing

bacteria and its application in piggery wastewater treament after biogas system

in Mekong Delta” was carried out in the laboratory of Biotechnology Research

& Development Institute, Can Tho University and other laboratories, from January, 2010 to August, 2014

The objectives were (i) isolating and selecting some high flocculant

activity bacterial strains in piggery wastewater treament after biogas system in

Mekong Delta provinces; (ii) evaluating the genetic diversity among these strains; (iii) two strains with the highest flocculating activity were chosen to

determinate the optimal conditions for bioflocculant-producing and to apply in

piggery wastewater treament after biogas system

The results revealed that two hundred and twenty-one bacterial isolates with flocculant activity (from 1.21% to 80.28%) were isolated on selective media and thirty-four isolates with high flocculating rate (from 21.34% to 80.28%) were selected from thirteen provinces or cities The colony characteristics of these isolates are generally round-shaped, wet and mucous covered Cells are mostly short rods, mobile and belong to the Gram-positive bacteria Then phylogenetic trees were established based on the 16S rRNA sequences by the Maximum-Likelihood method Nucleotide diversity were evaluated from analyzing the sequence polymorphism (Pi), theta per sequence (Theta) and number of Haplotypes core were done Eighteen protein bioflocculant-producing strains with high flocculating rate were tested, the

result showed that fourteen out of them belonged to Bacillus megaterium with the identity from 97% to 99%; three isolates were identical with Bacillus

aryabhattai from 98% to 99% and one isolate was 100% of the identity with Bacillus sp Moreover, eleven out of sixteen polysaccharide bioflocculant-

producing isolates with high flocculating rate were related to Bacillus genus with 98% to 100% identity; three isolates were related to Klebsiella genus

with 98% to 100% identity; two isolates were 98% to 99% of the identity with

Sphingobacterium genus Based on the nucleotide sequences of thirty-four

bioflocculant-producing bacterial strains, the genetic relationships among them were determined, twenty-four strains had from 98% to 100% identity to

Bacillus megaterium and Bacillus aryabhattai; ten strains performed the

identity from 98% to 100% with Klebsiella pneumoniae, Bacillus

amyloliquefaciens and Sphingobacterium Genetic diversity analysis showed

that nucleotide polymorphism was 0.090, sequence polymorphism per site was

0.156 and number of haplotypes was 16 These results showed that genetic diversity of bioflocculant-producing bacteria is as well as the biodiversity of bacteria in the nature The optimal conditions for the bioflocculant production varied between two bacterial strains which were selected from selective

media: (1) Bacillus megaterium strain LA51P reached to 95.78% after 124

hours cultivation with initial pH 5.7, cultivating temperature 29oC and the optimal medium consisting of starch (0.85%), glutamate (6.8%), CaCl2(0.75%) with kaolin solution after 5 minutes together with MgSO4(0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial liquid) The maximal bioflocculant production (4.9 g/l) was obtained in the optimal medium

and the flocculant rate was the same as the broth (2) Bacillus aryabhattai

strain KG12S reached to 96.87% after 122 hours cultivation at initial pH

5.9, cultivating temperature 29oC and the optimal medium for Bacillus

aryabhattai strain KG12S consisting of glucose (1.12%), glutamate (5.7%),

and K2HPO4 (0.4%) + KH2PO4 (0.8%), with kaolin solution after 5 minutes together with CaCl2 (0.1%) and 0.2% inoculant (bacterial liquid) The maximal bioflocculant production (4.8 g/l) was obtained in the optimized medium and the flocculant rate was the same as the broth From those above results, two strains that were used to treat piggery wastewater after biogas system performed a great potential for piggery wastewater pretreament For the scale of 40 m3, some parameters reached to A standard of QCVN_40/2011/BTNMT such as Chemical Oxygen Demand [COD] (< 75 mg/l); total solid suspension [TSS] (< 50 mg/l) and Biochemical Oxygen Demand [BOD] (< 30 mg/l)

Keywords: Bacillus sp., bioflocculant-producing bacteria, flocculation,

flocculating rate, genetic diversity of bacteria, piggery wastewater

Chương 1: GIỚI THIỆU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Ô nhiễm môi trường đang là vấn đề của toàn cầu và ngày càng trở nên nghiêm trọng do sự phát triển mạnh mẽ của công nghiệp và nông nghiệp bao gồm trồng trọt và chăn nuôi Đối với chăn nuôi ở dạng cơ sở hoặc hộ gia đình thì các chất thải gây ô nhiễm môi trường có tác động trực tiếp đến cộng đồng, làm giảm sức sống của vật nuôi từ đó dẫn đến hiệu quả chăn nuôi thấp Theo WHO (2005) cần phải có giải pháp làm môi trường chăn nuôi trở nên trong sạch hơn, cần phải kiểm soát và xử lý chất thải nhằm giữ vững an toàn sinh học và tăng cường sức sống của giống vật nuôi

Biogas là một trong những hệ thống xử lý chất thải chăn nuôi đặc biệt là chăn nuôi heo Biogas gồm một chuỗi các quá trình trong đó vi sinh vật có khả năng phân hủy sinh học các hợp chất trong điều kiện thiếu oxy Ở ĐBSCL, biogas được áp dụng để xử lý nước thải chuồng trại chăn nuôi và tổng hợp khí sinh học Tuy nhiên, nước thải sau khi qua hệ thống xử lý biogas thì các chỉ số COD, BOD, TSS… vẫn còn cao hơn so với mức quy định và có mùi khó chịu gây ảnh hưởng đến khu vực lân cận (Phùng Đức Tiến, 2009)

Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện nhằm tìm ra những biện pháp cũng như những kỹ thuật hữu hiệu để loại bỏ các chất ô nhiễm vô cơ hay hữu cơ trong nước thải chăn nuôi heo một cách hiệu quả Trong đó, giải pháp phân lập những vi sinh vật có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học để ứng dụng xử lý nước thải chăn nuôi heo sau biogas là một lựa chọn mới sẽ góp phần ngăn ngừa ô nhiễm môi trường nước trong khu vực

Sự kết tụ (flocculation) là một quá trình cần thiết giúp lắng tụ các chất lơ lửng và làm tăng nhanh quá trình phân hủy chất ô nhiễm Sự kết tụ trong nước được chia làm 3 nhóm chính gồm: Kết tụ vô cơ (như sử dụng phèn chua - aluminium sulphate và cloride aluminium), kết tụ hữu cơ tổng hợp (các dẫn xuất từ polyacrylamide với polyethyleneimine và các chất kết tụ tự nhiên như chitosan, sodium alginate) và kết tụ sinh học (bioflocculants) Các hóa chất sử dụng kết tụ có giá thành thấp nhưng lại ảnh hưởng đến sức khỏe con người và

môi trường sống như nhôm là nguyên nhân gây ra bệnh Alzheimer (Kurane et

al., 1994), còn các dẫn xuất từ polyacrylamide là độc tố cho hệ thần kinh và là

chất gây ung thư khó phân hủy trong tự nhiên (Yokoi et al., 1996) Chất kết tụ

sinh học (bioflocculants) là chất được tạo ra từ vi sinh vật, có tác dụng nhanh

chóng và an toàn cho con người và môi trường (Sheng et al., 2006) Trong

những năm gần đây, nhiều loài vi sinh vật đã được tìm thấy có khả năng tổng hợp và phóng thích hợp chất kết tụ sinh học ở dạng đa phân tử (flocculating

biopolymer) Theo Sheng et al (2006) đất và chất thải là những nguồn tốt nhất

để phân lập các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học producing microorganisms)

(bioflocculant-Các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học có bản chất là protein, polysaccharide và hỗn hợp cả hai loại trên (glycoprotein) được ứng dụng trong

xử lý nước thải Ngoài ra, chất kết tụ sinh học cũng có thể được tinh sạch và xác định được thành phần cấu tạo Từ đó, có tiềm năng để cải thiện chất lượng sản phẩm trong quá trình chế biến sinh học (bioprocessing)

Vì vậy, với yêu cầu xây dựng một nền nông nghiệp bền vững thì đề tài

“Đa dạng di truyền vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng

xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL” sẽ góp phần

ứng dụng công nghệ sinh học vào thực tế cuộc sống và đẩy mạnh chăn nuôi theo hướng phát triển bền vững Tính mới của đề tài thể hiện ở nguồn phân lập

vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng vào xử lý nước thải sau biogas của trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL

1.2 Mục tiêu đề tài và nội dung nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu đề tài

Mục tiêu chính: Tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn có khả năng

tổng hợp chất kết tụ sinh học với tỷ lệ kết tụ cao, đánh giá được mức độ đa dạng di truyền giữa các dòng vi khuẩn tuyển chọn dựa trên trình tự nucleotide 16S rRNA và đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ chuồng trại chăn nuôi heo

Mục tiêu cụ thể: (1) Phân lập và tuyển chọn được một số dòng vi khuẩn

tổng hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas của chuồng trại chăn nuôi heo ở các tỉnh ĐBSCL; (2) Xác định được mối quan hệ di truyền giữa các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học cao dựa trên trình

tự 16S rRNA và xác định được các điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp chất kết

tụ sinh học của dòng vi khuẩn được tuyển chọn để ứng dụng xử lý nước thải sau hệ thống biogas; (3) Đánh giá được hiệu suất xử lý nước thải sau biogas từ chuồng trại chăn nuôi heo của các chủng vi khuẩn ở điều kiện phòng thí nghiệm và điều kiện thực tế

1.2.2 Nội dung nghiên cứu

Phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học ở ĐBSCL dựa trên hình dạng khuẩn lạc vi khuẩn.Tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có tỷ lệ kết tụ cao ở các tỉnh ĐBSCL, đồng thời nhận diện vi khuẩn dựa trên sự kết hợp phương pháp sinh hóa và phương pháp sinh học phân tử

Từ đó, phân tích đặc tính đa dạng di tryền ở các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

Xác định điều kiện tối ưu cho sự tổng hợp chất kết tụ sinh học của dòng

vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ cao, tiêu biểu cho từng môi trường phân lập và thử nghiệm hiệu suất xử lý nước thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas ở điều kiện phòng thí nghiệm và thực tế

1.3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu của đề tài: Các chủng vi khuẩn có khả năng tổng

hợp chất kết tụ sinh học trong nước thải sau hệ thống biogas của chuồng trại chăn nuôi heo

Phạm vi nghiên cứu: Các dòng vi khuẩn tổng tổng hợp chất kết tụ sinh

học bản địa được phân lập từ nước thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas ở

13 tỉnh thành thuộc ĐBSCL và ứng dụng xử lý nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo

1.4 Những đóng góp mới, ý nghĩa khoa học và thực tiễn của luận án

Luận án đã nghiên cứu có tính hệ thống vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bao gồm các khâu phân lập, tuyển chọn, xác định mối quan hệ di truyền giữa các dòng, tối ưu khả năng tổng hợp chất kết tụ, ly trích chất kết tụ sinh học, thử nghiệm hiệu suất kết tụ nước thải của các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng xử lý thực tế

Những kết quả có ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu đã phân lập được 221 dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học có nguồn gốc từ chất thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo trên 2 môi trường chọn lọc

Sử dụng kết hợp phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử xác định được 34 chủng vi khuẩn phân lập trên 2 môi trường tổng hợp chất kết

tụ sinh học protein và polysaccharide

Xác định được các điều kiện tối ưu cho vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học và ứng dụng trong xử lý nước thải sau hệ thống biogas chuồng trại chăn nuôi heo

Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài làm nguồn tư liệu cho việc nghiên cứu và giảng dạy về vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bản địa phân lập từ hệ thống nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo ở ĐBSCL

Sử dụng các chủng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ vào thử nghiệm ở thể tích nước thải sau biogas ở 10 lít, 100 lít, 1 m3

và cũng như ứng dụng trong xử

lý nước thải ở thể tích 40 m3

1.5 Cơ sở lý luận và giả thuyết khoa học

ĐBSCL hiện đang phát triển mạnh ngành chăn nuôi heo nhưng chưa có nghiên cứu nào cho thấy có sự hiện diện của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trong chất thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas Vì vậy, nghiên cứu

về vi khuẩn xử lý môi trường, đặc biệt là tìm hiểu về vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học bản địa để ứng dụng trong xử lý nước thải chăn nuôi heo sau hệ thống biogas là cần thiết

Ô nhiễm môi trường chăn nuôi ngày càng tăng và trở thành vấn đề khó khăn cho xã hội cần phải giải quyết, đồng thời việc sử dụng các chất hóa học

xử lý môi trường không chỉ không đảm bảo phát triển chăn nuôi bền vững mà còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế Do đó, nghiên cứu và tuyển chọn các dòng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học, có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học cao trong môi trường nuôi cấy với giá thành rẻ và ứng dụng xử lý môi trường là hướng nghiên cứu cần thiết

Môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học protein dựa

trên nghiên cứu của Hanaza et al (2008) và môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học polysaccharide dựa trên nghiên cứu Deng et al

(2003)

Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào nghiên cứu

của Deng et al (2003); Lu et al (2005) và Lixi et al (2006)

Quá trình tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào tỷ

lệ kết tụ (%) được tính theo công thức tính tỷ lệ kết tụ của Deng et al (2003)

Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa trên sự kết hợp phương pháp truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử với cặp mồi được sử

dụng trong nghiên cứu của Jie et al (2006) và đánh giá đa dạng di truyền dựa vào nghiên cứu của Hutter et al (2006)

Xác định các yếu tố ảnh hưởng đến tỷ lệ kết tụ sinh học của vi khuẩn dựa trên các nghiên cứu về vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trên tạp chí chuyên ngành từ năm 1988 đến 2013

Đánh giá hiệu suất kết tụ của vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được tuyển chọn dựa vào phương pháp của các công trình nghiên cứu được công bố trên các tạp chí chuyên ngành và các đề tài nghiên cứu khoa học từ 2000 đến

2013

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU2.1 Tổng quan về chất thải chăn nuôi heo

Để đáp ứng nhu cầu thực phẩm của con người, ngành chăn nuôi trên thế giới đã phát triển rất nhanh và đạt được nhiều thành tựu quan trọng Trên thế giới, ngành chăn nuôi hiện chiếm khoảng 70% đất nông nghiệp và 30% tổng diện tích đất tự nhiên, hàng năm đóng góp khoảng 40% tổng GDP nông nghiệp toàn cầu Bên cạnh việc cung cấp một số lượng lớn sản phẩm quan trọng cho nhu cầu của con người, ngành chăn nuôi cũng đã gây ra những hậu quả nghiêm trọng đối với môi trường (Nguyễn Xuân Trạch, 2009)

Vì vậy, xử lý chất thải chăn nuôi ngày càng được quan tâm hơn bởi các

cơ quan quản lý nhà nước, cộng đồng và chính những người chăn nuôi Có nhiều chương trình và dự án hợp tác quốc tế về xử lý chất thải chăn nuôi nhưng cho đến nay chất thải chăn nuôi ở nước ta vẫn chưa được xử lý nhiều, hoặc có xử lý nhưng công nghệ xử lý chưa đảm bảo về tiêu chuẩn bảo vệ môi trường Quản lý nhà nước về bảo vệ môi trường trong chăn nuôi còn nhiều khó khăn về các nguồn lực, sự phối hợp giữa các Bộ, Ngành liên quan và các cấp quản lý địa phương nhằm triển khai công tác BVMT trong chăn nuôi vẫn chưa đồng bộ

2.1.1 Đặc điểm của nước thải sau biogas chuồng trại chăn nuôi heo

Trong những năm gần đây, ngành chăn nuôi Việt Nam đã phát triển đáng

kể, tốc độ tăng trưởng bình quân giai đoạn 2001 - 2007 đạt 8,9% (Bùi Thục Oanh, 2008) Lượng chất thải lỏng từ hoạt động chăn nuôi thải ra hàng năm khoảng 80 triệu tấn chất thải rắn và hàng tỉ m3

chất thải lỏng và việc xử lý chất thải ở hầu hết các cơ sở chăn nuôi heo chỉ mới dừng lại ở mức sử dụng hệ thống hầm biogas (Viện chăn nuôi, 2006), sau quá trình này các thành phần gây ô nhiễm môi trường còn ở mức rất cao và cần phải được xử lý tiếp trước khi có thể thải ra môi trường (Nguyễn Hoài Châu và Trần Mạnh Hải, 2010) cụ thể: COD = 1251 đến khoảng 3397 mg/l; BOD = 783 đến khoảng 1339 mg/l;

Ptotal = 57 đến khoảng 99 mg/l; Ntotal = 205 đến khoảng 333 mg/l (Nguyễn Hoài Châu, 2006) và theo kết quả phân tích nước thải chăn nuôi heo của Phùng Đức Tiến (2009) cho thấy các chỉ tiêu đều vượt ngưỡng cho phép

2.1.2 Quản lý chất thải chăn nuôi heo trên thế giới

Việc xử lý chất thải chăn nuôi heo đã được nghiên cứu triển khai ở các nước phát triển từ cách đây vài chục năm Theo nghiên cứu của các tổ chức và

các các nhà nghiên cứu như Boone et al (1993) và Robert (2001), các công

nghệ áp dụng cho xử lý nước thải trên thế giới chủ yếu là các phương pháp

sinh học Ở các nước phát triển, quy mô trang trại hàng trăm hecta, trong trang trại heo được nuôi với quy mô lớn trên 10.000 con, phân heo và chất thải heo chủ yếu làm phân vi sinh và năng lượng biogas cho máy phát điện, nước thải chăn nuôi được sử dụng cho các mục đích nông nghiệp (Hình 2.1)

Hình 2.1 Mô hình quản lý chất thải rắn chăn nuôi trên thế giới

(Nguồn: Boone et al.,1993)

Ở các nước phát triển việc ứng dụng phương pháp sinh học trong xử lý nước thải chăn nuôi đã được nghiên cứu, ứng dụng và cải tiến trong nhiều năm qua Tại Hà Lan, nước thải chăn nuôi được xử lý bằng công nghệ SBR qua 2 giai đoạn: giai đoạn hiếu khí chuyển hóa thành phần hữu cơ thành CO2, nhiệt năng và nước, amoni phản nitrat hóa thành nitrit hoặc khí nitơ; giai đoạn kỵ khí xảy ra quá trình đề nitrat thành khí nitơ và phốtphat được loại bỏ từ pha

loãng bằng định lượng vôi vào bể sục khí (Have et al., 1994) Tại Tây Ban

Nha, nước thải chăn nuôi được xử lý bằng quy trình VALPUREN (được cấp bằng sáng chế Tây Ban Nha số P9900761) Đây là quy trình xử lý kết hợp phân hủy kỵ khí tạo hơi nước và làm khô bùn bằng nhiệt năng được cấp bởi hỗn hợp khí sinh học và khí tự nhiên

2.1.3 Quản lý chất thải chăn nuôi heo tại Việt Nam

Hệ thống nuôi

trên sàn

Kho chứa chất thải rắn

Ruộng, cánh đồng

không giống phân bò hay gia cầm khác Phân heo ướt và hôi thối nên khó thu gom và vận chuyển, phân heo là phân “nóng” khó sử dụng, hiệu quả không cao và có thể làm chết hoặc mất năng suất cây trồng Theo kết quả điều tra đánh giá hiện trạng môi trường của Viện chăn nuôi (2006) tại các cơ sở chăn nuôi heo có quy mô tập trung như ở Hà Nội, Hà Tây, Ninh Bình, Nam Định, Quảng Nam, Bình Dương, Đồng Nai cho thấy: Chất thải rắn bao gồm chủ yếu

là phân, chất độn chuồng, thức ăn thừa và đôi khi là xác gia súc, gia cầm chết Kết quả điều tra hiện trạng quản lý chất thải chăn nuôi cho thấy 100% số cơ sở chăn nuôi đều chưa tiến hành xử lý chất thải rắn trước khi chuyển ra ngoài khu vực chăn nuôi

Theo kết quả điều tra đánh giá hiện trạng môi trường của Viện chăn nuôi (2006) tại các cơ sở chăn nuôi heo có quy mô tập trung thuộc Hà Nội, Hà Tây, Ninh Bình, Nam Định, Quảng Nam, Bình Dương, Đồng Nai cho thấy: nước thải của các cơ sở chăn nuôi heo bao gồm nước tiểu, rửa chuồng, máng ăn, máng uống và nước tắm rửa cho heo Cả 10 cơ sở chăn nuôi heo được điều tra chỉ có hệ thống xử lý chất thải lỏng bằng công nghệ biogas Kết quả điều tra cũng cho thấy hệ thống xử lý nước thải tại các trang trại trên là: Nước thải 

bể Biogas  hồ sinh học  thải ra môi trường, hầu hết các trang trại chăn

nuôi heo khác cũng có sơ đồ xử lý chất thải như trên (Pouilieute et al., 2010)

Việc quản lý chất thải chăn nuôi heo đang gặp nhiều khó khăn, do sử dụng chất thải chăn nuôi heo trong nông nghiệp còn rất thấp Vì vậy cần có nhiều biện pháp tích cực kết hợp để giải quyết vấn đề và khắc phục sự ô nhiễm môi trường do một lượng chất thải chăn nuôi gây ra

2.2 Xử lý nước thải trong chăn nuôi

2.2.1 Đặc điểm mộ số chỉ tiêu đánh giá chất lượng nước

Mức độ ô nhiễm của nước thải được đánh giá thông qua một số chỉ tiêu BOD, COD và TSS (Phạm Văn Ty, 2007)

COD (Chemical Oxygen Demand) là lượng oxy cần để oxy hóa bằng con đường hóa học các chất hữu cơ và vô cơ có mặt trong nước, COD càng lớn thì mức độ ô nhiễm hữu cơ của nước thải càng cao

TSS (Total Suspended Solids) là toàn bộ lượng chất rắn ở dạng hòa tan

và lơ lửng trong nước thải

BOD (Biochemical Oxygen Demand) là chỉ tiêu sử dụng rộng rãi để đo chất lượng nước, BOD là lượng oxy hòa tan mà vi sinh vật đòi hỏi cho quá trình phân giải hiếu khí các chất hữu cơ có mặt trong nước thải Nước càng nhiều chất hữu cơ dễ bị oxy hóa, tức càng ô nhiễm và BOD càng cao

2.2.2 Biện pháp xử lý nước thải

Chất thải từ hệ thống chăn nuôi tập trung đang gây ảnh hưởng lớn đến môi trường và sức khỏe con người Tuy nhiên, lượng chất thải rắn được xử lý chỉ chiếm chưa đầy một nửa, số còn lại được thải trực tiếp ra môi trường Có thể tham khảo báo cáo của dự án Susane do Viện Chăn nuôi thực hiện năm

2006 (Hình 2.2) về sự phân bố chất thải chăn nuôi ở Việt Nam như sau:

Hình 2.2 Xử lý nguồn chất thải chăn nuôi ở Việt Nam

(Nguồn: Báo cáo dự án Susane)

Còn đối với chất thải lỏng, có tới 60% được thải trực tiếp ra đất hoặc nguồn nước, 12% là thải trực tiếp vào ao cá, chỉ 25% được xử lý bằng hầm biogas Trong khi đó, chất thải chăn nuôi sử dụng làm phân bón cho cây trồng đang có chiều hướng giảm do quy mô chăn nuôi tăng dẫn tới diện tích trồng trọt ngày càng thu hẹp

Ủ phân

Các phương pháp xử lý nước thải hiện đại đều nhằm mục đích làm giảm lượng chất hữu cơ lơ lửng trong nước thải trước khi nó đi vào một thủy vực nào đó (Phạm Văn Ty, 2007)

Theo Ngô Thị Nga và Trần Văn Nhân (2002) cơ bản nước thải được xử

lý qua ba giai đoạn bao gồm:

Xử lý cấp 1: Gồm các quá trình xử lý sơ bộ như lắng, lọc nhằm loại ra các vật rắn có kích thước lớn

Xử lý cấp 2: Gồm các quá trình sinh học có tác dụng khử hầu hết các tạp chất hữu cơ hòa tan có thể phân hủy sinh học gồm: hoạt hóa bùn, lọc sinh học, oxi hóa sinh học trong các hồ và phân hủy yếm khí

Xử lý cấp 3: Gồm vi lọc, kết tủa, đông tụ, hấp thụ bằng than hoạt tính, trao đổi ion, các quá trình khử các chất dinh dưỡng, clo hóa và ozone hóa Theo Phúc Nguyên (2010), biogas là một công nghệ đa mục đích, phục

vụ các nhu cầu: Cung cấp năng lượng cho việc đun nấu trong gia đình; Cung cấp bã thải sạch làm phân bón hữu cơ trong nông nghiệp và làm thức ăn bổ sung giàu dinh dưỡng trong nuôi trồng thủy sản

Nghiên cứu khả năng xử lý nước thải chăn nuôi heo bằng cỏ Vetiver và Lục Bình – Xây dựng mô hình xử lý nước thải ô nhiễm chất hữu cơ từ các trại chăn nuôi heo bước đầu đem lại hiệu quả kinh tế cao (Nguyễn Tuấn Phong và Dương Thúy Hoa, 2005)

2.3 Kết tụ sinh học trong nước

2.3.1 Kết tụ sinh học (Bioflocculant)

Kết tụ sinh học là quá trình do vi sinh vật tổng hợp ra hợp chất đa phân

tử có khả năng thu gom và làm lắng các vật chất lơ lửng trong dung dịch

(Kwon et al., 1996; Shih et al., 2001) Kết tụ sinh học có tính chất hóa học thuộc một trong ba dạng protein, polysaccharide hoặc glycoprotein (Gao et al.,

2006) Vi khuẩn có thể sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường để tổng hợp chất đa phân tử trong tế bào dưới sự hoạt động của các loại enzyme khác nhau, các đa phân tử này có thể được bài tiết ra ngoài và tồn tại trong môi trường hoặc trên bề mặt vỏ tế bào vi khuẩn Cho nên, hoạt động của vi khuẩn biến đổi những chất có trong môi trường thành các đa phân tử phức tạp có thể

sử dụng trong kết tụ (Deng et al., 2003), có nhiều dạng tổng hợp chất kết tụ

sinh học ở vi khuẩn có thể ở dạng polyme ngoại bào của các tế bào sống

(Salehizadeh et al., 2000) hoặc quá trình tích lũy chất kết tụ sinh học ngoại bào và sự gom tụ tế bào (Jie et al., 2006)

Có nhiều công trình nghiên cứu cho thấy có nhiều dòng hoặc chủng vi

khuẩn khác nhau có thể tạo chất kết tụ sinh học khác nhau như: Bacillus

licheniformis sp (Hiroaki và Kiyoshi, 1985) và Nocardia amarae YK1

(Takeda et al., 1992) có khả năng tạo chất kết tụ sinh học là protein;

Alcaligens latus KT201 (Kurane et al., 1991) và Bacillus subtilis IFO3335

(Yokoi et al., 1996) có khả năng tạo chất kết tụ sinh học là polysaccharide;

Arcuadendron sp TS-4 (Lee et al., 1995) và Arathrobacter sp (Wang et al.,

1994) có khả năng tạo chất kết tụ sinh học là glycoprotein

Chất kết tụ sinh học là một chất có phân tử lớn dễ bị vi sinh vật phá hủy

(biodegradable) được tiết ra từ các vi sinh vật (Gong et al., 2008) Tính chất

hóa lý của chất kết tụ sinh học được xác định bởi bản chất di truyền (gentic

make-up) của sinh vật (Salehizadeh et al., 2000) Nhiều vi sinh vật tổng hợp các chất kết tụ sinh học như Rhodococcus erythropolis, Paecilomyces sp.,

Klebsiella pneumoniae, Citrobacter sp đã được tìm thấy (Lian et al., 2008)

2.3.1.1 Kiểm tra khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học của vi khuẩn bằng dung dịch kaolin

Kaolin là một khoáng sét có công thức là Al2Si2O5(OH)4 và công thức cấu tạo (Hình 2.3), được nghiền mịn cho vào nước tạo thành một dung dịch các chất lơ lửng Dung dịch này dùng để đánh giá khả năng kết tụ của chất kết

tụ sinh học được tổng hợp từ vi khuẩn, thông qua đa phân tử kết tụ sinh học sẽ hấp thụ các phân tử kaolin trong dung dịch và lắng xuống đáy làm trong dung dịch

Hình 2.3 Công thức cấu tạo kaolin

Độ trong của dung dịch được kiểm tra bằng cách xác định chỉ số OD ở bước sóng 550nm sẽ đánh giá được khả năng kết tụ của chất kết tụ sinh học

(Deng et al., 2003) Đây là bước đầu trong việc đánh giá khả năng kết tụ nhằm

chọn ra dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học hiệu quả nhất

(Nguồn: Grim, 1962)

2.3.1.2 Cơ chế và đặc điểm của quá trình kết tụ sinh học (Mechanisms of Bioflocculation)

Việc nghiên cứu cơ chế của quá trình kết tụ có thể giúp chúng ta hiểu rõ vai trò của chất kết tụ sinh học trong xử lý nước và nước thải Khối lượng phân tử và các nhóm chức trong phân tử chất kết tụ là nhân tố ảnh hưởng đến hiệu quả kết tụ, chất kết tụ sinh học là protein: nhóm amino và carboxyl là nhóm chức năng trong sự kết tụ, nhưng khối lượng phân tử thường thấp Trong khi chất kết tụ sinh học là polysaccharide thường có trọng lượng phân

tử cao và có nhóm chức nhiều hơn (Kurane et al., 1994)

Chất kết tụ sinh học MPFA9 được tạo ra từ dòng Bacillus mucilaginosus

là một polysaccharide có khối lượng phân tử là 2,6 x 106 (đvC) và chứa acid uronic (19,1%) Trong đó nhóm carboxyl nằm hướng ra ngoài và kéo các vật thể nhỏ xung quanh, do tác dụng của lực Van der Waals các nhóm OH-

, COOcủa chất kết tụ và nhóm H+

-, OH- trên bề mặt vật thể hình thành liên kết hydro

làm cho các vật thể bị hấp thụ về chất kết tụ (Deng et al., 2003), nhiều cầu nối

hóa học xảy ra khi vật thể được hấp thụ vào bên trong chuỗi kết tụ sinh học và nhiều vật thể hấp thụ chuỗi này có thể hấp thụ cùng lúc với nhiều chuỗi khác, tiếp tục kết thành khối và lắng xuống đáy

Chủng vi khuẩn Enterobacter cloacae WD7 được phân lập từ nhà máy

chế biến thủy sản tổng hợp polymer carbohydrate thô với lượng 2,27 g/l sau

03 ngày nuôi cấy và polymer này có khả năng kết tụ cao Polymer này là một heteropolysaccharide có tính acid gồm các đường trung tính (29,4%), acid uronic (14,2%) và amino sugars (0,93%); có các nhóm hydroxyl, carboxyl, carbonyl và methoxyl; ổn định ở pH từ 5 - 7 và nhiệt độ 4 – 60oC; có thể kết tụ trong huyền phù cao lanh ở khoảng pH 2 - 8 và nhiệt độ 4 – 50o

C (Prasertsan

et al., 2006)

Vi khuẩn Bacillus subtilis DYU1 tổng hợp chất kết tụ sinh học DYU500

với khả năng kết tụ cao Ở nồng độ chất kết tụ sinh học DYU500 là 40 mg/l,

50 mM CaCO3 và nhiệt độ 30oC thì khả năng kết tụ (13,5), tỷ lệ kết tụ (97%) đạt giá trị cao nhất Trong thành phần của DYU500 có acid poly-glutamic (PGA) chiếm số lượng lớn Trọng lượng phân tử trung bình của DYU500 khoảng (3,16 - 3,2)x106 Da Các thành phần chính của DYU500 là các đường tổng, acid uronic, protein và polyamide (polyme đồng hình của acid glutamic) với hàm lượng (w/w) lần lượt là 14,9%, 2,7%, 4,4% và 48,7% Hoạt tính kết tụ của DYU500 trong huyền phù cao lanh tăng rõ rệt khi thêm các cation hóa trị hai như Ca2+

hoặc Mg2+ với khoảng nồng độ tối ưu lần lượt là 0,15 - 0,9 mM (Ca2+) và 0,1 - 0,9 mM (Mg2+) Sự ảnh hưởng của các cation mạnh nhất ở pH

acid yếu hoặc pH trung hòa (6,0 - 7,0) Hoạt tính kết tụ giảm tuyến tính cùng với việc gia tăng nhiệt độ ủ và vô hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ 120oC (do phá hủy cấu trúc polyamide của DYU500)

(a)

(b)

Hình 2.4 Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500

(Nguồn: Wu et al., 2007)

Cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học DYU500 được đề xuất theo hai

cơ chế như sau: (1) Theo Hình 2.4a cho thấy: Quá trình kết tụ có lẽ là do sự giảm điện tích trên bề mặt các hạt cao lanh trong huyền phù khi có sự hiện diện của các cation, và dẫn đến điện tích có thể chuyển ngược từ âm sang dương Do đó, các nhóm carboxyl (COO-) tích điện âm của chất kết tụ sinh học DYU500 có thể phản ứng với các vị trí tích điện dương của các hạt cao lanh trong huyền phù (2) Theo Hình 2.4b: Các cation kích thích quá trình kết

tụ thông qua quá trình trung hòa điện tích và quá trình làm ổn định điện tích

dư của nhóm carboxyl của chất kết tụ sinh học DYU500 sau đó hình thành cầu nối tạo liên kết với các hạt cao lanh Tuy nhiên, có thể có các cầu nối cuối cùng xảy ra sau khi các hạt đã được hấp thụ vào các mạch của chất kết tụ sinh học DYU500 Nhiều hạt cao lanh có thể hấp thụ thành một mạch phân tử dài

: Hạt cao lanh : Cation kim loại : Chất kết tụ sinh học DYU500 : Lực đẩy tĩnh điện

: Lực hút

và chúng có thể hấp thụ đồng thời bởi các mạch khác của chất kết tụ sinh học DYU500, dẫn đến hình thành các khối không gian ba chiều có thể lắng nhanh hơn Dựa trên giả thuyết này, quá trình thúc đẩy sự kết tụ đối với chất kết tụ sinh học DYU500 của các cation thì phụ thuộc lớn vào nồng độ và hóa trị của

các ion (Wu et al., 2007)

Các chất kết tụ sinh học được tổng hợp ra từ các chủng vi khuẩn từ phân

lập được từ các hệ sinh thái Qatari khác nhau thuộc giống Bacillus có sự hiện

diện của các nhóm carboxyl, hydroxyl và amino.Tỷ lệ kết tụ của các chất kết

tụ sinh học sinh ra từ ba chủng vi khuẩn QUST2, QUST6 và QUST9 cao nhất

ở pH 7,0 Với liều lượng chất kết tụ sinh học là 20 mg/l thì tỷ lệ kết tụ đạt tối

đa đối với tất cả các chất kết tụ sinh học từ các chủng vi khuẩn Trong tất cả các chất kết tụ sinh học thì hàm lượng carbon khoảng 42 - 48%, hàm lượng

nitơ khoảng 11 - 12% (Abd-El-Haleem et al., 2008)

Chất kết tụ sinh học ZS-7 tổng hợp ra bởi chủng vi khuẩn Bacillus

licheniformis X14 là một glycoprotein gồm polysaccharide (91,5% w/w) thành

phần chính và protein (8,4% w/w) Trọng lượng phân tử của chất kết tụ sinh học ZS-7 là 6,89x104 Da Chất kết tụ sinh học ZS-7 chứa acid polysaccharide gồm uronic acid (16,4%), pyruvic acid (7,1%) và acetic acid (0,5%) Phân tích phân tử của chất kết tụ ZS-7 cho thấy C, H, O, N và S chiếm tỷ lệ lần lượt là 32,1%; 6,25%; 55,1%; 5,35% và 1,3% Kết quả phân tích X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) và Fourier transform infrared (FTIR) cho thấy trong chất kết tụ sinh học này có sự hiện diện của các nhóm chức năng như amino,

amide, carboxyl, methoxyl và hydroxyl (Li et al., 2009)

Qua cơ chế của quá trình kết tụ có thể giúp chúng ta hiểu rõ vai trò của chất kết tụ sinh học trong xử lý nước và nước thải để cải thiện các ảnh hưởng

xử lý thực tế Các chất kết tụ sinh học gây ra sự tập hợp các hạt rắn và các tế

bào VSV thông qua các cầu nối và quá trình trung hòa điện tích Theo Li et al

(2009) đề xuất cơ chế kết tụ của chất kết tụ sinh học ZS-7 được sinh ra từ

chủng vi khuẩn Bacillus licheniformis X14 như sau: (1) Khi chất kết tụ sinh

học ZS-7 tiếp cận với các hạt rắn trong dung dịch, một lực hút phải lớn hơn lực đẩy tĩnh điện Lực hấp phụ có lẽ được phát ra từ các liên kết hydro giữa các nhóm OH-, NH2- và NH2CO- của chất kết tụ sinh học và các nhóm H+, OH-của các hạt rắn, cũng như các liên kết hóa học giữa các nhóm COO-

và các hạt huyền phù Quá trình kết tụ có lẽ được cho là việc giảm điện tích âm trên bề mặt các hạt rắn khi có mặt Ca2+, cuối cùng điện tích có lẽ bị chuyển ngược từ

âm sang dương Như vậy, các nhóm carboxyl của acid uronic, acid pyruvic và aci acetic trong chất kết tụ sinh học ZS-7 có thể phản ứng với các vị trí tích điện dương của các hạt rắn trong huyền phù cao lanh (2) Cơ chế hình thành

xảy ra sau khi các hạt rắn đã hấp thụ vào các mạch của chất kết tụ sinh học Nhiều hạt rắn có thể hấp thụ vào một mạch phân tử dài và đồng thời có thể được hấp thụ bởi các mạch chất kết tụ khác, dẫn đến sự hình thành khối không gian ba chiều có khả năng lắng nhanh

2.3.1.3 Một số nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

Có nhiều công trình nghiên cứu về vi khuẩn tổng hợp chất kết sinh học trên thế giới điển hình các chủng vi khuẩn đã tìm thấy ở các công trình nghiên cứu dưới đây:

Chủng vi khuẩn Paecilomyces sp I-1 tổng hợp chất kết tụ PF-101 có

trọng lượng 300,000 dalton với công thức phân tử là (C8H16NO8)n PF-101 là một polysaccharide gồm khoảng 85% galactosamine, 2,3% acetyl, 5,7%

formyl (Takagi et al., 1985); Vi khuẩn Rhodococcus erythropolis tổng hợp chất kết tụ sinh học (NOC-1) trong thành phần có protein (Takeda et al., 1991); Hỗn hợp vi khuẩn R-3 gồm bốn chủng vi khuẩn Oerskovia sp.,

Acinetobacter sp., Agrobacterium sp và Enterobacter sp được phân lập từ

mẫu bùn có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học (Kurane et al., 1994) Chủng vi khuẩn Bacillus As-101 tổng hợp chất kết tụ được phân lập từ bùn hoạt tính, chất kết tụ sinh học được tổng hợp bởi chủng vi khuẩn Bacillus As-

101 có hoạt tính kết tụ bị giảm tuyến tính trong suốt quá trình gia nhiệt

(Salehizadeh et al., 2000)

Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum tổng hợp chất kết tụ sinh học

REA-11 có thành phần gồm acid galacturic, có khả năng kết tụ khoảng 80% được phóng thích trong dịch nuôi cấy, còn 20% ở trong các tế bào vi khuẩn

(He et al., 2002); Ba chủng vi khuẩn Bacillus subtilis WD90, Bacillus subtilis

SM 29 và Enterobacter agglomerans SM 38 tổng hợp polyme chịu nhiệt (lần

phân lập từ đất tổng hợp chất kết tụ sinh học WF-1, hiệu quả của chất kết tụ sinh học WF-1 tốt hơn các chất kết tụ tổng hợp thông thường như

polyacrylamide anion hóa hoặc polyacrylamide không ion hóa (Lu et al., 2005); Chủng vi khuẩn Vagococcus sp W31 phân lập từ các mẫu nước thải

của dòng sông Little Moon ở Bắc Kinh, Trung Quốc tổng hợp chất kết tụ sinh học MBFW31 với số lượng lớn, chất kết tụ sinh học MBFW31 bền nhiệt và có khả năng kết tụ mạnh ở khoảng pH rộng với liều lượng thấp, có các nhóm

hydroxyl, carbonyl và methoxyl hiện diện trong phân tử của chất kết tụ sinh

học MBFW31 (Jie et al., 2006)

Chủng Aeromonas sp N11 chất kết tụ sinh học có khả năng kết tụ cao và

có thể đạt được tỷ lệ kết tụ 92,4% (Li et al., 2007); Chủng Klebsiella sp (A9)

được phân lập từ chất thải đô thị tiết ra nhiều chất kết tụ sinh học, hoạt tính kết

tụ sinh học của chủng này tăng đáng kể khi thêm các cation hóa trị ba như Fe3+

và Al3+, hiệu quả kết tụ cao nhất ở pH = 6,0 (Sheng et al., 2006); Vi khuẩn ưa lạnh Pseudoalteormonas sp SM9913 được phân lập từ cặn của đại dương ở độ

sâu 1855 m Exopolysaccharides (EPS SM9913) thu nhận được từ vi khuẩn này có độ nhớt cao và có thể gom tụ các hạt proteinaceous và các ion kim loại

(Li et al., 2008); Một số vi sinh vật tổng hợp các chất kết tụ sinh học như

Rhodococcus erythropolis, Paecilomyces sp., Klebsiella pneumoniae, Citrobacter sp đã được nghiên cứu (Lian et al., 2008); Các chủng vi khuẩn

tổng hợp chất kết tụ sinh học như Bacillus fusiformis, Bacillus subtilis,

Bacillus flexus được phân lập từ thiết bị lên men sinh học theo mẻ và được

nhận diện bằng cách giải trình tự 16S rRNA tổng hợp chất kết tụ sinh học phần lớn là carbohydrate (91% w/w) và năng suất tổng hợp được là 2,1g/l

(You et al., 2008); Chủng vi khuẩn T2a được phân lập từ tỉnh Tiền Giang,

Việt Nam cho tỉ lệ kết tụ cao (97,2%) (Lê Thị Loan, 2009); Các vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học được phân lập từ trong bùn hoạt động của hệ thống xử

lý nước thải phía bắc ở Durban, Nam Phi gồm Bacillus subtilis (E1),

Exiguobacterium acetylicum (D1), Klebsiella terrigena (R2), Staphylococcus aureus (A22), Pseudomonas pseudoalcaligens (A17), Pseudomonas plecoglossicida (A14), các chất kết tụ sinh học này có khả năng làm giảm độ

đục và tổng số vi khuẩn của nước sông Palmiet (Buthelezi et al., 2009)

2.3.1.4 Đa dạng vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học trong môi trường

Chất kết tụ sinh học (bioflocculants) là chất an toàn, không độc hại được tạo ra từ vi sinh vật, có tác dụng nhanh chóng không độc hại đối với con người

và môi trường (Sheng et al., 2006) Trong những năm gần đây, nhiều loại vi

sinh vật đã được tìm thấy có khả năng tổng hợp và phóng thích hợp chất kết tụ sinh học ở dạng đa phân tử (flocculating biopolymer) và chúng có thể được phân lập từ chất thải, đất và nước thải bao gồm nhiều loại vi sinh vật Chất kết

tụ sinh học được tổng hợp từ các chủng vi khuẩn khác nhau được ứng dụng trong xử lý nước thải, chế biến thực phẩm và quá trình lên men công nghiệp

(Yang et al 2009) Một số chất kết tụ sinh học được ly trích từ môi trường

nuôi cấy của một số dòng vi khuẩn đã được nghiên cứu (Bảng 2.1), các chủng

cho tỷ lệ kết tụ cao gồm vi khuẩn Bacillus sp., Halomonas sp., Scenedesmus sp., Chryseobacterium sp., Penicillium sp., and Pseudoalteromonas sp

Bảng 2.1 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các loài vi khuẩn khác nhau từ năm 2007 - 2013

Bacillus mucilaginosus - 94,00 Lian et al., 2008

Proteus mirabilis 1.33 93,13 Xia et al., 2008

Bacillus fusiformis, 2.12 - You et al., 2008

Halomonas sp V3a’ 4.52 95,00 He et al., 2009

Bacillus licheniformis - 97,90 Li et al., 2009

Paenibacillus polymyxa - 99,36 Yang et al., 2009

Bacillus licheniformis - 99.20 Ji et al., 2010

Proteus mirabilis - >90,00 Zhang et al., 2010 Virgibacillus sp - 70,40 Cosa et al., 2011

Bacillus mojavensis 5.2 96,12 Elkady et al., 2011

Schizophyllum commune 1.3 - Shu and Hsu (2011)

Ochrobactrum ciceri W2 3,8 95,00 Wang et al., 2012

Scenedesmus sp - 97,40 Chan et al., 2013

Paenibacillus elgii B69 25,63 87,00 Li et al., 2013

Klebsiella sp TG-1 - 86,90 Liu et al., 2013

Bacillus subtilis MSBN17 13,42 - Sathiyanarayana et al., 2013 Solibacillus silvestris W01 - 90,00 Wan et al., 2013

Theo Sheng et al (2006) thì đất và chất thải là những nguồn tốt nhất để

phân lập các vi sinh vật tổng hợp chất kết tụ sinh học Dựa vào trình tự 16S rDNA của một số nghiên cứu cho thấy mối quan hệ của các dòng vi khuẩn

tổng hợp chất kết tụ sinh học như nghiên cứu của Liu et al (2010) phân lập

dòng Bacillus licheniformis có khả năng tổng hợp chất kết tụ sinh học

polysaccharide (Hình 2.5) và nghiên cứu của Mandal et al (2013) phân lập dòng Klebsiella sp có khả năng kết tụ sinh học cao (Hình 2.6).

Hình 2.5 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S

rDNA của chủng vi khuẩn 8-37-0-1

(Nguồn: Liu et al., 2010)

Hình 2.6 Cây phả hệ về mối quan hệ di truyền dựa trên trình tự 16S

rDNA của vi khuẩn Klebsiella sp

(Nguồn: Mandal et al., 2013)

2.3.2 Nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

Căn cứ tìm hiểu các tài liệu xác định được quy trình nghiên cứu vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học theo các bước tuần tự sau:

2.3.2.1 Phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

Mẫu được sử dụng để phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học thường là mẫu chất thải rắn, lỏng và các mẫu bùn hoạt tính theo quy trình Hình 2.7

Hình 2.7 Quy trình phân lập, nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ

sinh học Môi trường phân lập thường dùng các môi trường chọn lọc và thành phần một số môi trường chọn lọc được thể hiện như ở Bảng 2.2 Chất kết tụ sinh học được tổng hợp từ các vi khuẩn có đặc tính hóa học dạng protein, polysaccharide hoặc glycoprotein (hỗn hợp cả 2 dạng protein và polysacharide) Môi trường chọn lọc thường được sử dụng để phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học là môi trường protein và môi trường polysaccharide

Mẫu nước thải sau

Pha loãng với nước cất

Tuyển chọn các dòng vi khuẩn có tỷ lệ kết tụ cao

Nhận diện vi khuẩn Dựa vào các đặc điểm hình thái, đặc tính sinh

lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn Dựa vào phương pháp sinh học phân tử

Bảng 2.2 Một số môi trường phân lập vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

Thành phần môi trường Tài liệu tham khảo

5 g pepton; 2,5 g yeast extract; 1g glucose và 15 g agar

trong 1 lít nước cất và điều chỉnh pH về 7,2

Vossoughi et al.,

2001

4% (w/v) dibutylphthalate; 0,5 g urea; 0,5 g yeast extract;

0,1 g NaCl; 0,2 g MgSO4; 2 g KH22PO4; 5 g K2HPO4

trong một lít nước cất và điều chỉnh pH về 8,5

He et al., 2002

10 g glucose; 2 g KH2PO4; 5 g K2HPO4; 0,2 g

MgSO4.7H2O; 0,1 g NaCl; 0,5 g carbamide và 0,5 g dịch

nấm men trong 1 lít nước cất và điều chỉnh pH về 7,0

Deng et al., 2003

10 g glucose; 10 g fructose; 0,5 g peptone; 0,5 g yeast

extract; 0,5 g urea; 0,5 g (NH4)2SO4; 5,0 g K2HPO4; 0,2

g MgSO4; 0,1 g NaCl hòa tan trong 1 lít nước cất và điều

40 g/l glucose; 2 g/l K2HPO4; 5 g/l K2HPO4; 0,2 g/l

(NH4)2SO4; 0,1 g/l NaC1; 0,5 g/l urea; 0,5 g/l yeast extract;

0,2 g/l MgSO4 và điều chỉnh pH ban đầu về 7,2

Lixi et al., 2006

20 g glucose; 2 g KH2PO4; 5 g K2HPO4; 0,1 g NaCl; 0,2 g

(NH4)2SO4; 0,5 g carbamide; 0,5 g yeast extract hòa tan

trong 1 lít nước cất và điều chỉnh pH 8,0

Li et al., 2007

20 g tinh bột hòa tan; 1 g/l KNO3; 0,5 g/l MgSO4.7H2O;

0,5 g NaCl; 0,5 g/l K2HPO4.3H2O; 0,01 g/l FeSO4.7H2O;

15 – 20 g bột agar

al., 2008

20 g/l glucose; 0,5 g/l yeast extract; 0,5 g/l urea; 0,1 g/l

NaCl; 5 g/l KH2PO4; 5 g/l K2HPO4; 20 g/l agar Điều

chỉnh pH ban đầu của môi trường về 7,0 – 7,2

Gong et al., 2008

1000 ml; 10 g glucose; 4 g/l K2HPO4 ; 0,2 g MgSO4.7H2O;

0,5 g carbamide; 0,4 g K2HPO4; 0,1 g NaCl; 0,5 g yeast

2.3.2.2 Tuyển chọn vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học

Nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học dựa vào các đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hóa

Để nhận diện vi khuẩn tổng hợp chất kết tụ sinh học các nhà khoa học

thường căn cứ vào các đặc điểm sau: Deng et al (2003) đã nhận diện vi khuẩn

Bacillus mucilaginosus thông qua một số đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý,

sinh hóa Trên môi trường rắn chứa potassium silicate, các khuẩn lạc của vi

khuẩn này không màu, nhớt, bề mặt láng và có độ dính Nghiên cứu Lu et al

(2005) cũng dựa vào một số đặc điểm về hình dạng tế bào và khuẩn lạc của

chủng vi khuẩn trên môi trường thạch sau 2-3 ngày ủ và Theo Lixi et al

(2006), vi khuẩn trong các mẫu được nhân lên số lượng lớn, sau đó pha loãng dịch vi khuẩn và cấy lên môi trường thạch có khuẩn trơn láng và nhầy nhớt Kiểm tra khả năng kết tụ của các chủng vi khuẩn có thể dựa vào hoạt tính kết tụ (Flocculating activity) hoặc tỷ lệ kết tụ (Flocculating rate)

Khả năng kết tụ và Tỷ lệ kết tụ được tính theo công thức:

Hoạt tính kết tụ = 1/ODmẫu – 1/ODđối chứng (Wu và Ye, 2007)