luận văn công nghệ sinh học Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens

Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin,các dược chất, các hoá chất sử dụng

Lời đầu tiên trong bản khoá luận này tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới các thầy cô khoa Công nghệ Sinh học – Viện Đại học

Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ, chỉ bảo tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại tr ờng và đã sắp xếp chu đáo nơi thực tập tốt nghiệp để tôi hoàn thành bài luận văn này một cách tốt nhất.

Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Lê Huy Hàm – Viện tr ởng Viện Di truyền Nông nghiệp đã tận tình h ớng dẫn và dìu dắt tôi trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thành đề tài luận văn Cảm

ơn tập thể cán bộ phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ tế bào thực vật – Viện Di truyền Nông nghiệp đặc biệt là TS Phạm Thị Lý Thu, TS Nguyễn Thị Khánh Vân, Ths Vũ Văn Tiến và CN Phạm Thị H ơng đã đóng góp nhiều ý kiến quý báu, tạo điều kiện và nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian tôi thực hiện đề tài.

Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và những ng ời thân đã luôn động viên, sát cánh bên tôi, giúp đỡ tôi những khi gặp khó khăn.

Hà Nội, ng y 19 tháng 5 năm 2009 à

Sinh viên

1.3 ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài 2

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

2.1 Một số đặc điểm sinh học của bèo tấm Spirodela polyrrhiza. 4

2.1.1 Hệ thống phân loại 4

2.1.2 Đặc điểm hình thái của bèo tấm 5

2.1.3 Phương thức sinh sản 5

2.1.4 Phân bố của bèo tấm 6

2.2 Các yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới đời sống bèo tấm… 7

2.3 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật 9

2.3.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp 10

2.3.2 phương pháp chuyển gen gián tiếp 12

2.4 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 12

2.4.1 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid 13

2.4.2 Cấu truc và chức năng của đạn T-DNA 14

2.4.3 Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A.tumefaciens 15

2.4.4 Hệ thống vectơ chuyển gen 16

2.5 Tình hình nghiên cứu xây dung hệ thống chuyển gen vào bèo tấm 18

2.5.1 Tình hình nghiên cứu thế giới 18

2.5.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 20

PHẦN III : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

3.1 Vật liệu nghiên cứu 22

3.1.1 Vật liệu thực vật 22

3.1.2.Vật liệu vi khuẩn và plasmid 22

3.1.3 Hoá chất và máy móc thiết bị phục vụ cho nghiên cứu 23

3.2 Phương pháp nghiên cứu 24

3.2.1 Xây dựng hệ thống chuyển gen vào bèo tấm S polyrrhiza 24

3.2.2 Quan sát và xác định tỷ lệ biểu hiện tạm thời gen gus……… … 27

3.2.3 Phương phỏp tỏch chiết DNA bèo tấm……….…27

3.2.4 Phương pháp phân tích PCR……….28

3.3 Nội dung nghiên cứu 29

3.4 Các chỉ tiêu đánh giá 31

PHẦN IV : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32

4.1 Xây dựng quy trình chuyển gen vào bÌo tấm S polyrrhiza 32

4.1.1 Chọn lọc chủng vi khuẩn thích hợp cho các thí nghiệm chuyển gen ở bèo tấm SP nguyên cây và callus .32

4.1.2 Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 34

4.1.3.Ảnh hưởng của thời gian ly tâm chân không tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở SP nguyên cây và callus 35

4.1.4 Ảnh hưởng của hàm lượng AS tới tỷ lệ biểu hiện tạm thời của gen gus ở bèo tấm SP nguyên cây và callus 36

4.2 Chuyển gen bền vững vào callus bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua vi khuẩn Agrobacterium 39

4.2.1 Kết quả nuôi cấy phục hồi sau khi đồng nuôi cấy 39

4.2.2 Kết quả chọn lọc sau diệt khuẩn 39

4.2.3 Kết quả tách chiết DNA và phân tích PCR các dòng bèo tấm chuyển gen 42

PHẦN V : KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44

5.1 Kết luận 44

5.2 Đề nghị 45

TÀI LIỆU THAM KHẢO 46

BẢNG KÍ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ADN Deoxyribo Nucleic Acid

CH Casein hydrolysate

EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid

Et-Br Ethidium Bromide

gus β-glucuronidase gene= gen mã hoá β- glucuronidase

MCS Multi-Cloning Site

NOS Nopaline Sythetase

NOS-p Nopaline Sythetase promotor

NptII Neomycin phosphotransferase gene

OD600 Mật độ vi khuẩn đo ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế DUR

800 Spectrophotometer của hãng Beckman CoulterPCR Polymerase Chain Reaction

Thập niên cuối thế kỷ 20 đầu thế kỷ 21 chứng kiến những thành tựu vượt

bậc trong lĩnh vực công nghệ sinh học thực vật Một trong những thành tựu đó làtạo ra các giống cây trồng chuyển gen có các đặc tính mới nh chống chịu sâu,bệnh, kháng thuốc diệt cỏ…Đến cuối năm 2008 diện tích cây chuyển gen toàncầu đã đạt 125 triệu ha Một loạt các giống cây trồng với các đặc tính hoàn toàn

mới như: chịu hạn, chịu mặn, tăng cường khả năng hấp thụ nitơ, chịu úng, tăngcường sinh trưởng, hoặc tăng cường chất lượng dinh dưỡng, chất lượng chế biến,tăng cường hoạt chất sinh học…đã được nghiên cứu và đang chuẩn bị đưa vàoứng dụng trong sản xuất (James, 2008).

Sự phát triển hứa hẹn sáng sủa nhất của công nghệ sinh học thực vật là

sử dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học như: vitamin,các dược chất, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế như: khángnguyên, kháng thể, interferon, vaccine…(Mason & cs, 1998)

Có nhiÒu hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp cần thiết cho các mục đíchkhác nhau của con người Đó là hệ thống sử dụng tế bào động vật bậc cao, vikhuẩn, nấm men…Gần đây tế bào côn trùng, thực vật biến đổi gen được sử dụng

để khắc phục các nhược điểm của hệ thống sản xuất protein sử dụng tế bào độngvật bậc cao, vi khuẩn và nấm men Do đó nhiệm vụ to lớn đặt ra cho các nhàkhoa học là tìm kiÕm hệ thống sản xuất protein tái tổ hợp khác, rẻ tiền, dễ sửdụng và không mang nguy cơ lây nhiễm các bệnh có nguồn gốc virus Hệ thống

đó là thực vật So với các hệ thống truyền thống, thực vật có nhiều lợi thế trongviệc sản xuất protein tái tổ hợp Vaccine do thực vật sản xuất thông qua kỹ thuật

di truyền được gọi là “Vaccine sản xuất bằng thực vật” (Rowlandson &Tackaberry, 2003) Vaccine này có thể được sử dụng ở dạng tinh khiết hay dướidạng dịch chiết thực vật hoặc nguyên liệu thực vật Vaccine tái tổ hợp có thểđược đưa vào những thực vật ăn được đối với người và động vật, tạo khả năngđưa vaccine vào qua đường miệng, gây miễn dịch cho hệ thống màng nhầy vàmiễn dịch toàn cơ thể (Hansson et al, 2000; Fishcher et al, 2003).ý tưởng sửdụng thực vật làm hệ thống sản xuất vaccine uống (edible vaccine) đó lôi cuốncác nhà khoa học của nhiều nước tham gia vào nghiên cứu trong thập niên vừaqua và đã thu được nhiều kết quả khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003)

Spirodela polyrrhiza là loài bèo tấm có tốc độ sinh sản vô tính nhanh Thời gian nhân đôi sinh khối của chóng trong vòng 36 - 48 giờ Bèo S.

polyrrhiza dễ nuôi trồng với các thiết bị và thao tác đơn giản, môi trường dinh

dưỡng không phức tạp, tạo ra các cây bèo đồng nhất, hệ số nhân sinh khối lớntrong thời gian ngắn, hàm lượng protein cao với thành phần axit amin phong phó

(Landolt,1986) Vì vậy việc sử dụng bèo tấm nói chung và Spirodela polyrrhiza

nói riêng làm đối tượng chuyển gen để sản xuất các loại protein tái tổ hợp có giátrị cao với giá thành thấp là một hướng nghiên cứu triển vọng

Xuất phát từ những cơ sở khoa học và đòi hỏi của thực tế trên, chúng tôi

thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu xây dựng quy trình chuyển gen vào bèo tấm Spirodela polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens “.

1.2 Mục đích của đề tài

Xây dựng quy trình chuyển gen vào callus và bèo tấm nguyên cây Spirodela

polyrrhiza thông qua Agrobacterium tumefaciens

1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

*Ý nghĩa khoa học: Kết quả của đề tài sẽ cung cấp những dẫn liệu khoa học về khả năng tiếp nhận gen từ Agrobacterium tumefaciens vào loài bèo tấm

Spirodela polyrrhiza.

* Ý nghĩa thực tiễn: Là cơ sở ứng dụng để chuyển gen quan tâm vào bèo tấm

Spirodela polyrrhiza nhằm sản xuất protein tái tổ hợp.

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Một số đặc điểm sinh học của bèo tấm Spirodela polyrrhiza

a Bèo trong vại nuôi b Hình thái bèo tấm S.polyrrhiza

Hình 2.1: Bèo tấm Sprirodela polyrrhiza

S polyrrhiza thuộc chi Spirodela, chi này gồm 2 loài: S intermedia và

S polyrhiza Chi Spirodela là chi nguyên thủy nhất trong họ Lemnacea và có

kích cỡ genome nhỏ nhất (Landolt, 1986)

2.1.2 Đặc điểm hình thái của bèo tấm

Bèo tấm nói chung không có dạng thân, lá điển hình mà cơ thể gãi gọntrong một cấu trúc gọi là cánh bèo (frond) Chúng có hình dạng và kích thước rất

đa dạng, từ,1 mm đến 10,0 mm, từ hình cầu đến hình trứng méo, hình ovan; từkhông rễ tới có một rễ và nhiều rễ Mặc dù tổ chức cơ quan của chóng bị suygiảm so với các loài thực vật điển hình nhưng hầu hết các loài bèo tấm có đầy đủcác mô và cơ quan tương tự nhiều loài thực vật hạt kín lớn hơn như: rễ, hoa, quả,

hạt, Sự suy giảm về tổ chức cơ thể có thể quan sát thấy bắt đầu ở chi Spirodela, tiếp đến là chi Lemna, Wolffiella và Wolffia (Landolt, 1986).

Bèo tấm S polyrrhiza có hình dạng giống chiếc lá, hình trứng méo, cơ

thể dạng bản mỏng, dài 1,5 – 10,0 mm, rộng 1,5- 8,0 mm Mặt trên cánh bèo cómàu xanh nhờ sự tập trung của diệp lục, đôi khi có một chấm nâu ở vùng nút(node) cánh Mô biểu bì gồm nhu mô quang hợp xen kẽ bởi các gian bào khí lớn,nhờ các gian bào khí này mà bèo tấm trôi nổi được trên mặt nước Mặt dưới (mặtbụng) có màu nâu đỏ, thường gặp khi bèo hoá già hoặc sống trong môi trườngthiếu chất dinh dưỡng Phần phía dưới nút có hai túi bên do vảy mành tạo thành.Các cánh bèo con được hình thành từ mô phân sinh tại điểm nút nằm trong hai túimàng này Mỗi cánh bèo có 7-21 rễ mọc ra tại vùng nút phía ngoài hai tói(Landolt, 1986)

2.1.3 Phương thức sinh sản

Bèo tấm có hai phương thức sinh sản để duy trì nòi giống: sinh sản hữu

tính và sinh sản vô tính Sinh sản hữu tính được thực hiện thông qua sự ra hoa vàtạo hạt tương tự như các loài thực vật hạt kớn khỏc Không chỉ có kích thước cơthể nhỏ mà hoa và hạt của bèo tấm cũng rất nhỏ bộ, chớnh vì thế mà bèo tấm

được xem là loại thực vật hạt kín nhỏ bé nhất trong thế giới thưc vật (Landolt,1986).

Bèo tấm sinh sản vô tính thông qua hình thức nảy chồi, các cánh bèo conđược sinh ra từ vựng mụ phân sinh nằm sâu trong cánh bèo mẹ và chúng táchkhỏi cánh bèo mẹ khi trưởng thành ở hầu hết các loài Khi các cánh bèo con đượchình thành thì bản thân chỳng đó mang sẵn các thế hệ cánh bèo tiếp theo đangđược hình thành ở mô phân sinh của chúng (Landolt, 1986)

Trong tự nhiên, sinh sản vô tính là phương thức chủ yếu giúp cho quầnthể bèo phát triển nhanh chúng, cũn phương thức sinh sản hữu tớnh giỳp choquần thể bốo cú sự đa dạng về di truyền và chỉ xảy ra ở điều kiện nhiệt độ, độ ẩm

và chất dinh dưỡng thớch hợp với sự ra hoa, thụ phấn và kết trái Hạt của bèotấm có sức chống chịu lớn với cỏc điốu kiện nóng, lạnh và khô hạn nên có thể tồntại qua nhiều năm trong bùn, đất và các điều kiện ngoại cảnh bất lợi (Ladolt,1986)

2.1.4 Phân bố của bèo tấm

S polyrhiza nói riêng và bèo tấm nói chung, sống ở các vùng nước ngọt

như ao hồ hay đầm lầy Đặc điểm của các vùng nước này là tĩnh lặng hoặc códòng chảy chậm Chúng cũng có thể sống ở các vùng nước lợ nhưng rất hiếm

thấy (Landolt, 1986)

S polyrhiza phân bố rộng rãi trên toàn thế giới trừ vùng cực Bắc, cận

Bắc cực, những vùng rất ẩm ướt hay rất khô với mùa hè ấm, phia Đông và phíaNam của Nam Mỹ, New Zealand và một số đảo khác, hiếm gặp ở cỏc vựng cúkhí hậu Địa Trung Hải (Landol, 1986)

Hình 2.2 Phân bố của bèo tấm S polyrrhiza (Landol, 1986)

2.2 Các yếu tố môi trường nuôi cấy ảnh hưởng tới đời sống bèo tấm

a) Thành phần môi trường: Cây trồng nói chung và bèo tấm nói riêng sinh

trưởng và phát triển tốt hay không phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện môi trường.Cho đến nay người ta tìm ra được nhiều loại môi trường dinh dưỡng cơ bản như:Môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962), môi trường LS (Laismener &Shoog, 1963), môi trường Knop (Knop, 1974), môi trường B5 (Gamborg, 1986),môi trường H (Hutner, 1953) Mỗi đối tượng cần có một môi trường thích hợp

với sự sinh trưởng và phát triển của chúng Đối với S polyrrhiza nói riêng và các

loài bèo tấm nói chung, một trong các môi trường nuôi nhân tạo thích hợp nhấtthường được sử dụng là môi trường khoáng Hutner, 1953 (Landolt, 1986)

Bảng 2.1 Thành phần các chất dinh dưỡng cần thiết cho Spirodela polyrrhiza

< 0,00001 0,2 0,01 0,0001 0,0005 0,00001 0,002

< 0,00001

< 0,000001

< 0,00001

10 -30 2,5- 5 0,2 – 1 0,5 – 20

1 – 20

0 – 60 0,5 – 10 0,2 – 4 0,01 – 1 0,01 – 0,1 0,001 – 0,06 0,02 – 0,5 0,1 – 1

0 – 0,3 0,001

100 75 50 50 50

> 60 50 50

> 10 1 1 5 10 3 0,1

b) Các yếu tố khác

* Nhiệt độ

Nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát

triển của thực vật dối với bèo tấm thì nhiệt độ thích hợp cho hầu hết các loài là

khoảng 21 – 30 °C tùy thuộc vào cường độ chiếu sáng và hàm lượng chất dinh

dưỡng theo Rẹmankova & cs (1986) thì S polyrrhiza sinh trưởng tốt nhất ở 31

°C

Tuy nhiên ta có thể tìm thấy bèo tấm S polyrrhiza ở những nơi có khí

hậu khá lạnh (12 – 13,5 °C) hay những nơi có nhiệt độ cao (34 – 38°C).Ở nhiệt

độ khắc nghiệt, bèo tấm ngừng sinh trưởng và hình thành chồi ngủ (turion) chỡmsõu xuống mặt nước, đến khi nhiệt độ thích hợp thì chồi ngủ nảy mầm, hồi phục

trở lại (chồi ngủ của S polyrrhiza có thể sống sót ở - 4oC trong ít nhất 3 tháng và

45 °C trong vòng một tuần) (Jacob, 1947)

* Ánh sáng

Về bản chất, ánh sáng có mối liên hệ mật thiết với nhiệt độ Thôngthường trong tự nhiên, khi cường độ chiếu sáng cao thì nhiệt độ cũng tăng lên.Bèo tấm sinh trưởng và phát triển được cả ở những nơi có nắng chiếu trực tiếp vànơi bóng râm, tuy nhiên nơi bóng râm thường thích hợp hơn cho sự sinh trưởng

và phát triển của chúng Bèo tấm cũng có thể sinh trưởng hoàn toàn trong bóngtối nếu các chất hữu cơ như các loại đường có mặt trong môi trường nuôi(Landolt & Kandeler, 1987)

* Độ pH

pH ảnh hưởng đến khả năng hút chất dinh dưỡng của cây Bèo tấm có thểsinh trưởng và phát triển trong môi trường có dải pH từ 3,5 – 10,4

2.3 Các phương pháp chuyển gen vào thực vật

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết

kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của cây trồng nói riêng và của các sinhvật nói chung (vi sinh vật, động vật) làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmidtái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạtđộng tổng hợp nờn cỏc protein đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mớicủa cơ thể chuyển gen (GS TS Nguyễn Quang Thạch, 2004)

Có nhiều phương pháp chuyển gen vào thực vật nhưng có thể phân thànhhai nhóm chính: Phương pháp chuyển gen trực tiếp và phương pháp chuyển gen

gián tiếp Trong phương pháp chuyển gen gián tiếp, gen được chuyển vào tế bàothực vật qua mét sinh vật trung gian, thường là vi khuẩn, virus Còn ở phươngpháp chuyển gen trực tiếp, gen được đưa trực tiếp vào tế bào thực vật thông quanhững thiết bị và thao tác nhất định mà không phải nhờ tới các sinh vật trunggian(GS TS Nguyễn Quang Thạch, 2004)

2.3.1 Phương pháp chuyển gen trực tiếp

a) Chuyển gen nhờ kỹ thuật siêu âm

Kỹ thuật siêu âm dùng để chuyển gen vào các tế bào trần Sau khi thuđược tế bào trần, tạo huyền phù tế bào trần với các plasmit tái tổ hợp mang genmong muốn và gen chọn lọc Cắm đầu siêu âm của máy phát siêu âm ngập tronghuyền phù tế bào trần 3mm Cho máy phát siêu âm với tần số 20kHz theo từngnhịp ngắn 110 mili giây Tổng thời gian tác động khoảng 500 - 900 mili giây Sau

đó đem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môi trường chọn lọc

để tách các tế bào trần đã nhận được DNA Nuôi cấy tái sinh cây

b) Chuyển gen nhờ kỹ thuật điện xung (electroporation)

Kỹ thuật này áp dụng cho việc chuyển gen vào tế bào trần Người tachuẩn bị một huyền phù tế bào trần với các plasmit tái tổ hợp mang gen mongmuốn và gen chọn lọc Dùng thiết bị điện xung tạo điện thế cao khoảng 200 - 600V/cm trong khoảng thời gian ngắn 4 - 5 phần nghìn giây Kết quả làm cho màng

tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời có đường kính khoảng 30 ηm, màqua đó các DNA biến nạp ở bên ngoài có thể xâm nhập vào trong tế bào Sau quátrình điện xung, tế bào trần được nuôi trong các môi trường thích hợp hoặc môitrường chọn lọc để tách các tế bào trần đã thu nhận DNA Sau đó các tế bào trầnnày được nuôi cấy tái sinh cây và tiếp tục chọn lọc

c) Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide

Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản xuất.Sợi silicon carbide có đường kính rất nhỏ khoảng 0,6 µm và dài khoảng 10 - 80

µm Khi lắc một huyền phù tế bào đơn cùng plasmit tái tổ hợp mang gen mongmuốn và gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc vortex khoảng 5 giây, các

tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm nhập vào Sau đó các tế bào nàyđược nuôi cấy tạo mô sẹo, tái sinh cây và chọn lọc để tách ra những cây manggen chuyển

d) Chuyển gen bằng súng bắn gen

Chuyển gen bằng súng bắn gen là kỹ thuật sử dụng các viên đạn là cácphần tử kim loại nặng có kích thước hiển vi và có tỷ trọng cao để đạt được giatốc cao Dưới tác dụng của một lực nén chúng có thể xuyên qua vỏ và màng tếbào, đưa líp DNA bọc ngoài vào tế bào và tiếp cận với bộ máy di truyền của tếbào Tách các mô tế bào đó nuôi cấy tái sinh thành cây (Sanford & cs., 1987;Nguyễn Đức Thành, 2003)

e) Biến nạp bằng hoá chất PEG (polyethylene glycol)

Cũng giống như phương pháp chuyển gen bằng xung điện, phương phápchuyển gen nhờ PEG thường được sử dụng để chuyển gen vào các tế bào trần Ởnồng độ cao, PEG làm DNA cần biến nạp không còn ở trạng thái hòa tan nữa màkết dính lại trên màng sinh chất Sau đó, bằng cách loại bỏ PEG và xử lý nồng độcao của Ca2+ hoặc ở độ pH cao, DNA biến nạp sẽ được chuyển nạp vào trong tếbào trần

Ngoài ra còn có các phương pháp chuyển gen trực tiếp như: Phương pháp vi tiêm ( sử dụng các thiết bị hiển vi và máy vi nhu động để chuyển gen

trực tiếp vào tế bào, thường áp dụng đối với các tế bào có kích thước nhỏ bé như

hạt phấn, phôi non); Phương pháp vĩ tiêm (sử dông kim tiêm có đường kính lớn

hơn đường kính tế bào để đưa DNA vào tế bào, thường áp dụng cho những đối

tượng có bầu nhụy lớn, dễ thao tác); Phương pháp sốc nhiệt, (Nguyễn Đức

Thành, 2003)

2.3.2 Phương pháp chuyển gen gián tiếp

2.3.2.1 Chuyển gen nhờ virus

Virus được sử dụng làm vectơ chuyển gen cho cây trồng do rất dễ thâmnhập và lây lan trong cơ thể thực vật Mặt khác trong cấu tạo của virus cũng cómặt axit nucleic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào Tuy nhiên hiệnnay, việc chuyển gen nhờ virus rất Ýt được sử dụng, do virus về nguyên tắckhông truyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây chuyển gen nhờ virus phảitiến hành bằng phương pháp vô tính Điều này không phải thực hiện được với tất

cả các loài cây Đây chính là một nhược điểm lớn của phương pháp chuyển genbằng virus

2.3.2.2 Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium

Dựa vào cơ chế chuyển gen của vi khuẩn A tumefaciens, người ta đó

dựng vi khuẩn đất để chuyển các gen mong muốn cho mỡnh trờn cơ sở thiết kếlại hệ thống Ti – plasmid của vi khuẩn sao cho vẫn đảm bảo được chức năngchuyển gen nhưng không mang các gen gây độc cho cây Người ta đã tạo ra cácdạng vector mới để chuyển gen là những vector liên hợp và vetor nhị thể Các hệthống vetor mới đượ tạo thành này đều được dựa trên cơ sở cải tiến Ti – plasmid.Phần T-DNA củ Ti-plasmid sẽ bị cắt bỏ những gen gây u và gen tổng hợp opine,thay thế vào đấy là các gen mong muốn kèm theo gen chỉ thị và gen khởi động

2.4 Chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens

Phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium đã được áp dụng thành

công trên nhiều đối tượng cây trồng đặc biệt là cây hai lá mầm nh: khoai tây, cà

chua, thuốc lá, đu đủ… Sự chuyển nạp nhờ vi khuẩn vào cây một lá mầm khóthành công do cây một lá mầm nh hoà thảo thường không có phản ứng với sựthương tổn Vết thương không dẫn đến sự phản phân hoá tế bào lân cận Mặtkhác, vi khuẩn khó gắn kết với thành tÕ bào, hoạt tính promoter T- DNA giảm,

hoạt động của vùng vir bị ức chế.

Gần đây phương pháp chuyển gen nhờ Agrobacterium đã thành công ở

một số cây hoà thảo nh: lúa (Hiei & cs., 1994; Khanna & cs., 1999; Khanna &cs., 2003), ngô (Ishida, 1996) Trong trường hợp này người ta dùng tế bào phôi ởdạng huyền phù làm đối tượng chuyển nạp trong môi trường nuôi cấy có bổ sung

chất dẫn dụ acetosyringone.

2.4.1 Cấu trúc và chức năng của Ti-plasmid

Ti-plasmid (tumor inducing = Ti) được phát hiện ở tất cả các chủng A.

tumefaciens gây nhiễm và tồn tại bền vững ở nhiệt độ dưới 30oC Đây là mộtphân tử DNA mạch vòng, sợi kép, tồn tại trong tế bào như một đơn vị sao chépđộc lập (hình 1.2), dài khoảng 200kb và có trọng lượng phân tử bằng 3 - 5% sovới trọng lượng phân tử của nhiễm sắc thể vi khuẩn Phân tích di truyền cho thấy,Ti-plasmid dạng octopin và dạng nopalin là hai dạng phổ biến nhất, có 4 vùngtương đồng, trong đó vùng T-DNA và vùng gây độc (vùng VIR), liên quan trựctiếp tới sự hình thành khối u ở thực vật Hai vùng còn lại chứa gen mã hoá choviệc sao chép plasmid và chuyển nạp

C

D (Nopalin) pTiC58

Hình 2.3 Cấu tróc Ti-plasmid

Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T-DNA được chuyển từ vi khuẩn sang hệgen của cây chủ và tồn tại bền vững ở đó Tuy nhiên, vùng này không mã hoánhững sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T-DNA mà cần có sự trợ giúpđặc biệt của các gen gây khối u nằm trên vùng VIR và trên nhiễm sắc thể vi

khuẩn (gen chv)

2.4.2 Cấu trúc và chức năng của đoạn T-DNA

Kết quả phân tích trình tự gen trên T-DNA ở các Ti-plasmid khác nhaucho thấy, T-DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp gần như hoàn toàn dàikhoảng 25bp, gọi là đoạn biên (hình 1.3) Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quátrình chuyển T-DNA và xâm nhập của T-DNA vào tế bào thực vật

Hình 2.4 Cấu trúc T-DNA

ở đoạn biên phải (Righ Boder-RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho

quá trình chuyển T-DNA Đoạn biên trái (Left Boder-LB) gián tiếp tham gia vàoquá trình chuyển T-DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thường(Negrotto & cs., 2000; Lê Thị Thu Hiền, 2003)

Các gen trên T-DNA gồm 2 nhóm: (1) Nhóm gen mã hóa các enzyme

cho các quá trình sinh tổng hợp opine - là sản phẩm được vi khuẩn A.

tumefaciens sử dụng làm nguồn năng lượng cung cấp Cacbon và Nitơ; (2) Nhóm

gen gây khối u mang các gen tms1, tms2 mã hóa cho sinh tổng hợp auxin, tmr mã

2

Vïng g©y khèi u(Onc)

nos

hóa cho enzyme liên quan đến sinh tổng hợp cytokinin (PGS TS Khuất HữuThanh, 2003).

2.4.3 Cơ chế phân tử của chuyển gen thông qua A tumefaciens

Các tế bào ở cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất của phenol như:Acetosyringon, hydroxy-acetosyringon Dưới tác dụng dẫn dụ của các hợp chất

này, A tumefaciens nhận biết rồi bám vào thành tế bào cây chủ Protein VirA nằm trên thành tế bào vi khuẩn Agrobacterium sẽ nhận biết sự có mặt và tương

tác với các phân tử acetosyringon, có mặt các phân tử đường Tiếp đến VirA sẽphosphoryl hoá protein VirG làm cho VirG trở thành dạng hoạt động Đến lượt

VirG lại kích hoạt các gen gây độc khác như virB, virC, virD và virE cũng như tăng cường mức độ phiên mã của gen virG (Mclean & cs., 1994) bằng cách tương

tác với trình tự điều hoà của VIR box Tiếp theo đó, tại vùng T – DNA kể cả 2biên, 1 đoạn DNA mạch đơn tách ra khỏi Ti-plasmid và chuyển vào tế bào thực

vật với đầu 5’ đi trước (Janofsky & cs, 1986) Đoạn DNA mạch đơn còn lại trên

Ti-plasmid sẽ làm khuôn để tổng hợp mạch DNA bổ trợ mới Gen VirD mã hoácho một số endonuclease cắt T-DNA ở vị trí giữa nucleotid thứ 3 và 4 của trình

tự biên Đoạn bị cắt ra là sợi đơn đại diện cho vùng T-DNA và được gọi là sợi T,sợi T được chuyển sang tế bào thực vật với đầu 5’ đi trước (Wie và cs., 2000).Đầu 5’ của sợi T được liên kết đồng hoá trị với protein VirD2 ở vị trí axit amintyrosine 29 (Gelvin, 2003)

Trong quá trình di chuyển, protein VirE2 gắn với sợi T tạo thành phứchợp T dạng ống sợi nucleo-protein (T-complex) nhằm bảo vệ chúng trước các tácđộng của các enzym thuỷ phân và các enzym endonuclease có trong dịch bào của

tế bào cây chủ Protein VirB tạo ra cầu nối giữa tế bào vi khuÈn và tế bào câychủ giúp cho sợi T có thể được vận chuyển sang tế bào cây chủ (Zupan & cs.,2000) Protein VirD2 gắn ở đầu 5’ của sợi T đóng vai trò là tín hiệu nhận biết

trong hệ thống vận chuyển này (Hooykaas và Schilperoot, 1992) Sau khi T-DNAqua màng tế bào, chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với hệ gen thực vật ởnhững vị trí ngẫu nhiên (hình 1.4).

Hình 2.5.Quá trình chuyển T-DNA vào tế bào thực vật (Zhu & cs., 2000)

Tại đó nhờ sự điều khiển của gen thực vật mà các gen trên T-DNA bắtđầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên sự phát triển tháiquá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u (Wie & cs., 2000; LêThị Thu Hiền, 2003)

2.4.4 Hệ thống vectơ chuyển gen

Ti-plasmid ban đầu ở Agrobacterium không được sử dụng làm vectơ

chuyển gen do chúng có kích thước lớn gây khó khăn cho việc sao chép ở mứcphân tử và chuyển nạp gen; mặt khác chúng lại chứa các gen tổng hợp opinekhông cần thiết cho cây mà chỉ cần cho vi khuẩn và các phytohoocmon gây nênkhối u ở cây bị xâm nhiễm; chúng có nhiều vị trí nhận biết của một enzym giớihạn do dã mét enzyme giới hạn có thể cắt DNA của Ti-plasmid ở nhiều điểmkhác nhau, trong khi đó công nghệ gen lại cần có những vị trí cắt duy nhất cho

hoạt động của một số enzyme giới hạn; ngoài ra các gen onc được dùng làm chỉ

thị chọn lọc có tính trội, nhưng chúng lại cản trở quá trình tái sinh bình thường ởthực vật (Lê Trần Bình & cs., 2003; Lê Thị Thu Hiền, 2003)

Với những lý do này, Ti-plasmid đã được nghiên cứu cải biến như: cắt bỏcác gen không quan trọng, lắp thêm các gen cần thiết vào vùng đa nhân dòng(MCS), tạo hai hệ thống vectơ chuyển gen hiệu quả: vectơ nhị thể (binary vector)

và vectơ liên hợp (co-integrate vector) Nhờ vậy, cây trồng được biến nạp bằngTi-plasmid cải biến vừa mang gen quan tâm, vừa có khả năng tái sinh và pháttriển bình thường (Hajdukiewicz & cs., 1994)

2.4.4.1 Hệ vectơ nhị thể

Trên cơ sở phát hiện vùng VIR không cần nằm trên cùng một plasmidvới vùng T-DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T-DNAvào hệ gen thực vật, người ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vectơ nhị thểtrong đó vùng T-DNA và vùng VIR nằm trên hai plasmid khác nhau nhưng trong

cùng một chủng A tumefaciens (hình 2.6)

Hình 2.6 Sơ đồ cấu trúc vectơ nhị thể

Cã hai loại vectơ được sử dụng trong hệ thống vectơ nhị thể là vectơ

chuyển gen và vectơ bổ trợ Hai cấu trúc này cùng được đưa vào Agrobacterium,

khi các gen trên vectơ bổ trợ hoạt động thì các sản phẩm của nó sẽ tác động tới

đoạn T-DNA trên vectơ chuyển gen dẫn đến việc chuyển đoạn T-DNA sang tếbào thực vật (Lê Thị Thu Hiền, 2003).

2.4.4.2 Hệ vectơ liên hợp

Vectơ liên hợp được xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương

đồng nằm trên plasmid vi khuẩn (như vectơ của E coli) với vùng T-DNA trên plasmid của A tumefaciens Trong đó, người ta giữ lại vùng VIR, loại bỏ vùng

mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong plasmid (hình 1.6)

Hình 2.7 Sơ đồ cấu trúc vectơ liên hợp

Có 3 loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp đó là: Ti-plasmid;vectơ trung gian và vectơ trợ giúp (Walkerpeach & Velten, 1994)

2.5 Tình hình nghiên cứu chuyển gen vào bèo tấm

2.5.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Có rất nhiều các nghiên cứu về hệ thống phân loại, sinh lý, sinh hóa, hìnhthái, cấu tạo, sinh sản đã được tiến hành trên các loài bèo tấm khác nhau(Landolt, 1986; Landolt & Kandeler, 1987), tuy nhiên các nghiên cứu về chuyểngen vào bèo tấm thì còn hạn chế

Năm 2001, Yamamoto & cs đã áp dụng qui trình tạo callus trên đối

tượng L.gibba G3 của Moon và Stomp (1997) để xây dựng quy trình chuyển gen

thông qua Agrobacterium tumefaciens vào bèo tấm L.gibba G3 và L.minor 8744

và 8627 Tác giả đã thu được 1 dòng bèo chuyển gen thuộc loài L.gibba G3 và 3 dòng bèo chuyển gen của L.minor 8627 (2 dòng) và L.minor 8744 (1 dòng) Gen được chuyển là gen gus được điều khiển bởi promotor CaMV35S Kết quả phân

tích lai ADN cho thấy tất cả các dòng bèo chuyển gen đều thấy sự có mặt gen

gus (Yamamoto & cs., 2001)

Còng trong năm 2001, Boehm & cs đã xây dựng hệ thống chuyển gen

nguyên cây vào bèo tấm Wolffia columbiana nhờ chủng vi khuẩn Agrobacterium

tumefaciens LBA4404 chứa plasmit p35SGUSINT Hiệu quả chuyển gen ban đầu

chỉ đạt 3,9%, nhưng khi quá trình biến nạp được diễn ra trong điều kiện chânkhông hoặc xử lý với corodum đã làm tăng hiệu quả chuyển gen lên 15 - 20% số

cánh bèo có biểu hiện màu xanh chàm của gen gus (Boehm & cs., 2001).

Trên thế giới, trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu chuyểngen để sản xuất hoạt chất bằng bèo tấm Các nhà khoa học Mü, Israel, Pháp đã sử

dụng các loài Lemna để chuyển các gen có giá trị kinh tế, nhằm sản xuất các hoạt

chất khác nhau, trong đó có vaccine Tháng 10 năm 2004, chính phủ Pháp đã tàitrợ để thành lập công ty Lemnagene nhằm mục đích ứng dụng công nghệ sinhhọc trên đối tượng bèo tấm (www lemnagene com)

Mới đây, Rival & cs đã áp dụng quy trình nuôi mô và chuyển gen vào

bèo tấm Spirodela oligorrhiza của Edelman & cs (1998) và Li & cs (2004) để

chuyển thành công gen mã hoá aprotinin, một loại chất ức chế protease serin

được dùng trong sản xuất dược phẩm nhằm làm giảm phản ứng viêm nhiễm vàgiảm sự mất máu trong giải phẫu tim và gan Bên cạnh gen mã hoá cho aprotintrưởng thành, tác giả còn thiết kế thêm một trình tự peptit đóng vai trò là tín hiệutiết do promoter CaMV35S điều khiển Nhờ trình tự tín hiệu tiết này mà proteintạo ra từ 25 dòng bèo tấm chuyển gen được tiết thẳng vào môi trường nuôi cấy

với tỷ lệ 3,7% và được phát hiện nhờ phân tích northern, western và xác địnhtrình tự axit amin (Rival & cs., 2007).

2.5.2 Tình hình nghiên cứu về bèo tấm trong nước

ở nước ta bèo tấm tồn tại phổ biến ở hầu hết mọi nơi Tuy chưa cómột nghiên cứu đầy đủ về phân loại học thực vật các loài bèo tấm Việt Namnhưng qua đặc điểm hình thái chúng tôi thấy rằng ở Việt Nam có mặt rất nhiều

loài của cả 5 chi thuộc họ Lemnaceae Nhiều loài được sử dụng rộng rãi trong

chăn nuôi Một số loài trước kia được sử dụng làm thức ăn cho người ở một số

vùng nônng thôn như các loài chi Wolffia.

Các nghiên cứu liên quan đến bèo tấm ở Việt Nam chỉ hạn chế ở việc sửdụng làm thức ăn bổ sung cho gia súc, gia cầm Tại Đại học Nông lâm thành phố

Hồ Chí Minh, các nhà khoa học thử nghiệm bổ sung bèo tấm cho 200 con gàgiống Tàu Vàng, kết quả gà tăng trọng nhanh và chi phí thức ăn giảm 10 –15%/kg thịt Thí nghiệm trên gà mái đẻ, trứng cho lòng đỏ đậm và hương vị thơmhơn

Đại học Huế cũng đó cú một số nghiên cứu ứng dụng họ bèo tấm

Lemnacae trong việc cải tạo môi trường nước Kết quả cho thấy bèo có khả năng

hấp thụ NH4+ khá cao từ 90 – 100%, trong đó bèo Nhật bản hấp thụ từ 93 –100%, bèo tấm hấp thụ 90 – 93,33% và bèo cái hấp thụ 90 – 99,99% Bèo cũng

có khả năng hấp thụ PO4+ cao từ 35 – 58,6%, trong đó hấp thụ cao nhất là bèoNhật Bản từ 40 – 58,6%, bèo tấm hấp thụ 42,22 – 50% và bèo cái hấp thụ từ 35 –53,44% (http://www.vista.gov.vn).

Tại viện Di truyền nông nghiệp Việt Nam, quy trình chuyển gen mã hoávirus Gumboro VP2 (gây bệnh viêm túi bạch huyết nhiễm trùng ở gà) vào callus

và bèo tấm nguyên cây (Lemna sp và Wolffia sp ) bằng súng bắn gen và

Agrobacterium đã được xây dùng và cải thiện trên cơ sở tối ưu hoá các yếu tố

chính ảnh hưởng đến quá trình bién nạp: chủng vi khuẩn, nồng độ AS, thời gianđồng nuôi cấy,…Sự có mặt của gen chuyển trong các dòng bèo tấm chuyển gen

đã được phân tích bằng các phương pháp sinh học phân tử (PCR, Southem) đã

nhận được 06 dòng bèo tấm Wolffia australiana chuyển gen VP2 Protein VP2 đã

được tách chiết từ các dòng bèo tấm chuyển gen Thử nghiệm bước đầu cho thấy

01 dòng bèo tấm chuyển gen có khả năng gây đáp ứng miễn dịch trên gà (Báocáo tổng kết khoa học và kỹ thuật đề tài Viện Di truyền Nông nghiệp Việt Nam,2008)

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu

3.1.1 Vật liệu thực vật

Bèo Spirodela polyrrhiza được thu thập trên đồng ruộng tại địa bàn Hà

Nội và nuôi trong vại sành ở vườn ươm Viện Di truyền Nông nghiệp, sau đóđược gửi tới Giáo sư Landolt, Viện Địa thực vật, Học viện Liên bang Thụy Sỹ

phân lọai, định danh và xác định là loài Spirodela polyrrhiza (S polyrhiza, SP).

Đây là một trong những loài phân bố rộng rãi tại Việt Nam và khu vực châu Á

Hình 3.1 S.polyrrhiza trong bỡnh nuụi Callus S polyrrhiza

3.1.2 Vật liệu vi khuẩn và plasmid

5 chủng vi khuẩn : AA6, EHA105, AGL-1, LBA4404, GV3101

Chủng AA6 mang vectơ nhị thể pBINGUSINTsbAvirG726pm (hình3.2) Nằm trong vùng giới hạn bởi bờ trái (LB) và bờ phải (RB) là gen chỉ thị

(gus-int) và gen chọn lọc nptII (gen kháng kanamycine) Gen gus-int được điều khiển bởi promoter P35S và gen nptII được điều khiển bởi promoter PNOS, cả

hai đều có đoạn mã kết thúc là TNOS

Hình 3.2 Cấu trúc của đoạn T-ADN trong vectơ nhị thể pBINGUSINTsbAvirG726pm

Chủng EHA105, AGL-1, LBA4404, GV3101 mang vectơ nhị thể

pCAMBIA1301 (hình 3.3) chứa gen chỉ thị là gen gus và gen chọn lọc thực vật

là gen hptII (kháng hygromycine) được điều khiển bởi đoạn khởi động

CaMV35S

Vi khuẩn A tumefaciens được nuôi cấy trên môi trường LB (pH=7), có bổ

sung kháng sinh thích hợp cho mỗi chủng

3.1.2 Hóa chất và máy móc thiết bị phục vụ cho nghiên cứu

a) Các hóa chất

- Các muối đa lượng, vi lượng, vitamin là thành phần của các nền khoáng H(Hutner, 1953), N6 (Chu & cs., 1975),