khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử

Đặc điểm của lúa địa phương Các giống lúa địa phương được hình thành do quá trình chọn lọc tự nhiên vànhân tạo trong điều kiện địa phương, do vậy chúng có một số đặc điểm cơ bản, đólà: c

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

-  

 -BÁO CÁO THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thị Hồng Nhung

“Khóa luận đệ trình Khoa CNSH, Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội là một phần yêu cầu của trình độ đại học ngành Công nghệ sinh học".

HÀ NỘI - 2010

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới thầy giáo hướng dẫnPGS.TS Phan Hữu Tôn, người đã tận tình chỉ bảo tôi trong suốt quá trình thực hiệnkhóa luận

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo KS Tống Văn Hải và các thầy cô giáo

Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tạođiều kiện thuận lợi và tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận

Cuối cùng tôi xin được gửi lời cảm ơn đến gia đình và bạn bè đã luôn ủng

hộ, khuyến khích tôi trong suốt quá trình học tập

Tôi xin chân thành cảm ơn!

Hà nội, ngày tháng năm 2010

Sinh viên

Nguyễn Thị Hồng Nhung

MỤC LỤC

Lời cảm ơn i

Mục lục ii

Danh mục chữ viết tắt v

Danh mục bảng vi

Danh mục hình vii

Tóm tắt viii

PHẦN I MỞ ĐẦU 1

1.1 Đặt vấn đề 1

1.2 Mục đích và yêu cầu 2

1.2.1 Mục đích 2

1.2.2 Yêu cầu 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

2.1 Nguồn gen lúa địa phương và vấn đề bảo quản nguồn gen cây lúa 3

2.1.1 Đặc điểm của lúa địa phương 3

2.1.2 Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen địa phương 3

2.1.3 Các hướng sử dụng nguồn gen lúa địa phương 4

2.2 Nghiên cứu về chất lượng gạo 5

2.2.1 Nghiên cứu về tính trạng mùi thơm 5

2.2.2 Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm 9

2.2.3 Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt 9

2.3 Nghiên cứu về bệnh bạc lá 10

2.3.1 Tác hại của bệnh 10

2.3.2 Triệu chứng bệnh 11

2.3.3 Nguyên nhân gây bệnh 12

2.3.4 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh bạc lá 13

2.3.5 Biện pháp phòng trừ 14

2.4 Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bạc lá 15

2.4.1 Cơ sở di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa 15

2.4.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng bệnh bạc lá 19

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 22

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 22

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 22

3.2 Nội dung nghiên cứu 23

3.3 Phương pháp nghiên cứu 23

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng 23

3.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản 23

3.3.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 24

3.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng 28

PHẦN IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

4.1 Kết quả đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá 31

4.1.1 Kết quả lây nhiễm nhân tạo 31

4.1.2 Kết quả PCR kiểm tra gen kháng bạc lá 34

4.1.3 So sánh kết quả PCR với kết quả lây nhiễm nhân tạo 37

4.2 Kết quả đánh giá chất lượng 40

4.2.1 Kết quả chất lượng thương trường của gạo 40

4.2.2 Kết quả đánh giá mùi thơm và khả năng mang gen mùi thơm 44

4.3 Kết quả đánh giá các tính trạng nông sinh học 47

4.3.1 Thời gian sinh trưởng 47

4.3.2 Chiều cao cây 49

4.3.3 Khả năng đẻ nhánh, tỉ lệ nhánh hữu hiệu 50

4.3.4 Đặc điểm hình thái của lá đòng 52

4.3.5 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 53

4.3.6 Đặc điểm chiều dài bông 56

4.3.7 Đặc điểm hình thái hạt 56

4.4 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu 58

4.4.1 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu kháng bệnh bạc lá 58

4.2.2 Kết quả chọn lọc nguồn vật liệu chất lượng tốt 59

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 63

5.1 Kết luận 63

5.2 Đề nghị 64

TÀI LIỆU THAM KHẢO 63

PHỤ LỤC 63

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

- BAC Bacterial Artificial Chromosome - nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn

- BAD2 Enzyme betaine aldehyde dehydrogenase 2

- EAP External antisense primer - mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr

- ESP External sense primer- mồi ngoại biên của cặp mồi phát hiện gen fgr

- GBSS Grainule bound starch synthase - enzyme tổng hợp amylose

- IFAP Internal fragrant antisense primer - mồi nội biên của cặp mồi phát hiện

gen fgr.

- INSP Internal non-fragrant sense primer- mồi nội biên của cặp mồi phát hiện

gen fgr.

- IRRI International Rice Research Institute - Viện nghiên cứu lúa quốc tế

- KDML Giống lúa Khao Dawk Mali

- NST Nhiễm sắc thế

- PCR Polymerase chain reaction - phản ứng chuỗi trùng hợp, kĩ thuật chỉ thị

phân tử nhằm nhân một đoạn DNA đã biết trước trình tự

- RFLP Restriction fragment length polymorphism - sự đa hình về chiều dài của

những đoạn cắt giới hạn

- SNPs Single nucleotide polymorphisms - hiện tượng đa hình đơn nucleotide

- SS Starch synthase - enzyme tổng hợp tinh bột

- SSRs simple sequence repeats - kỹ thuật chỉ thị phân tử nhằm nhân hoặc lai

các đoạn lặp DNA lặp đi lặp lại trong genome

DANH MỤC BẢNG

Bảng 1 Phản ứng của các dòng đẳng gen với các chủng vi khuẩn 31

Bảng 2 So sánh kết quả xác định gen kháng bằng PCR và kết quả lây nhiễm nhân tạo của các mẫu giống 37

Bảng 3 Chất lượng xay xát của gạo 40

Bảng 4 Kích thước hạt gạo 41

Bảng 5 Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm 43

Bảng 6 So sánh kết quả đánh giá mùi thơm bằng phương pháp sử dụng KOH 1,7% và kết quả kiểm tra gen fgr bằng phương pháp PCR 46

Bảng 7 Thời gian sinh trưởng của các mẫu giống 48

Bảng 8 Chiều cao cây của các mẫu giống 50

Bảng 9 Số nhánh tối đa, số nhánh hữu hiệu, tỷ lệ nhánh hữu hiệu 51

Bảng 10 Chiều dài và chiều rộng lá đòng 52

Bảng 11 Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất 53

Bảng 12 Chiều dài bông lúa 56

Bảng 13 Chiều dài, chiều rộng hạt thóc và tỷ lệ Dài/Rộng 57

Bảng 14 Đặc điểm của 6 mẫu giống kháng bạc lá được chọn 58

Bảng 15 Đặc điểm của 3 mẫu giống chất lượng tốt được chọn 59

DANH MỤC HÌNH

Hình 1 Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu của Bradburry

và cộng sự (2005) 8

Hình 2 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IR24 32

Hình 3 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB4 32

Hình 4 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB5 33

Hình 5 Kết quả lây nhiễm nhân tạo trên đối chứng IRBB7 33

Hình 6 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa4, sử dụng cặp mồi MP2 35

Hình 7 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen Xa7, sử dụng cặp mồi P3 36

Hình 8 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556 trước cắt enzym DraI 36

Hình 9 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen xa5, sử dụng cặp mồi RG556 sau khi cắt enzym DraI 37

Hình 10 Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm của hạt gạo 44

Hình 11 Điện di sản phẩm PCR xác định mẫu giống mang gen fgr 45

TÓM TẮT

Để đảm bảo an ninh lương thực thì việc chọn tạo giống lúa có năng suất cao

là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, chỉ nâng cao năng suất là chưa đủ, nhu cầu vềgiống lúa hiện nay phải là những giống hội tụ đủ 3 yếu tố năng suất cao, chất lượngtốt và kháng sâu bệnh hiệu quả Muốn chọn tạo giống lúa năng suất cao, chất lượngtốt và kháng sâu bệnh thành công thì nguồn gen đóng vai trò rất quan trọng Trongnghiên cứu này, chúng tôi khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tậpđoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử DNA

Chúng tôi tiến hành khảo sát, đánh giá các đặc điểm nông sinh học, các chỉ

tiêu chất lượng, gen mùi thơm, gen kháng bệnh bạc lá Xa4, xa5, Xa7 Từ đó tuyển

chọn một số mẫu giống triển vọng để khảo nghiệm và những mẫu giống có phẩmchất tốt, khả năng kháng bạc lá và năng suất cao Sử dụng chỉ thị MP2 phát hiện gen

kháng Xa4, chỉ thị RG556 phát hiện gen kháng xa5, chỉ thị P3 phát hiện gen kháng Xa7, dùng cặp mồi ESP và IFAP phát hiện gen thơm fgr.

Kết quả đã phát hiện được 21 mẫu giống chứa gen Xa4, 6 mẫu giống chứa gen xa5, 23 mẫu giống chứa gen Xa7 và 5 mẫu giống chứa gen thơm fgr Lây nhiễm

nhân tạo cho thấy kết quả PCR là chính xác Kết quả đánh giá chất lượng và đặcđiểm nông sinh học của các mẫu giống thấy các giống lúa địa phương vô cùng đadạng và phong phú Từ đó tuyển chọn được 9 mẫu giống tương đối tốt, trong đó có

6 mẫu giống vừa có khả năng kháng bệnh vừa có tiềm năng cho năng suất cao và 3mẫu giống có chất lượng tốt, có tiềm năng năng suất

Việt Nam là một trong những trung tâm khởi nguyên của cây lúa nên quỹgen lúa vô cùng phong phú Đặc biệt ở nước ta cũng tồn tại rất nhiều giống lúa nếpđịa phương mang gen kháng bạc lá, có những tính trạng nông sinh học quý làm vậtliệu cho công tác chọn tạo giống Thế nhưng ngày nay, do sức ép của sự gia tăngdân số, cùng với quá trình hội nhập, và cũng do tập quán canh tác cũng thay đổi…

đã dẫn đến nguồn gen lúa địa phương đang có nguy cơ bị mất dần Chính vì vậyviệc thu thập, bảo tồn các giống lúa địa phương làm vật liệu cho chọn giống là rấtcần thiết hiện nay

Hàng năm năng suất lúa liên tục tăng nhưng vẫn không đáp ứng đủ nhu cầu

do dân số tăng nhanh Vì vậy, để đảm bảo an ninh lương thực thì việc chọn tạogiống lúa có năng suất cao là vô cùng quan trọng Tuy nhiên, chỉ nâng cao năngsuất là chưa đủ, nhu cầu về giống lúa hiện nay phải là những giống hội đủ 3 yếu tốnăng suất cao, chất lượng tốt và kháng sâu bệnh hiệu quả

Vì vậy, đánh giá khách quan, chính xác và chi tiết các đặc điểm của nguồngen là việc làm rất cần thiết, từ đó nhà chọn giống có hướng để chọn tạo giống mớithành công sau này

Muốn biết được khả năng kháng bệnh của một giống, theo phương phápthông thường, người ta tiến hành đánh giá bệnh trong điều kiện tự nhiên và lâynhiễm nhân tạo bằng phương pháp cắt đầu lá Sau đó, chờ khi lúa biểu hiện bệnh sẽtiến hành đánh giá dựa trên phổ kháng nhiễm của các dòng đẳng gen Tuy nhiên,

phương pháp này có nhiều nhược điểm: mất nhiều thời gian, tốn công sức và kếtquả đôi khi không chính xác do chịu tác động của điều kiện ngoại cảnh.

Trước đây để đánh giá mùi thơm của lúa thì người ta tiến hành ngửi mẫu láhoặc mẫu gạo bằng phương pháp hóa học Phương pháp này cũng có nhược điểm tốnnhiều công sức và kết quả cũng kém chính xác do dựa vào cảm quan của từng người

Hiện nay, với sự phát triển của các kỹ thuật chỉ thị phân tử DNA đặc biệt là

kỹ thuật PCR thì việc tìm và phát hiện một đoạn DNA liên quan đếm một tính trạngnào đó trở nên đơn giản và chính xác Có thể đánh giá ngay ở giai đoạn cây non tiếtkiệm được rất nhiều thời gian và công sức

Nhận biết được tầm quan trong của nguồn gen trong quá trình chọn tạo giốngcây trồng cũng như kỹ thuật PCR trong việc phát hiện gen nên được sự hướng dẫn

của PGS.TS Phan Hữu Tôn và KS Tống Văn Hải chúng tôi tiến hành đề tài: “Khảo sát chất lượng và khả năng kháng bệnh bạc lá tập đoàn các mẫu giống lúa nếp mới thu thập bằng chỉ thị phân tử”.

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

- Khảo sát các đặc điểm nông sinh học của tập đoàn giống lúa nghiên cứu

- Khảo sát, đánh giá chất lượng

- Khảo sát, đánh giá gen mùi thơm

- Khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá và khả năng mang gen kháng bạc lá

Xa4, xa5, Xa7 trong tập đoàn mẫu giống lúa nếp.

- Tuyển chọn một số mẫu giống triển vọng để khảo nghiệm và những mẫugiống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và năng suất cao

1.2.2 Yêu cầu

- Tiến hành thí nghiệm khảo sát tập đoàn giống nghiên cứu, đo, đếm, đánhgiá được một số đặc điểm nông sinh học

- Đánh giá các chỉ tiêu chất lượng

- Xác định các mẫu giống có chứa gen kháng bệnh bạc lá và gen mùi thơmbằng kỹ thuật PCR

- Tiến hành lây nhiễm nhân tạo và đánh giá khả năng kháng nhiễm của cácgiống nghiên cứu

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguồn gen lúa địa phương và vấn đề bảo quản nguồn gen cây lúa

Cây lúa được xem như là cây trồng đầu tiên trên thế giới được công bố hoànthành đọc chuỗi ký tự DNA, đó là bản đồ của mỗi gen định vị trên 12 nhiễm sắc thể

đã được xác định (Phan Hữu Tôn và cs, 2005) Với hệ gen phong phú Indica: 45

000 – 56 000 gen, Japonica 32 000 – 50 000 gen (2003), đây là nguồn vật liệu khởiđầu quan trọng để các nhà chọn giống tiến hành lai tạo giống mới

2.1.1 Đặc điểm của lúa địa phương

Các giống lúa địa phương được hình thành do quá trình chọn lọc tự nhiên vànhân tạo trong điều kiện địa phương, do vậy chúng có một số đặc điểm cơ bản, đólà: cho năng suất ổn định do thích nghi cao với điều kiện địa phương, có tính chốngchịu tốt với một số sâu bệnh nguy hiểm và điều kiện bất thuận của tự nhiên Trongquần thể các giống lúa địa phương tồn tại rất nhiều gen quý như: các gen quy địnhtính kháng bệnh, gen quy định mùi thơm… Bên cạnh đó có một số nhược điểm nhưthời gian sinh trưởng dài, năng suất chưa cao…

2.1.2 Hiện trạng và việc sử dụng nguồn gen địa phương

Nguồn gen cây trồng của Việt Nam rất phong phú Theo thống kê nước ta cótới 1810 giống ngô, 75 giống khoai lang, 33 giống đay, 114 giống lạc, 224 giốngđậu đỗ, 48 giống dâu… Là một trong những cái nôi của cây lúa nước, cả nước có

2000 giống lúa cổ truyền, trong đó có 206 giống lúa nếp Hiện vẫn còn những loàilúa hoang dại trong tự nhiên, qua quá trình chọn lọc, trồng cấy hàng nghìn đời nên

có khả năng thích nghi và chịu đựng tốt với môi trường đồng ruộng Đây thực sự làquỹ gen phong phú, đa dạng, một nguồn gen hết sức quý giá

Tháng 1 năm 2001, tập đoàn thương mại nông nghiệp, Syneta công bố việchoàn thành đọc chuỗi ký tự gennom cây lúa, một công trình mang tính hợp tác quốc

tế với khoảng 50.000 gen Bộ gennom cây lúa có 12 nhiễm sắc thể, bao gồm 430

triệu cặp base của phân tử DNA Trung bình mỗi gen có khoảng 3.000bp Nguồn genphong phú này chủ yếu tồn tại trong các giống lúa địa phương có thích nghi cao vớicác điều kiện tự nhiên nhưng còn có một số đặc điểm như: thời gian sinh trưởng dài,năng suất chưa cao…Do vậy các giống địa phương dần được thay thế bằng các giốnglúa lai có năng suất cao hơn Vấn đề đặt ra cho toàn nhân loại là phải thường xuyên tiếnhành đánh giá, thu thập và bảo quản nguồn gen, dùng các biện pháp kỹ thuật thích hợp

để lai tạo giống mới dựa trên những tính trạng tốt của các giống địa phương

IRRI đã hợp tác chính thức với Việt Nam từ năm 1975 trong chương trình thửnghiệm giống lúa quốc tế (IRTP) trước đây và nay là chương trình đánh giá nguồngen cây lúa (INGER) Trong quá trình hợp tác, Việt Nam đã nhận được 279 tập đoànlúa gồm hàng ngàn mẫu giống mang nhiều đặc điểm nông sinh học tốt, năng suất cao,chất lương tốt, chống chịu sâu bệnh và điều kiện ngoại cảnh bất thuận

Việt Nam đã tiến hành công tác bảo tồn nguồn gen từ những năm 1987, kếtquả đã bảo tồn và lưu giữ được trên 13.500 giống thực vật tại Trung tâm tài nguyênthực vật (Lưu Ngọc Trình, 2000), trên 450 giống lúa có khả năng chịu hạn, chịu úngngập và chống chịu sâu bệnh tốt (Trần Duy Quý, 2000), trên 480 giống cây ăn quả

và rau (Vũ Mạnh Hải, 2000)

2.1.3 Các hướng sử dụng nguồn gen lúa địa phương

Bằng nhiều phương pháp khác nhau và tùy vào từng điều kiện cụ thể, người

ta có nhiều cách để sử dụng nguồn gen địa phương làm sao để đạt kết quả tốt nhất

- Dùng phương pháp chọn lọc trực tiếp: Từ quần thể địa phương, các nhàkhoa học tiến hành chọn lọc trực tiếp bằng cách chọn những cá thể tốt nhất với kiểusinh thái địa lý và gây thành giống mới Ví dụ: Mộc tuyền được chọn từ giống MộcKhâm (Nguyễn Văn Hiển và cs, 2002)

- Dùng trong các tổ hợp lai: Các nhà khoa học sử dụng các giống lúa địaphương có thương phẩm tốt như chống chịu sâu bệnh, chống chịu tốt với điều kiệnngoại cảnh, mang gen mùi thơm để lai với các giống khác có tình trạng bổ sungnhư: như thời gian sinh trưởng ngắn, năng suất cao nhằm tạo giống mới

- Dùng phương pháp gây đột biến: Các giống lúa địa phương mang tính trạng

quý nhưng còn có nhược điểm được sử dụng làm vật liệu gây đột biến nhằm cải tiếntính trạng mong muốn Ví dụ: đã gây đột biến tạo dòng nếp cải hoa vàng vừa manggen mùi thơm, vừa cấy được cả hai vụ, khắc phục được nhược điểm phản ứng vớiánh sáng ngày ngắn, dễ đổ…

2.2 Nghiên cứu về chất lượng gạo

2.2.1 Nghiên cứu về tính trạng mùi thơm

2.2.1.1 Bản chất hóa học của mùi thơm

Mùi thơm của lúa là kết quả tạo thành bởi một loạt các hợp chất hóa học khácnhau (Widjaja và cộng sự, 1996) Bullard và Holguin, 1977, đã sử dụng phương phápsắc ký khí để xác định thành phần hóa học tạo nên mùi thơm Họ thu được 70 chất vàxác định chính xác được 30 chất trong số đó, nhưng theo quan điểm của họ thì không

có một thành phần rõ ràng nào quy định tính thơm của gạo (Darrell và cs, 2000)

Buttery và cộng sự, năm 1983, đã chỉ ra rằng 2-acetyl-1- pyrroline (2-AP),một chất dễ bay hơi, chính là thành phần chính tạo nên mùi thơm của lúa 2-AP xuấthiện trên tất cả các bộ phận của cây (thân, lá và hạt) ngoại trừ phần rễ (Buttery và

cs, 1983; Lorieux và cs, 1996; Yoshihashi và cs, 2002) 2-AP không hình thànhtrong quá trình thu hoạch và nấu chín mà hình thành trong quá trình sinh trưởng củacây Chính vì vậy mà mùi thơm của lúa có thể được xác định trên cả hạt và mô lá(Yoshiyashi và cs, 2002; Nguyen Loc Hien và cs, 2006) Kỹ thuật thu hoạch và bảoquản cũng ảnh hưởng đến lượng 2-acetyl-pyroline, từ đó ảnh hưởng đến mùi thơmcủa gạo (Goodwin và cs, 1994)

2.2.1.2 Di truyền của tính trạng mùi thơm

Cho đến nay, rất nhiều quan điểm khác nhau về di truyền tính trạng mùi thơm

đã được đưa ra, như là: Jodon, 1944, cho rằng tính trạng mùi thơm do 1 gen trội quyđịnh, nhưng trước đó Kandam và Paatanka, 1938, lại cho rằng tính trạng này do 2gen quy định Nagaraju, 1975, đưa ra quan điểm là có 3 gen tham gia quy định tínhtrạng mùi thơm Dhulappanavar, 1976, kết luận rằng tính trạng mùi thơm do 4 genquy định

Tuy nhiên, phần lớn các nghiên cứu đều kết luận rằng tính trạng mùi thơm của

lúa do 1 gen quy định (Sood và Siddiq,1980; Shekhar và Reddy, 1981; Berner vàHoff, 1986; Bollich và cs, 1992; Ali và cs, 1993; Li và Gu, 1997; Sadhukhan và cs,1997) Berner và Hoff , 1986, kết luận rằng 1 gen trội quy định tính trạng mùi thơmcủa lúa và gợi ý phương pháp xác định mùi thơm của hạt bằng cách nếm thử mộtnửa hạt gạo đồng thời giữ lại một nửa hạt có chứa phôi Li và Gu, 1997, nghiên cứu

về di truyền và vị trí của gen quy định mùi thơm trên giống lúa Shenxiangjing vàphát hiện ra mùi thơm được điều khiển bởi 1 gen lặn Ngoài ra, từ kết quả lai thuậnnghịch giữa các giống lúa thơm, họ cũng đi đến kết luận rằng gen quy định mùithơm di truyền đa allen Tiến hành lai chéo WX (một giống lúa thơm) với các dòngtam bội có nguồn gốc từ IR36 và WJ (cũng là một giống lúa thơm), Li và Gu kếtluận gen quy định mùi thơm nằm trên nhiễm sắc thể số 8 Trước đó, sử dụng kỹthuật RFLP, Ahn và cs, 1992, cũng đã định vị được gen này trên nhiễm sắc thể số 8(R.K Singh và cs, 2000)

Kato và Itani, 1996, tiến hành nghiên cứu về sự liên quan di truyền của mùithơm và các tính trạng nông sinh học khác bằng cách nghiên cứu trên các tổ hợpcủa thế hệ F8 bằng phương pháp chọn lọc một hạt của tổ hợp lai giữa BGT xKoshihiraki Sau khi so sánh sự khác biệt của các cặp tính trạng giữa nhóm có mùithơm và nhóm không có mùi thơm, họ đưa ra kết luận gen quy định mùi thơm ditruyền hoàn toàn độc lập

Khush và Dela Cruz, 1998, đã nhấn mạnh trong các nghiên cứu của họ là tínhtrạng mùi thơm của lúa là một tính trạng số lượng với một dãy biến dị rộng

L Bradbury và cs, 2005, đã công bố một nghiên cứu về vị trí, cấu trúc và cơ

chế của gen fgr quy định tính trạng mùi thơm của lúa Trong nghiên cứu này,

Bradburry và cộng sự đã phát hiện 8 đột biến mất đoạn và 3 SNPs trên exon củagene mã hóa tổng hợp betaine aldehyde dehydrogenase 2 (BAD2) chính là nguyênnhân hình thành tính thơm trên các giống luá thơm Basmati (Louis M T Bradbury

và cs, 2005) Các giống lúa không thơm sẽ có bản gen mã hóa BAD2 đầy đủ, trongkhi các giống lúa thơm sẽ có bản gen mã hóa BAD2 chứa đột biến mất đoạn và cácSNPs Hậu quả của sự thay đổi cấu trúc này sinh ra một mã dừng làm mất tác dụng

của enzyme BAD2 Ngoài ra, các tác giả đã sử dụng các Bacterial Artificial

Chromosome (nhiễm sắc thể nhân tạo của vi khuẩn) để kiểm tra vị trí của gen fgr và

đã phát hiện được vị trí chính xác của gen này trên NST 8

Kết quả của nghiên cứu này đã được công nhận rộng rãi và được sử dụng trongrất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử trong chọn tạo các giống lúa thơm

2.2.1.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu mùi thơm của gạo

Đến nay, nhiều chỉ thị phân tử như SNPs (single nucleotide polymorphisms)hay SSRs (simple sequence repeats) có liên kết với tính thơm đã được áp dụngtrong chọn lọc giống lúa thơm (Cordeiro và cs, 2002)

Ahn và cs, 1992, đưa ra một chỉ thị phân tử kí hiệu là RG28 nằm trên nhiễm

sắc thể số 8 có liên kết gần với gen thơm (fgr) Họ cũng gợi ý rằng chỉ thị phân tử

này có thể áp dụng để dự đoán sớm sự có mặt của mùi thơm trên một giống lúa,đồng thời có thể phân biệt được tính trạng đồng hợp hay dị hợp thể của gen thơm vàchỉ thị này rất hữu dụng trong việc phát hiện nhanh tính trạng thơm trong các dònglai (Ahn và cs, 1993) Sau đó, đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau với mục đíchnghiên cứu sâu hơn về hoặc ứng dụng chỉ thị này trong công tác chọn tạo giống lúathơm Nghiên cứu của Li và cs, 1996, với kết luận tính trạng mùi thơm do 1 gen lặnnằm trên NST số 8 đã củng cố thêm quan điểm RG28 là một chỉ thị đặc hiệu chogen thơm Pandey và cs, 1994, 1995, nghiên cứu về liên kết giữa RG28 và thơmbằng cách nghiên cứu tổ hợp lai chéo giữa Pusa 751 (có mùi thơm) X IR72 (khôngthơm) đã đưa ra kết luận RG28 có khoảng cách là 10cM với gen thơm thay vì4,5cM như kết luận của Ahn (Pandey và cs, 1994, 1995)

Các cặp mồi thiết kế từ RG28 đã được ứng dụng rộng rãi trong việc phát hiệnnhanh lúa thơm (Lang và Buu, 2002; Cordeido và cs, 2002; Jin và cs, 2003) Tuynhiên nhược điểm lớn nhất của các mồi này là chúng chỉ liên kết với gen thơm ởmột mức độ nào đó nên không thể chính xác đến 100% (Garland và cs, 2000; Hien

và cs, 2005; Louis M T Bradbury và cs, 2005)

L Bradbury và cộng sự, 2005, nghiên cứu về cấu trúc và cơ chế hình thànhcủa gen thơm chính là cơ sở để thiết kế một loại mồi thật sự hoàn hảo cho việc xácđịnh mùi thơm trên lúa Dựa trên cấu trúc phân tử của gen quy định tính trạng mùi

thơm, một bộ mồi đã được thiết kế, gồm 2 cặp mồi cùng nhân lên trên 1 vùng củaDNA mục tiêu, trong đó 1 cặp mồi này lại nhân 1 đoạn nằm trong đoạn nhân củacặp mồi kia

Bộ 4 mồi này gồm có: 1 cặp mồi nhân không đặc hiệu nhân lên đoạn nằmngoài khu vực xuất hiện đột biến trong cả trường hợp thơm và không thơm và 1 cặpmồi còn lại phân biệt 2 allen của gen thơm

Hai mồi ngoại biên đóng vai trò như một nhân tố kiểm soát dương tính, nhânlên một đoạn khoảng 580bp nằm trên cả kiểu gen thơm (577bp) và kiểu gen khôngthơm (585bp) Từng chiếc riêng lẻ của cặp mồi nội biên (kí hiệu ESP và EAP) bắtcặp với các mồi ngoại biên (kí hiệu IFAP và INSP) để tạo ra các sản phẩm đặctrưng cho kiểu gen

Với mồi này, phản ứng PCR sẽ tạo được 4 đoạn nhân như sau: 1 đoạn 580bp

sẽ xuất hiện ở cả hai trường hợp thơm và không thơm, 1 đoạn 355bp xuất hiện ở

trường hợp đồng hợp thể trội Fgr/Fgr (không thơm), một đoạn 257bp xuất hiện ở trường hợp đồng hợp thể lặn fgr/fgr (thơm) và đối với trường hợp dị hợp thể Fgr/fgr

(không thơm) sẽ xuất hiện đồng thời cả 2 đoạn 355bp và 257bp

Bộ 4 mồi này có tính chính xác tới 100% do chúng được thiết kế từ trình tựcủa chính gen mã hóa tổng hợp BAD2 (Robert Henr và Daniel Waters, 2006; WakilAhmad Sarhadi và cs, 2008)

Hoạt động của bộ 4 mồi được minh họa ở hình dưới:

Hình 1 Hoạt động của bộ 4 mồi được mô tả trong nghiên cứu của Bradburry

và cộng sự (2005).

2.2.2 Nhiệt độ hóa hồ và độ phá hủy kiềm

Nhiệt độ hóa hồ (rice starch geltinization temperature) là một thành phần quantrọng của chất lượng gạo do nó có liên quan chặt chẽ đến thời gian nấu chín và chấtlượng của cơm (Maningat và cs, 1978)

Những nghiên cứu về bản chất phân tử của gen đã xác định rằng gen chính

quy định độ bền gel và độ phá hủy kiềm đều nằm gần locus Wx trên NST6

(Umemotoet và cs, 2002; Gao và cs, 2003) Gen quy định độ phá hủy kiềm đượcchứng minh là mã hóa enzyme phân hủy tinh bột SSIIa (starch-solublesynthaseisoform), và một sự khác biệt về 1 cặp base chính là nguyên nhân của sựkhác biệt về độ phá hủy kiềm của 2 nhóm Japonica và Indica (Gao và cs, 2003;Nakamura và cs, 2005) Cho đến nay, người ta vẫn chưa xác định được có baonhiêu alen của gen này tồn tại trên các giống lúa trồng Umemoto và cs, 2004, đãphân biệt được 4 alen của gen mã hóa SSIIa, tuy nhiên các alen này lại không cónhiệt độ hóa hồ đặc trưng Trong nghiên cứu về bản chất phân tử của gen quy địnhnhiệt độ hóa hồ, Umemoto phát hiện ra sự khác biệt về cấu trúc phân tử của cácgiống lúa có nhiệt hóa hồ khác nhau, theo đó trên exon 8 có 3 đột biến gồm có base

A thành G (dẫn đến acid amin methionin-ATG thành valine-GTG), GC thành TT(dẫn đến leucine-CTC thành phenylalanine-TTC) và một SNPs (A/G) Khảo sát trêncác mẫu giống lúa trồng, Umenmoto phát hiện có 4 dạng alen tồn tại là G/G/GC,A/G/GC, A/A/GC và A/G/TT Tiếp tục so sánh về nhiệt hóa hồ giữa các dạng, họđưa ra kết luận dạng G/GC có nhiệt hóa hồ cao, 2 dạng A/GC và G/TT có nhiệt hóa

hồ thấp (Umemoto và cs, 2004) Từ kết quả nghiên cứu này một số chỉ thị phân tử

đã được thiết kế và ứng dụng trong các chương trình chọn tạo giống chất lượng cao(R.K Singh và cs, 2000 )

2.2.3 Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt

Chiều dài, chiều rộng và tỉ lệ dài/rộng của hạt gạo là những đặc tính quantrọng nhất là đối với các giống lúa chất lượng Gạo được phân loại theo mục đíchthương mại thành dạng hạt ngắn, hạt vừa, hạt dài và hạt thon Tuy nhiên, trên thịtrường dạng gạo thon dài là được ưa chuộng nhất

Phần lớn các nghiên cứu đều kết luận rằng chiều dài chiều rộng của hạt chịu

tác động tổng hợp của nhiều gen Hsieh và Wang, 1986, kết luận chiều dài của hạt

di truyền đa gen, được điều khiển bởi gen đa allen kí hiệu là Gl và mức độ trội của các alen theo thứ tự Gl1>Gl2>gl, dạng hạt tròn trội so với dạng hạt dài và hình

dạng hạt cũng do gen 3 allen Gs quy định Rao và Sang, 1989, đưa ra kết luận chiềudài và chiều rộng của hạt gạo di truyền hoàn toàn độc lập, chịu sự điều khiển củacác gen khác nhau (R.K Singh và cs, 2000 )

Takeda, 1984, nghiên cứu di truyền kích thước hạt trên giống lúa Fusayoshicủa Nhật Bản và cho rằng tính trạng này do đa gen quy định và có một gen trội

không hoàn toàn kí hiệu là Lk-f là gen chính

Sau đó, trong nghiên cứu bằng phương pháp phân tích quần thể phân liTakeda và Saito, 1994, đã phát hiện ra chiều dài hạt được điều khiển bởi một gen

lặn kí hiệu lk-I (Phạm Văn Phượng, 2006)

2.3 Nghiên cứu về bệnh bạc lá

2.3.1 Tác hại của bệnh

Bệnh bạc lá được phát hiện lần đầu tiên ở Nhật Bản vào khoảng năm

1884-1885 Bệnh phổ biến ở hầu hết các nước trồng lúa trên Thế giới đặc biệt là Châu Á(Nhật Bản, Trung Quốc, Philippin, Ấn Độ ) Đã có rất nhiều những ghi nhận vềthiệt hại do bệnh gây ra Theo Mew và cs, 1987, bệnh gây hại tới 60% năng suất hạtmỗi năm (Mew T.W, 1987)

Ở nước ta bệnh này đã gây hại từ lâu trên các giống lúa mùa cũ, đặc biệt là từnăm 1965- 1966 tới nay, bệnh phá hại một cách nghiêm trọng ở các vùng đồng bằngtrên các giống lúa mới nhập nội có năng suất cao ở vụ xuân và nhất là trong vụ mùa.Theo báo cáo tổng kết của một số kết quả nghiên cứu lúa lai thì có những năm nước

ta có khoảng hơn 350 000 ha lúa bị nhiễm nặng ở vụ mùa và cả vụ xuân, trong đóhàng trăm ha bị mất trắng như vụ mùa năm 2002 ở Đan Phượng, Phú Xuyên, BắcNinh, Ninh Bình.Cũng theo số liệu năm 2004 trên tạp chí BVTV số 03, bệnh bạc láxuất hiện ở tỉnh Hà Nam, Hải Phòng, Phú Thọ, Điện Biên, Bắc Giang, Nghệ An,Thanh Hóa với tổng diện tích là 3770 ha, trong đó diện tích nhiễm nặng là 560 ha.Tỉ

lệ bệnh phổ biến là 8- 20% số lá, nơi cao là 50-70% số lá

Mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào giống, thời kỳ nhiễm của cây sớmhay muộn và mức độ nặng hay nhẹ Năm 1970 trên diện tích lúa mùa cấy giốngNN8 bị bệnh ở mức độ 60- 100%, giảm năng suất từ 30- 60% Theo báo cáo củaphòng bệnh cây Viện Bảo Vệ Thực Vật, 1970, thì tác hại của bệnh ngày càng lớnkhi mức độ bị bệnh càng nặng (PGS.TS.Tạ Minh Sơn, 1996).

Điều cần chú ý là mức độ tác hại của bệnh phụ thuộc vào thời kỳ kí bệnh.Nếu cây lúa bị bệnh ngay từ khi đẻ nhánh thì mức độ bị bệnh về sau thường rấtnặng, ảnh hưởng rõ rệt hơn tới năng suất, có thể làm giảm 41% trở lên, nếu bệnh bắtđầu từ thời kỳ làm đòng trở lên thì tác hại có thể vẫn còn lớn, trung bình làm giảmnăng suất của cây lúa khoảng 30% Nhưng đến thời kỳ cuối (chín sữa – chín chắc)mới bị bệnh mức độ tác hại ít hơn, dưới 10% (Lê Lương Tề, 1980)

Tác hại chủ yếu của bệnh làm lá úa, đặc biệt là lá đòng sớm tàn, nhanhchóng bị khô chết, bộ lá úa xơ xác ảnh hưởng tới hiệu quả quang hợp tích luỹ chấtkhô, dẫn đến giảm khối lượng 1000 hạt, tỉ lệ lép cao, năng suất sút kém

Thông thường ranh giới mô bệnh với mô khỏe trên phiến lá rất rõ rệt, cógiới hạn theo đường gợn sóng vàng hoặc không vàng, có khi có một đường chỉ viềnmàu nâu xẫm, đứt quãng hay không đứt quãng

Trong điều kiện ẩm, nhiệt độ tương đối cao thì trên vết bệnh xuất hiệnnhững giọt dịch vi khuẩn hình tròn, nhỏ, keo đặc lại có màu hơi vàng đục, khi rắn

cứng có màu nâu hổ phách, màu mật ong (GS.TS Vũ Triệu Mân, PGS.TS LêLương Tề, 2001).

2.3.3 Nguyên nhân gây bệnh

Nguyên nhân gây ra bệnh là do vi khuẩn xanthomonas oryzae p.v oryzae Trước đây vi khuẩn này còn được gọi với nhiều tên khác: Bacillus oryzae hori et Bokura (Bokura, 1911), Pseudomonas oryzae uyeda et ishiyama(ishiyama, 1922), Xanthomonas campestris p.v oryzae.

Vi khuẩn hình gậy 2 đầu hơi tròn, có lông roi ở một đầu, kích thước 1-2 ×0,5- 0,9 µm Khuẩn lạc có dạng hình tròn, màu vàng sáp, rìa nhẵn, bề mặt ướt, háokhí, nhuộm gram âm, không có khả năng khử NO3, không dịch hoá gelatin, khôngtạo NH3, Indol, có khả năng tạo H2S

Nhiệt độ thích hợp nhất cho vi khuẩn sinh trưởng là 26 - 300C nhiệt độ tốithiểu 0 - 5 0C, tối đa 400C Nhiệt độ gây chết là 530C trong 10 phút, có thể sốngtrong phạm vi PH ( 5.7 - 8.5), thích hợp nhất PH (6.8 -7.2)

Vi khuẩn xâm nhiễm một cách thụ động qua thuỷ khổng, lỗ khí ở trên mút

lá, mép lá và đặc biệt qua vết thương sây sát trên lá Khi đã tiếp xúc với bề mặt lá

có màng nước ướt, vi khuẩn dễ dàng di động tiến vào bên trong các lỗ khí, qua vếtthương mà sinh sản nhân lên về số lượng, qua các bó mạch dẫn lan rộng đi Trongđiều kiện mưa ẩm thuận lợi cho việc phát triển của vi khuẩn, trên bề mặt lá bệnh tiết

ra những giọt keo vi khuẩn, thông qua sự va chạm giữa các lá lúa nhờ mưa gió màtruyền lan tới lá, cây khác để tiến hành xâm nhiễm lặp lại nhiều đợt trong thời kỳsinh trưởng Cho nên tuy là một loại bệnh có cự ly truyền nhiễm lây lan hẹp songvới phạm vi không gian khá rộng, giọt keo vi khuẩn hình thành với số lượng nhiều,

đó chính là một trong những nguyên nhân quan trọng làm bệnh phát triển mạnh saunhững đợt mưa gió vào cuối vụ xuân và trong suốt vụ mùa ở nước ta

Ở nước ta phát hiện thấy vi khuẩn hại trên lúa và trên các ký chủ cỏ dại, cỏmôi, cỏ lồng vực, cỏ gừng bò Ở Nhật Bản có một số cỏ dại thuộc họ hoà thảo (

leersia oryzoides và leersia sayanaka) là ký chủ phụ của vi khuẩn bạc lá lúa, cho

nên ở đây cỏ dại là nguồn dự trữ bệnh qua đông rất quan trọng Mặt khác đất và

nước ruộng cũng là một phần dự trữ bệnh ban đầu Ở Trung Quốc những công trìnhnghiên cứu của Phương Trung Đạt khẳng định nguồn bệnh chủ yếu là ở hạt giống(GS.TS Vũ Triệu Mân, PGS.TS Lê Lương Tề, 2001).

2.3.4 Đặc điểm phát sinh phát triển bệnh bạc lá

Xét về từng điều kiện riêng biệt thì bệnh phát sinh phát triển mạnh truyềnlan nhanh trong điều kiện nhiệt độ tương đối cao 26 - 300C, ẩm độ cao từ 90% trởlên Sự biến động nhiệt độ quá lớn cũng không thuận lợi cho bệnh phát triển nhanh.Trong suốt thời gian mà nhiệt độ thích hợp cho sự phát triển của bệnh thì độ ẩmcao, lượng mưa lớn, rải đều liên tiếp sẽ là yếu tố có ý nghĩa quyết định mức độ bệnhnặng hay nhẹ Nhìn chung ở Miền Bắc nước ta, bệnh bạc lá có thể phát sinh, pháttriển trong các mùa vụ, vào vụ chiêm xuân, bệnh thường phát sinh trong tháng 3- 4

và phát triển mạnh vào tháng 5 – 6, vụ mùa phát triển mạnh tháng 8 - 9 Những đợtmưa to gió lớn thường xảy ra trong tháng 8 – 9 không những có tác động gây nênvết thương cọ xát trên lá mà còn tạo điều kiện cho vi khuẩn sinh sản mạnh, số lượngdịch vi khuẩn tiết ra nhiều trên lá, làm cho vi khuẩn xâm nhiễm dễ dàng, khôngnhững thế nó còn là yếu tố trực tiếp giúp bệnh lan truyền đi nhanh và xa cùng với

sự tác động của nước chảy trên các cánh đồng (GS.TS Vũ Triệu Mân, PGS.TS LêLương Tề, 2001)

Ảnh hưởng của kỹ thuật trồng trọt đối với sự phát sinh phát triển của bệnhcũng tương đối phức tạp Một mặt ảnh hưởng trực tiếp tới tình hình sinh trưởng làmtăng hay giảm sức chống chịu bệnh, mặt khác cũng làm ảnh hưởng tới tiểu khí hậucủa ruộng Những vùng đất màu mỡ, chứa nhiều chất hữu cơ làm bệnh thường pháttriển nhiều hơn ở những chân đất xấu, bón ít phân, lúa cằn cỗi Trong các yếu tố kỹthuật thì phân bón nhất là phân đạm vô cơ có ảnh hưởng rất rõ rệt đến mức độ phátsinh của bệnh Các dạng đạm vô cơ dễ làm cây lúa nhiễm bệnh mạnh hơn các dạngđạm hữu cơ Trong phân hữu cơ thì phân xanh (điền thanh, bèo hoa dâu, lạc) bónvùi trong ruộng dễ làm cây lúa bị bệnh nặng hơn khi bón phân chuồng ủ hoai mục(Mai Văn Quyền, 1970)

Bón đạm cân đối với lân và kali thì bệnh nhẹ hơn nhiều so với bón đạm đơn

thuần, tuy nhiên nếu bón đạm vô cơ với lượng quá cao 100N/ha hoặc 120N/ha trở lênđối với các giống lúa nhiễm thì dù có bón thêm lân và kali về sau tác dụng cũngkhông rõ rệt, bệnh vẫn có thể phát triển nặng Tác dụng của kali thường chỉ có ýnghĩa hạn chế rõ rệt trong điều kiện bón đạm vừa phải vì vậy mức bón đạm và bónđạm cân đối với kali ngay từ ban đầu có ý nghĩa quan trọng trong việc phòng ngừabệnh và hạn chế tác hại của bệnh (Mai Văn Quyền, 1970).

Trong điều kiện đất chua, úng, ngập nước hoặc mực nước sâu đặc biệt là ởvùng đất hầu mùn, hàng lúa bị bóng cây ven đường che bóng thì bệnh có thể pháttriển sớm và mạnh hơn Mực nước ruộng ngập sâu, cây dễ bị bệnh nặng (khi giữ ởmực nước 5cm) Kozaka và Soto cũng cho rằng vi khuẩn xâm nhiễm dễ dàng hơntrong điều kiện ruộng ngập nước

Giống cũng là một yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh phát triển của bệnhbạc lá Các giống thuần và lúa lai có nguồn gốc từ Trung Quốc được trồng ở nhiềuvùng hiện nay đều nhiễm bệnh bạc lá rất nghiêm trọng, các giống lúa cũ, lúa địaphương nói chung không có giống nào miễn dịch với bệnh bạc lá, nhưng mức độkháng bệnh có khác nhau Phần lớn các giống lúa mới, thấp cây hoặc cao cây, lá tobản, thời gian sinh trưởng dài hay ngắn đều có thể bị bệnh

Theo PGS.TS Tạ Minh Sơn, vụ đông xuân 1997 sau đợt mùa đông bệnhphát sinh mạnh, tỉ lệ TB là 20%, nơi cao là 70 - 90% chủ yếu trên các giống lúa laiTrung Quốc (PGS.TS.Tạ Minh Sơn, 1996)

Tuy nhiên mức độ bị bệnh của các giống cũng như mức độ tác hại của bệnhtrên các giống có thể thay đổi tuỳ theo điều kiện địa lý và canh tác Nói chung cácgiống lúa có tính chống chịu bệnh cao thường là các giống lúa đẻ tập trung, giaiđoạn đòng – trỗ tiến hành nhanh, lá nhỏ

Đồng thời trên cơ sở các biện pháp đó trong các trường hợp cụ thể cần kết hợp làmtốt khâu xử lý hạt giống và dùng vôi, kali, phân hữu cơ, bón lót, bón thúc sớm, giữnước nông, để phòng ngừa bệnh bạc lá và các bệnh khác.

Cho đến nay thì thì biện pháp sử dụng giống kháng bệnh vẫn là biện pháphiệu quả nhất và có một ý nghĩa rất lớn

2.4 Cơ sở khoa học của chọn giống lúa kháng bạc lá

2.4.1 Cơ sở di truyền tính kháng bệnh bạc lá lúa

2.4.1.1 Nghiên cứu về chủng nòi và sự phát triển của bệnh bạc lá

Từ những kết quả của các nghiên cứu gần đây về vi khuẩn bạc lá

Xanthomonas Oryzae P.v Oryzae Cho thấy mỗi vùng, mỗi lãnh thổ lại có một số

chủng vi khuẩn bạc lá đặc trưng Sự có mặt của các chủng bạc lá phụ thuộc vào cơcấu các giống lúa và điều kiện tự nhiên của mỗi vùng: ở Philippin đã phát hiện có 6race đang tồn tại, Nhật Bản có 12 phathotype, và ở Ấn Độ có 9 type (TikaB.Adhikavr Iw Mew và cs, 1999; Tika B.Adhikari TW và cs, 1999)

Ở Việt Nam, theo kết quả nghiên cứu của một số tác giả, vào thập kỷ 90 có

4 nòi sinh lý phổ biến ở Miền Bắc, đến năm 2006 theo kết quả nghiên cứu của TSPhan Hữu Tôn trên các mẫu bệnh thu thập ở các tỉnh Miền Bắc đã phân lập được

154 Isolate và xác định được 10 chủng vi khuẩn gây bệnh khác nhau Trong đó có 2

chủng, chủng 2 và 3 là phổ biến ở vùng Đồng Bằng Sông Hồng, song những chủngcòn lại vẫn có tiềm năng gây nguy hiểm cho dù xuất hiện với tần suất thấp hơn tuynhiên chúng vẫn có khả năng gây bệnh cho các giống lúa (Phan Hữu Tôn, 2006)

Và gần đây nhất, trong chiến lược chọn tạo giống lúa kháng bệnh bạc lá ởMiền Bắc của Trường ĐH Nông Nghiệp Hà Nội dùng phương pháp thu thập mẫubệnh, ứng dụng công nghệ sinh học phân lập nuôi cấy và phân biệt gen kháng bệnh

bằng PCR đã xác định được 16 chủng vi khuẩn Xanthonas Oryzae P.v oryzae gây

bệnh khác nhau (Tạp chí KHKT, 2009)

Điều này cho thấy số lượng các chủng bạc lá ở Miền Bắc nước ta đang tănglên nhanh chóng và đa dạng hơn, vì vậy mà đòi hỏi phải tạo ra những giống lúamang nhiều gen kháng bệnh có tính kháng ngang bền vững hơn

2.4.1.2 Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá

Nghiên cứu về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá, các nhà khoa học NhậtBản là những người đi đầu trong lĩnh vực này Nisimura, 1961, đã có những nghiêncứu đầu tiên về di truyền khả năng kháng bệnh bạc lá Trong khi nghiên cứu về sựluân chuyển các giống lúa trồng ở Nhật Bản, ông đã phát hiện khả năng kháng bệnhbạc lá ở hai giống lúa trồng Kogyoku và kaganeman, được điều khiển bởi một gentrội nằm trên NST số 11 (Theo hệ thống thứ tự NST của ông)

Tiếp theo đó IRRI cũng đã tiến hành đánh giá khả năng kháng bệnh của cácgiống lúa nhiệt đới, đồng thời tiến hành nghiên cứu về bản chất di truyền của khảnăng kháng bệnh bạc lá là do gen quy định (Tsugufumi Ogawa, 1997)

Ngày nay, người ta đã xác định được 29 gen kháng bạc lá lúa ký hiệu từ Xa1đến Xa29 (Kinoshita và cs, 2005, zhang và cs.2005) Gồm có 22 gen trội và 7 gen

lặn là: xa5, xa8, xa13, xa15, xa19, xa20, xa24 (N.furuya và cs).

Các gen kháng thu thập từ nhiều nguồn khác nhau: gen kháng nguyên thuỷ

có sẵn trong các giống lúa trồng, gen kháng được tạo bởi đột biến như xa19, xa20, Xa25, hoặc các gen kháng có nguồn gốc từ các giống lúa dại như Xa21, Xa23 từ O.longistaminata (K.s lee và cs).

Tính kháng bệnh bạc lá có thể được kiểm tra bởi một gen trội, một gen lặnhoặc gen trội không hoàn toàn, hay do nhiều gen cùng liên kết quy định Tuy nhiên,

các gen kháng bạc lá dù là gen trội (Xa) hay gen lặn (xa) đều có ý nghĩa đối với

chọn giống Những gen lặn chỉ được dùng trong chương trình chọn giống lúa thuần

do chúng chỉ biểu hiện được khả năng kháng khi ở dạng đồng hợp, còn những gentrội lại có ý nghĩa đối với cả việc chọn giống lúa lai và giống lúa thuần

Tính kháng bệnh bạc lá cũng tuân theo học thuyết “gen đối gen” nghĩa làalen kháng của ký chủ chỉ hoạt động khi ký sinh mang alen không gây bệnh (NguyễnVăn Hiển và cs, 2002) Điều này đã giải thích vì sao những giống kháng bệnh rấthiệu quả ở vùng này lại bị nhiễm nặng ở vùng khác Dựa vào thuyết này, người ta đãthiết kế một bộ giống thử gồm các dòng đẳng gen mang đơn gen kháng và đa genkháng nhằm xác định các chủng nòi vi khuẩn có ở một vùng Mặt khác dựa trên các

nòi vi khuẩn đã được xác định, người ta có thể thống kê các gen kháng của một giốnghoặc xác định một gen kháng mới chưa được biết tới.

Theo các kết quả nghiên cứu của K.S Lee thì kể từ khi các giống mang gen

kháng Xa4 đầu tiên được sử dụng tại Philippin cho đến nay đã phát hiện khá nhiều chủng vi khuẩn có biểu hiện kháng với gen Xa4 (K.s Lee,2003) Như vậy, sự ra đời

của các giống lúa kháng bệnh kéo theo sự tiến hoá của các chủng vi khuẩn, làmgiảm tính bền vững của gen kháng bệnh Mục tiêu nhằm kéo dài thời gian khángbền vững của gen kháng là vô cùng quan trọng trong công tác chọn giống khángbệnh bạc lá

Theo Tika và Mew nghiên cứu về khả năng kháng bệnh trên 11 dòng đẳnggen mang 1, 2, 3 hoặc 4 gen kháng bằng cách lây nhiễm nhân tạo với 50 chủng vikhuẩn thu thập tại Nepal Kết quả cho thấy dòng nào mang nhiều gen kháng sẽ cóbiểu hiện nhiễm nhẹ hơn hẳn so với dòng chỉ mang 1 gen kháng (Tika B Adhikari

và cs, 1999) Điều này cho thấy việc tổ hợp 2 hay nhiều gen kháng vào một giốngchính là chiến lược để tăng phổ kháng cho giống và tăng độ bền của gen kháng

2.4.2 Các phương pháp chọn tạo giống kháng bệnh

Dựa trên cơ sở của tính kháng bệnh bạc lá là do gen quy định, cho đến nayphương pháp chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá phổ biến và quan trọng nhất làphương pháp lai hữu tính, thông qua phương pháp này ta có thể chuyển những gen

có khả năng kháng bệnh cao vào các giống có đặc tính nông sinh học quý thông quaBackcross Từ đó mà nhiều giống kháng bệnh đã được tạo ra Khả năng kháng bạc

lá thường do đơn gen quy định, vì vậy việc sử dụng phương pháp lai lại để chuyểngen kháng là rất hiệu quả Nguyên lý của phương pháp này là sử dụng một giốnglúa tốt nhưng không mang gen kháng cần thiết để lai lại với một giống mang genkháng hữu hiệu Sau một số lần chọn lọc và lai lại liên tục, giống mới được tạothành gần như mang toàn bộ nguồn gen tốt của cây lai lại và mang thêm được genkháng mong muốn Trong qúa trình lai lại, có thể kết hợp với tự phối, chọn lọc cácdạng phân ly để đẩy nhanh quá trình

Phương pháp lai hữu tính được tiến hành đầu tiên ở Nhật Bản từ cây lúa

chống bệnh đầu tiên được phát hiện vào năm 1926 (Jennings và cs, 1979) Đến naytrên Thế giới đã có rất nhiều nước áp dụng rộng rãi phương pháp này trên cả lúathuần và lúa lai Đặc biệt Trung Quốc là một trong những nước áp dụng rộng rãinhất phương pháp này họ đã chuyển được một số gen có khả năng chống bệnh caovào một số giống quan trọng trong quy trình sản xuất lúa lai 3 dòng Điển hình là

gen Xa21 có phổ kháng rộng đối với các nòi vi khuẩn đã được chuyển thành công

vào “Munghu63” là một dòng phục hồi được sử dụng rộng rãi trong quy trình sảnxuất lúa lai 3 dòng

Phương pháp lây nhiễm nhân tạo được sử dụng để xác định con lai có manggen kháng hay không Nhưng bằng phương pháp này đôi khi khó phân biệt được cácgen kháng khác nhau, nếu chúng cùng biểu hiện một số phổ kháng nhiễm với cácchủng vi khuẩn tương ứng Để khắc phục nhược điểm này, hiện nay phương pháp sửdụng chỉ thị phân tử PCR dựa trên các trình tự ADN liên kết chặt chẽ với gen kháng

từ đó mà có thể xác định các gen kháng dễ dàng và hiệu quả hơn Tại viện Lúa ĐồngBằng Sông Cửu Long, Bùi Chính Bửu cùng cộng sự đã sử dụng PCR để kiểm tra tổhợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với

nhiệt độ chính xác cao (Bùi Chính Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2003).

Ngoài ra, hiện nay còn có các nghiên cứu nhằm chuyển gen kháng bằngphương pháp cứu phôi và lai TB Bằng phương pháp cứu phôi Anude Border và cs,

1992, đã chuyển gen kháng từ lúa dại vào lúa trồng (Lee và cs) Bằng cánh lai tế

bào trần giữa lúa trồng Oryzae Sativa L với nguồn cho gen kháng là lúa dại Oryzae (Meyeriana) Cheng- qui Yan và cs đã tiến hành thành công việc tạo dòng tế bào

mang gen kháng bạc lá Kết quả thu được 29 dòng cây lai xoma, hình thái biểu hiệngiống cả hai bên bố mẹ, trong đó có 2 dòng biểu hiện tính kháng cao, 8 dòng biểuhiện tính kháng vừa (Cheng-qui Yan và cs, 2004)

Bên cạnh đó còn có phương pháp gây đột biến Invitro cũng tạo ra tính kháng,làm thay đổi một số tính trạng nông sinh học cho giống, phương pháp này bước đầu đãđược thực hiện và thành công ở trên cây lúa, ngô và khoai tây

2.4.3 Ứng dụng công nghệ sinh học trong nghiên cứu và chọn giống kháng

bệnh bạc lá

Sự phát triển của công nghệ sinh học, đặc biệt là công nghệ gen đã mang đếnnhững bước tiếng đáng kể trong nghiên cứu và chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá Vi

khuẩn Xanthomonas oyzae pv Oyzae có thể được xác định nhanh chóng bằng cách

sử dụng các chỉ thị phân tử Adachi và T Oku, 2000, đề xuất sử dụng 2 đoạn mồiXOR-F và XOR-R2 để nhân đoạn ADN, đoạn ADN này nằm giữa hai gen tổng hợpnên cấu tử 16S và 23S của ribosome vi khuẩn bạc lá (dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005).Ngoài ra, các kỹ thuật phân tử như RFLP (restriction fragment lengthpolymorphism) cũng được áp dụng tành công trong việc xác đánh giá sự đa dạnghay xác định chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipnes, Hàn Quốc vànhững nước trồng lúa khác (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham Ghasemie,2008; Phan Hữu Tôn,2009)

Ngày nay, đã có nhiều gen quan trọng của các loại cây trồng được lập bản đồliên kết với các đoạn ADN genome, đặc biệt là gen kháng bệnh ở các cây lươngthực chính (Melchinger, 1990; Kelly, 1995; Penner và cs, 1995; Miklas và cs, 1996;A.C.Sanchez, 2000) Dựa trên bản đồ này, chỉ thị phân tử xác định gen kháng bạc lá

đã được xây dựng Kỹ thuật này ngày càng được sử dụng phổ biến bởi tính khả thi,tính hiệu quả và tính kinh tế Chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trongviệc xác định gen kháng (Nelson và cs, 1996), trong việc tổ hợp nhiều gen kháng đểtạo thành giống chứa đa gen kháng (Huang và cs, 1997), trong chuyển gen khángbằng phương pháp nuôi cấy mô, lai tế bào trần (Kelly, 1995)

Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnhbạc lá và chọn tạo giống lúa kháng bệnh ở các trung tâm chọn giống

Từ năm 1997-2004, Viện lúa đồng bằng sông Cửu Long đã sử dụng phươngpháp sử dụng chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩnphổ biến trong đánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa địa phương thuthập được ở duyên hải Trung bộ và đồng bằng sông Cửu Long Kết quả đã thu được

17 giống mang gen xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14 Kiểm tra độ tin cậy của phương pháp chỉ

thị phân tử trong nghiên cứu phát hiện gen kháng ở quần thể con lai giữa

IR24/Barer đối với gen xa5 cho thấy độ chính xác lên tới 93,3% (Bùi Chí Bửu và

Nguyễn Thị Lang, 2004) Bùi Chí Bửu và Cs cũng đã sử dụng chỉ thị phân tử đểkiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với giống lúa địa phương mang gen kháng Xa4,

xa5, xa13 với độ chính xác ccao (Nguyen Vinh Phuc , 2005).

Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử đã được ứng dụng thành công trong nghiên cứubệnh bạc lá và chọn giống kháng bệnh Từ năm 2000 cùng với sự hợp tác của cácchuyên gia Nhật Bản trong khuôn khổ dự án Jica, nhóm nghiên cứu về bệnh bạc lácủa trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội của Phan Hữu Tôn và cs đã liên tục công

bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng Nhóm nghiên cứu đã sử dụng chỉ thị phân

tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn để tiến hành thu thập, phân lập và bảo quản cácchủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở miền Bắc Đồng thời, để phục vụ cho chiến lượcchọn tạo giống lúa kháng bệnh, Phan Hữu Tôn cũng tiến hành lây nhiễm trên cácdòng đẳng gen nhằm kết luận gen kháng hữu hiệu với các chủng vi khuẩn ở miền

Bắc Cho đến nay, các gen xa5, Xa7, Xa21 đã được xác định là các gen kháng hầu

hết các chủng vi khuẩn Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng được tiến hànhđánh giá khả năng kháng bệnh, kết quả cho thấy chúng không có khả năng khángcác chủng vi khuẩn ở Việt Nam (Phan Hữu Tôn, 2004)

Trong các năm 2000-2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành việc tìm kiếmnguồn gen kháng từ các giống lúa địa phương bằng cả hai phương pháp lây nhiễmnhân tạo và PCR Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu đã công bố của Phan HữuTôn thì trên cơ sở điều tra 145 giống lúa địa phương đã phát hiện được 12 giống

chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7 Năm 2004, trên cơ sở tiếp tục điều tra 120

giống địa phương, Phan Hữu Tôn và cs phát hiện được thêm 8 giống lúa địa phương

chứa gen xa5 Các kết quả nghiên cứu trên đều nhằm mục đích phục vụ cho chiến

lược chọn tạo giống lúa chống bệnh bạc lá ở miền Bắc Việt Nam (Bùi Chí Bửu vàNguyễn Thị Lang, 2004, 2007)

Đến nay, bước đầu có thể khẳng định các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, xa13, Xa14 là các gen kháng thường có mặt trên các giống lúa địa phương ở Việt

Nam Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong

việc chọn tạo giống lúa kháng bệnh, bởi chúng có khả năng kháng được hầu hết cácchủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta Nhưng trong số các gen kháng hữu hiệu, tại

miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn xa5 Hiện chưa có nghiên

cứu nào công bố việc phát hiện được gen Xa21 trên các giống lúa trồng Việc sửdụng kỹ thuật PCR xác định gen kháng và vi khuẩn bạc lá trong chọn tạo giống lúakháng bệnh cho kết quả rất khả quan

PHẦN III NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu nghiên cứu

- 50 mẫu giống lúa được thu thập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinhhọc ứng dụng, Đại học Nông nghiệp Hà Nội (Kí hiệu, tên, nguồn gốc các mẫu

giống được trình bày chi tiết tại Phụ lục 1).

- Các dòng đẳng gen chứa các gen kháng bệnh bạc lá khác nhau, gồm dòngnhiễm chuẩn: IR24, các dòng mang gen kháng chuẩn IRBBgồm IRBB4, IRBB5 vàIRBB7

- 7 chủng vi khuẩn gây bệnh bạc lá đang tồn tại ở miền Bắc Việt Nam, đượcphân lập và bảo quản tại bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng như sau:

1 HAU 01043 TN 13 – 4 Hà Nội

2B HAU 020361 Nếp tân Thuận Châu (Sơn La)

3A HAU 020083 Nhị ưu – 838 Quỳnh Giang, Quỳnh Lưu (Nghệ An)

4 HAU 010081 Tẻ đỏ Hải Dương

5A HAU 020131 Khang dân Diễn Kỳ, Diễn Châu (Nghệ An)

6 HAU 020346 Nhị ưu 838 Cường Thịnh, Yên Kì (Yên Bái)

8 HAU 020201 Nếp thơm Vinh Hống, Bình Giang (Hải Dương)

- Các loại hóa chất và dụng cụ dùng trong thí nghiệm PCR

3.1.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Nghiên cứu được tiến hành vào vụ xuân năm 2010 từ tháng 1/2010 đếntháng 6/2010

- Các thí nghiệm ngoài đồng ruộng được bố trí tại ruộng thí nghiệm của Bộmôn Công nghệ sinh học ứng dụng

- Các thí nghiệm trong phòng được thực hiện tại phòng thí nghiệm sinh họcphân tử, Bộ môn Công nghệ sinh học ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học

3.2 Nội dung nghiên cứu

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng và khả năng mang gen mùi thơm của 50mẫu giống

- Đánh giá khả năng kháng và mang gen kháng bệnh bạc lá

- Đánh giá năng suất và một số tính trạng nông sinh học quan trọng khác

3.3 Phương pháp nghiên cứu

3.3.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm ngoài đồng ruộng

- Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống không nhắc lại

- Mật độ cấy: Mỗi giống cấy 5m2 Cây cách cây 11cm, hàng cách hàng 20cm,Cấy 1 dảnh/ khóm

3.3.2 Phương pháp đánh giá một số đặc điểm nông sinh học cơ bản

Các đặc điểm nông sinh học được khảo sát theo IRRI standard evaluation system for rice, 2002.

3.3.2.1 Xác định thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng

- Từ cấy đến bắt đầu trỗ: lúc có 10% số cây chính có bông thoát khỏi bẹ láđòng khoảng 5cm

- Từ trỗ đến chín: khi 85% số hạt chắc có màu vàng

Sau đó tính tổng thời gian sinh trưởng từ ngày gieo mạ đến ngày lúa chínhoàn toàn

3.3.2.2 Đặc điểm nông sinh học chính thời kỳ ruộng cấy

- Số nhánh tối đa: đếm 10 cây

- Số nhánh hữu hiệu: đếm 5 – 10 cây (số nhánh có khả năng tạo thành bông)

- Chiều dài lá đòng: đo 5 cây

- Chiều rộng lá đòng: đo 5 cây

- Chiều dài bông: đo chiều dài từ cổ đến đỉnh bông thời kỳ vào chắc

- Chiều cao cây cuối cùng: đo từ mặt đất đến đỉnh bông dài nhất, thời kỳchín

- Đo chiều dài, chiều rộng hạt thóc: đo từ cuối đến đỉnh hạt, không đo râu và

đo phần rộng nhất của hạt thóc

3.3.2.3 Đặc điểm nông sinh học thời kỳ chín liên quan đến năng suất

- Số bông hữu hiệu/khóm: đếm 5 cây (lấy số trung bình)

- Số hạt chắc/bông

- Khối lượng 1000 hạt đo 3 lần

- Năng suất tiềm năng (NSTN) = A x B x C x D x 10-4

Trong đó: A: Số khóm/m2 (45 khóm/m2)

B: số bông hữu hiệu/khómC: Số hạt chắc/bông chínhD: Khối lượng 1000 hạtVới mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng

3.3.3 Phương pháp đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá

3.3.3.1 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo

 Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

- Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv oryzae được nuôi cấy trên môi trường

108 CFU/ml để lây bệnh

 Phương pháp lây nhiễm

Lây bệnh theo phương pháp sát thương cơ giới cắt đầu lá của N.Furuya,2003: Dùng kéo đã khử trùng nhúng vào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnhbạc lá (mỗi chủng vi khuẩn dùng một kéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dàikhoảng 2 – 5cm và lây nhiễm vào giai đoạn lúa làm đòng - trỗ, mỗi chủng một cây,trên một cây cắt toàn bộ lá xanh trên đó

Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thí nghiệm để xác định khả năng duy trì

độ độc tính của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cách lây thử lêndòng mẫm cảm IR24 Sau 5 ngày thấy đầu lá héo xanh và tái đi chứng tỏ các chủng

vi khuẩn này có độ độc tính và có thể dùng để lây nhiễm được

 Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá

Sau khi lây nhiễm được 18 – 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh theo

phương pháp do N Furuya et al, 2003 đề xuất.

Dựa vào chiều dài của vết bệnh để đánh giá tính kháng của giống như sau:

+ Chiều dài vết bệnh <8cm: Kháng bệng bạc lá (R)

+ Chiều dài vết bệnh từ 8 - 12cm: Nhiễm vừa (M)

+ Chiều dài vết bệnh >12cm: Nhiễm nặng (S)

3.3.3.2 Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR

 Chiết tách DNA

Chiết tách DNA theo quy trình của Zheng và cộng sự, 1995, có cải tiến:

Thu ngắt mẫu lá khoẻ dài 2cm bỏ vào ống nghiệm có dung tích 1.5ml, đánh dấutên giống rồi đặt vào đá lạnh

Trong phòng thí nghiệm các cối sứ đã được hấp khử trùng đặt trong đá lạnh

1 Các mẩu lá 2cm được cắt nhỏ 0,5mm rồi bỏ vào cối sứ

2 Nhỏ 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào cối sứ rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫulá

3 Nghiền kỹ mô lá đến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh đen,chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra

4 Đổ thêm 400µl dung dịch chiết xuất DNA vào, trộn lẫn và chuyển 400µl vàoống nghiệm đã đánh dấu theo tên giống ban đầu

5 Đổ vào ống nghiệm 400µl (25 Phenol: 24 chloroform: 1 isaminachohol) trộnđều, quay li tâm 13000 vòng trong 5 phút sau đó chuyển phần dung dịch lớp trênsang ống nghiệm mới đã đánh số theo từng tên giống

6 Đổ vào ống nghiệm 400µl (24chlorofrom : 1 isaminachohol) làm tương tựnhư bước 5

7 Đổ 800µl ethanol (Isopropanol) trộn đều sau đó li tâm 13000 vòng trong 5phút Đổ phần dung tích phía trên đi, giữ lại phần kết tủa ở đáy ống nghiệm.

8 Rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độ trong phòng bằngcách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm

Phần kết tủa chính là DNA Hoà tan DNA kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồibảo quản ở nhiệt độ -200C hoặc 40C, dùng cho các giai đoạn nghiên cứu tiếp theo

 Tiến hành phản ứng PCR bằng máy chu trình nhiệt

- Chuẩn bị DNA các mẫu giống nghiên cứu và các dòng chỉ thị (gồm: IR24 – đốichứng âm không chứa gen kháng , IRBB4, IRBB5, IRBB7 – đối chứng dương chứa

gen kháng Xa4, xa5, Xa7)

- Thành phần dung dịch phản ứng PCR gồm có:

+ Đối với Xa4 và Xa7 thành phần 25 μl gồm: 12.5 μl gotaq master mix, 1 μl

Primer Forward, 1 μl Primer Revese, 1 μl DNA mẫu và 9.5 μl nuclease – Freewater

+ Đối với xa5 thành phần 20 μl gồm có: 14.24 μl nuclease – Free water, 2.5

μl buffer, 0.16 μl dNTP 25mM, 1 μl Primer Forward, 1 μl Primer Revese, 0.1 μldream taq polymerase, 1 μl DNA mẫu

- Các mồi sử dụng để phát hiện ra gen kháng bạc lá Xa4, xa5 và Xa7

Kí hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCRđược trình bày ở bảng dưới đây:

MP2 Xa4 R 5’GTG CTA TAA AAG GCA TTC GGG 3’

F 5’ATC GAT CGA TCT TCA CGA GG 3’

-N Furuya

et al, 1992P3 Xa7 F 5’ CAG CAA TTC ACT GGA GTA GTG GTT 3’

R 5’ CAT CAC GGT CAC CGC CAT ATC GGA 3’

-N Furuya

et al, 2003RG556 xa5 R 5’TAG CTG CTG CCG TGC TGT GC 3’

F 5’ AAT ATT TCA GTG TGC ATC TC 3’ DraI

Yoshimura

et al., 1995

- Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7 như sau:

Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

- Chu kỳ nhiệt cho gen xa5 như sau:

Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

 Điện di sản phẩm PCR phát hiện gen kháng

Sau khi tiến hành phản ứng PCR, sản phẩm nhân gen sẽ được chạy điện di đểphát hiện gen kháng

- Chuẩn bị gel agarose 1,5%

- Chạy điện di ở hiệu điện thế 75V

- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng ethilium bromide nồng độ10mg/ml trong 10 phút

- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di để xem có genkháng hay không Phát hiện bằng cách so sánh kích cỡ vệt băng nhân lên của mẫu vớikích thước vệt băng của đối chứng, nếu vạch nào trùng với đối chứng âm là khôngchứa gen kháng, còn vạch nào trùng với đối chứng dương thì chứa gen kháng

 Phản ứng cắt DNA sản phẩm PCR phát hiện gen xa5

Riêng gen xa5 sau khi điện di sản phẩm PCR thấy có ADN được nhân lên,

vệt băng của IR24 Do đó phải dùng đến enzym cắt giới hạn RE ( dùng enzym DraIvới trình tự cắt là TTT - AAA ).

Thành phần 15 μl dung dịch cắt bằng enzyme DraI như sau: Nuclease free water: 3,2µl; 10X Buffer R: 1,5µl; enzym DraI 10unit/µl: 0,3µl; Sản phẩm PCR: 10µl.

Ủ hỗn hợp phản ứng ở nhiệt độ 370C với thời gian từ 6h đến qua đêm

Điện di sản phẩm ADN đã được cắt bằng enzym trên gel agarose 1.5%

3.3.4 Phương pháp đánh giá chất lượng

3.3.4.1 Các thí nghiệm liên quan đến chất lượng thương trường của gạo

Các phương pháp này được tiến hành theo “Hệ thống tiêu chuẩn đánh giácây lúa của IRRI, 1996”

 Tỷ lệ gạo lật, gạo trắng

- Mỗi giống 200 hạt đã phơi khô quạt sạch, ẩm độ khoảng 14%, cân khối lượng vàđem đi bóc vỏ trấu, sau đó cân khối gạo sau khi bóc vỏ

Tỷ lệ gạo lật = (KL gạo đã bóc vỏ /KL lúa ban đầu) * 100%

- Từ khối lượng gạo đã bóc vỏ đem làm trắng, sau đó cân khối lượng gạo trắng

Tỷ lệ gạo trắng = (KL gạo trắng /KL lúa ban đầu) * 100%

 Đo chiều dài gạo xay

Hình dạng hạt gạo được đo sau khi gạo được bóc vỏ trấu, làm trắng Theo tiêuchuẩn của IRRI (1996), có thể chia hạt gạo thành các loại sau:

Theo chiều dài gạo: Quá dài: >7,5mm Dài: 6,6 – 7,5mm

Trung bình: 5,5 – 6,6mm Ngắn: <5,5mm

 Dạng hình gạo xay

Tiến hành đo chiều dài và chiều rộng hạt gạo trắng bằng thước pame Mỗigiống đo 5 hạt, lấy trung bình chiều dài và chiều rộng Dạng hình gạo xay được đánh giá bằng tỷ số dài/rộng theo tiêu chuẩn của IRRI (1996)

Dạng hình Tỷ số (D/R)Thon dài > 3,0Trung bình 2,1 - 3,0

 Mùi thơm của gạo

Lấy 10 hạt gạo trắng của mỗi giống và nghiền nhỏ Bột gạo của mỗi giống đượcđặt trong một hộp kín chứa 500µl KOH 1,7% đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong

10 phút Đánh giá mùi thơm bằng phương pháp ngửi, mức độ thơm được đánh giábởi 5 người

Điểm 1: Không thơm Điểm 2: Hơi thơm Điểm 3: Thơm

 Độ phá huỷ kiềm và nhiệt độ hoá hồ

Chỉ tiêu này được đánh giá theo phương pháp của Little, 1958, với quy trình nhưsau: 6 hạt gạo nguyên đã xát trắng được ngâm vào dung dịch KOH 1,7% trong 23giờ ở nhiệt độ 30ºC

Độ phá hủy kiềm và nhiệt độ hóa hồ của các mẫu giống được quan sát vàđánh giá theo thang điểm như sau:

Thang

1 Hạt gạo còn nguyên Hạt gạo trắng bột Thấp Cao

2 Hạt gạo phồng lên Gạo trắng bột, có viền trắng xung quanh Thấp Cao

3 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên hay rõ nét Hạt trắng bột, viền nhoè như bông gòn, vẩn đục Thấp - TB Cao - TB

4 Hạt gạo phồng lên, viền còn nguyên hay mở rộng Tâm nhoè như bông gòn, viền vẩn đục Trung bình Trung bình

5 Hạt gạo rã ra, viền hoàn toàn và mở rộng Tâm nhoè như bông gòn, viền trong suốt Trung bình Trung bình

6 Hạt tan ra hoà chung vớiviền Tâm đục, viền trong suốt Cao Thấp

7 Hoà tan ra hoàn toàn và quyện vào nhau Tâm và viền trong suốt Cao Thấp

3.3.4.2 Kiểm tra gen mùi thơm

IFAP 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’

- Thành phần 20µl dung dịch phản ứng PCR gồm có: 14 μl nuclease – Freewater, 2.5 μl buffer, 0.4 μl dNTP 25mM, 1 μl Primer ESP, 1 μl Primer IFAP, 0.1 μldream taq polymerase, 1 μl DNA mẫu

- PCR được thực hiện theo chu kỳ nhiệt như sau: 940C trong 2 phút, 34 chu

kỳ, 940C trrong 30 giây, 580C trong 30 giây, 720C trong 30 giây, và 720C trong 5phút

 Điện di sản phẩm PCR

Kết quả mẫu giống có chứa gen thơm (fgr) sẽ xuất hiện một vạch có kích

thước 257bp trùng với đối chứng dương Bắc thơm và các giống không chứa gen sẽkhông có vạch nhân lên giống như đối chứng âm IR64