Nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử ADN nhằm xác định gen CMS, gen duy trì, gen phục hồi phục vụ chọn tạo giống lúa lai ba dòng

Để có được những tổ hợp có ưu thế lai cao thì cần có sự đa dạng về cácdòng bất dục, dòng duy trì, dòng phục hồi.. Năm 1973 đã sản xuất được lô hạt giống F1 đầu tiên với sự tham gia của 3

PHẦN I: MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề

Lúa lai là một trong những thành tựu to lớn của các nhà khoa học trongviệc tăng năng suất cây trồng giải quyết vấn đề an ninh lương thực

Theo nghiên cứu của các nhà khoa học thì lúa lai có thể tăng năng suất lên20% - 30% so với lúa thường Vì vậy nhiều nước trên thế giới đã đưa lúa lai vàosản xuất đại trà Trung Quốc là nước đầu tiên đưa lúa lai vào sản xuất và đã đạtđược những thành tựu đáng kể Nhận thấy được vai trò của việc sản xuất lúa lainên trong những năm gần đây các nhà khoa học nước ta đã đầu tư rất nhiều côngsức nghiên cứu và phát triển lúa lai Sản xuất và phát triển lúa lai đã trở thànhmột chương trình chiến lược trong việc tăng năng suất lúa ở nước ta

Hiện nay trên thế giới cũng như ở nước ta có hai hệ thống sản xuất lúa laichủ yếu là: hệ thống lúa lai hai dòng mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và hệ thốnglúa lai ba dòng bất dục đực tế bào chất So với lúa lai hai dòng thì lúa lai ba dòng

ổn định hơn ít biến động với điều kiện môi trường Nó rất thuận lợi đối với mộtnước có điều kiện tự nhiên như nước ta Chính vì vậy từ lâu hệ thống lúa lai badòng đã được nghiên cứu và sản xuất rộng rãi trên thế giới

Để có được những tổ hợp có ưu thế lai cao thì cần có sự đa dạng về cácdòng bất dục, dòng duy trì, dòng phục hồi

Để chọn tạo được các dòng này bằng các phương pháp truyền thống như:Lai chuyển gen, đánh giá đời con…thì tốn rất nhiều thời gian và công sức vàthường đem lại hiểu qủa không cao

Ngày nay với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học đặc biệt là

kỹ thuật phân tử ADN (Chỉ thị phân tử) đã đem lại hiệu quả cao trong công tácchọn tạo giống

Xuất phát từ thực tiễn là nhanh chóng tạo đựơc các dòng bất dục, dòng

duy trì, dòng phục hồi chúng tôi tiến hành đề tài: “ Nghiên cứu, ứng dụng chỉ thị phân tử ADN nhằm xác định gen CMS, gen duy trì, gen phục hồi phục vụ chọn tạo giống lúa lai ba dòng ”.

- Tìm được các marker nghiên cứu

- Đo đếm đánh giá một số tính trạng, chỉ tiêu nông sinh học

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Hiện tượng ưu thế lai ở lúa

2.1.1 Khái niệm

Ưu thế lai là hiện tượng quần thể con lai F1 thu được khai lai hai bố mẹ

không giống nhau về mặt di truyền tỏ ra hơn hẳn so với cả hai bố mẹ về sức sinhtrưởng, sức sống, khả năng sinh sản khả năng chống chịu với các điều kiện bấtthường, khả năng thích nghi, năng suất hạt, chất lượng hạt và các đặc tính khácnữa [10]

2.1.2 Cơ sở di truyền của ưu thế lai

Từ khi biết đến ưu thế lai các nhà di truyền học đã bắt tay ngay vào việctìm hiểu cơ sở di truyền của nó Đến nay đã có rất nhiều giả thuyết được đưa ra

để giải thích hiện tượng ưu thế lai và các giả thuyết được nhiều người thừa nhậnnhất đó là:

Giả thuyết tính trội

Theo giả thuyết này thì trong quá trình tiến hoá, các tính trạng có lợithường do gen trội quy định, còn các tính trạng không có lợi do gen lặn quy định

Ở con lai F1 chứa nhiều gen trội có lợi nhất hơn cả bố mẹ vì F1 có độ dị hợp tửcao nhất về các cặp gen, nên các gen trội lấn át hoàn toàn các gen lặn trong cùnglocus trên NST tương đồng làm cho con lai F1 có ưu thế lai hơn hẳn hai bố mẹ

VD: Khi lai AAbbCCdd với aaBBccDD cho con lai có kiểu genAaBbCcDd nên cho ưu thế lai hơn bố mẹ rõ rệt

Giả thuyết siêu trội

Theo giả thuyết này thì không có hiệu ứng trội cũng như hiệu ứng lặn giữacác alen.Do vậy, biểu hiện của ưu thế lai không phải do hiệu ứng trội mà là do sựphân hoá khác nguồn của các alen Giữa alen trội và lặn trong cặp gen dị hợp có

sự tác động tương hỗ lẫn nhau Điều này làm cho cơ thể có kiểu gen dị hợp sẽ cósức sống hơn hẳn cơ thể mang kiểu gen đồng hợp tử trội lẫn đồng hợp tử lặn(AA < Aa > aa).

Giả thuyết cân bằng di truyền

Theo giả thuyết này thì mỗi cơ thể sinh vật có một trạng thái cân bằng ditruyền do các gen trong nhân quy định và có vai trò tác động của tế bào chất Khilai giữa hai cơ thể khác nhau sẽ tạo nên một cân bằng mới thích ứng hơn cânbằng cũ nên có nhiều tính trạng mới tốt hơn ở bố mẹ

2.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa lai ba dòng trên thế giới

Hiện tượng con lai hơn hẳn bố mẹ đã được loài người biết đến từ lâu.Khoảng 584 năm trước Công nguyên người ta đã biết lai lừa với ngựa để tạo racon la có sức khoẻ như ngựa và dẻo dai như lừa Nhân dân vùng Trung du Bắc

bộ từ thời Lê đã biết tạo con lai giữa vịt và ngan lớn nhanh có thịt thơm ngon.Theo tài liệu chính thức thì ưu thế lai đã được I G Kolreiter phát hiện mô tả vàứng dụng ở cây thuốc lá vào năm 1760, ở cây ngô đã được Beall (1878) mô tả vàShull (1904) ứng dụng thành công [2]

Ở cây lúa J W Jones là người đầu tiên báo cáo về sựu xuất hiện ưu thế laitrên các tính trạn số lượng và năng suất Sau Jones có rất nhiều công trình nghiêncứu xác nhận sự xuất hiện ưu thế lai về năng suất và các yếu tố cấu thành năngsuất (Anomymous- 1977, Li- 1977) về tích luỹ chất khô (Rao- 1965, Jenning-1967 ) về các đặc tính sinh lý (cường độ quang hợp, diện tích lá ) và về cácđặc tính chống chịu (chịu rét, hạn, chống bệnh, chịu sâu ) Các công trìnhnghiên cứu này khẳng định khai thác ưu thế lai ở lúa là một hướng rất có triểnvọng [3]

Lúa là cây tự thụ phấn điển hình, khả năng nhận phấn ngoài rất thấp, bởivậy việc sản xuất hạt lai gặp rất nhiều khó khăn Đã có rất nhiều nhà khoa họcnghiên cứu vấn đề sản xuất hạt lai thương phẩm như: Các nhà khoa học Ấn Độ(Kadam- 1937, Richaria- 1962 ), các nhà chọn giống người Mỹ (Stansel vàCraigmiles- 1966, Cranahan và cộng sự- 1972), Nhật Bản (Shinjyo và Omura-1966), Viện nghiên cứu lúa quốc tế IRRI có (Athwall và Virmani- 1972) Tuynhiên vẫn chưa có phương pháp thích hợp để sản xuất hạt lai [22].

Trung Quốc bắt đầu nghiên cứu với lúa lai muộn hơn nhưng là nước đầutiên trên thế giới áp dụng thành công ưu thế lai trong sản xuất đại trà

Những năm đầu thập niên 60 của thế kỷ trước Yuan Long Ping và cộng sự

đã phát hiện được cây lúa bất dục trong loài lúa dại: Oryza fatua spontanea tại

đảo Hải Nam Sau 9 năm lai lại liên tục với các dạng lúa trồng họ đã thành công

trong việc chuyển gen bất dục đực tế bào chất vào lúa trồng (Oryza sativa) và tạo

ra đựơc các dòng bất dục đực di truyền tế bào chất có các đặc điểm nông sinhhọc quý tương đối ổn định Năm 1973 đã sản xuất được lô hạt giống F1 đầu tiên

với sự tham gia của 3 dòng bố mẹ là: Dòng bất dục đực tế bào chất (Cytoplasmic

Male Sterile- CMS, dòng A), dòng duy trì bất dục (Maintaiiner line, dòng B),

dòng phục hồi hữu dục (Restores line, dòng R) Năm 1974, Trung Quốc đã đưa

ra nhiều tổ hợp lúa lai có ưu thế lai cao; năm 1975, đưa ra quy trình sản xuất hạtlai “3 dòng”; năm 1976 đã sane xuất đủ lượng hạt lai F1 để gieo cấy trên diệntích 140.000 ha Năm 1990, đã cấy thêm được 5 triệu ha lúa lai thương phẩm vànăm 1996, đã đưa diện tích lên tới 17,6 triệu ha chiếm 55% tổng diện tích gieocấy cả nứơc Năng suất lúa lai cao hơn lúa thuần khoảng 30% Trên diện tích hẹp(0,1 ha) lúa lai đạt năng suất kỷ lục là 16,8 tấn/ha/vụ và 23 tấn/ha/2 vụ [2]

Hiện nay, kỹ thuật sản xuất lúa lai của Trung Quốc đã phát triển ở mực độcao Năng suất hạt lai F1 trung bình 2,5 tấn/ha trên phạm vi cả nước Nhiều dòngCMS có tỷ lệ thụ phấn chéo cao từ 85-90% như II-32A, ZhiA, You-IA và cóphẩm chất tốt đã được tạo ra [23] Kể từ khi tổ hợp lúa lai đầu tiên là Nan Youđược tạo ra năm 1974 và được đưa vào sản xuất đại trà năm 1976 đến nay đã cóhơn 100 tổ hợp được trồng với diện tích lớn Các tổ hợp lúa lai ba dòng Indicacủa Trung Quốc chủ yếu thuộc vào các hệ như Wei You (dòng mẹ là V20A)gồm Wei You 64, Wei You 77, hệ Shan You, Quế You 99 ,hệ Bo You (dòng

mẹ là BoA) gồm Bo You 64, Bo You Quế 99B; Hệ Kim You (dòng mẹ là Kim

32 A) bao gồm Kim You 77, Kim You Quế 99, ngoài ra còn một số hệ mẹ khácnhư ZhiA, XieA, You IA

Nhiều dòng CMS tốt đã được tạo ra trên nền di truyền của các giống thuộcViện nghiên cứu lúa IRRI, các giống có nguồn gốc từ Hàn Quốc và Ấn Độ Cácdòng IR54752A, IR54753A và IR54754A thích ứng tốt với điều kiện nhiệt đới ,

có khả nằng kết hợp cao và tỷ lệ thụ phấn chéo đảm bảo Các dòng này đã được

sủ dụng để tạo ra hạt lai F1

Qua hơn 30 năm nghiên cứu và phát triển Trung Quốc đã tạo ra được hơn

600 dòng bất dục đực tế bào chất (dòng A) và dòng duy trì tương ứng (dòng B),hơn 3000 dòng phục hồi để tạo ra nhiều tổ hợp lai trong đó có hơn 200 tổ hợpđược gieo trồng phổ biến ngoài sản xuất

Ở Hàn Quốc (theo Moon-1998; Moon và cộng sự- 1994) dự án hợp tácnghiên cứu với IRRI đã đóng vai trò đáng kể trong sự phát triển lúa lai Nhiều tổhợp lúa lai ba dòng đã được tạo ra và đạt năng suất từ 9-12 tấn/ha vượt trungbình 21% so với lúa thuần tốt nhất Ví dụ như tổ hợp V20A/Miyang 46,V20A/Suweon 294, HR1619A/Iri362, IR54756A/ Iri362

Ấn Độ bắt đầu nghiên cứu lúa lai từ những năm 1970 Tuy nhiên phải đếnnăm 1989, nhờ sự ủng hộ của Nhà nước và các tổ chức quốc tế (IRRI, FAO)chương trình nghiên cứu, phát triển lúa lai mới được tăng cường Vụ mùa năm

1996, Ấn Độ trồng được trên 60.000 ha lúa lai Từ 1994 - 1996, 6 giống lúa lai

ba dòng của các cơ quan nghiên cứu thuộc khu vực nhà nước đã được công nhận

và đưa vào sản xuất đại trà Đó là các giống: APHR-1, APHR-2, MGR-1,

KRH-1, CNRH-3 và DRRH-1 Các tổ hợp này cho năng suất cao hơn lúa thường từ 16

- 44% (Siddiq- 1996) Năm tổ hợp lúa lai của các công ty tư nhân cũng đã đượcchấp nhận và được trồng trên diện tích rộng, đó là các tổ hợp: PHB71, 6201,

6027, MPH516 và MPH517 trong đó tổ hợp 6201 đã được trồng thử nghiệm ởmiền Bắc Việt Nam và đạt năng suất 7,2 tấn/ha Hiện nay kỹ thuật sản xuất hạtgiống lúa lai ở F1 của Ấn Độ đã đạt được những thành tựu bước đầu Năng suấthạt F1 là 1,5 – 2,0 tấn/ha trên diện tích rộng

Theo Suprihatno và cộng sự (1994), Indonesia bắt đầu nghiên cứu lúa lai

từ năm 1983 Đầu tiên là việc đánh giá và sử dụng nhiều dòng CMS vào chươngtrình chọn tạo giống lúa lai ba dòng Các tổ hợp lúa lai IR58025A/BR827,IR58025A/IR53942, IR58025A/IR54852 đã được tạo ra và thử nghiệm ởKuningham, tổ hợp IR62829/BR736 đạt 8,09 tấn/ha, cao hơn IR64 là 18% Năm

1996, ở Tegalgondo (Trung Java) và Kuningan (Tây Java), tổ hợpIR58025A/IR53942 cao hơn giống lúa thuần mới công nhận Membaramo tươngứng là 17 và 27% Ngoài ra, ở một số nước khác như Nhật Bản, CHDCNDTriều Tiên, Philipin, Malaisia, Thái Lan

2.1.3 Tình hình nghiên cứu và sản xuất lúa lai ba dòng ở Việt Nam

Việt Nam bắt đầu nghiên cứu lúa lai vào năm 1980 tại Viện Khoa học kỹthuật Nông nghiệp, Viện lúa Đồng bằng sông Cửu Long và Viện Di truyền Nông

Nghiệp Nguồn vật liệu bố mẹ chủ yếu nhập nội từ IRRI, tuy nhiên những nghiêncứu này mới ở giai đoạn tìm hiểu Bước đầu chúng ta chỉ đánh giá các dòngCMS, xây dựng các quy trình sản xuất hạt lai F1 và đánh giá ưu thế lai để tìmnhững tổ hợp lai có triển vọng Đến năm 1992, chương trình nghiên cứu lúa laiquốc gia mới thực sự được hình thành [2].

Năm 1990, bộ Nông nghiệp đã nhập một số tổ hợp lúa lai từ Trung Quốcgieo trồng thử trong vụ xuân ở đồng bằng Bắc bộ Cụ thể từ năm 1989 đến năm

1991 đã có một số tổ hợp cao hơn lúa thường từ 15 – 40% như IR62829/Pusanđạt 9,05 tấn/ha Một số giống lúa lai hệ 3 dòng nhập nội từ Trung Quốc nhưShan ưu 63, Bắc ưu 903, Nhị ưu 63 đã cho năng suất cao hơn lúa thuần từ 13 –

30 % Một số dòng CMS được đánh giá có tính bất dục hoàn toàn và gần như là

ổn định là V20A, IR58025A, BoA Các dong phục hồi cho các dòng trên cũngđựơc chọn lọc như Minh khôi 63, Trắc 64, Quế 99 [5]

Tại Viện di truyền Nông nghiệp, một số tổ hợp lai cho năng suất cao cũngđược tạo ra Tiêu biểu là tổ hợp BoA/DT12 cho năng suất 7,5-10 tấn/ha có tínhthích ứng cao và đã được chọn lọc để để đưa ra sản xuất thử [10]

Ngoài việc thu thập các dòng CMS chúng ta còn tiến hành nghiên cứu đểtạo dòng CMS mới Chúng ta đã tạo ra được 8 dòng CMS mới từ 5 nguồn lúadại, 4 trong số 8 dòng đó có nguồn tế bào chất bất dục từ lúa dại Đồng Tháp kếthợp với nhân của các giống IR66, IR70, PMS23, V20B; 4 dòng còn lại là:OMS1, OMS2, OMS4, RPMS2 có kiểu bất dục giao tử thể rất khác với dạng bấtdục đực “WA” của Trung Quốc [6]

Trung tâm nghiên cứu và phát triển lúa lai thuộc Viện Khoa học Kỹ ThuậtNông nghiệp Việt Nam đã tạo ra được nhiều tổ hợp 3 dòng có triển vọng như:HYT56, HYT57, HYT82, HYT83 trong đó HYT57 và HYT83 đã được công

nhận cho khu vực hoá Các tổ hợp này có đặc điểm nổi bật là: năng suất cao, chấtlượng tốt, chống chịu được với sâu bệnh và điều kiện bất thuận ở Việt Nam [8].

Theo Phạm Đồng Quảng (2006) tính đến năm 2003-2004 Việt Nam đã sảnxuất được trên 600.000 ha lúa lai, chủ yếu là lúa lai ba dòng, sản lượng thu được

là gần 4000 tấn/năm, chiếm 25% nhu cầu giống trong nước Vì vậy FAO coiViệt Nam là nước áp dụng thành công công nghệ sản xuất lúa lai vào đại trà vàViệt Nam là nước có diện tích lúa lai thương phẩm đứng thứ 2 trên thế giới chỉsau Trung Quốc [9]

Tuy nhiên các giống lúa lai được trồng ở Việt Nam thì có đến hơn 80%được nhập nội từ Trung Quốc Việt Nam vẫn chưa có một tổ hợp lai 3 dòng nàohoàn toàn do Việt Nam tạo ra được đưa váo sản xuất trên diện rộng thực sự đemlại hiệu quả cao (Tạp chí nông thôn mới, số ra 179/20065)

Với mục tiêu năm 2010 nước ta chủ động sản xuất hạt giống cho khoảng 1triệu ha lúa lai thì buộc các nhà chọn giống phải tích cực hơn nữa trong việc tạo

ra nhiều tổ hợp lúa lai ba dòng nội địa cho năng suất cao, chất lượng tốt, thíchứng rộng, chống chịu tốt Đây là vấn đề cấp bách đòi hỏi các nhà chọn giốngcùng bắt nhau nhau tích cực thực hiện

2.2 Hệ thống lúa lai ba dòng

2.2.1 Khái niệm

Hệ thống lúa lai ba dòng là hệ thống sản xuất hạt lai F1 dựa vào 3 dòng có

bản chất di truyền khác nhau đó là: Dòng bất dục đực tế bào chất (Cytoplasmic

Male Sterile- CMS, dòng A), dòng duy trì bất dục (Maintainer line, dòng B),

dòng phục hồi hữu dục (Restores line, dòng R).

2.2.2 Dòng bất dục đực tế bào chất

a) Bản chất di truyền dòng bất dục

Sự bất dục là do sự tương tác giữa gen nhân và gen trong tế bào chất gây

ra Cây bất dục này thì có tế bào chất bất dục dạng (S) và trong nhân có chứa genbất dục là (rfrf) Cây bất dục có kiểu gen là Srfrf Những cây này thì ty thể khôngcung cấp đủ năng lượng cho các hoạt động của tế bào trong khi đó các sản phẩmcủa các gen trong nhân lại không bù đắp được Chính điều này làm cho hạt phấncủa những cây này bị bất dục do không tích luỹ được năng lượng, hạt phấn lép,méo mó biến dạng, không có khả năng nảy mầm thụ tinh

b) Đặc điểm

Dòng này thì có nhụy phát triển bình thường nhưng hạt phấn bị thui chột.Nên dòng này không có khả năng tự thụ phấn tạo hạt nhưng có khả năng nhậnphấn của các dòng khác có chúa gen phục hồi để tạo hạt [19]

Chúng ta có thể nhận biết được những dòng này bằng cách nhuộm hạtphấn bằng dung dịch I-KI1% và soi trên kính hiển vi thì các hạt phấn này khôngnhuộm màu, có hình dạng méo mó Hoặc nhận bằng cách bao cách ly dòng nàythì dòng này không cho hạt, các hạt bị lép hoàn toàn

c) Một số dạng bất dục phổ biến

+ Bất dục đực hoang dại (Wild Abortion: WA)

Đây là dạng bất dục bào tử thể nó đựơc tạo ra bằng cách lai giữa lúa dại vàlúa trồng là các giống thuộc loài phụ Indica chín sớm như như: V20, V41, ZhenShan 97…Các giống Indica ngắn ngày của Trung Quốc có thể được dùng làmdòng duy trì còn các giống Indica chín muộn và các giống trồng ở vùng ĐôngNam Á có thể dùng làm các dòng phục hồi như: IR24, IR26, Zhu Ai, Tai Yin1…

Hiện nay dạng bất dục “WA” được sử dụng rộng rãi nhất, nó chiếm 95%tổng số lượng hạt giống F1 được đưa vào sản xuất

+ Dạng bất dục đực kiểu Hồng Liên

Thuộc hệ bất dục giao tử thể được hình thành do việc lai trở lại liên tụcgiữa lúa đỏ dại có râu (mẹ) với giống Lien Tang Zao (bố) Ở dạng này thì cácdòng duy trì thuộc dạng “WA” như: Zhen Shan 97, Jin Nan Te 43 và Xian Feng1lại trở thành dòng phục hồi cho các dòng bất dục thuộc dạng Hồng Liên Và cácdòng phục hồi mạnh thuộc dạng “WA” như Tai Yin1 là các dòng duy trì tốt vớidạng Hồng Liên

+ Dạng bất dục đực kiểu “BT”

Dòng bất dục Taichuang 65 và các dòng bất dục Li Ming và Feng Jin đượctruyền từ BT-C, và các dòng bất dục của lúa Sinica Tien 1 và Tien 3 thuộc dạngnày Phần lớn các giống Sinica là các dòng duy trì của chúng Các gen phục hồicủa lúa Sinica đều được bắt nguồn từ lúa Indica Lúa Indica được trồng ở chỗ đấtcao tỉnh Yunnan, Trung Quốc và ở Đông Nam Á cũng như nhiều dòng của IRRImang gen phục hồi

sử dụng trực tiếp là phương pháp hiệu quả nhất trong chương trình gây tạo dòngCMS

+ Lai xa giữa các loài phụ hoặc lai lúa dại với lúa trồng

Trong khi lai xa người ta thường thấy con lai bất dục ngay từ thế hệ F1 vàquần thể F2 thì có sự phân ky về sự bất dục Sự bất dục này do nhiều nguyênnhân khác nhau gây nên Để có được dạng bất dục di truyền tế bào chất thì theokinh nghiệm tổng kết của các chuyên gia chọn giống Trung Quốc thì cần chọncác dạng Indica nguyên thuỷ làm mẹ lai với một số dạng cải tiến trong nhómIndica chín sớm, chín trung bình và các giống Japonica cải tiến sẽ xuất hiệnnhiều cá thể bất dục Chọn trong đó những cá thể có nhiều tính trạng nông sinhhọc tốt lai thử với dòng bố khởi đầu Nếu con lai bất dục thì tiến hành lai lại rồiđánh giá độ thuần, cuối cùng sẽ thu được dòng bất dục và dòng duy trì tươngứng

+ Phương pháp gây đột biến

Người ta có thể dùng các tác nhân đột biến (hoá học, vật lý) để tạo ra cácdạng bất dục khác nhau trong quần thể Để tìm được dòng CMS trong số đóchúng ta phải tiến hành lai thử các cá thể bất dục được tạo ra với dòng vật liệukhởi đầu chưa có xử lý đột biến hoặc các giống lúa thường khác nhau có nhữngtính trạng mong đợi Sau đó tiến hành đánh giá con lai F1 và lựa chọn những tổhợp lai bất dục, cặp nào có độ ổn định bất dục cao thì đó chính là dòng CMS vàdòng duy trì mới

e) Yêu cầu đối với một dòng A tốt để sản xuất hạt lai F1

- Hạt phấn phải bất dục hoàn toàn và ổn định qua các vụ

- Phải tương đối dễ phục hồi:

• Phổ phục hồi rộng có nghĩa là nhiều giống lúa thường khi lai với dòng

A cho con lai F1 hữu dục cao trên 80%, trên cơ sở đó có thể chọn ra nhiều tổ hợplai tốt

• Cấu tạo hoa phù hợp với đặc điểm nhận phấn ngoài: Góc mở vòi trấurộng, thời gian mở dài, thời gian sống của vòi nhụy kéo dài Có tập tính nở hoatốt: nở tập trung.

2.2.3 Dòng duy trì bất dục

a) Bản chất di truyền

Các cây thuộc dòng duy trì có tế bào chất hữu dục (tế bào chất dạng F),gen trong nhân là gen lặn kiểm soát tính bất dục hạt phấn Kiểu gen của nhữngcây thuộc dòng này là (Frfrf)

b) Đặc điểm

Dòng duy trì có bộ gen nhân giống hệt bộ gen nhân của dòng CMS chỉkhác là tế bào chất của dòng này là hữu dục nên dòng này vẫn cho hạt phấn hữudục và quá trình thụ phấn thụ tinh xảy ra bình thường, tỷ lệ kết hạt cao Và khilấy hạt phấn của dòng này thụ phấn cho dòng A thì ta sẽ thu được chính dòng A

Vì vậy dòng B làm nhiệm vụ duy trì tính bất dục của dòng A Và mỗi dòng A chỉ

có một dòng B tương ứng

c) Chọn tạo dòng duy trì bất dục

Trong tập đoàn lúa tồn tại một số dòng duy trì, tuy nhiên không thể phânbiệt giữa dòng duy trì với các giống lúa thường khác bằng quan sát hình thái.Muốn tìm được dòng B trong tập đoàn lúa phải có dòng A bất dục Ta sẽ tiếnhành lai thử các giống trong tập đoàn lúa thu hạt lai Sau đó gieo các tổ hợp lai

đó để đánh giá độ hữu dục của tổ hợp đó bằng cách soi hạt phấn và bao cách lycho tự thụ Nếu soi hạt phấn có tỷ lệ hạt phấn bất dục > 80% thì dòng đó có thểchọn được làm dòng B Trong tập đoàn lúa thì dòng B chiếm tỉ lệ không cao vàthông thường mỗi dòng B chỉ duy trì tốt nhất cho một dòng A Khi muốn cải tạo

dòng A mới đồng tế bào chất thì mới sử dụng dòng duy trì khác Khi cần cải tiếnmột tính trạng nào đó của dòng A thì trước hết phải cải tạo một tính trạng tươngứng trên dòng B Sau đó chọn lọc các cá thể phân ly trong quần thể F2 có nhiềuđặc điểm mong muốn, lai cá thể được chọn với dòng A Cây lai lại nếu cho hạtphấn bất dục chứng tỏ cặp gen lặn của cây B khởi đầu đã được truyền sang concháu Khi đó vừa tiến hành chọn lọc cá thể ở dòng bố vừa tiến hành lai trở lại đểchuyển toàn bộ các đặc điểm mong muốn sang cây A, như vậy sẽ thu được cặpA/B cải tiến Ngoài ra có thể sử dụng đột biến hoá học để cải tiến những tínhtrạng của dòng B

b) Đặc điểm

Dòng phục hồi có hạt phấn hữu dục và dùng để thụ phấn cho dòng A đểsản xuất hạt lai F1 Hạt lai F1 khi gieo sẽ cho các cây F1 đồng nhất về đa số cáctính trạng và cho ưu thế lai cao

c) Chọn tạo dòng phục hồi hữu dục

Có 3 phương pháp để gây tạo dòng phục hồi

+ Phân lập dòng phục hồi trong quần thể tự nhiên bằng lai thử

Để phát hiện dòng phục hồi trong quần thể tự nhiên các nhà chọn giống sửdụng dòng A để lai thử với các giống trong tập đoàn giống tự nhiên Sau đó gieo

các tổ hợp thu được cùng hàng với các giống bố Khi lúa trỗ tiến hành quan sáthạt phấn để đánh giá độ hữu dục của hạt phấn Những tổ hợp có tỷ lệ hạt phấnhữu dục > 80% thì dòng bố có khả năng được chọn tạo làm dòng phục hồi.Ngoài việc đánh giá độ hữu dục của hạt phấn cần chọn lọc những tổ hợp có tỷ lệhạt chắc cao, khối lượng hạt lớn

+ Tạo dòng phục hồi bằng phương pháp lai hữu tính

Lai hai dòng phục hồi có các đặc tính nông sinh học tương phản có thể bổsung cho nhau Chọn các cá thể phân ly ở F2 và tiến hành lai với các dòng CMS

để đánh giá khả năng phục hồi Lặp lại liên tục đến khi dòng bố ổn định cả vềkhả năng phục hồi, cả về tính trạng nông sinh học, đó là dòng R mới

Lai dòng phục hồi với những dòng không có khả năng phục hồi nhưng cónhững đặc điểm tốt có thể bổ sung cho dòng phục hồi như: có tiềm năng năngsuất cao, chống chịu tốt với sâu bệnh Các tổ hợp lai thu được sẽ được gieotrồng và tiến hành chọn lọc phả hệ ở các thế hệ phân ly Chọn lọc những cá thể

có nhiều đặc tính mong muốn lai thử với dòng A để đánh giá khả năng phục hồi.Những dòng có khả năng phục hồi tốt sẽ tiếp tục được chọn thuần

+ Tạo dòng phục hồi bằng phương pháp sử lý đột biến

Người ta có thể tạo ra các dòng phục hồi hữu dục mới hoặc làm tăng khảnăng phục hồi của các dòng sẵn có bằng cách sử dụng các tác nhân gây đột biến(vật lý, hoá học) Những nghiên đây cho thấy phương pháp gây đột biến vừa tạo

ra được dòng R mới, vừa góp phần cải tạo tính trạng của các dòng R sẵn có,đồng thời bổ sung được các tính trạng tốt

d) Yêu cầu đối với một dòng R tốt

• Một dòng phục hồi tốt cần sinh trưởng phát triển mạnh cao hơn dòng mẹ,phải có độ thuần cao

• Thời gian gian sinh trưởng dài hơn dòng A

• Có nhiều tính trạng quý có thể di truyền cho con lai F1

• Bao phấn to mẩy chứa nhiều hạt phấn, khi nở hoa bao phấn mở, tungphấn mạnh, tập trung, khả năng bám dính của hạt phấn tốt, nảy mầm nhanh vàkhả năng thụ tinh mạnh

• Có khả năng phục hồi mạnh, cho con lai F1 đậu hạt cao trên 80%

• Có khả năng tương hợp rộng

2.3 Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa lai

2.3.1 Khái niệm

Chỉ thị phân tử là đoạn ADN bất kỳ được dùng để phân biệt sự khác nhau

về kiểu hình (tính trạng) giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài khác nhau

2.3.2 Một số chỉ thị phân tử thường được áp dụng

a) Chỉ thị RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)

RFLP là kỹ thuật nhận dạng ADN bằng cách lai axit nucleic Bản chất của

kỹ thuật này là dựa trên sự phân cắt ADN bằng enzyme giới hạn và sự lai (liênkết) giữa các bazơ bổ sung trên hai sợi đơn axit nucleic (sợi ADN hoặc mARN).Khi xử lý bằng enzym giới hạn sẽ thu được những mảnh ADN nhỏ hơn có kíchthước khác nhau, những mảnh này sau đó được điện di và cho lai với mẫu dò,nếu chúng bổ sung với mẫu dò thì sẽ có phản ứng lai Kết quả của phản ứng lai

là chúng ta có thể xác định được sự đa hình giữa các mẫu ADN khác nhau [13]

Để tiến hành phương pháp này trước hết cần chiết tách ADN của bộgenome Sau đó sử dụng một hoặc vài enzym cắt giới hạn, chúng ta sẽ thu đượcnhững đoạn ADN có kích thước nhỏ hơn, những đoạn này được phân tách bằngcách chạy điện di trên gel agarose Tùy theo kích thước của mỗi đoạn này mà nó

sẽ di chuyển đến các vị trí khác nhau trên gel Sau đó chuyển nguyên vẹn các vệt

này lên trên màng lai Loại màng lai được ưa dùng hiện nay là hybond N+, nó sẽgiữ chặt ADN trên đó Trước khi chuyển lên màng lai các mảnh ADN được xử

lý bằng axit (HCl) nhằm bẻ gẫy những mảnh ADN thành những mảnh nhỏ hơnnữa để chúng dễ dàng di chuyển lên màng lai, đồng thời vì lai ADN chỉ tiến hànhđược giữa sợi đơn và sợi đơn nên những mảnh ADN trong gel tiếp tục được xử

lý bằng kiềm (NaOH) để làm biến tính tách ADN thành sợi đơn [7] Các vệt đóđược lai với các mẫu dò mục tiêu, đã được đánh dấu phóng xạ, màng lai sau khiđược rửa và chụp hình trên phim X quang, trong những điều kiện nhất định nhưvệt lai trên màng lai sẽ chuyển thành vết đen trong phim X quang

b) Chỉ thị PCR (Polymerase Chain Reaction)

Bản chất của kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp, phản ứng chuỗipolymerase) là kỹ thuật tổng hợp nhân tạo các đoạn ADN với tốc độ nhanh chưatừng thấy và độ chính xác cao được thực hiện trong máy chu trình nhiệt

Kỹ thuật PCR được Kary Mullis phát minh vào năm 1985 và tiếp tục đượchoàn thiện, phát triển thông qua sự phân lập và sản xuất thành công enzyme tổng

hợp ADN chịu nhiệt từ vi khuẩn Thermus aquaticus và sự thiết kế thành công

các máy chu trình nhiệt cho phép thay đổi nhanh chóng và chính xác nhiệt độcho từng giai đoạn phản ứng Cho đến nay kỹ thuật PCR được coi như mộtphương pháp nền quan trọng nhất của công nghệ sinh học hiện đại [11]

Nguyên tắc của phương pháp này là tạo lượng lớn các đoạn ADN đặc thù

từ ADN khuôn dựa trên cơ sở hoạt động của ADN-polymerase để tổng hợp sợimới bổ sung

Các yếu tố cơ bản để thực hiện phản ứng PCR bao gồm:

- Các sợi khuôn ADN chỉ cần biết trình tự nucleotide của đoạn nhỏ nằmcạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi

- Hai đoạn mồi ngắn để xác định các điểm bắt đầu tổng hợp ADN, là tínhiệu chỉ hướng đi (5’-3’) của enzyme ADN-polymerase Mồi dài khoảng 20 đến

30 nucleotide và các nucleotide ở hai đầu của mồi không tự kết hợp bổ sung vớinhau

- Có đầy đủ các loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP

DNase

- Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq).

Các nguyên liệu này được trộn theo một tỷ lệ nhất định với dung tích từ20àl đến 50àl Sau đó tiến hành phản ứng trong máy chu trình nhiệt với chu kỳđịnh trước (30-60 chu kỳ) Sản phẩm thu được sau khi thực hiện phản ứng PCR

sẽ được điện di trên gel agarose 1% sau đó đựơc nhuộm Ethidium Bromide Cuốicùng các vết băng đựơc phát hiện bằng máy chiếu UV [16]

c) Chỉ thị RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN)

Phương pháp RAPD được William, Welsh, McClelland đề xuất vào năm

1990 Bản chất của phương pháp này là quá trình nhân bản các đoạn ADN bằng

kỹ thuật PCR có sử dụng các mồi được thiết kế ngẫu nhiên Các mồi này sẽ bắtcặp ngẫu nhiên vào ADN khuôn ở vị trí bất kỳ nào mà tại đó có trình tự bổ sungvới nó Đoạn mồi được thiết kế có kích thước từ 8-12 nu (thông thường là 10nu) Sau phản ứng sẽ có vô số các đoạn ADN được nhân lên với những tính trạngnhất định [11]

d) Chỉ thị AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)

Phương pháp này được Zabeau và Vos cùng cộng sự đề xuất vào nhữngnăm 1993-1995 Bản chất của phương pháp này là sử dụng kỹ thuật PCR đểnhân bản các đoạn ADN đã được cắt bởi enzyme giới hạn Khâu then chốt của

kỹ thuật này là việc thiết kế các mồi đặc trưng Dựa vào trình tự nucleotide ở haiđầu bị cắt người ta thiết kế các đoạn gắn (adaptor) và gắn chúng vào các đầu cắt.Dựa vào trình tự adaptor ta có thể thiết kế mồi PCR gồm hai phần: phần trình tự

bổ sung với adaptor và phần bổ sung những nu tùy thích thường từ 1-3 nu Vớimồi thiết kế như vậy chỉ có các đoạn ADN có trình tự 2 đầu bắt cặp với trình tựmồi mới được nhân lên Đây là phương pháp kết hợp giữa RFLP và RAPD nên

có nhiều ưu điểm: đơn giản, ổn định, dễ thiết kế mồi ở lượng lớn, khả năng ứngdụng lớn [7]

2.3.3 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa lai

Từ khi phát hiện ra kỹ thuật PCR năm 1985 nó đã trở thành một kỹ thuậtquan trọng đựơc sử dụng trọng nghiên cứu và chọn tạo giống cây trồng Cho đếnnay đã có nhiều chỉ thị được phát hiện ra dựa trên kỹ thuật PCR như: AFLP,RAPD, SSR, STS, CAPS nó đã trợ giúp đắc lực trong công tác chọn tạo giốngcây trồng nói chung và chọn tạo giống lúa lai nói riêng

Các chỉ thị phân tử liên kết chặt với nhiều tính trạng kiểu hình được sửdụng để xác định các đặc trưng của bố mẹ trong nghiên cứu lúa lai và để xácđịnh tiêm năng ưu thế lai Chỉ thị phân tử đã được sử dụng để lập bản đồ một sốgen quan trọng và định vị một số gen số lượng thông qua liên kết di truyền Một

số gen vô cùng quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúa lai như gen kiểmsoát tính trạng phục hồi hữu dục, gen tương hợp rộng, gen kiểm soát tính trạngbất dục đực tế bào chất đã được định vị Nhiều chỉ thị liên quan đến các tínhtrạng nói trên cũng đã được tìm ra như:

- Đánh dấu gen tương hợp rộng bằng chỉ thị RFLP dùng mẫu dò RG138,RG164, RG456 (Zhang et al 1992)

- Đánh dấu gen phục hồi hữu dục cho dạng CMS-WA của giống IR24dùng chỉ thị RFLP và RAPD (Ning Huang 1998).

Yu (1991) đã định vị được hai chỉ thị là RG561 và Cdo94 nằm trên NST

số 10 liên kết chặt với gen phục hồi Rf và Zhang et al (1994) đã phát hiện ra haichỉ thị khác là RZ392 và RG458 liên kết với gen Rf3 nằm trên NST số 1 vớikhoảng cách là khoảng 3cM

Arli, Shenoy và Sharma (1996) đã công bố kết quả phân tích xác định tính

di truyền của hai dòng bất dục kiểu CMS (IR58025A và IR62829A) bằng phảnứng PCR và kỹ thuật RAPD với 20 mẫu dò có ký hiệu là PA b-7, PA O-12, PBO-19, P OP-17 và P17-4

Năm 2004, Ashiola et al đã tìm được PCR marker dựa trên trình tự của tythể nhằm để phân biệt sự khác nhua giữa dòng duy trì và dòng phục hồi cho dạngbất dục đực “WA”

Sane et al (1997), jena and Pandey (1999), Chii et al (2000) đã sử dụngphương pháp RAPD nhằm phân biệt dòng duy trì và dòng bất dục đực tế bàochất dạng “WA” Kubo and Kadowaki (1997), Ashitola et alY(2004) đã sử dụngmarker RMT6 để khuyếch đại một trình tự lặp lại (AT6) ở phía trước gen mã hóa

cho tiểu phần nad5 nhằm phát hiện được các dòng duy trì và dòng bất dục đực

“WA”

Theo P Rajendrakumar et al (2006) đã sử dụng một marker prcms nhằm

nhân đoạn lặp lại đặc biệt trên ty thể để phát hiện dòng duy trì và dòng bất dụcđực tế bào chất dạng “WA”

Như vậy từ những thành tựu nghiên cứu đạt được trên thế giới chúng ta

có thể vận dụng và thiết kế được các cặp mồi và sử dụng các chỉ thị phân tử thích

hợp để tìm nguồn gen trong các giống lúa địa phương, cụ thể là các gen bất dục,gen duy trì, gen phục hồi để phục vụ cho công tác chọn tạo giống lúa lai ba dòng.

2.3.4 Ưu điểm của việc sử dụng chỉ thị phân tử

Việc sử dụng chỉ thị phân tử và bản đồ di truyền giúp cho các nhà chọngiống thấy rõ được mối quan hệ giữa: Tính trạng-Gen-Môi trường Điều nàygiúp cho các nhà chọn giống có những biện pháp thích hợp trong chương trìnhchọn giống với các tính trạng

Chỉ thị phân tử còn giúp cho các nhà chọn giống chọn được chính xác genquy định tính trạng mong muốn và trong thời gian rất ngắn Từ đó rút ngắn đượcthời gian và công sức nâng cao hiệu quả chọn lọc

Ngoài ra nó còn có nhiều ưu điểm nữa, chính vì vậy chúng tôi thực hiện đềtài này để tìm ra những chỉ thị thích hợp nhất phục vụ cho công tác chọn tạogiống ở Việt Nam

PHẦN III: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU 3.1.Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Đối tượng nghiên cứu

Trên cây lúa (Oryza sativa L.)

3.1.2 Vật liệu nghiên cứu

3.1.2.1 Trong phòng thí nghiệm

- Máy PCR, máy chạy điện di, máy chụp ảnh điện di, máy li tâm, máyvoltex, tủ lạnh, lò vi sóng

- Các loại ống eppendoff, các loại pipet, đầu típ, các loại cối chày sứ

- Các cặp mồi sử dụng cho trong phản ứng PCR để phát hiện các gen: gencms, gen rf, gen Rf4

polymerase, nucleaza-free water)

- Hoá chất dùng để chiết tách ADN

Thành phần dung dịch đệm chiết tách

Hỗn hợp 10mldung dịch chiếttách

+ TAE (Tris base, glacial aceric acide, EDTA) 1X.

- Dung dịch KI 1% dùng để nhuộm soi hạt phấn

3.1.2.2 Ngoài đồng ruộng

- Gồm 137 tổ hợp lai giữa các dòng bất dục với các giống lúa địa phương,những giống lúa cải tiến,

- Ngoài ra còn có các vật liệu khác như : Bao nilon, cọc tre, phân bón

3.2 Thời gian nghiên cứu

Từ ngày 15/7/2007 đến ngày 15/1/2008

3.3 Địa điểm nghiên cứu

Tại phòng thí nghiệm sinh học phân tử và khu thí nghiệm đồng ruộng củabộn môn Công nghệ sinh học khoa Nông học trường Đại học Nông nghiệp I -Trâu Quỳ - Gia Lâm - Hà Nội

3.4 Bố trí thí nghiệm

- Các tổ hợp F1 được bố trí tuần tự không nhắc lại

- Mỗi tổ hợp F1 cấy trong 2m2 cùng dòng bố.

- Địa điểm : Khu ruộng thí nghiệm của bộ môn Công nghệ sinh học trườngĐại học nông nghiệp I - Hà Nội

3.5 Nội dung và phương pháp nghiên cứu

3.5.1 Nghiên cứu phát hiện các dòng có khả năng duy trì, phục hồi cho các dòng bất dục CMS.

* Phương pháp:

- Lai cưỡng bức giữa các giống lúa địa phương với các dòng bất dục đểthu hạt F1: Bằng cách bứng cây mẹ đặt cạnh cây bố, sau đó cắm cọc tre nghiêng

một góc 450 và bao nilon lại, ghi thẻ đánh dấu tổ hợp lai, ngày lai Dòng mẹ phảiđảm bảo chưa mở vỏ trấu, có thời gian trỗ trùng khớp với cây bố Cây mẹ cầnđược tỉa bớt lá và các nhánh trổ quá sớm, các nhánh còn non Cây mẹ phải đặtthấp hơn cây bố để đảm bảo khả năng nhận phấn tốt nhất Thời gian lai tiến hànhvào buổi chiều.

- Trồng hạt F1 và quan sát hạt phấn:

+ Soi hạt phấn

Hạt phấn được lấy ở những bông đang tung phấn Đem đi nhuộm trongdung dịch KI 1% sau đó đem đi soi dưới kính hiển vi Những hạt phấn có màuđen là hạt phấn hữu dục Đếm trên hiển vi trường nếu thấy có hơn 80% số hạtphấn hữu dục thì cây đó hữu dục Nếu có hơn 80% số hạt phấn bất dục thì cây đóbất dục

+ Tự thụ F1

Bao cách ly bông F1 (lúc chưa phơi màu), đến khi thu hoạch đếm tỷ lệ hạtchắc, hạt lép Nếu tỷ lệ hạt lép > 70% thì cây đó bất dục Nếu tỷ lệ hạt chắc >70% thì cây đó hữu dục

- Những tổ hợp nào bất dục thì dòng bố của chúng có thể chứa gen duy trì

- Những tổ hợp nào hữu dục thì dòng bố của chúng có thể chứa gen phụchồi

3.5.2 Xác định khả năng chứa gen duy trì, gen phục hồi bằng PCR.

* Phương pháp:

- Chiết tách ADN tổng số của tất cả các dòng bố của các tổ hợp F1 theo quy trìnhcải tiến của bộ môn Công nghệ sinh học

Bước 1: Thu mẫu lá khoẻ, cắt dài khoảng 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích

1,5 ml, đánh dấu tên giống rồi bỏ vào đá lạnh

Bước 2: Trong phòng thí nghiệm các cối sứ đã được khử trùng đặt trong đá lạnh,

các mẫu lá được cắt nhỏ 0.5cm bỏ vào cối sứ

Bước 3: Nhỏ 400 µl dung dịch chiết suất ADN vào cối sứ rồi lấy chày nghiềnnhỏ mẩu lá

Bước 4: Nghiền nhỏ mẫu lá trong dung dich chiết suất cho đến khi dung dịch

chuyển sang màu xanh đen

Bước 5: Đổ thêm 400 ml dung dịch chiết suất vào và trộn lẫn và hút 400 µl dungdịch và ống nghiệm đã được đánh dấu

Bước 6: Đổ vào ống nghiệm 400 µl hỗn hợp phenol: chlorofom:isolamylalchohol (25: 24: 1) Sau đó ly tâm trong khoảng 30 giây rồi chuyểnphần dung dịch trên sang ống nghiệm đã được đánh dấu cùng giống

Bước 7: Cho 800 µl ethanol (96%), trộn đều sau đó ly tâm 3 phút với tốc độ

12000 vòng/phút Đổ dung dịch phía trên giữa lại phần kết tủa phía dưới đáy ốngnghiệm

Bước 8: Rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng Bước 9: Hoà tan kết tủa bằng 50 µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -200C

5’-Ghi chú: - Mồi cho gen CMS và rf theo Huang và cộng sự năm 1997

- Rf4: Theo tạp chí plant Breeding 125.363-367 (2006).

Chu trình nhiệt nhân PCR cho các cặp mồi

- Chạy điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%

+ Chuẩn bị gel: Chúng tôi cân 1,5 gam agarose cho vào 100ml dung dịchTAE 1X đun và khuấy từ cho đến khi tạo dung dịch trong suốt Sau đó đổ dungdịch vào trong khay để tạo gel điện di

+ Chạy điện di: Lấy 10ul ADN là sản phẩm của phản ứng PCR trộn lẫn vớikhoảng 2ul Loading Buffer 10X rồi cho vào giếng điện di

+ Sau khi đã cho ADN vào hết các giếng thì đặt bản gel trong máy điện divới dung dịch điện di là TAE 1X, dưới hiệu điện thế 60V, cường độ dòng điện là120mA, trong thời gian 45 phút.

- Chụp ảnh điện di: Bản gel sau khi được chạy điện di đem nhuộm trongEthidium Bromide trong 10 phút Sau đó bản gel được đưa vào máy chiếu tia

UV và chụp ảnh

- Quan sát hình ảnh điện di để phát hiện gen mong muốn

3.5.3 Nghiên cứu và chọn lọc gen CMS mới.

đạt 2/3 vỏ trấu, Dùng kéo cắt chéo 1/3 vỏ trấu bụng rồi dùng panh gắp hết 6 baophấn trong vỏ trấu, sau đó bao cách ly lại Khoảng 8h-10h sáng hôm sau lấybông cây bố trỗ đem tung phấn cho cây đã khử đực, cách ly lại và ghi thẻ đánhdấu tổ hợp lai.

3.5.4 Các chỉ tiêu từ cấy đến thu hoạch

- Thời gian sinh trưởng (tính từ lúc gieo mạ đến khi chín 85%)

- Chiều cao cây (Đo từ mặt đất đến đầu bông)

- Số nhánh hữu hiệu

- Số bông hữu hiệu

- Chiều dài bông (Đo trên bông chính)

- Chiều dài lá đòng (Đo từ cuống lá đến múp đầu lá)

- Chiều rộng lá đòng (Đo phần rộng nhất của lá đòng)