luận văn công nghệ sinh học Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01 (Standard chrysanthemum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro

Có thể tạo được cây con sạch bệnh, đồng nhất về việcduy truyền với số lượng lớn trong thời gian ngắn, đáp ứng được nhu cầucho thực tiễn sản xuất, chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên

NHỮNG TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN

NS : Non-signficant (sai khác không có y nghĩa)LSD0.05 : Giới hạn nhỏ nhất sai khác có y nghĩa khi

so sánh ở xác suất 95%

LSD0.01 : Giới hạn nhỏ nhất sai khác có y nghĩa khi

so sánh ở xác suất 95%

PHẦN MỘT: MỞ ĐẦU

l ĐẶT VẤN ĐỀ

Hoa cúc (Chrysan Themumsp) là một trong những loài hoa được nhiềungười ưa chuộng và phổ biến nhất ở Việt Nam Hoa cúc là một trong 4 câytượng trưng cho người quân tử, tượng trưng cho 4 mùa “Tứ quí”

“Xuân lan, thu cúc, đông đào

Hạ chen hoa Lựu, Mai vào gió đông”

Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống vật chất cũng nhưtrình độ thẩm mỹ của con người được nâng cao, nhu cầu thưởng thức cáiđẹp cũng được coi trọng Do đó nhu cầu về hoa không ngừng tăng lên.Trong rất nhiều loài hoa thì hoa cúc đã được sự chú ý của người chơi hoa.Khi nói đến hoa, Người Việt Nam không chỉ nói đến hoa cúc vì hoa cúckhông chỉ hấp dẫn người tiêu dùng về màu sắc, hình dáng và mùi thêm kínđáo mà còn thu hút các nhà sản xuất kinh doanh bởi đặt trưng rất bền, mọiđặt tính mà không phải bất kỳ loài hoa nào cũng có Từ trước đến nay, hoacúc luôn được đánh giá là loài hoa có giá trị kinh tế cao, nhu cầu về loàihoa cúc lúc nào cũng lớn trên thị trường trong và ngoài nước Với các ưuthế đó, hoa cúc đang được các nhà trồng hoa chú trọng đầu tư và pháttriển Trong số các giống Cúc hiện nay, Cúc CN01 là giống có năng suấtcao, các đặt điểm về chất lượng hoa lại phù hợp với nhu cầu xuất khẩu,nên hiện đang trồng phổ biến Tuy nhiên, Cúc CN01 lại được trồng chínhvào mùa vụ mà thời tiết không thuận lợi, sâu bệnh nhiều… Việc nhângiống bằng phương pháp dâm cành vẫn còn gặp nhiều khó khăn

Thứ nhất: về chất lượng giống: các giống hoa Cúc hiện có ở Việt Namtuy được nhập nội và trồng chưa lâu nhưng bước đầu tiên đã giảm chấtlượng do sâu bệnh, do nhân giống và tính không được định kỳ phục trúng

giống Hiện tượng này làm giảm chất lượng sản phẩm như: bông không to,cành ngắn nhỏ… Vì vậy chưa đáp ứng nhu cầu của thị trường.

Thứ hai: Về kỹ thuật nhân giống, cây hoa Cúc nước Ta chủ yếu đượcnhân giống bằng phương pháp dâm cành nên hệ số nhân giống chưa cao,cây không sạch bệnh Hơn nữa phương pháp nhân giống này còn phụthuộc nhiều vào điều kiện thời tiết, khí hậu … gây khó khăn cho việc nhângiống trên đồng ruộng Ngoài ra trong công cuộc chuyển đổi cơ cấu câytrồng theo hướng sản xuất sản phẩm nông nghiệp hàng hóa có giá trị cao,việc phát triển hoa nói chung và hoa Cúc nói riêng phục vụ tiêu dùng vàxuất khẩu đang có sự bùng phát như vậy việc nghiên cứu nhân giốngnhanh là việc rất cần thiết

Với kỹ thuật nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy invitro tỏ ra ưu việt Có thể tạo được cây con sạch bệnh, đồng nhất về việcduy truyền với số lượng lớn trong thời gian ngắn, đáp ứng được nhu cầucho thực tiễn sản xuất, chính vì vậy chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:

''Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân giống cây hoa cúc CN01

(Standard chrysanthemum) bằng phương pháp nuôi cấy in vitro''.

- Nghiên cứu các phương pháp khử trùng cho các vật liệu đưa vào nuôi cấy

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến việc nhânnhanh hồi cúc

- Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều tiết sinh trưởng đến khả nănghình thành rễ để tạo cây hoàn chỉnh

- Nghiên cứu ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây in vi tro ở giaiđoạn vườn ươm.

PHẦN HAI

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

l GIỚI THIỆU VỀ CÂY HOA CÚC.

1.1 Nguồn gốc, vị trí, phân loại và các giống hoa cúc.

Hoa cúc (Chlysanthemum sp) là một loại hoa có nguồn gốc từ Trung

Quốc, Nhật Bản, Việt Nam và một số nước Châu Âu Hoa cúc được xếp vào

lớp hai lá mầm (Dicotyledones), phân lớp hoa cúc (Asterldae), bộ cúc

(Astelales), phân họ hoa ống (Asteloideae) chi (Chrysanthemum) Theo điều

tra hiện nay thì Chlysanthemum ở Việt Nam có 5 loài và trên thế giới có 20 loài Các giống loài thuộc chi Chlysanthemum chủ yếu làm hoa và cây

cảnh[1]

Chi Chlysanthemum thuộc cây thân thảo, sống một năm hay lâu năm,

thường mọc thẳng đứng, đơn hoặc phân cành nhánh nhiều Lá thường chiathuỳ, mọc cách và không có lá kèm, mép lá cớ khía răng cưa Hoa lưỡng tính,tập hợp thành cụm hoa, hình đầu lớn người ta thường gọi là hoa tự đầu trạng.Mỗi cánh hoa thực chất là một bông hoa, tràng hoa hình ống Bộ nhụy gồmhai lá noãn luôn luôn dính lại thành bầu dưới, có một ô và một noãn Quả bế,nhẵn, không cánh, chỉ có một hạt nằm trong khoang quả và đôi khi nó lại dínhvới quả

Các loài thuộc chi Chrysanthemum hoa thường to, có màu vàng, trắng,

tím đậm, tím nhạt hay hồng

Hiện nay hoa cúc có rất nhiều chủng loại giống khác nhau:

- Giống cũ gồm có các loại: Cúc gấm, vàng Đà Lạt, hoạ mi, chi thơm, đỏ

Ấn Độ, tím hoa cà

- Giống mới nhập nội gồm có: CN93, CN97, CN98, tím hè, vàng Đài Loan,tím xoáy, tím Hà Lan, đỏ tiết dê, tím sen, và tập đoàn cúc chi có nguồngốc từ Hà Lan gồm rất nhiều giống khác nhau [ l 3]

l.2 Giá trị kinh tế của cây hoa cúc.

Cúc là một lại hoa đẹp thường được dùng trong các ngày lễ, tết, cướixin và được sử dụng với nhiều cách như trồng đại trà để cắt hoa cắm bình,trồng trong bồn, trang trí trong nhà, trong vườn hoa và công viên

Sản xuất và kinh doanh hoa cúc đã đem lại cho người trồng hoa nhiềulợi nhuận Trên mỗi sào (bắc bộ) đất trồng trọt, với mật độ trung bình: 50 cây/

m2 , người trồng có thể thu được từ 5 - 6 triệu đồng (tính giá trung bình 300đ/bông) và chi phí cho làm đất, chăm sóc, giống và các vật tư khác thì hết l,8 -

2 triệu đồng Trong khi đó với cây lúa thu nhập chỉ đạt 350.000 - 400.000đ/sào [ l4]

Ngoài ra, nếu hoa được đùng xuất khẩu thì lợi nhuận còn lớn hơnnhiều Hiện nay, với sự thành công của các biện pháp kỹ thuật như kéo dàituổi thọ của hoa, điều khiển hoa ra theo ý muốn, trồng hoa trái vụ hoặc cho nởvào các dịp lễ tết, đã làm cho giá trị của hoa được tăng lên rất nhiều lần

Bên cạnh đó, hoa còn được dùng để chế tinh dầu thơm, pha trà, ngâm

rượu, làm thuốc trừ sâu Đối với ngành y dược, một số loại cúc còn có tác

dụng chữa bệnh đau đầu, đau mắt…

1.3 Vài nét về cây hoa cúc CN0l

CN01 là giống cúc đơn (standald Chrysanthemum) ĐÂY là giống

nhập nội của Nhật Bản, được đưa ra từ Trung tâm hoa - cây cảnh - Viện Ditruyền Nông nghiệp tháng 3 năm 2001

Giống có đặc điểm cây cao (70 - 75 cm), thân mập cứng, lá dài xanh

bóng, bộ lá gọn Khả năng phân cành ít nên có thể trồng dày 45 – 50 cây/m2.Hoa kép to, cánh ngắn, cứng, xếp chặt, có màu và vàng cam Thời gian sinhtrưởng từ 85 - 95 ngày, độ bền hoa cắt từ 10 - l2 ngày, được trồng chính vàocác vụ xuân hè, hè thu, và thu sớm

Theo số liệu thống kê chưa đầy đủ từ Phòng nông nghiệp các tỉnh phía bắc,năm 2003, diện tích trồng cúc CN01 đã lên đến 6,3 ha, riêng Hà Nội có 4,9 ha[15].

l.4 Tình hình sản xuất cây hoa cúc

14.l Tình hình sản xuất cây hoa cúc trên thế giới

Trên thế giới, cây hoa cúc được trồng ở nhiều nước như Trung Quốc, NhậtBản, Hà Lan, Pháp, Mỹ Trong đó, Hà Lan là một trong những nước xuấtkhẩu hoa cúc nói riêng và hoa cắt nói chung lớn nhất trên thế giới Diện tíchtrồng hoa ở nhà kính và ở ngoài trời từ năm l970 là 709 ha, đến năm 1984 là

5016 ha Hàng năm, Hà Lan đã sản xuất hàng trăm triệu cành hoa cắt, hoachậu phục vụ cho thị trường tiêu thụ rộng lớn gồm hơn 80 nước ở khắp nơitrên thế giới Đặc biệt ở Nhật Bản, nhu cầu sử dụng hoa cúc rất lớn, diện tíchtrồng là loại hoa này chiếm khoảng 70% tổng diện tích trồng các loại hoakhác Tuy vậy, hàng năm ở Nhật Bản vẫn phải nhập một số lượng lớn hoacúc từ Hà Lan

Ở Thái Lan, hoa cúc là một trong những cây trồng quanh năm, với sốlượng cành cắt hàng năm là 50.841.500 cành

Trung Quốc là một trong những nước có kỹ thuật tiên tiến trong việcsản xuất hoa cúc khô và là nơi có nguồn hoa cúc phong phú

1.4.2 Tình hình sản xuất hoa cúc ở Việt Nam.

Ở Việt Nam, diện tích trồng hoa cúc còn ở mức khiêm tốn, khoảng

3500 ha, tập trung chủ yếu ở các vùng trồng hoa như Hà Nơi, Hải Phòng, ĐàLạt và chủ yếu là các giống cúc nhập nội Riêng Hà Nội và thành phố HồChí Minh, hàng năm sản xuất hàng chục triệu cành hoa cúc cắt, cúc chậu phục

vụ cho nhu cầu trong nước

Hải Phòng, cúc là cây quan trọng thứ hai trong cơ cấu sản xuất hoatươi Cùng với layơn, cúc là một mặt hàng xuất khẩu trong những năm tới

Ở các tỉnh phía Nam như Đà Lạt, Huế là nơi có diện tích trồng cúc lớnnhất Đà Lạt là vùng lý tưởng cho nhiều giống cúc sinh trưởng và phát triển

Có thể nói, so với những năm trước đây sản xuất hoa cúc ở Việt Nam là

đã tăng lên đáng kể Tuy nhiên, lương hoa sản xuất ra thực sự còn rất hạn chế

so với nhu cầu rất cao của thị trường, cũng như tiềm năng kinh tế to lớn màcây hoa cúc có thể mang lại nếu được đầu tư phát triển 19]

Ở Việt Nam hiện nay việc nhân giống cây hoa cúc chủ yếu bằngphương pháp vô tính gồm hai biện pháp:

- Nhân giống bằng giâm cành: Chọn cành bánh tẻ, to khoẻ, không sâu bệnhlàm cành giâm Cành giâm có chiều dài 6 - 8 cm, có 3 - 4 lá, sau khi giâmphải che nắng, che mưa, giữ ẩm 70% - 80%

- Nhân giống bằng nuôi cấy in vitro: Là phương pháp được dùng phổ biếnhiện nay ở các nước trồng cúc, bởi cây cúc dễ nhân trong ống nghiệm, hệ

số nhân cao, giá thành hạ, cây con sạch bệnh Đặc biệt phương pháp này

có thể duy trì và nhân giống quanh năm, không phụ thuộc vào điều kiệnngoại cảnh Từ các mô, các cơ quan khác nhau qua nuôi cấy người ta cóthể tạo ra những cây hoàn chỉnh, hoàn toàn sạch bệnh và đồng nhất vềmặt di truyền [16]

2 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU CÂY HOA CÚC TRÊN THẾ GIỚI VÀ Ở VIỆT NAM

Do giá trị kinh tế cũng như giá trị sử dụng của cây hoa rất cao mà trênthế giới có rất nhiều nước đi sâu nghiên cứu kỹ thuật trồng hoa, kỹ thuật nhân

và tạo giống hoa mới

2.l Tình hình nghiên cứu cây hoa cúc ở lĩnh vực nuôi cấy mô tế bào

Năm l974, Asjes và công sự (Hà Lan) đã chứng minh rằng có thể sửdụng nhiều bộ phận của cây hoa cúc để làm vật liệu nuôi cấy mô Ông đã ứngdụng thành công kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng để tạo ra các giống cúcsạch bệnh

Việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy in vitro cũng được thực hiệnthành công bởi Fukai, Goi và Yanaka (1991) Các tác giả đã nghiên cứuphương pháp tối ưu để tạo mẫu vô trùng có tỷ lệ sống và tái sinh chồi caonhất Kết quả thí nghiệm cho thấy, bảo quản chồi đỉnh cúc trước nuôi cấy 2ngày trong điều kiện lạnh dần cứ 0,20C/phút đến -400C Với 10% dimethylsufoide và 3% gluco cho tỷ lệ sống và tái sinh chồi rất cao, có loài lên tới100%

Ngoài chồi đỉnh, nhiều nhà nghiên cứu đã sử dụng các bộ phận kháccủa cây hoa cúc để nuôi cấy như đoạn thân, mẫu lá Kaul, Miller, Hutchison,Richards (1990) cho thấy các đoạn thân có khả năng tái sinh chồi cao hơn cácmẫu lá Cùng năm đó Lu, Negent và Wardley đã thành công việc tái sinh cây

trực tiếp từ những đoạn thân của hoa cúc Chlysanthemum morifolium Ramat

trên môi trường cơ bản MS có bổ sung 0,2-0,5 mg/l BAP và 0,2-2 mg/l NAA

Tỷ lệ tạo chồi cao nhất là 100% Đối với những đoạn thân của cây đã thànhthục, khả năng phát sinh chồi cao hơn [28] Người ta còn có thể nhân giốnghoa Cúc bằng cách tái sinh Callus từ các mẫu cấy thân và lá Rasthasarathi,Bhattaccharya, Satyahari, Nilanana (1960) đã nuôi cấy callus từ lá và thân củaChrysanthemum morifoliun trên môi trường MS có bổ sung 2mg/l 2,4D trong

2 tuần Sau đó, các tác giả đã tái sinh chồi từ callus trên môi trường đặc MS

có bổ sung 1mg/l IAA và 0,2 mg/l BAP Sau 2 tuần 1cm2 callus được tái sinh2-3 chồi

Ngoài ra, việc sử dụng cánh hoa, quả để làm nguyên liệu nuôi cấy tạochồi trực tiếp hoặc gián tiếp cũng được nhiều nhà khoa học nghiên cứu [32]

Cho đến nay, việc sử dụng chồi đỉnh và chồi nách để làm nguyên liệucho nuôi cấy mô vẫn là biện pháp phổ biến nhất bởi vì sử dụng chồi đỉnh vàchồi nách dễ thành công, ít nhiễm bệnh, có hiệu quả cao hơn so với việc sửdụng các bộ khác của cây hoa cúc để nuôi cấy Sử dụng phương pháp này,cho phép tạo một số lượng lớn cây con giống, sạch bệnh đồng nhất về mặt di

truyền trong thời gian ngắn, hoàn toàn đáp ứng được cho sản xuất ở quy môcông nghiệp

Để hoàn thiện quá trình nuôi cấy mô hoa cúc, các nhà nghiên cứu đã đisâu tìm hiểu ảnh hưởng của một số điều kiện và yếu tố môi trường trongnhân nhanh in vitro như ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ, điều kiện ánhsáng Bên cạnh đó, việc nghiên cứu giai đoạn cuối cùng của quá trình vi nhângiống là giai đoạn đưa cây in vitro ra ngoài đất cũng rất quan trọng Đây làbước quyết định hiệu quả của toàn bộ quá trình vi nhân giống vào thực tiễnsản xuất Roberts và Smith (1990) đã nghiên cứu bảo vệ rễ bằng chất đệmcellulose sorbarods trong môi trường nuôi cấy dạng lỏng, làm giảm thiệt hạitrong quá trình đưa cây ra ngoài [35]

2.2 Các nghiên cứu khác về cây hoa cúc.

Ngoài lĩnh vực nuôi cấy in vitro, các nhà khoa học trong và ngoài nướcquan tâm nghiên cứu cây hoa cúc ở các lĩnh vực khác như:

Năm 1982, các nhà chọn giống Ấn Độ đã xử lý tia gamma ở liều lượng

từ 0,1-0,5kr ở những cành cúc đã ra rễ và thấy, có thể làm thay đổi hình dạnghoa Cũng bằng phương pháp này nhưng xử lý ở liều lượng 2,5 kr ở các đoạn

thân cắt Kawai và đồng sự (1979) đã tạo ra 7 giống Chrysanthemum có màu

sắc khác nhau

Năm 1995, Florigene là một trong những công ty đầu tiên ở Hà Lanchuyển những giống cúc màu hồng thành màu trắng do genchalconsesynthase khống chế việc tổng hợp sắc tố

Theo Hoogeweg (1999) thời gian chiếu sáng 11 giờ cho chất lượng hoacúc tốt nhất Nhưng nếu ở nhiệt độ cao thì ức chế sự ra hoa, nên vào nhữngnăm nóng ấm sự ra hoa của cúc sẽ gặp nhiều khó khăn mặc dù điều kiện ánhsáng đã phù hợp [27] Theo Nishico (1987) vào thời kỳ ra hoa yêu cầu thời

gian chiếu sáng là 10 giờ, nhiệt độ thích hợp là 180C, nếu thời gian chiếu sángdài cúc sẽ kéo dài thời gian sinh trưởng, cây cao, lá to, ra hoa muộn [26]

Để tăng tỷ lệ sống sót và có chiều cao cây phù hợp với giai đoạnchuyển cúc in vitro ra vườn ươm, Obmerga và Remando (1997) đã kết luận

việc sử dụng paclobutrazol ở nồng độ 0,5g ai/ha cho giống Reddelano và 100g ai/ha cho Pinklady là có kết quả tốt trong việc rút ngắn chiều cao, tăng

lệ sống và trong một phạm vi nào đó còn trì hoãn sự nở hoa [9]

Năm 1992, Sanjaya (Indonexia) khi nghiên cứu ảnh hưởng của 6 côngthức xử lý các chất điều tiết sinh trưởng là IAA, IBA, -NAA, biorota,rootonef và đối chứng không xử lý đã chỉ ra IBA là có hiệu quả cao nhấttrong việc nâng cao số lượng rễ cũng như chiều dài ra rễ [35]

Khí nghiên cứu hiệu quả của IBA đến sự ra rễ của cành giâm Nongkran(1989) đã nhận thấy ở nồng độ 1000 ppm khi xử lý ở các kiểu cúc chùm vàcúc đơn cho hiệu quả cao nhất so với nồng độ 3000ppm và 8000ppm

2.3 Tình hình nghiên cứu về cây hoa cúc ở Việt Nam

Ở Việt Nam, mạc dù cây hoa cúc đã được nhập nội vào nước ta từ lâunhưng sự hiểu biết về cây hoa này cũng như kết quả nghiên cứu còn chưanhiều Nhìn chung các kết quả nghiên cứu thường tập trung chủ yếu vào việctập hợp các kinh nghiệm trồng hoa và các phương pháp nhân giống

Năm l969, Võ Văn Chi, Lê Khả Kế [2] khi điều tra phân loại cây cỏ ởViệt Nam đã kết luận họ cúc rất lớn, có nhiều chi và nhiều loài, hiện nay trênthế giới có khoảng 20.000 loài và trên l.000 giống đã được trồng phổ biến,riêng ở Việt Nam có 75 giống, 199 loài

Từ năm l992, Trung tâm Hoa - cây cảnh Viện Di truyền Nông nghiệpkết hợp với Bộ môn nuôi cấy mô tế bào của Viện đã tiến hành nghiên cứu xâydựng qui trình nhân giống cây hoa cúc bằng phương pháp nuôi cấy in vitro.Tiến hành thu thập khảo sát và đánh giá một số giống cúc mới, kết quả là từ

2/1993 đến tháng 2/1999, giống cúc CN93 và CN98 đã được Hội đồng khoahọc Bộ Nông nghiệp cho phép khu vực hóa, đến tháng 4/1996 và 9/2000 lầnlược hai giống cúc CN93 và CN98 đã được công nhận là giống cúc quốc gia[14]

Năm 1988, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự đã xây dựng hoàn chỉnh

qui trình nhân giống bằng nuôi cấy mô cho một số giống cúc đang được trồngphổ biến ở miền Bắc nước ta như cúc CN93, vàng Đài Loan, đỏ Hà Lan [9]

Trung tâm Hoa - cây cảnh của Viện Di truyền Nông nghiệp đã sử dụngkích phát tố của công ty Thiên Nông với liều lượng 1g thuốc pha trong l lítnước sạch rồi nhúng phần gốc của cành khoảng 30 phút Sau đó, đem phầndung dịch thuốc còn lại pha thêm 5g phân bón lá phun lại lên cành giâm Cứ3-5 ngày phun dung dịch này một lần có thể đảm bảo từ 80 - 90% số cây ra rễvới thời gian rút ngắn so với đối chứng từ 3 - 5 ngày, phương pháp nàythường được áp dụng trong việc nhân giống vào mùa hè cho hiệu quả cao [14]

Theo Nguyễn Quang Thạch và các cộng sự (1998) để nâng cao tỷ lệsống và ra rễ của cành giâm trong nhân giống vô tính có thể sử dụng IBAhoặc -NAA với nồng độ 1000 ppm bằng cách nhúng phần gốc của cànhkhoảng 0,5-1cm vào dung dịch thuốc từ 3-5 giây rồi cắm vào đất hoặc cát [9]

Điều tra về sâu bệnh hại trên cây hoa cúc, các tác giả của Trung tâmhoa - cây cảnh Viện Di truyền Nông nghiệp đã đề xuất các biện pháp phòngtrừ và xác định trên cúc có 9 loại bệnh hại bao gồm 7 bệnh hại do nấm, 1bệnh do vi khuẩn và 1 bệnh vàng lá do sinh lý Những bệnh do nấm gây rabao gồm đốm lá, phấn trắng, đốm nâu, gỉ sắt, đốm vòng, héo ngọn, lở cổ rễ vàhéo vi khuẩn Trong đó, gây thiệt hại đáng kể nhất là bệnh đốm lá có thể dùngScore 250ND, bệnh phấn trắng dùng Daconil 75WP, bệnh đốm vòng, đốmnâu có thể dùng Zineb 80WD hoặc Boocdo 1% để phòng trừ Về sâu hại chủyếu 1à sâu xanh, sâu khoang có thể dùng Pegasus 500SC Các côn trùng

khác như rệp muội, nhện dùng Oncol 20EC hoặc Karate 2,5EC Để phòng trừ

có hiệu quả cao cần kết hợp với các biện pháp canh tác, diệt bỏ các tàn dừ gâybệnh, sử dụng nguồn giống khoẻ mạnh và sạch bệnh [18] [9][ l0]

3 NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG TÁC NHÂN GIỐNG

3.1- Khái niệm về nuôi cấy mô tế bào.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho tất cả cácloại nuôi cấy từ nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, trên môitrường nhân tạo trong điều kiện vô trùng Cho đến nay, nuôi cấy mô tế bàothực vật được xem giải pháp công nghệ quan trọng trong công nghệ sinh họcnói chung Trên môi trường nhân tạo, từ các môn hoặc các cơ quan thực vậtban đầu có thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh và chỉ trong một thời gian ngắn

có thể tạo ra một lượng lớn cây trồng có cấu trúc di truyền và các đặc điểmsinh học giống hệt nhau

3.2 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô và tế bào thực vật.

3.2.l Tính toàn năng của tế bào thực vật

Mỗi một tế bào của cơ thể đa bào đều chứa đầy đủ vật chất di truyềncủa cơ thể

Tính toàn năng của một tế bào cho phép từ những cơ quan, bộ phận của

cơ thể tái sinh thành cây hoàn chỉnh đồng nhất về mặt di truyền với cây mẹ

3.2.2 Sự phân hóa và phản phân hóa của tế bào.

Sự phân hoá là sự chuyển các tế bào từ dạng phôi sinh sang tế bàochuyên hoá để đảm nhận chức năng sinh lý, sinh hoá khác nhau

Sự phản phân hóa là sự chuyển từ tế bào chuyên hóa sang tế bào phôisinh để thực hiện chức năng phân chia

Hoạt động của các quá trình này được điều khiển bởi các chất điều hòasinh trưởng thực vật, cũng như các yếu tố nhiệt độ, môi trường, ánh sáng

3.2.3 Vật liệu nuôi cấy.

Ở cơ thể thực vật đa bào đều có tính toàn năng nghĩa là đều có khảnăng phân hóa tái sinh thành một cây hoàn chỉnh từ một tế bào, mô, cơ quantrong môi trường dinh dưỡng nhân tạo và môi trường có điều kiện thích hợp

Do vậy về nguyên tắc bất kỳ một bộ phận nào của cây cũng có thể sử dụnglàm vật liệu nuôi cấy, có thể là cơ thể thực vật nguyên vẹn như cây con, mầmnon, … các mô sẹo, các tế bào đơn, tế bào trần

Tuy nhiên, khả năng này phụ thuộc vào từng loài Có loài dễ tái sinh từ

mô nuôi cấy như khoai tây, cà chua, thuốc lá có loài rất khó như hoa đồngtiền, trầm hương Thông thường các giai đoạn sinh trưởng khác nhau của môcũng như các bộ phận khác nhau của cây, khi nuôi cấy sẽ cho những kết quảkhác nhau Điều đáng chú ý là những mô nuôi cấy có nguồn gốc từ cây invitro có khả năng phát sinh, phát triển tốt hơn so với những mô nuôi cấy cónguồn gốc là những cây ngoài tự nhiên hay trong nhà kính Điều này đã đượcEconomau và Read (1986) chứng minh ở cây đỗ quyên, Liu và Sanford( 1988) chứng minh ở cây dâu tây Nhìn chung, tất cả các bộ phận như thân,

lá, rễ, cuống lá đều có thể sử dụng để nuôi cấy, nhưng các cơ quan này do

có sự chuyển hoá khác nhau nên quá trình giải mã các thông tin di truyềntrong đó để tạo mô, tạo chồi, tạo rễ, tái sinh cây là cũng rất khác nhau Kích thước mô nuôi cấy khác nhau sẽ cho các phản ứng không giốngnhau và có liên quan mật thiết với tỷ lệ sống, cũng như mức độ ổn định vềmặt di truyền của mô cấy Do đó, tuỳ từng đối tượng, từng loại mô và mụcđích sử dụng mà người ta nuôi cấy mô có kích thước khác nhau cho phù hợp[4]

3.2.4 Môi trường nuôi cấy

Mô nuôi cấy bị tách rời ra khỏi cơ thể mẹ nên mất khả năng tự dưỡng.

Vì vậy, để cho mô tồn tại, và phân hóa thì trong các giai đoạn nuôi cấy phảitạo ra được môi trường, có đủ các chất dinh dưỡng mà cây cần thiết Thànhphần hoá học của môi trường dinh dưỡng gồm chủ yếu là muối khoáng,nguồn cacbon, chất điều hoà sinh trưởng Môi trường thường được sử dụngnhiều nhất trong nuôi cấy mô là môi trường MS (Murashige Skoog, l962 ).Môi trường này, giàu thành phần đa lượng (K+, Ca+, Mg++ ) có tác dụng tốtđối với sự tăng trưởng của mô Thành phần vi lượng ( Mn++, Co+, Cu++ ) cầndùng với nồng độ thấp Sắt cần cho sự chuyển hoá, thiếu sắt tế bào mất khảnăng phân chia Nguồn cacbon đưa vào mới trường nuôi cấy in vitro là bắtbuộc Đây là nguồn cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh lý, sinh hoádiễn ra trong mô

Saccharo là nguồn cacbon tốt nhất trong nuôi cấy, nồng độ thường sửdụng là 2 - 3% Mô và tế bào nuôi cấy có tổng hợp được vitamin nhưngkhông đủ, nên trong nhiều trường hợp người ta cũng bổ sung vitamin và chủyếu là B1, B6, m = inositol Vitamin rất nhạy cảm với tăng trưởng của mônuôi nên được sử dụng ở nồng độ thấp, nó có vai trò quan trọng trong sinhtổng hợp tế bào [4], [12], [24]

Các loại nước trái cây như nước dừa, dịch chiết chuối, dịch chiết càchua… các hỗn hợp axit amin nhân tạo cũng được sử dụng trong nuôi cấy invitro, vì thành phần của nó có nhiều chất thúc đẩy tăng trưởng của mô TheoTukele và cộng sự (1981) trong thành phần nước dừa có các axit amin,protein và axit hữu cơ, đường, auxin, cytokynin và các chất quan trọng khác

có tác dụng tốt trong việc tăng trưởng mô [l 2], [25]

3.2.5 Điều kiện nuôi cấy.

Nuôi cấy in vitro là quá trình nuôi cấy trong điều kiện vô trùng, sử dụngnguồn ánh sáng bằng đèn Neon có thể điều khiển được Trong phòng thí

nghiệm cường độ ánh sáng thường được sử dụng là 2000 - 3000 lux, điềukiện nhiệt độ luôn luôn ổn định từ 25 - 270C.

3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô tế bào thực vật.

3.3.l ảnh hưởng của nhiệt độ.

Nhiệt độ là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân chia tế bào và quátrình trao đổi chất trong mô Ảnh hưởng của nhiệt độ bên trong và bên làngoài bình nuôi cấy đã được Murashige nghiên cứu vào năm 1947 Theo ông,nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật nóichung Ngoài ra, nó còn ảnh hưởng trực tiếp đến sự phát triển của từng tế bàoriêng rẻ và khả năng tạo các cơ quan của mô nuôi cấy

Trong nuôi cấy in vitro, mỗi một loài có biên độ nhiệt độ thích nghikhác nhau Nhiệt độ luôn được hạn chế trong hệ thống nuôi cấy nên mô nuôicấy sẽ dễ thích nghi hơn với môi trường Nhiệt độ thích hợp nhất cho nuôi cấy

in vitro chưa được xác định chính xác, nhưng khoảng từ 20 - 270C được sửdụng nhiều nhất [20]

Nhiệt độ cũng có tác động qua lại tương hỗ với cường độ ánh sáng, chu

kỳ chiếu sáng và những chất thêm vào trong môi trường nuôi cấy

3.3.2 ảnh hưởng của ánh sáng.

Ánh sáng là nhân tố ảnh hưởng đến sinh trưởng, phân hoá của mô vàhình thái của cây Các chỉ tiêu cần chú ý là: cường độ ánh sáng, chu kỳ chiếusáng và chất lương ánh sáng

Cường độ chiếu sáng ảnh hưởng đến quá trình sinh lý, sinh trưởng và

sự hình thành các cơ quan của mô cấy

Chu kỳ Chiếu Sáng cũng ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình nuôi cấy.Tuy nhiên, qua thực tế nghiên cứu, người ta nhận thấy khó tách biệt ảnhhưởng của chu kỳ chiếu sáng ra khởi ảnh hưởng của cường độ ánh sáng Đốivới nhiều loài, thời gian chiếu sáng trong nuôi cấy tốt nhất từ l2-16 giờ/ngày

Chất lượng ánh sáng cũng ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình sinhtrưởng của mô nuôi cấy và có liên quan đến sự thay đổi nồng độ hocmon nộisinh [20].

3.3.3 ảnh hưởng của việc xử lý mẫu.

Mẫu vật nuôi cấy khi bị xử lý bằng hoá chất hay những tác động kháctrước khi nuôi cấy sẽ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của nó trong quátrình nuôi cấy Hoạt tính của hocmon nội sinh ở mẫu vật nuôi cấy bị ảnhhưởng rõ rệt do xử lý Trong nghiên cứu, nhiều tác giả đồng ý với Geler vàđồng sự (1979) rằng: khả năng phát sinh cơ quan của mẫu vật sẽ yếu đi vàkhông thể bù đắp hoàn toàn bởi lượng hocmon thêm vào trong môi trườngnuôi cấy [5]

3.3.4 ảnh hưởng của chất điều khiển sinh trưởng.

Các chất diều khiển sinh trưởng rất nhạy cảm với sự tăng trưởng vàphát triển của mô nuôi cấy ở nồng độ thấp thì kích thích sinh trưởng nhưng ởnồng độ cao lai ức chế sinh trưởng Ba nhóm chất điều khiển sinh trưởng điểnhình là: auxin, cytokinin và gibberellin Tuy nhiên, trong nuôi cấy mô và tếbào, người thường chỉ sử dụng hai nhóm chất chính là auxin và cytokinin [5]

Auxin là chất điều khiển sinh trưởng do Went và Thimann (1939) pháthiện, chủ yếu kích thích sinh trưởng của tế bào nhưng cũng làm tăng phân bào[l2] Các chất thuộc nhóm auxin thường được sử dụng là IAA, IBA, -NAA

và 2,4D Các chất này can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý của mô nuôicấy Thông thường, sử dụng auxin trong nuôi cấy lúc đầu ở nồng độ cao, sau

đó ở nồng độ thấp hơn để tránh tình trạng nhiễm độc [11 ]

Cytokinin được Skoog phát hiện lần đầu tiên (1950) trong khi thínghiệm chiết suất axit nucleic Đó là những cấu tử của axit nucleic bị phânhuỷ thành Cytokinin có tác dụng kích thích phân bào mạnh Ba chất thườngdùng trong nuôi cấy mô tế bào là kinetin, BAP, và zeatin Trong đó kinetin

lược sử dụng nhiều nhất Những sản phẩm này kích thích sự phát sinh chồinuôi cấy, nếu phối hợp xử lý cùng auxin ở tỷ lệ nồng độ thích hợp thì sẽ kíchthích quá trình phân chia tế bào BAP là sản phẩm tổng hợp nhân tạo Hoạtlực của BAP cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơnzeatin với tác động của nhiệt độ cao Zeatin ít được dùng vì quá đắt [l2].

Gibberellin điển hình là GA3 có tác dụng kích thích tăng trưởng củađỉnh sinh trưởng, cảm ứng sự kéo dài của thân, thúc đẩy sự hoạt động của cácphôi dinh dưỡng, phôi ngủ nghỉ của hạt, chồi, kích thích ra hoa của cây ngàydài trong điều kiện ngày ngắn Tuy nhiên, sự tác động của gibberellin đến các

tế bào nuôi cấy in vitro là không rõ rệt [11]

3.4 Các nguyên tắc kỹ thuật về nhân giống in vitro.

Giai đoan1: Khử trùng mô cấy

Đây là giai đoạn tối quan trọng, thậm chí quyết định toàn bộ quy trìnhnhân giống in vitro Mục đích của giai đoạn này là tạo ra được tạo ra đượcnguyên liệu thực vật vô trùng để đưa vào nuôi cấy in vitro Khử trùng môthực vật người ta thường dùng một số chất hoá học như HgCl2, Ca(OCl)2 ,NaOCl, H2O2 Tùy thuộc vào từng loại mô thực vật mà lựa chọn nồng độ vàthời gian xử lý hoá chất thích hợp

Giai đoan 2: Tái sinh mô nuôi cấy.

Trong nhân giống in vitro, mẫu nuôi cấy thường được sử dụng là chồihoặc chồi nách của cây mẹ Ngoài ra, tuỳ từng đối tượng mà người ta còn cóthể dùng các mẫu nuôi cấy là rễ, thân, lá, đài hoa, cánh hoa Mục đích của giaiđoạn này là sự tái sinh một cách định hướng các mô nuôi cấy: Quá trình nàyđược điều khiển chủ yếu dựa vàn tỉ lệ các hợp chất auxin/cytokinin ngoại sinhđưa vào môi trường nuôi cấy Tuy nhiên, cần phải quan tâm đến tuổi sinh lýcủa mẫu cấy Thường các mô non chưa phân hoá có khả năng tái sinh cao hơncác mô trưởng thành đã chuyên hoá sâu Theo Anolerson (l980) mẫu cấy của

cây được lấy vào thời kỳ sinh trưởng mạnh cho kết quả rất khả quan trong táisinh chồi.

Giai đoan 3: Nhân nhanh chồi.

Toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét cho cùng là nhằm mục đíchtạo ra hệ số nhân cao nhất Chính vì vậy, giai đoạn này được xem là giai đoạnthen chốt của quá trình

Để tăng hệ số nhân người ta thường phải đưa thêm vào môi trường dinhdưỡng nhân tạo các chất điều hòa sinh trưởng (auxin, cytokinin,gybberellin ) Các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men,dịch thủy phân Casein… kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng thích hợp.Tùy thuộc vào từng đối tượng nuôi cấy người ta có thể nhân nhanh bằng kíchthích sự hình thành các cụm chồi (nhân cụm chồi), hay kích thích sự pháttriển của chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua việc tạo cây từ phôi vôtính

Giai đoan 4: Tạo cây hoàn chỉnh.

Khi đạt kích thước nhất định các chồi được chuyển từ môi trường ở giaiđoạn 3 sang môi trường tạo rễ Thường sau từ 1-2 tuần, từ những chồi riêng lẻnày sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây hoàn chỉnh Ở giai đoạn này, người tathường bổ sung vào môi trường nuôi cấy các auxin, vì auxin là hocmon thựcvật quan trọng có chức năng tạo rễ phụ từ mô nuôi cấy [33] Trong nhóm này,các chất IAA, IBA, -NAA và 2,4D được sử dụng, nghiên cứu nhiều nhất

Giai đoan 5: Đưa cây ra đất.

Giai đoạn đưa cây hoàn chỉnh (có đủ thân, rễ, lá) từ ống nghiệm ra đất

là bước cuối cùng của quá trình nhân giống in vitro và là bước quyết định khảnăng ứng dụng quá trình này trong thực tiễn sản xuất

Cây lấy ra từ ống nghiệm phải được rửa sạch agar bám trên bề lặt rễ đểtránh sự xâm nhập của côn trùng và nấm mốc

Đây là giai đoạn chuyển cây con từ trạng thái sống dị dưỡng sang sốnghoàn toàn tự dưỡng Do đó, để đảm bảo cho cây có tỷ lệ sống cao thì cần phảiđưa cây ra vườn ươm, ươm trên các giá thể thích hợp từ 10 -15 ngày Lúc này

rễ mới được sinh ra, lá non bắt đầu hình thành Sau đó chuyển cây ra đất vớichế độ chăm sóc bình thường

3.5 ứng dụng của nuôi cấy in vitro trong công tác nhân giống.

Nuôi cấy mô tế bào thực vật có thể phục vụ rất nhiều lĩnh vực khácnhau Trong công tác nhân giống cây trồng, nuôi cấy in vitro được ứng dụngđể:

- Làm phong phú vật liệu di truyền cho công tác chọn giống

- Nhân nhanh và duy trì các giống, cá thể có ý nghĩa khoa học và ý nghĩakinh tế cao

- Làm sạch virut phục tráng giống bị thoái hoá vì bệnh

Trong đó, ứng dụng trong nhân giống cây trồng là lĩnh vực được quan tâmhơn cả Nuôi cấy in vitro là một phương pháp nhân giống hữu hiệu nhất trongcác phương pháp nhân giống vô tính Phương pháp này cho phép tạo ra mộtquần thể cây con đồng đều, giữ được đặc tính của cây mẹ, có hệ số nhângiống cao, sớm phát huy được hiệu quả kinh tế, không tốn diện tích cho nhângiống dễ chăm sóc, khắc phục được những điều kiện bất lợi của thời tiết.Phương pháp này đặc biệt tỏ ra ưu việt hơn với các loài cây khó nhân giốngbằng phương pháp hữu tính, các giống quý cớ số lượng giống ban đầu hạnchế mà lại cần nhân nhanh Theo Murashige ( 1974) có khoảng 300 loại cây

có thể nhân giống bằng các phương pháp nuôi cấy in vitro Lợi ích củaphương pháp này còn ở chỗ: Có thể tạo ra một quần thể với số lượng lớn,sạch bệnh, đồng nhất về mặt di truyền, phục tráng một quần thể thực vật cónguy cơ bị diệt vong, trao đổi quốc tế nguồn gen, lưu giữ bảo quản nguồn gendưới dạng cây in vitro [29]

Khả năng ứng dụng dễ thấy nhất của phương pháp nuôi cấy mô thực vật làphục tráng giống cây trồng Kỹ thuật này đặc biệt có giá trị đối với khoai tây,cây ăn quả và nhiều loại cây trồng nhân giống vô tính khác Đối với khoaitây, bệnh nguy hiểm nhất đó là bệnh virut - một trong những nguyên nhânchính gây nên hiện tượng thoái hoá giống Năm 1965 Morell và Latin đã dùng

kỹ thuật nuôi cấy đỉnh sinh trưởng tạo được cây khoai tây không có virut,mang lại hiệu quả rất lớn cho ngành sản xuất khoai tây của thế giới

Việc ứng dụng nuôi cấy mô thực vật trong nhân giống được Nozeran(1980) nâng lên một mức mới khi ông nhận thấy sự trẻ hóa của các chồi náchcây nho và cây khoai tây đem cấy chuyển nhiều lần trong ống nghiệm Việcứng nuôi cấy mô trong nhân giống trên quy mô lớn đã được thể hiện ở quy

mô thương mại đối với hàng loạt cây trồng có ý nghĩa kinh tế cao như chuối,dứa, cà, khoai tây và đã có những đóng góp to lớn cho nền nông nghiệp thếgiới

Trong lĩnh vực sản xuất hoa cây cảnh, kỹ thuật nuôi cấy in vitro và cácnghệ sinh học khác như: tạo phôi soma, biến dị soma đã ngày càng đóng

góp rất nhiều vào thị trường hoa - cây cảnh trên thế giới Năm 1985, kim

ngạch của thị trường này ước tính 20 - 25 tỷ USD ở Hà Lan, kỹ thuật vi nhângiống trở thành nền tảng của công nghệ hoa và cây cảnh Năm l987, Thái Lan

có 20 công ty tư nhân dùng kỹ thuật nuôi cấy in vitro trên quy mô thương mại

để sản xuất hoa cắt Colombia là nước sản xuất hoa Cẩm Chướng lớn nhấtgiới nhờ công nghệ nuôi cấy in vitro

Tóm lại, nuôi cấy in vitro đã được đưa vào chương trình chọn và nhângiống hiện đại Bằng phương pháp này, con người đã xây dựng nên các hệthống sản xuất giống gốc, cho nhiều loại cây hoàn toàn sạch virut (khoai tây,

đu đủ…

Ở Việt Nam, từ năm 1975 nhiều phòng nuôi cấy mô trong cả nước đãthành lập và thu được thành quả đáng kể Tại Viện Sinh vật - Viện Khoa học

Việt Nam hoàn thiện quy trình nhân giống in vitro một số giống cây trồng cókhả năng chống chịu như lúa, thuốc lá, khoai lang, dứa sợi Tại trường Đạihọc Nông nghiệp I - Hà Nội hoàn thiện quy trình nhân giống khoai tây Tạicác tỉnh phía Nam xây dựng được ngân hàng cà phê với 10 giống khác nhau,hoàn thiện quy trình nhân giống cao su Ngoài ra, các phòng thí nghiệm nuôicấy mô, tế bào trong cả nước đã nghiên cứu thành công nhiều quy trình nhângiống cây hoa và cây ăn quả

Tóm lại, nuôi cấy mô thực vật hiện nay được đưa vào trong các chươngtrình chọn giống và nhân giống hiện đại, góp phần tích cực vào lý luận sinh

học cây trồng, và thực tiễn nông nghiệp Mở ra một hướng đi mới cho nghiên

cứu di truyền học, sinh hoá, sinh lý thực vật Đặc biệt đem lại những ứngdụng to lớn trong công tác lai tạo và nhân nhanh giống cây trồng

PHẦN BA

ĐỐI TƯỢNG, NÔI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU: Chồi đỉnh, chồi nách sát chồi đỉnh cây cúc

CN01 (Standard Chrysanthemum)

2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU:

2.1 Giai đoạn trong phòng thí nghiệm.

2.1.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu quả của các phương pháp khử trùng.

- Khử trùng bằng H2O2 nồng độ 10% và 15% trong thời gian: 3; 5; 10 phút

- Khử trùng bằng HgCl2 nồng độ 0,1% và 0,2% trong thời gian: 3; 5; 10phút

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lấn nhắclại, mỗi lần nhắc lại 5 bình, mỗi bình cấy 3 mẫu Đánh giá thí nghiệm sau 15ngày theo dõi

2.1.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ BAP đến hệ số

nhân chồi cúc CN01 Thí nghiệm tiến hành trên môi trường MS cơ bản (3%saccaro và 0,75% agar) có bổ sung BAP với nồng độ thay đổi như sau:

2.1.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước dừa (ND) đến

hệ số nhân chồi cúc CN01 Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MS cơ

bản (3% saccaro và 0,75% agar) có bổ sung 0,5 mg/l BAP và nước dừa vớinồng độ thay đổi như sau:

Công thức 1 : MS + 0,5 mg/l BAP (đối chứng)

2.1.4 Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ IBA đến hệ số nhân

chồi cúc CN01 Thí nghiệm được tiến hành trên môi trường MS cơ bản (3%saccaro + 0,75% agar) có bổ sung thêm 0,5 mg/l BAP + 15% ND và IBA vớinồng độ thay đổi như sau:

Công thức l : MS + 0,5 mg/l BAP + 15% ND (đối chứng)

Công thức 2 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15% ND + 0,l mg/l IBA

Công thức 3 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15 % ND + 0,2 mg/l IBA

Công thức 4 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15 % ND + 0,5 mg/l IBA

Công thức 5 : MS + 0,5 mg/l BAP + 15 % ND + 1 mg/l IBA

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 3 lần nhắclại mỗi lần nhắc lại 5 bình, mỗi bình cấy 5 mẫu Đánh giá thí nghiệm sau 4tuần theo dõi

2.1.5.Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ -NAA đến quá

trình hình thành rễ của chồi cúc CN01 Thí nghiệm được tiến hành trên môitrường MS cơ bản (3% saccaro + 0,7% agar) có bổ sung -NAA với nồng độthay đổi như sau: