luận văn công nghệ sinh học So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác định hàm lượng vitamin B1 trong gạo

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC********** KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Đề tài: SO SÁNH TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYME THUỶ PHÂN ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B1 TRONG GẠO Người hướng

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

**********

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Đề tài:

SO SÁNH TÁC DỤNG CỦA MỘT SỐ ENZYME THUỶ PHÂN

ĐỂ XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG VITAMIN B1 TRONG GẠO

Người hướng dẫn: TS Lê Thị Hồng Hảo

DS Trần Cao Sơn Sinh viên thực hiện: Lê Thị Khánh Loan Lớp: CNSH 06-04

Hà Nội 2010

Nhân dịp hoàn thành khó luận tốt nghiệp cho phép tôi được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và lời cảm ơn chân thành tới:

TS Lê Thị Hồng Hảo -Viện phó Viện Kiểm Nghiệm Vệ Sinh An Toàn

đã r ực i ếph ướngd n , i úp đỡtĩ i Đồng h i ,tơ i xin hõ n h ànhc ảmơ n banlãnh đạo i ện i ểm Ngi ệmV ệ Sinh An o àn h ực h ẩm u ốc Giac ùng o àn h ểc

ác anh h ịc ánb ộ iâ n trong i ện đã i úp đỡv àt ạođi ều i ện chotơ i trong u á rình ngiâ nc ứuv à h ực i ện ko á u ậnn y

Tĩi cũng xin chõn thành cảm ơn các thầy cụ, cán bộ cuả khoa CụngNghệ Sinh Học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã dạy dỗ, chỉ bảo, tạo điều kiệntốt cho tĩi học tập, tạo cơ hội cho tĩi đi thực tập và làm khoá luận tốt nghiệp

Cuối cũng xin cảm ơn gia đình, bạn bố đã động viân,giúp đỡ tĩi trongthời gian qua

Hà Nội, tháng 5 năm 2010

Sinh viân

Lờ Thị Khánh Loan

AOAC (Association Official Analytical Chemists): Hiệp hội các nhà hoá học

PDA: Photo Diode Array

ppm (part per million): nồng độ phần triệu

STT: Số thứ tự

TTHD: Trung tâm hoạt động

UV-VIS: Ultra Violet-Visible: Tử ngoại khả biến

VTM B1: Vitamin B1

Bảng1.2.1: Nguồn vitamin B1 trong một số thực phẩm

Bảng 3.1.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thành phần pha độn 3

Bảng 3.1.3: Khảo sát tốc độ pha độn 3

Bảng 3.1.4: Các điều kiện chạy HPLC phân tích hàm lượng vitamin 1 trong gạ 3

Bảng 3.2.5: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme tới quá trình chiết vitamin 1 trong gạ 3

Bảng 3.2.6: Ảnh hưởng của enzyme tới hiệu suất thu hồ 3

Bảng 3.2.7: Sự phụ thuộc của diện tích píc vào nồng độ vitamin 4

Bảng 3.3.8: Kết quả độ lặp lại của phương phá 4

Bảng 3.3.9 Hiệu suất thu hồi của vitamin 1 ở các nồng độ khác nha 4

Bảng 3.3.10: Kết quả phân tích mẫu thực t 4

Hình 1.3.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng có enzyme xúc tá 1

Hình 1.3.2: Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng có enzy e xúc tá 1

Hình 2.3.3: Sơ đồ mô tả hệ thống HPL 2

Hình 3.1.4: Sắc đồ Vitamin 1 sử dụng cột Symmestry Water C1 3

(250mm × 4,6mm × 5µm 3

Hình 3.1.5: Sắc đồ chạy chuẩn 0,50 ppm tại tốc độ dòng 0,8 ml/phút 3

Hình 3.3.6: Sắc đồ chạy chuẩn vitamin 1 0,025pp 4

Hình 3.3.7: Sắc đồ chạy mẫu tại giới hạn phát hiện (7µg/kg 4

Hình 3.4.8: Sắc đồ chạy mẫu gạo RN6 4

Hình3.4.9: Sắc đồ chạy mẫu gạo Nàng Xuâ 4

Hình3.4.10: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Ố 4

Hình 3.4.11: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tá 4

Hình 3.4.12: Sắc đồ chạy mẫu gạo tẻ thườn 4

Hình3.4.13: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp nương Điện Biê 4

Hình3.4.14: Sắc đồ chạy mẫu gạo Tài Nguyê 4

Hình 3.4.15: Sắc đồ chạy mẫu gạo nếp Cái Hoa Vàn 5

Hình 3.4.16: Sắc đồ chạy mẫu gạo lứ 5

MỞ ĐẦ

PHẦN TỔNG QU

1.1 Giới thiệu chung về vitami

1.1.1 Định nghi

1.1.2 Phân loạ

1.1.3 Vai trò của vitami

1 2 Vài nét về vitamin 1

1.2.1 Lịch

1.2.2 Cấu tạo và tính ch

1.2.3 Vai trò của vitamin 1 đối với sức khoẻ con ngườ

1.2.4 Nhu cầu

1.2.5 Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitaminB

1.3 Tổng quan về enzy

1.3.1 Khái ni

1.3.2 Vai t

1.3.3 Cấu tạo hoá học của enzy

1.3.4 Cơ chế hoạt độn

1.3.6 Đặc tính một số enzyme được sử dụn 1

1.4 Các phương pháp xác định thiami 1

1.4.1 Định lượng thiamin bằng phương pháp khối lượng 1

1.4.2 Phương pháp inh vật học và vi trùng học

1.4.3 Phương pháp chuẩn độ điện t

1.4.4 Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế c

1.4.5 h ương pháp phổ huỳnh quan 1

1.4.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPL 2

PHẦN I ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PH NGHIÊN C

2.1 Đối tượng, thiết bị, hóa ch

2.1.1 Đối tượng nghiên c

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và thuốc t

2.2 Nội dung nghiên c

2.2.2 Đánh giá phương pháp đã xây dự

2.2.3 Ứng dụng phương pháp xác định vitaminB 1 trong một số loại g

2.3 Phương pháp nghiên c

2.3.1 Phương pháp lấy m

2.3.2 Phương pháp phân tích vitaminB

2.3.3 Phương pháp xử lý kết q

PHẦN I KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬ 3

3.1 Tối ưu hoá các điều kiện để tách và xác định vitamin B1 bằng HP

3.1.1 Lựa chọn detector và bước sóng phát hi

3.1.2 Lựa chọn cột tá

3.1.3 Lựa chọn pha độ

3.1.4 Khảo sát tốc độ dò

3.2 So sánh một số enzyme thủy phân để tối ưu hoá quy trình xử lý m

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của enzyme tới hiệu suất thu hồ 3

3.3 Đánh giá phương pháp phân tíc 4

3.3.1 Khảo sát khoảng tuyến tính và lập đường chuẩ 4

3.3.2 Giới hạn phát hiện (LOD 4

3.3.3 Giới hạn định lượng (LOQ 4

3.3.4 Xác định độ lặp lạ 4

3.3.5 Xác định độ thu hồ 4

3.4 Ứng dụng phân tích mẫu thực t 4

PHẦN I KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NG

4.1 Kết lu

4.2 Đề ng

TÀI LIỆU THAM KH

PHỤ L

MỞ ĐẦU

Sự khám phá ra vitamin là một trong những thành tựu lớn của hoá sinh.Vitamin là một nhóm các hợp chất hoá học có mặt trong hầu hết các loại thựcphẩm, được phân loại làm hai nhóm chính: vitamin tan trong dầu và vitamintan trong nước Mặc dù, các vitamin không cung cấp năng lượng nhưng chúngrất cần thiết cho các hoạt động sống của con người Trong các loại vitamin thìvitamin B1 (thiamin) giữ vai trò quan trọng trong nhiều hoạt động của cơ thể.Thiamin có mặt trong nhiều loại thực phẩm, trong đó các loại ngũ cốc mà đặcbiệt là gạo có hàm lượng thiamin cao Gạo là loại lương thực không thể thiếuđối với cuộc sống hàng ngày của mỗi người, nhất là ở Việt Nam

Xác định hàm lượng vitamin B1 chính là một trong các yêu cầu kiểmnghiệm về hoá sinh của gạo Để xác định hàm lượng vitamin B1 trong thựcphẩm có hàm lượng tinh bột cao như gạo thì quá trình phân tích thường phải

sử dụng enzyme, vì các enzyme có khả năng phá vỡ liên kết polysaccarid tạodịch đường hồ tan, và phá vỡ liên kiết giữa vitamin B1 và protein Bên cạnh

đó, các enzyme còn xúc tác phản ứng dephosphoryl để tách dạng thiamin

phosphate ester thành thiamin tự do[22],[27] Điều này là quan trọng do trong

thực phẩm vitamin B1 tồn tại ở dạng tự do (thiamin) B1, dạng phosphate ester,hơn nữa chúng còn có sự ràng buộc với protein Sau đó, thiamin tự do đượcoxy hóa thành thiochrom và định lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệunăng cao HPLC sử dụng detectơ huỳnh quang RF

Hiện nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về hàm lượng vitamin

B1 trong ngũ cốc nói chung và gạo nói riêng Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành

nghiên cứu đề tài: “So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để xác

định hàm lượng vitamin B 1 trong gạo” với các mục tiêu:

- Khảo sát điều kiện chạy máy sắc ký lỏng hiệu năng cao để phân tíchvitamin B1

- So sánh tác dụng của một số enzyme thuỷ phân để khảo sát quá trìnhtách chiết vitamin B1 trong gạo.

- Đánh giá phương pháp xác định hàm lượng vitamin B1

- Ứng dụng phương pháp để xác định hàm lượng vitamin B1 trong một sốloại gạo trên thị trường Hà Nội

PHẦN I TỔNG QUAN

1.1 Giới thiệu chung về vitamin [5], [11]

1.1.1 Định nghiã[11]

Vitamin là những hợp chất hữu cơ, được cung cấp cho cơ thể với sốlượng nhỏ từ thức ăn, là những chất không thể thiếu được với cơ thể ngườicũng như động vật để tạo ra các coenzyme cần thiết cho phản ứng chuyển hóakhác nhau

1.1.2 Phân loại

Dựa vào độ tan của vitamin, người ta chia thành 2 nhóm:

- Vitamin hòa tan trong nước: Các vitamin nhóm B, vitamin C

- Vitamin hòa tan trong dầu: vitamin A, vitamin D, vitamin E,vitamin K

1.1.3 Vai trò của vitamin

Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất xảy ra trong cơthể đều có sự tham gia trực tiếp của vitamin Các động vật cũng như conngười không có khả năng tự tổng hợp được các vitamin bằng quá trình đồnghóa Nguồn cung cấp vitamin chủ yếu là thức ăn Do vậy, cơ thể có thể thừahay thiếu vitamin Khi cơ thể bị thiếu hay không có một vitamin nào đó thì sẽmắc một số bệnh như quáng gà, còi xương, viêm đa dây thần kinh… Ngượclại khi thừa vitamin nói chung, các vitamin không gây độc và bị đào thải rangoài

1 2 Vài nét về vitamin B1 [5], [11]

1.2.1 Lịch sử

Năm 1911, nhà bác học Casimir Funk đã phân lập được từ cám gạo mộtyếu tố có hoạt tính và cho rằng nó là một loại yếu tố mới trong thực phẩm,yếu tố này cú tác dụng điều trị bệnh viâm nhiều dây thần kinh Ông đặt tên làvitamine sau rút gọn thành vitamin và cuối cùng gọi là vitamin B1 Năm 1926,hợp chất này đã được phân lập dưới dạng kết tinh bởi Jansen và Donath, vàcấu trúc hoá học của nó được xác định bởi Willians vào năm 1936 Hội đồngdược và hoá học chấp nhận tên gọi thiamin đối với chất kết tinh vitamin B1

Tân khoa hoc: 3-[(4- amio-2- methyl-5- pyrimdinyl)

methyl]-5-(2-hydroxyethyl)-4 - methyl thiazol

Tên gọi khác: Thiamin.

Biệt dược: Betaxin, Bewon, Biamin, aneurin….

Thông thường nó tồn tại ở dạng muối như:

- Thiamin hydroclorid ( C12H17ClN4OS.HCl)

- Thiamin hydrobromid (C12H17BrN4OS.HBr)

- Thiamin nitrat (C 12H 17N5O4S)

1.2.2.2 Tính chất

 Điểm nóng chảy: 246-2500c cho đến khi phá huỷ

 Độ hồ tan : 100g trong 1000ml nước, hay1g trong 100ml etanol 96%không tan trong hexan, ête, axeton

 Vitamin B1 tồn tại dưới dạng tinh thể màu trắng, tan nhiều trong nước,khó tan trong ethanol 960 và methanol, không tan trong clorofom vàether rất nhạy cảm với nhiệt và bị phân huỷ phần lớn khi làm chín,hoặc xử lý trong lò vi sóng ngược lại, sự đông lạnh không làm thay đổihàm lượng của nó Vitamin B1 có mùi đặc biệt của men Nỉ dễ hút ẩm

và ở trạng thái khô thì vững bền Trái lại trong dung dịch, nó dễ bị oxyhoá và dễ bị phá huỷ

 Độ bền của thiamin phụ thuộc vào pH, nhiệt độ, lực ion và các phần tửphản ứng khác Thiamin trong môi trường trung tính và đặc biệt trongmôi trường acid tương đối vững bền Trong môi trường kiềm, thiaminrất dễ bị phá huỷ, đặc biệt là khi có tác dụng của nhiệt độ

 Do có tính bazơ nên vitamin B1 tạo tủa với một số thuốc thử chung củaAlkaloid: tạo tủa với Hg2Cl, với I2, tanin, thuốc thử Mayer Đặc biệt,với acid silicovolframic tạo tủa có thành phần xác định nên ngoài việcdựng thuốc thử này để định tính, người ta còn dựng nó để định lượngthiamin

 Trong môi trường kiềm, vitamin B1 tác dụng với kali fericyanid tạothiocrom màu vàng và có huỳnh quang màu xanh da trời

 Vitamin B1 được tổng hợp chủ yếu ở thực vật và một số vi sinh vật

1.2.3 Vai trò của vitamin B1 đối với sức khoẻ con người

 Thiamin pyrophosphate là dạng thiamin liên kết với H3PO4 và có vaitrò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của cơ thể Thiaminpyrophosphate là coenzyme của các enzyme piruvat-decacboxylasehoặc a-cetoglutarat-decacboxylase Tức là dưới dạng thiaminpyrophosphate, vitamin B1 tham gia vào hệ enzyme decacboxyl, để oxyhoá các acid ceto như acid pyruvic hoặc a-cetoglutaric Là 2 sản phẩmtrung gian của quá trình phân giải glucid Chính vì vậy khi thiếuvitamin B1 thì sự trao đổi glucid sẽ gặp khó khăn[5] Khi thiếu vitamin

B1 sự chuyển hoá các ceto acid bị ngừng trệ làm cho cơ thể tích luỹ mộtlượng lớn các ceto acid dẫn đến rối loạn trao đổi chất và gây nên cáctrạng thái bệnh lý nguy hiểm[11], [33]

 Thiamin pyrophosphate còn tham gia thành phần coenzyme củatrancetolaza trong chuyển hoá pentoza Vitamin B1 cần cho quá trìnhtổng hợp acid ribonucleic (RNA), acid deoxyribonucleic (DNA) lànhững acid liên quan đến quá trình di truyền[34] Vitamin B1 cũng cầncho quá trình tổng hợp nicotinamid adenin dinucleotid photphat khử(NADP) cần cho tổng hợp acid béo mà các acid béo không no lại có rấtnhiều vai trò trong cơ thể (là thành phần của nhiều hợp chất có hoạttính sinh học cao như lipoprotein; là yếu tố cần thiết của màng tế bào,các tổ chức liên kết, tổ chức thần kinh )

 Ngoài ra, vitamin B1 cùng với acid pantothenic còn tham gia tạo nênchất acetylcholin là chất giữ vai trò quan trọng trong việc truyền xungđộng thần kinh Chính vì vậy mà khi thiếu vitamin B1, ở hệ thần kinhnơi xảy ra trao đổi mạnh glucid, sẽ bị ảnh hưởng nhiều hơn cả[5]

 Khi thiếu B1 có thể phát sinh bệnh beri-beri, còn gọi là bệnh tờ phù, doquá trình trao đổi chất bị rối loạn[11]

1.2.5 Nguồn thực phẩm chính cung cấp vitamin B 1

Vitamin B1 là loại vitamin rất phổ biến trong thiên nhiên, đặc biệt trong

nấm men, cám gạo, mầm lúa mỡ, ngơ, gan, thận, tim, não [5],[11] Trong

thực phẩm vitamin B1 tồn tại ở dạng tự do, và dạng phosphate ester, như làthiamin monophosphate (TMP), thiamin diphosphate (TDP), và thiamintriphosphate (TTP), một phần vitamin B1 còn có sự liên kết với protein [18], [24],[27]

Bảng1.2.1: Nguồn vitamin B1 trong một số thực phẩm [23]

1.3 Tổng quan về enzyme

1.3.1 Khái niệm

Enzyme là chất xúc tác sinh học, có bản chất protein, hồ tan trong nước

và trong dung dịch muối lỏng Enzyme có phân tử lượng lớn từ

20.000-1.000.000 dalton [2].

1.3.2 Vai trò[5]

Enzyme có cường lực xúc tác rất lớn: ở điều kiện thích hợp hầu hết cácphản ứng có xúc tác enzyme xảy ra với vận tốc nhanh gấp 108 -1011 lần sovới phản ứng không có chất xúc tác

Tất cả các enzyme đều có nguồn gốc tự nhiên, không độc điều này có ýnghĩa quan trọng trong công nghiệp thực phẩm và y học

1.3.3 Cấu tạo hoá học của enzyme[5],[26]

1.3.3.1 Bản chất protein của enzyme

Bản chất hoá học của enzyme là protein Enzyme được cấu tạo từ các L- axitamin kết hợp với nhau qua liên kết peptit Enzyme chia ra làm hai dạngcấu tạo:

α Enzyme một cấu tử (là một protein đơn giản) như pepsin, amylase

- Enzyme hai cấu tử (là một protein phức tạp, trong phân tử còn có nhóm

không phải protein)

Trong phân tử enzyme hai cấu tử có hai phần:

 Apoenzyme: phần protein (làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme,quyết định tính đặc hiệu cao của enzyme)

 Nhóm ngoại “agon”: phần không phải protein ( quyết định kiểu phảnứng, trực tiếp tham gia vào phản ứng mà enzyme xúc tác) Khi nhóm

ngoại tách khỏi phần apoenzyme và có thể tồn tại độc lập, thì nhữngagon đó có tên gọi riêng là coenzyme

1.3.3.2 Trung tâm hoạt động (TTHĐ)[5]

Trong quá trình xúc tác của enzyme chỉ có một phần tham gia trực tiếp vàophản ứng để kết hợp với cơ chất gọi là "trung tâm hoạt động" Cấu tạo đặcbiệt của trung tâm hoạt động quyết định tính đặc hiệu và hoạt tính xúc tác củaenzyme

 Trong enzyme 1 cấu tử, trung tâm hoạt động thường bao gồm một tổhợp các nhóm định chức của axitamin không tham gia tạo thành trụcchính của sợi polypeptid Ví dụ, nhóm -SH của cysteine - OH củaserine, vòng imidazol của histidine, -COOH của aspartie và acidglutamic Các nhóm này thường phân bố trên những phần khác nhaucủa mạch polypeptid nhưng nằm kề nhau trong không gian tạo thànhtrung tâm hoạt động

 Trong enzyme hai cấu tử, ngoài mạch polypeptid mà các nhóm chứckết hợp để tạo trung tâm hoạt động, còn có các nhóm chức coenzyme

và các nhóm ngoại khác kết hợp tạo thành trung tâm hoạt động

 Ở enzyme chứa kim loại, các ion kim loại cũng tham gia vào việc tạotrung tâm hoạt động

 Trong các nhóm chức tham gia tạo trung tâm hoạt động cần phân biệthai nhóm: "tâm xúc tác" (tham gia trực tiếp vào hoạt động xúc tác củaenzyme) và "miền tiếp xúc" (giúp enzyme kết hợp đặc hiệu với cơ chất)

 Một enzyme có trung tâm hoạt động tồn tại dưới dạng chưa được hoạthoá gọi là zimogen hoặc proenzyme

Theo Emil- Fischer (1890) thì trung tâm hoạt động của enzyme vốn cócấu trúc không gian tương ứng với cấu trúc của phân tử cơ chất, cũng giốngnhư tương ứng giữa ổ khó và chìa khó

Tuy nhiên đã có nhiều dẫn liệu thực nghiệm chứng minh cấu trúc khônggian của enzyme cũng như protein không cứng mà mềm dẻo, linh động Theoquan niệm hiện nay, khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm chức ở phầntrung tâm hoạt động của phân tử enzyme thay đổi vị trí không gian tạo thànhhình thể khớp với hình thể của cơ chất, vì vậy gọi là sự “khớp cảm ứng”.Giữa

cơ chất và trung tâm hoạt động tạo thành nhiều tương tác yếu, do đó có thể dễdàng bị cắt đứt trong quá trình phản ứng để giải phóng enzyme và các sảnphẩm phản ứng

1.3.4 Cơ chế hoạt động[5]

Enzyme tác dụng trong điều kiện ”êm dịu” nhiệt độ tối ưu 30- 50o C, pHtrung tính và áp suất thường Điều này quan trọng trong công nghiệp thựcphẩm

Các cơ chất kết hợp với trung tâm hoạt động tạo phức hợp enzyme - cơ

 Trong một số enzyme còn có "trung tâm dị không gian" những phầnenzyme khi kết hợp với các chất có phân tử nhỏ nào đó sẽ làm biến đổicấu trúc bậc ba của toàn bộ phân tử enzyme làm cấu trúc trung tâm hoạtđộng thay đổi → biển đổi hoạt tính của enzyme

1.3.5 Các yếu tố ảnh hưởng hoạt tính của enzyme

1.3.5.1 Nhiệt độ[5]

Tốc độ của phản ứng enzyme chịu ảnh hưởng của nhiệt độ Mỗienzyme có một nhiệt độ tối ưu (tại nhiệt độ này enzyme có hoạt tính caonhất) Ví dụ: đa số các enzyme ở tế bào của cơ thể người hoạt động tối ưu ởkhoảng nhiệt độ 35-40o C, nhưng enzyme của vi khuẩn suối nước nóng lại hoạtđộng tốt nhất ở 700C hoặc cao hơn [30] Khi chưa đạt đến nhiệt độ tối ưu củaenzyme thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm tăng tốc độ phản ứng enzyme Tuynhiên, khi đã qua nhiệt độ tối ưu của enzyme thì sự gia tăng nhiệt độ sẽ làmgiảm tốc độ phản ứng và có thể enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính

ở pH = 2

PH tối ưu

Ảnh hưởng của PH tới tốc độ phản ứng

Hình 1.3.2: Ảnh hưởng của pH tới tốc độ phản ứng có enzyme xúc tác

1.3.5.4 Nồng độ enzyme[30]

Với một lượng cơ chất xác định, nồng độ enzyme càng cao thì tốc độphản ứng xảy ra càng nhanh Tế bào có thể điều hồ tốc độ chuyển hoá vật chấtbằng việc tăng giảm nồng độ enzyme trong tế bào

1.3.5.5 Chất ức chế enzyme[30]

Một số chất hoá học có thể ức chế hoạt động của enzyme nhưng khơng

bị chuyển hoá bởi enzyme Các chất này cú thể là những ion, các phân tử vĩ

cơ, hữu cơ, kể cả các protein khi cần ức chế enzyme nào đó cũng có thể tạo

ra các chất ức chế đặc hiệu cho enzyme ấy Một số chất độc hại từ môi trườngnhư thuốc trừ sâu DDT là những chất ức chế một số enzyme quan trọng của

hệ thần kinh người và động vật

1.3.5.6 Chất hoạt hoá[5], [30]

Chất hoạt hoá: Là những chất làm cho enzyme từ trạng thái không hoạtđộng thành trạng thái hoạt động, từ trạng thía hoạt động yếu sang trạng tháihoạt động mạnh

Bản chất hoá học:

- Chất hoạt hoá gián tiếp: Tham gia phản ứng nhưng không tác dụng trựctiếp với phân tử enzyme Ví dụ, các chất có tác dụng loại trừ các yếu tốkìm hãm khỏi môi trường phản ứng

- Chất hoạt hoá trực tiếp: Tác dụng vào TTHĐ hoặc làm biến đổi cấuhình không gian của phân tử enzyme theo hướng có lợi cho hoạt độ xúctác của enzyme

Vì vậy khi hàm lượng chất hoạt hoá tăng trong mức độ cho phép thìhoạt động của enzyme cũng tăng theo

1.3.6 Đặc tính một số enzyme được sử dụng

Việc xác định hàm lượng vitamin B trong các mẫu thực phẩm (rau, ngũcốc, thịt cá, nấm men) không bổ sung vitamin B, người ta đã chỉ ra rằng nếuchỉ thuỷ phân bằng acid thì chỉ thực hiện được một phân phản ứngdephosphoryl dạng phosphoryl của vitamin B và việc kết hợp giữa thuỷ phânbằng acid với enzyme diastase thì quá trình chiết sẽ tối ưu hơn.Trong tiếntrình xây dựng phương pháp HPLC để xác định hàm lượng vitamin B1 trongthực phẩm, xuyên suốt quá trình thử nghiệm, việc đưa ra lựa chọn loạienzyme sử dụng để giải phóng vitamin B1 từ dạng phosphate este của nó,dạng liân kết với protein đặc biệt được quan tâm (Hasselmann etal., 1989)

[16] Chúng thuộc nhóm enzyme thuỷ phân Chúng có khả năng phá vỡ liên

kết este Và với thực phẩm có hàm lượng tinh bột cao (gạo) người ta còn quantâm tới enzyme có tác dụng thuỷ phân tinh bột để giúp các hợp chất cao phân

tử bị phân cắt thành sản phẩm thấp phân tử và dễ dàng hồ tan để tạo dịch

chiết, giải phóng vitamin B1 dạng tự do[24] Với các lớ do trờn và vỡ lớ dokinh tế, enzyme thường được chọn hơn cả là enzyme loại diastase nỉ cú sựhoạt động phosphatase Giờ đõy tất cả các enzyme diastase cú sự hoạt độngcủa protease, phosphatase[27].

1.3.6.1 α-Amylasae Amylasae

Amylase là enzyme đầu tiên được phát hiện và cô lập bởi Anselme Paye

ào năm 183à enzyme l ại ia tas [4



Các enzyme mylase thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kếtnội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước: RR’ + H-OH → R’OH + R

:

- H ti ưu c ủ α- amylae c ủa nấm mc l à 4,–4

9

- H ti ưu c ủ α- amylae c ủa vi khun l à 5,–

1- Khi pH<3 h ì enzyme vụ hoạt, trừ enzyme của AspNiger có thể

hoạt động ở pH = 2,5–28 Trong môi trường có sự tồn tại của acid HCl, HBr

thì enzyme hoạt động có hiệu quả hơ

 Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồnkhác nhau cũng không đồng nhất Trong dung dịch đệm (pH = 4,7),

α- amylase của Asp Oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao,

thậm chí ở 40oC trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22 29%, hoạt lực đường hóa còn 27 -85% Ở 50oC trong 2 giờ, α-amylase của nấm sợi này bị vụ hoạt hoàn toàn[30]

-1.3.5.2 Taka-Amylasae diastasae [31], [32]

Taka-diastase là một loại enzyme diastase (thủy phân) được nuôi cấy và

phân lập từ nấm Aspergillus oryzae Năm 1894, tiến sĩ Takamin (Nhật Bản) là

người đầu tiên sản xuất ra enzyme taka-diastase

Taka-diastase thủy phân liên kết 1,4-glycozid trong tinh bột, glycogenhay các loại poplysaccarid khác cú chứa từ 3 phân tử đường glucose trở lên

1.3.5.3 Clara–diastasae

Clara-diastase là tên riêng của một hỗn hợp các enzyme thủy phân baogồm α-amylase, cellulase, invertase, peptidase, phosphatase and sulfatase Vềmặt bản chất clara-diastase có đầy đủ các loại enzyme thủy phân đường,protein, cắt gốc phosphat và sulfat

1.4 Các phương pháp xác định thiamin

Nghiên cứu xác định hàm lượng vitamin B1 là một lĩnh vực rất quantrọng và được ứng dụng rộng rãi trong y học, dược, công nghệ thực phẩm

Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình khoa học và các nghiên cứu vềphương pháp xác định hàm lượng vitamin B1 Dưới đây là một số phươngpháp đã được ứng dụng rộng rãi

1.4.1 Định lượng thiamin bằng phương pháp khối lượng

D.Adamson và J.Handisyde định lượng thiamin trong các chế phẩmdược bằng phương pháp khối lượng dựa theo phản ứng kết tủa của vitamin B1

với thuốc thử acid silicovonframic Phương pháp được tiến hành: Cho dungdịch acid silicowonframic vào thiamin có nồng độ khoảng 0.05mg khi đun sôitrong môi trường acid clohydric để tạo kết tủa, sau đó rửa kết tủa bằng acidclohydric 1,4% nóng qua phễu thuỷ tinh G4, sấy khô kết tủa đến khối lượngkhông đổi ở nhiệt độ 100-1500c Khối lượng kết tủa được nhân với hệ số 0,19

sẽ cho hàm lượng của thiamin khan nước trong mẫu phân tích, với sai số 15%

7,5-Khi định lượng thuốc viên, trước tiên phải tiến hành hồ tan thuốc viên đãnghiền nhỏ bằng acid clohydric 2,6%, loại những phần rắn không tan và nướclọc lấy được đem cho tủa thiamin bằng acid silicowonframic[12],[17]

tố ảnh hưởng Nỉ được dựng chủ yếu là để thử tác dụng của thuốc

1.4.3 Phương pháp chuẩn độ điện thế

Saad S M Hassan, Monhamed T Zaki, và Monhamed H Eldesoukiđưa ra phương pháp xác định thiamin trong sản phẩm dược sử dụng điện cựcchọn lọc ion Phương pháp dựa trên phản ứng tạo sunphua vớikaliplumbite(KpbO2) và đo lượng ion chì còn dư không phản ứng với vitamin

B1 trong môi trường đệm acetat pH=4,5 bằng cách chuẩn độ với EDTA Quátrình chuẩn độ được đơn giản và độ chính xác tăng lên khi sử dụng kỹ thuậtGran’s plot Phương pháp cho phộp phân tích hàm vitamin B1 trong khoảng 3-50mg cho độ lặp lại 99% và độ lệch chuẩn ?0,7% Phương pháp cho kết quảvới độ lặp lại cao nhưng không được dựng để định lượng thiamin trong cácchế phẩm dược đa thành phần và trong nguyên liệu tự nhiên Vỡ trong các chếphẩm dược đa thành phần và trong nguyên liệu tự nhiên có nhiều yếu tố gâyảnh hưởng đến thế của điện cực [20]

1.4.4 Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao

Điện di mao quản thế cao (HVCE) là một phương pháp phân tích hiệnđại, được phát triển trân cơ sở của điện di cổ điển, đã được ứng dụng trongkhoảng chục năm gần đây Phương pháp này ngày càng được áp dụng rộngrói trong nhiều lĩnh vực đặc biệt trong dược, y và sinh học

Phương pháp sắc ký điện di mao quản thế cao khác với phương pháp sắc

ký lỏng hiệu suất cao (HPLC) về cơ chế của sự tách, đó là sự di chuyển khácnhau của các phân tử chất tan (ion) dưới tác dụng của lực điện trường E củanguồn cao thế được đặt vào hai đầu của cột tách (ống mao quản) trong môitrường của dung dịch điện ly và chất đệm có pH thích hợp

Phương pháp này đã được sử dụng để phân tích bẩy vitamin tan trongnước thiamin, nicotinamide, nicotic acid, pyridoxin, ascorbic acid, folic acid,riboflavin và đã được áp dụng thành công trong dược phẩm Hỗn hợp có chứacác viatamin này được tách khỏi nhau trong thời gian 7 phút bằng sắc ký điện

di mao quản thế cao trong môi trường dung dịch điện di natri dodecyl sunfat(SDS) sau đó được phát hiện bằng detector UV-VIS và detector diode-aray.Phương pháp cho giới hạn phát hiện 0,08-1mg đối với acid forlic và 0,025-1mg nicotinamide và thiamin, với độ lệch chuẩn <6% đối với tất cả cácmẫu[21].

1.4.5 Phương pháp phổ huỳnh quang [3,12]

Trong các phương pháp quang hóa học định lượng thiamin, phương phápthiocrom được xếp lên hàng đầu, vitamin B1 (dưới dạng muối thiaminclohydrat) bị oxy hoá bởi kali ferixyanid ở môi trường kiềm cho một chất cóhuỳnh quang màu xanh da trời gọi là thiocrom, theo phản ứng sau đây

N N

Kaliferixyanua Thiamin

Thiocrom

N N

N S N

 Xác định vitamin B1 trong cơ thể người và cơ thể vật nuôi Mẫu có thể

là phần cứng, phần mềm hoặc ở dạng dung dịch được xử lý, táchvitamin B1 trong mẫu bằng cách đun cách thuỷ mẫu (90-1000c) trongmôi trường acid clohydric 0,1N khoảng 1giờ, tiến hành oxy hoávitamin B1 bằng kali fericyanid trong môi trường NaOH để chuyển

quang của thiamin ở bước sóng λEX=365nm, λEM =435nm Phương phápcho phép xác định thiamin ở khoảng 0-2µg/ml Độ lệch chuẩn 5-10%.Cách này không áp dụng cho các mẫu hấp thụ thiamin hoặc những mẫuchiết mà có chứa chất ảnh hưởng đến phổ huỳnh quang của thiocrom.

 Xác định vitamin B1 trong đối tượng hạt và củ Cơ chế của phươngpháp được tiến hành như trên nhưng trong đối tượng này thì quá trìnhchiết mẫu có thêm NaCl sao cho nồng độ cuối cùng của NaCl trongmẫu khoảng 5% để giúp cho quá trình tách được để dàng hơn sau đómới tiến hành tách bằng acid clohydric Phương pháp cho phép xácđịnh thiamin trong mẫu ở khoảng 0,25-2µg/ml Độ lệch chuẩn 5-10%.Phương pháp được áp dụng cho xác định thiamin trong bột mì, bột gạo,bột ngô, mì ống và các sản phẩm mỡ ăn liền trong đó các dạngthiamin khác hoặc thiamin pyrophosphate không gây ảnh hưởng

 Xác định vitamin B1 trong bánh mỳ Cơ chế của phương pháp vẫntương tự như trên nhưng quá trình tách vitamin B1 được tiến hành nhưsau: mẫu được đun cách thuỷ ở (90-1000c) trong môi trường acidclohydric 0,1N khoảng 30phút, điều chỉnh pH đến khoảng 4,5 bằngnatri acetat sau đó thêm 5ml dung dịch enzyme, làm ấm đến 450c, cáchthuỷ ở 45-500c trong vòng 1giờ để tách vitamin B1 và tiếp tục quá trìnhnhư trên Phương pháp cho phép xác định thiamin trong mẫu ở khoảng0,25-2µg/ml Độ lệch chuẩn 5-10% Phương pháp được áp dụng cho tất

cả các đối tượng thực phẩm

1.4.6 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao cho phép thiamin hoặc hợpchất tạo dẫn xuất của thiamin được tách trên cột thích hợp của sắc ký lỏnghiệu năng cao và được dò bằng đầu dò UV, huỳnh quang

1.4.6.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC với detector PDA[28]

Mẫu sau khi acid hoá bằng Trichloracetic, thu dịch chiết chứa vitamin

B1, tiêm dịch vào hệ thống máy HPLC với điều kiện detector PDA, bước sóng246nm Pha động là đệm phosphate (pH=3): ACN và chương trình gradient,cột Symmestry Water C18 (150mm × 4,6mm × 5µm)

1.4.6.2 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) với detector huỳnh quang (RF).

Sở Khoa học thực phẩm, Đại học College Dublin đã ứng dụng phươngpháp HPLC để xác định vitamin B1 trong thịt, các sản phẩm từ thịt Vitamin

B1 được tách từ các loại thịt bởi quá trình thuỷ phân với HCl 0,1N, sau đó làquá trình thuỷ phân bằng enzyme, giúp phosphoryl hoá các dạng phosphateester của vitamin B1 Các enzyme sử dụng cú hoạt động phosphatase, cúnguồn gốc từ lúa mỡ Tác giả đã lựa chọn enzyme diastase, enzyme loại này

cú sự hoạt động của hỗn hợp nhiều enzyme: Amylase, protease vàphosphatase Sau khi vitamin B1 bị oxi hoá thành thiocrom và phân lớp trongisobutanol, dịch chiết vitamin B1 sẽ được đem phân tích trờn máy HPLC vớipha tĩnh là cột C18, pha động là methanol: nước, bước sóng kích hoạt 450nm,bước sóng phát xạ 510nm [27]

Vào năm 1987, viện kiểm nghiệm thực phẩm của Pháp đã tiến hành xácđịnh hàm lượng vitamin B1 trong một số mẫu thực phẩm (nấm men, hạt ngũcốc, bỏnh qui) bằng phương pháp sắc kí lỏng, sử dụng đầu dò huỳnh quang.Với các mẫu thực phẩm chức năng, tỉ lệ thu hồi của phương pháp luơn trờn89%, chỉ ngoại trừ mẫu thực phẩm cú chứa chocolate thì tỉ lệ này là xấp xỉ50% Mặc dự điều đó là một bất lợi thì việc xác định hàm lượng vitamin B1

bằng phương pháp sắc ký lỏng vẫn được cụng nhận là phương pháp tốt nhất.[16]

Vỡ vậy, AOAC đã xây dựng phương pháp chính thức để xác địnhvitamin B1 trong thức ăn cho người và gia súc, trong sữa cho trẻ sơ sinh bằngHPLC với detector RF.Với mẫu thực phẩm được xử lớ qua các bước: thuỷphân bằng acid, bổ sung enzyme thuỷ phân, oxi hoá thiamin thành thiocrom,chiết thiocrom bằng isobutanol Mẫu thực phẩm khụng chứa thiamin ở dạngphosphate ester, dạng liân kết với protein thì khơng cần bổ sung enzyme thuỷphân [14], [15].

Trờn thế giới, cú nhiều đối tượng thực phẩm đã phân tích vitamin B1

bằng phương pháp HPLC như [25]: xác định vitamin B1 trong thực phẩmdành cho người ăn kiêng, với thành phần pha động là Methanol: Natriacetat(pH=4,5) tỉ lệ (60:40), cột C18, bước sóng kích hoạt 366nm, bước sóng phát xạ435nm Trong các sản phẩm thịt, với pha động là Chloroform: Methanol tỉ lệ

(90:10), cột Spherisorb Silica (50×0.21cm), bước sóng kích hoạt 367nm,

bước sóng phát xạ 418nm Trong ngụ, với pha động là đệm citrate 0,1N(pH=7): Methanol tỉ lệ (65:35), cột nucleosil- 5 C18 (15×0,46cm)

Thiamin được dẫn xuất với K3Fe(CN)6 trong mĩi trường kiềm tạo rathiocrom Dẫn xuất được phân tích trên thiết bị HPLC, detectơ huỳnh quangvới bước sóng kích hoạt λex= 365nm, bước sóng phát xạ λem = 435nm Phươngpháp này có ưu điểm là loại được ảnh hưởng của nền mẫu, có độ chọn lọc và

độ nhạy cao, được áp dụng rộng rói trong các viện kiểm nghiệm thực phẩmtrờn thế giới.Tuy nhiên mặt hạn chế của phương pháp là giá thành cao và phảiđầu tư lớn

Trong phạm vi đề tài nghiên cứu này với điều kiện cho phép của phòngthí nghiệm chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao sử dụngdetector RF để xác định hàm lượng Vitamin B1 trong gạo sau khi gạo đã đượcthuỷ phân bằng enzyme

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP

NGHIÊN CỨU

2.1 Đối tượng, thiết bị, hóa chất

2.1.1 Đối tượng nghiên cứu

 Đối tượng nghiên cứu ở đây là một số loại gạo có trên thị trường HàNội đang được nhiều người tiêu dùng sử dụng

 Địa điểm lấy mẫu: Tại một số chợ lớn, đại lý gạo trên địa bàn nộithành Hà Nội như: Chợ Cầu Giấy, chợ Mơ, chợ Ngã Tư Sở, chợHoàng Mai

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ, hóa chất và thuốc thử

 Thiết bị và dụng cụ

 Hệ thống HPLC của hãng Shimazu với detectơ huỳnh quang

 Cột phân tích water C18 (250mm×4,6mm, cỡ hạt 5µm) hóng

Symmestry

 Máy lọc hút chân không

 Máy siâu âm

 Dung dịch chuẩn trung gian 25 ppm: Hút chính xác 5ml dungdịch chuẩn 100 ppm, cho vào bình định mức 20ml, định mứcđến vạch bằng acid acetic 2,5%.

 Dãy dung dịch chuẩn làm việc: Từ dung dịch chuẩn trung gianvitamin B1 25 ppm, ta tiến hành pha loãng bằng acid acetic2,5%, được các dãy các dung dịch chuẩn làm việc cú nồng độ

từ 0,05; 0,2; 0,5; 1,0; 2,5; 5,0; 8,0; 10,0 ppm

 Dung dịch Natri acetat (CH3COONa) 2,5M: Cân chính xác 20,8g Natriacetat của Merck hòa tan bằng nước, cho vào bình định mức1000ml,định mức đến vạch bằng nước Nếu pha bằng Natri acetatetrihydrate (CH3COONa.3H2O) thì cân 170,1g hồ tan bằng nước cất chovào bình định mức 1000ml, định mức tới vạch bằng nước cất

 Dung dịch Natri hydroxit (NaOH) 3,75M: Cân chính xác 15g NaOHcủa Merck dựng nước định mức đến 100ml

 Chuẩn bị pha động chạy sắc ký:

 Đệm Acetat (0,05M, pH=4,5): Hút 2,85ml acid acetic (99%-100%) củaMerck cho vào bình định mức 1000ml, định mức bằng nước cất Đemchỉnh pH=4,5 bằng NaOH 3,75M

 Methanol (MeOH) của Merck

 Dung dịch Kali ferricyanide (K3Fe(CN)6) 1%: Cân chính xác 1g

K3Fe(CN)6 của Merck hồ tan bằng nước cất, cho vào bình định mức100ml và định mức tới vạch bằng nước cất

 Dung dịch dẫn xuất K3Fe(CN)6 : Hút chính xác 1ml K3Fe(CN)6 1%,cho vào bình định mức 25ml, định mức đến vạch bằng dung dịchNaOH 3,75M Dung dịch dẫn xuất được bảo quản ở nhiệt độ 4oC, tránhánh sáng

 Dung dịch axit HCl 0,1N: Hút 8,5ml dung dịch HCl đậm đặc (37%,d=1,19) của Merck cho vào bình định mức 1000ml, định mức đến vạchbằng nước cất

 Enzyme Taka-diastase từ Aspergillus oryzae (hãng Sigma, hoạt độ ≈

100u/mg), Clara- diastase (hãng Fluka, hoạt độ ≥35u/mg), α-Amylase

từ Aspergillus oyzae (hãng Sigma, hoạt độ ≈37,2u/mg).

 Chuẩn bị dung dịch enzyme 5%; 10%; 15%: Cân 5; 10; 15g enzymeTaka-diastase, 5; 10; 15g Clara- diastase, 5; 10; 15g α-Amylase: cholần lượt vào bình định mức 100ml, hồ tan bằng nước và định mức tớivạch bằng nước Sử dụng trong ngày và bảo quản ở nhiệt độ 2-80C

2.2 Nội dung nghiên cứu

Để đáp ứng mục tiêu nói trên chúng tôi thực hiện các nội dung sau đây:

2.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp xác định vitamin B 1 trong gạo

2.2.2 Đánh giỏ phương pháp đã xây dựng

- Xác định khoảng tuyến tính Lập đường chuẩn

- Xác định giới hạn phát hiện (LOD)

- Xác định giới hạn định lượng (LOQ)

- Xác định độ lặp lại (SD)

- Xác định độ đúng của phương pháp thông qua hiệu suất thu hồi R%

2.2.3 Ứng dụng phương pháp xác định vitamin B 1 trong một số loại gạo

2.3.1 Phương pháp lấy mẫu

Mẫu nghiên cứu gồm 2 loại gạo: RN64, Nàng Xuân Các mẫu này đượclấy ngẫu nhiên bằng cách mua tại một số chợ, đại lý trên địa bàn nội thành HàNội như: Chợ Cầu Giấy, chợ Mơ, chợ Ngã Tư Sở, chợ Hoàng Mai

Chọn mẫu, tiến hành lấy mẫu theo TCVN 5451-1991 [1]

Mỗi loại mẫu mua tại 3 cửa hàng, khối lượng mỗi mẫu mua từ 2kg- 5kgcho vào túi chất dẻo chứa mẫu, đóng kín, ghi tên mẫu và mang về phòng thínghiệm Tại phòng thí nghiệm mẫu được trộn đều, xay mịn, đồng nhất vàphân tích Mỗi mẫu sau khi đã trộn, được phân tích lặp lại 3 lần và cú kèmmột mẫu thờm chuẩn để xác định độ lặp lại và hiệu suất thu hồi trờn từng đốitượng mẫu Phần mẫu lưu cho vào trong túi đựng mẫu và bảo quản trong tủmẫu

2.3.2 Phương pháp phân tích vitamin B 1

Có nhiều phương pháp khác nhau để xác định hàm lượng vitamin B1, chúngtôi đã lựa chọn phương HPLC với detector huỳnh quang để phát hiện và địnhlượng vitamin B trong gạo Đây là phương pháp có hiệu quả phân tích, độ

chính xác cao cũng như có thể tự động hoá trong trường hợp phân tích hàngloạt mẫu.

Cơ sở lí thuyết của phương pháp được tóm tắt dưới đây:

2.3.2.1 Nguyên tắc chung về phương pháp HPLC [8], [6], [7], [10]

Sắc ký lỏng là quá trình tách xảy ra trên cột tách với pha tĩnh là chấtrắn và pha động là chất lỏng (sắc ký lỏng - rắn) Mẫu phân tích được chuyểnlên cột tách dưới dạng dung dịch Khi tiến hành chạy sắc ký, các chất phântích được phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Trong hỗn hợp các chấtphân tích, do cấu trúc phân tử và tính chất lí hoá của các chất khác nhau, nênkhả năng tương tác của chúng với pha tĩnh và pha động khác nhau Do vậy,chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau