luận văn công nghệ sinh học Nghiên cứu sử dụng enzym proteaza của Bacillus subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và ổn định màu sắc của nước mắm

Đặc biệt là đã tổng hợp được enzym nhân tạo, chophép chúng ta trong tương lai không xa có thể tổng hợp được nhiều chất xúc tác mớitheo kiểu xúc tác enzym để sử dụng trong thực tế.. Từ kh

LỜI MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học đang được xem là một ngành mũi nhọn của tương lai, thuhút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học Trong đó một trong những thành tựu tolớn của khoa học và công nghệ trong thời gian gần đây là các nghiên cứu về enzym(men), nó đặc trưng cho sự phát triển của khoa học tự nhiên trong mấy chục năm vừaqua Một thành tựu vô cùng to lớn của enzym là đã khám phá được cấu trúc hoá học

và cơ chế xúc tác diệu kỳ của nó Đặc biệt là đã tổng hợp được enzym nhân tạo, chophép chúng ta trong tương lai không xa có thể tổng hợp được nhiều chất xúc tác mớitheo kiểu xúc tác enzym để sử dụng trong thực tế

Từ khi enzym được phát hiện thì chúng ta không ngừng đưa nó vào trong thựctiễn của cuộc sống, phục vụ cho nhiều ngành như công nghiệp, nông nghiệp, y học,thực phẩm …Enzym được xem là thành phần quan trọng và tất yếu trong thực phẩm.Bằng cách bổ sung có định hướng và chọn lọc thì có thể tạo cho sản phẩm có được kếtcấu, hương vị, màu sắc và các tính chất đặc thù khác Chính tầm quan trọng đó mà mấychục năm gần đây hình thành và phát triển mạnh kỹ thuật sản xuất chế phẩm enzym.Hàng năm, trên thế giới có khoảng 20 hãng sản xuất ra hơn 100.000 tấn chế phẩmenzym Tuy nhiên, nó tập trung chủ yếu ở các nước phương Tây, còn ở phương Đôngthì còn rất non kém Ở Việt Nam, nó được xem là một ngành còn mới lạ, mới ở bướcđầu phát triển Do đó, việc nghiên cứu và sản xuất enzym đang là một thách thức, đồngthời cũng là triển vọng cho ngành công nghệ sinh học của nước ta

Trong lượng enzym được sử dụng trên thế giới thì proteaza chiếm đến 60% hàmlượng enzym Trước đây, phần lớn các proteaza đều được thu từ nội tạng động vật,nhưng ngày nay nó đang được thay thế dần bằng proteaza của thực vật và vi sinh vật rẻtiền Để sản xuất proteaza, người ta thường tận dụng các nguồn nguyên liệu từ nhữngsản phẩm phế thải của các ngành chế biến khác như sản phẩm cặn bã của nhà máy sản

xuất tinh bột, của nhà máy giấy, nhà máy đường …Xuất phát từ tầm quan trọng đó củacác enzym và được sự hướng dẫn của cô giáo T.S Trần Thị Xô tôi chọn đề tài "Nghiên

cứu sử dụng enzym proteaza của Bacillus subtillis nhằm làm tăng hàm lượng đạm và

ổn định màu sắc của nước mắm " Sở dĩ tôi chọn nguyên liệu để thu nhận enzym là

Bacillus subtillis là do vi sinh vật là nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất

enzym ở qui mô lớn dùng trong công nghiệp, có thể chủ động về nguồn nguyên liệu,chu kì sinh trưởng của vi sinh vật ngắn, vào khoảng từ 16 đến 100 giờ, do đó ta có thểthu hoạch hàng trăm lần một năm, có thể điều khiển sự sinh tổng hợp enzym dễ dànghơn các nguồn nguyên liệu khác để tăng lượng enzym được tổng hợp hoặc tổng hợpđịnh hướng enzym, giá thành thấp vì môi trường nuôi cấy vi sinh vật tương đối đơngiản, rẻ tiền

Nội dung được trình bày trong đề tài gồm 4 phần chính :

Chương I : Tổng quan nguyên liệu

Chương II : Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu

Chương III : Kết quả và thảo luận

Chương IV : Kết luận

Do thời gian làm đề tài có hạn và những hiểu biết về enzym nói chung vàproteaza nói riêng còn hạn chế Cho nên phần trình bày không thể tránh khỏi nhữngvướng mắc và sai sót Em rất mong được sự góp ý nhiệt tình của các thầy cô và các bạn

để đề tài được hoàn chỉnh hơn

CHƯƠNG I TỔNG QUAN NGUYÊN LIỆU

1.1 Enzym và các ứng dụng của chúng

1.1.1 Giới thiệu về enzym

Enzym là những hợp chất hữu cơ có phân tử lượng lớn từ 20.000÷1.000.000danton, được cấu tạo từ các L-α - axit amin kết hợp với nhau qua liên kết peptit Đóchính là các protein có hoạt tính xúc tác Các enzym xúc tác cho hầu hết các phản ứng

đã xảy ra trong cơ thể sống Đảm bảo cho quá trình chuyển hoá các chất trong cơ thểsống tiến hành với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo những chiều hướng xác định để

đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.[2,Tr9]

Enzym có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn, gấp hàng trăm, hàng triệu lần các chất xúctác vô cơ và hữu cơ khác Đặc biệt là nó thực hiện xúc tác trong điều kiện nhẹ nhàng, ởnhiệt độ và áp suất bình thường, pH gần như pH sinh lý, hơn nữa enzym lại có khảnăng lựa chọn cao đối với phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tácdụng Nên việc sử dụng enzym làm xúc tác đem lại hiệu quả rất lớn

Enzym được phân làm hai nhóm chính:

+ Enzym một cấu tử (enzym đơn giản) là các protein đơn giản làm nhiệm vụxúc tác

+ Enzym hai cấu tử (enzym phức tạp) là các protein phức tạp làm nhiệm vụxúc tác Trong enzym hai cấu tử gồm có hai phần:

• Phần mang bản chất protein gọi là “Apoenzym“ hay “feron“ đảmbảo tính đặc hiệu cho phản ứng

• Phần phi protein có tên gọi là “Coenzym“ hay gọi là “Agon” có khảnăng tách ra và tồn tại một cách độc lập bên ngoài protein, tham gia vào quá trình xúctác

Enzym mang bản chất là protein, có thể hoà tan trong nước, trong dung dịchmuối loãng, trong dung môi hữu cơ có cực, nhưng không hoà tan trong dung môikhông phân cực Enzym có tính lưỡng tính, dựa vào tính chất này ta có thể tiến hànhphân tách và làm sạch bằng phương pháp điện di Các enzym cũng là các protein nên

nó chịu tác động của các yếu tố vật lý như nhiệt độ, các yếu tố hoá học như pH, dungmôi, các kim loại Do đó ta cần phải có sự lựa chọn các yếu tố để đảm bảo cho cường

lực xúc tác của enzym là lớn nhất.[14,Tr5]

1.1.2 Các ứng dụng của enzym

Việc nghiên cứu và ứng dụng các enzym đem lại ý nghĩa to lớn Về mặt lý thuyết,trong 20 năm gần đây người ta đạt được những thành tựu đáng kể trong nghiên cứu cấutrúc phân tử enzym và giải thích cơ chế phân tử quá trình sinh tổng hợp enzym trong tếbào, điều đó cho phép chúng ta trong tương lai không xa sẽ tổng hợp được nhiều chấtxúc tác mới theo kiểu enzym để sử dụng trong thực tế, đem lại hiệu quả kinh tế với cácenzym khó tách từ các nguyên liệu tự nhiên

Bên cạnh những thành tựu đạt được trong nghiên cứu lý thuyết về enzym Cácnghiên cứu ứng dụng enzym trong thực tế ngày càng được mở rộng và đạt hiệu quảcao Để sử dụng enzym trong thực tế có thể tiến hành theo hai cách sau:

+Điều hoà định hướng tác dụng của enzym trong các nguyên liệu chứa nó

+Tách enzym ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng trong cácquá trình sản xuất

Khi sử dụng enzym theo hướng thứ nhất trong nhiều trường hợp có thể đơn giảnhơn Tuy nhiên cách sử dụng này hạn chế phạm vi ứng dụng của enzym vì chỉ có thểdùng enzym đối với quy trình chế biến chính nguyên liệu của nó Sử dụng enzym theocách thứ hai có hiệu quả hơn vì chế phẩm enzym nhận được có thể sử dụng rộng rãi tuỳtheo yêu cầu Hơn nữa còn có thể dễ dàng điều khiển hoạt động của enzym theo ýmuốn và cho phép đề ra quy trình sản xuất

Các chế phẩm enzym được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như:trong hoá phân tích để định tính và định lượng các chất, trong nông nghiệp, trong yhọc, trong công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược liệu, công nghiệp hoá học vànhiều ngành công nghiệp khác như công nghiệp dệt, công nghiệp da v.v

1.1.2.1 Ứng dụng trong hoá phân tích để định tính và định lượng

Khi sử dụng enzym để định lượng các chất có thể tiến hành theo hai cách:

+Để định lượng một chất nào đó ta dùng enzym có tác dụng phân giải riêngchất ấy Sau đó dùng một trong các phương pháp phân tích thông thường để định lượngcác chất sau phản ứng, từ đó suy ra lượng chất cần phân tích Phương pháp này để đạtđược kết quả tốt nhất cần sử dụng enzym có tính đặc hiệu cao và chế phẩm enzym thậttinh khiết

+Nếu chất cần phân tích có tác dụng kìm hãm hoặc kích thích đặc hiệu mộtenzym nào đó, ta có thể định lượng bằng cách xác định mức độ ảnh hưởng của chúngđến hoạt độ enzym, đối chiếu với bảng hoặc đồ thị chuẩn để suy ra lượng chất cần phântích

1.1.2.2 Ứng dụng trong y học

Trong y học có thể sử dụng enzym để chữa bệnh, để sản xuất các sinh tố và cácchất kháng sinh Nhiều enzym hiện nay được dùng để điều chế thuốc như papain,pepxin, bromelain…

Có thể dùng enzym, coenzym để tăng thêm lượng enzym cho cơ thể, loại bỏ cácphần mô bị hỏng, bị thối ở các ổ viêm, các vết thương, chữa các bệnh thiếu enzym bẩmsinh, chẩn đoán nhanh một số bệnh, làm các nội quan nhân tạo hoặc có thể dùng enzym

để chữa các bệnh tiêu hoá kém, hoà tan các cục máu đông làm nghẽn mạch máu Ngoài

ra có thể dùng enzym để phân giải các thuốc khi cơ thể bị phản ứng mạnh với cácthuốc này hoặc dùng các chất kìm hãm đặc biệt để kìm hãm các quá trình tăng quá mứcgây tác hại cho cơ thể

1.1.2.3 Ứng dụng trong công nghiệp

Enzym được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp

- Trong công nghiệp xà phòng dùng để làm chất tẩy rửa dầu mỡ công nghiệp

- Sử dụng enzym amylaza để khử hồ trên vải trong công nghiệp dệt

- Sử dụng proteaza của Asp-oryzae 33 để khử lông trâu bò trong công nghiệp

bột để sản xuất glucoza Còn dựa vào khả năng thủy phân protein của proteaza người ta

bổ sung nó vào trong chế biến thịt, cá, sữa, đồ hộp, cá rán, chế biến nước mắm ngắnngày Hay dùng pectinaza để tăng hiệu suất ép nước làm dịch quả

Khi sử dụng chế phẩm enzym để chế biến các sản phẩm nông nghiệp như chè,thuốc lá…thì thường tăng nhanh quá trình chế biến, tăng hương vị và giá trị dinhdưỡng của sản phẩm Ngoài ra, sử dụng enzym còn có thể cải tạo hương vị của các loạirau quả tươi sau khi chế biến, trong bảo quản đồ hộp và một số nguyên liệu khác

1.1.2.5 Ứng dụng trong nông nghiệp

Sử dụng các chế phẩm enzym trong nông nghiệp để chế biến các sản phẩm nôngnghiệp như: Sản xuất thức ăn cho động vật đặc biệt là động vật còn non, xử lý hạttrước khi gieo Dùng enzym để sản xuất thức ăn cho động vật nhằm làm tăng giá trịdinh dưỡng cho thức ăn thô, tăng hệ số sử dụng thức ăn

Sử dụng enzym để chuẩn bị thức ăn cho gia súc có thể tiến hành theo hai cách:

+Thêm trực tiếp enzym vào trước khi dùng

+Thêm enzym để xử lý sơ bộ thức ăn.

Cách thứ nhất đơn giản hơn nhưng cách thứ hai lợi hơn vì khi xử lý ngoài cơ thể

ta có thể dễ dàng tạo điều kiện thích hợp về pH, nhiệt độ cho enzym hoạt động mạnh,

do đó hiệu quả phân giải thức ăn lớn hơn so với cách thứ nhất

Để sử dụng enzym trong chăn nuôi, tốt nhất là dùng các chế phẩm enzym từ visinh vật và chưa tinh chế, vì thành phần enzym, đặc biệt là các enzym thuỷ phân trongcác chế phẩm này thường phong phú hơn nhiều so với chế phẩm enzym từ động vật

Do vậy khi thêm chế phẩm enzym vi sinh vật vào thức ăn của động vật trưởng thành,khoẻ mạnh vẫn có ảnh hưởng rõ rệt Trong khi đó nếu thêm chế phẩm enzym động vậtlại không có hiệu quả gì

Khi sử dụng dụng chế phẩm enzym để bổ sung vào thức ăn cần lựa chọn chếphẩm phù hợp cho từng loại động vật Vấn đề quan trọng hơn nữa là phải xác địnhlượng enzym thích hợp cần thêm vào thức ăn để đạt kết quả tốt nhất Ngoài ra trongnông nghiệp có thể sử dụng enzym để xử lý hạt trước khi gieo nhằm rút ngắn thời gian

nảy mầm và tăng sản lượng thu hoạch.[16,Tr13][2,Tr12]

1.2 Enzym proteaza

1.2.1 Giới thiệu về enzym proteaza

Proteaza là enzym xúc tác sự thuỷ phân liên kết peptit (CO-NH) trong phân tử

protein và các cơ chất tương tự [2,Tr127 ].

Dưới tác dụng của enzym proteaza, protein bị thuỷ phân theo sơ đồ sau :

Protein pepton polypeptit peptit axit amin

Đây là quá trình thuỷ phân tương đối phức tạp và có sự tham gia của nhiều loạiproteaza khác nhau Nhiều proteaza cũng có khả năng thủy phân liên kết este và vậnchuyển axit amin (CO-OH)

Từ thế kỷ XVIII, nhà bác học Pháp Roemur đã phát hiện dạ dày của chim ăn thịt

có khả năng tiêu hoá thịt Tuy nhiên đến năm 1875 Convisart mới tách được từ dịch

tụy, đó là proteaza đầu tiên nhận được ở dạng chế phẩm Từ đó nhiều nhà bác họcnghiên cứu và tách được nhiều enzym khác nhau ở dạng tương đối tinh khiết.

Ngoài các enzym hệ tiêu hoá, người ta cũng có những quan sát về những proteazatrong máu Schmidt (1869-1872) đã nêu giả thiết trong máu có enzym trombin thamgia trong quá trình làm đông máu và tác giả thu được enzym này và kết tủa bằng cồn.Các proteaza thực vật được phát hiện muộn hơn Năm 1874 Group-Besanez công

bố đã nhận được proteaza từ hạt một loại đậu Tác giả cũng nhận thấy rằng dịch chiết

từ hạt đại mạch, bông, lanh đều có hoạt động phân giải protein nhưng bằng chứng nàykhông vững chắc Vì vậy Wurtz được xem là người đầu tiên tách được proteaza thựcvật (1879) Ông nêu rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có chứa proteaza, khi dùngcồn để kết tủa thu được chế phẩm không tinh khiết (100g/1cây) gọi là papain

Đến đầu nữa thế kỷ XX người ta mới phát hiện thêm các peptithydrolaza khácnhư: bromelain-proteaza từ cây dứa, captesin-proteaza của mô cơ động vật Nhờ kếttinh được enzym có độ tinh khiết cao nên người ta nghiên cứu được cấu trúc phân tử,cấu trúc trung tâm hoạt động, tính chất hoá lý và tính đặc hiệu của các proteaza

Từ năm 1950 trở lại đây đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về proteaza cho thấy các proteaza khác nhau về cơ chế phản ứng, phân hủy các cơ chất có cấu trúc khácnhau, điều kiện môi trường hoạt động khác nhau

1.2.2 Nguồn thu proteaza

Các proteaza khá phổ biến trong động vật, thực vật, vi sinh vật Tuy nhiên sự phân bố của chúng không đồng đều trong các mô của các loài và các cơ quan Có thể thu nhận proteaza theo 3 nguồn chính sau :

 Từ thực vật :

Thu nhận protein từ thực vật cũng chiếm một tỉ lệ quan trọng trong công nghệ

enzym Một số enzym thực vật được ứng dụng nhiều trong y học, thực phẩm và côngnghiệp Trong số đó phải kể đến bromelain có trong dứa, papain có trong đu đủ vàureaza có trong các cây họ đậu v.v…

Việc nghiên cứu proteaza thực vật được bắt đầu vào thế kỷ XIX gắn liền với công

trình nhà bác học người Nga Kieegov, ông đã chứng minh nước chiết từ hạt lúa mạch

có tác dụng chuyển hoá tinh bột thành đường Và đến năm 1962 lần đầu tiên Sumner

đã tách proteaza thực vật ở dạng tinh thể (ureaza)

Năm 1995, Võ Sỹ Hùng nghiên cứu thu nhận proteaza từ ruột bí đao, đến năm

1997 các tác giả đã nghiên cứu tìm cách ứng dụng proteaza thu được vào quy trình sảnxuất phomat phù hợp với điều kiện Việt Nam.Trong những năm gần đây, nhiều tác giảtrong nước đã nghiên cứu thu nhận được một số proteaza từ thực vật ở mức độ tinhkhiết khác nhau tuỳ theo mục đích sử dụng như papain từ nhựa đu đủ xanh, bromelain

từ võ, lõi, và lõi đầu dứa với hiệu suất thu hồi chế phẩm thô tương đối cao

Bromelain được điều chế từ vỏ, lõi, chồi dứa, nguồn cung cấp chính của enzymnày là hãng Biochem, Bangkok Thái Lan

 Từ động vật :

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhầy dạdày, tim,…những phế liệu của công nghiệp thịt -dùng để tách enzym rất tiện lợi Dịchtuỵ có chứa amylaza, lipaza, proteaza, ribonucleaza và một số enzym khác

Từ ngăn thứ tư của dạ dày bê nghé, người ta thu chế phẩm Renin để làm đông sữatrong sản xuất phomat Người ta cũng sản xuất pepxin từ dạ dày động vật Từ mô cơ(gan, thận, phổi, tim, dạ con) tách được captexin A, B, C, D, từ huyết tương tách đượcenzym trombin Tuy nhiên với nguồn nguyên liệu để sản xuất enzym là động vật thìnguyên liệu đó phải tươi tốt, lấy ngay sau khi giết mổ, bảo quản ở -200C Đây là vấn đềkhó khăn cho nên thu enzym proteaza từ động vật ít được quan tâm hơn so với thực vật

và vi sinh vật

 Từ vi sinh vật:

Với lí do về kinh tế, công nghệ mà hai nguồn nguyên liệu động vật, thực vậtkhông thể dùng làm nguyên liệu để sản xuất với qui mô công nghiệp lớn các chế phẩmenzym nhằm thoả mãn các nhu cầu của nền kinh tế quốc dân Như vậy, trong các

nguồn nguyên liệu sinh học thì nguồn nguyên liệu vi sinh vật là dồi dào và đầy hứahẹn

Phần lớn enzym được sản xuất từ vi sinh vật Các vi sinh vật chủ yếu được sử

dụng thuộc loài Bacillus hoặc loài Aspergillus Năm 1950, hãng Novo của Đan Mạch

chào hàng chế phẩm enzym lên men đầu tiên, là α-amylase lấy từ vi khuẩn Trongnhững năm gần đây, với số lượng enzym proteaza bán ra chiếm 60% tổng lượng enzymthì việc thu nhận proteaza từ vi sinh vật là điều tất yếu

+ Nhiều vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh proteaza như:

− Vi khuẩn: Giống Bacillus như: Bac.subtillis, Bac.thermophilus,

Bac.brevis ; giống Clostridium như Cl.perfrigens, Cl.sporogens

− Xạ khuẩn: Từ giống Streptococus như: Str.griseus, Str.rimosus

− Nấm mốc: Giống Asp như: Asp.oryzae, Asp.Niger, Asp.awamori,

Asp.candidus, Asp.flavus

So với proteaza động vật và thực vật, proteaza vi sinh vật có những đặc điểm khácbiệt.Trước hết hệ proteaza vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiềuenzym rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách radưới dạng tinh thể đồng nhất Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzym giống nhau nênproteaza vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thủy phân triệt để

và đa dạng Nếu khi dùng enzym vào mục đích sử dụng thì rất hiệu quả, tuy nhiên nógây khó khăn cho việc tách và tinh chế một enzym

1.2.3 Phân loại proteaza :

1.2.3.1 Dựa vào cơ chế thuỷ phân :

Phân làm hai nhóm :

mạch polypeptid Các enzym có khả năng thuỷ phân liên kết _NH_ của liên kết peptidgọi là aminopeptidaza, còn enzym xúc tác thuỷ phân liên kết peptid ở đầu mạch cacbon-CO- của mạch polypeptid được gọi là cacboxypeptidaza

 Endoproteaza : là những enzym xúc tác sự phân giải các liên kết peptid ở

giữa mạch polypeptid như dipeptithydrolaza

1.2.3.2 Dựa vào trung tâm hoạt động :

Căn cứ vào cơ chế phản ứng, pH hoạt động thích hợp,v.v… Hartley đã phân loạiproteaza vi sinh vật thành 4 nhóm chính :

−Các proteaza sinh kiềm: có pH tối thích trong vùng kiềm và thường chứa

một nhóm Serine quan trọng Nhóm này có thể được phát hiện bằng các chất ức chếnhất định như dizo-propylfluophotphat Nó bị vô hoạt nhanh chóng ở nhiệt độ lớn hơn

600C, điểm đẳng điện trong khoảng cao 9,5÷10,5, có khả năng phân giải este và liênkết amit của các dẫn xuất axit và axit amin

−Các proteaza-kim loại: pH tối thích trong vùng trung tính, trung tâm hoạt

động có chứa nguyên tử kim loại và bị ức chế bởi EDTA, nó sẽ bị mất hoạt tính hoàntoàn ở nhiệt độ 700C sau 30 phút

−Các proteaza axit: trung tâm hoạt động có chứa nhóm -COOH có pH tối

thích trong vùng 2÷5 và nó thuộc loại khá bền với nhiệt

−Các proteaza cystein: có pH tối thích trong vùng trung tính đến kiềm yếu

và bị ức chế bởi thuốc thử SH như P-clomecuribenzoat, trung tâm hoạt động là nhóm-SH của cystein

Sự phân loại này chỉ có ý nghĩa thực dụng, không thực sự chính xác vì pH hoạtđộng tối thích của mỗi enzym còn phụ thuộc vào bản chất của cơ chất và nhiều yếu tố

khác.[17,Tr177]

Các enzym proteaza nói chung được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khácnhau như: công nghiệp, nông nghiệp, y học, trong nghiên cứu khoa học

1.2.4.1 Trong quá trình chế biến cá

Khi làm nước mắm, muối cá, sản xuất bột cá proteaza vốn có trong cá sẽ thủyphân một phần protein của cá Tuy nhiên quá trình này thường xảy ra chậm và yếu,

người ta đưa thêm proteaza từ ngoài vào sẽ làm tăng rõ rệt quá trình thủy phân, rútngắn thời gian chế biến Protein của cá bị thủy phân mạnh nên quá trình loại mỡ, loạixương khỏi phần thịt cá bị thủy phân (trong sản xuất bột cá) được dễ dàng hơn, lượngnước mắm cốt thu được cũng nhiều hơn hẳn so với mẫu đối chứng Thêm proteaza vàolàm biến đổi nhanh chóng cấu tạo của mô cá do đó muối và các gia vị dễ dàng thấmvào, rút ngắn thời gian muối cá, thời gian xông khói cũng như thời gian xử lý nhiệt khichế biến cá Trong nhiều trường hợp khi thêm proteaza còn làm tăng hương vị của sảnphẩm.

1.2.4.2 Trong công nghiệp thịt

Proteaza được sử dụng để làm mềm thịt và tăng hương vị của thịt sau khi chếbiến Người ta xác định rằng nếu thủy phân một phần protein của thịt rồi mới chế biến

sẽ làm tăng hương vị rõ rệt của sản phẩm nhận được: như papain được sử dụng để làmmềm thịt, bromelain để thủy phân gan bò Thịt sau khi làm mềm có thể chế biến thànhcác thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao

Người ta còn dùng proteaza để sản xuất các dịch đạm thủy phân từ các phế liệugiàu protein như thịt vụn, đầu cá, da Dùng proteaza để thủy phân protein thường ít bịhao hụt axit amin như khi dùng phương pháp hoá học Thủy phân protein bằng axitthường mất khoảng 30÷50% serine, treonine, còn cystein và cystine thì bị thủy phânhoàn toàn Để thủy phân sâu sắc protein cần dùng các proteaza có tính đặc hiệu rộngrãi, tuy nhiên khi thủy phân bằng enzym khó lòng thủy phân hoàn toàn protein Chonên để thủy phân hoàn toàn protein cần dùng hỗn hợp proteaza từ các nguồn khácnhau

Một ưu điểm khác của phương pháp thủy phân protein bằng proteaza là khôngphá hủy các vitamin có trong nguyên liệu, không làm sẫm màu dịch thủy phân vàkhông tạo thành các sản phẩm phụ khác

1.2.4.3 Trong quá trình chế biến sữa

Proteaza không những có khả năng thủy phân protein mà còn có khả năng đông

tụ sữa Ở đây có sử dụng những proteaza có tác dụng làm đông tụ sữa: như renin,pepxin và một số proteaza vi sinh vật khác Ngoài ra để đáp ứng nhu cầu thực tế, ngàynay proteaza thực vật cũng được sử dụng để làm đông tụ sữa, trong đó fixin từ các câyFicus và bromelain từ dứa cũng được sử dụng vào mục đích này Tuy nhiên tất cảproteaza vi sinh vật và thực vật đều khác với Renin của động vật ở chỗ chúng khôngnhững làm đông tụ sữa mà còn có thể thủy phân sâu sắc cazein, do đó có ảnh hưởngxấu đến chất lượng của phomat Vì vậy trong quá trình làm phomat, Renin vẫn chiếmmột vị trí đặc biệt trong các proteaza khác Dưới tác dụng của Renin, cazein của sữa sẽđông tụ thành khối đặc không hoà tan và tất cả mỡ của sữa sẽ được giữ trong kết tủanày Các proteaza sẽ thủy phân một phần các axit amin các peptit thấp phân tử, cácchất này ảnh hưởng đến hương vị của phomat

Ngoài ra proteaza cũng được dùng để thu cazein kỹ thuật, dùng trong ngành kỹnghệ như: vecni, chất màu, hương liệu, proteaza cũng được dùng trong sản xuất chao

1.2.4.4 Trong công nghiệp nước giải khát

Proteaza được dùng trong bia, rượu vang, rượu mùi, nước quả và ổn định chấtlượng, cụ thể proteaza thường dùng là papain và bromelain Ngoài ra proteaza đượcdùng trong sản xuất rượu, ở đây nó phân giải các protein có tác dụng kìm hãmamylaza, do đó tăng nhanh quá trình chuyển hoá tinh bột

1.2.4.5 Trong công nghiệp da

Proteaza được dùng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da Các proteaza sẽ làmmềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một

số liên kết của sợi collagen

Khi xử lý bằng proteaza tính đàn hồi của da cũng tăng lên Sử dụng proteaza cũngrút ngắn được quá trình tẩy lông, lượng lông thu được tăng lên 25÷30% so với phương

pháp hoá học Sử dụng enzym trong công nghệ thuộc da tránh được độc hại cho côngnhân, tránh được ô nhiễm môi trường.

1.2.4.6 Trong công nghệ dược phẩm và y học

Proteaza được dùng để sản xuất các thuốc làm tăng khả năng tiêu hoá protein củanhững người bị bệnh tiêu hoá kém do dạ dày, tụy tạng không bình thường, thiếu enzymdùng phân giải các chất hữu cơ trong cơ thể, chữa bệnh tắc tĩnh mạch

Proteaza dùng sản xuất môi trường dinh dưỡng hỗn hợp có protein trong nuôicấy sinh vật để sản xuất chất kháng sinh, chất kháng độc Ngoài ra còn dùng chếphẩm proteaza để cô đặc và tinh chế huyết thanh kháng độc để chữa bệnh Trong sốcác proteaza: papain dùng chế thuốc trị bệnh, bromelain được dùng để điều trị viêmloét, rối loạn tiêu hoá, giảm phù nề, tụ huyết, giúp vết thương chóng lành, bromelain cótính an thần làm tăng khả năng hấp thụ kháng sinh lên bốn lần, bromelain còn dùng đểchữa trị hen suyễn

1.2.4.7 Trong công nghệ phim ảnh

Proteaza vi khuẩn và xạ khuẩn được dùng để tái sinh các các nguyên liệu cảmquang khác nhau như phim điện ảnh, giấy phim, phim Rơnghen, phim chụp máy bay Các proteaza sẽ được phân giải và hoà tan lớp nhũ tương gelatin trên phim và giấy ảnh,

do đó có thể làm sạch và sử dụng trở lại các loại phim và giấy ảnh quý

1.2.4.8 Trong nông nghiệp

Proteaza dùng trong chăn nuôi để phân giải sơ bộ protein trong thức ăn, làm tăngkhả năng hấp thụ thức ăn của động vật hoặc dùng để sản xuất dịch thủy phân giàu đạm

bổ sung vào thức ăn gia súc gia cầm

1.2.4.9 Trong sản xuất tơ tằm

Sợi thu được sau khi kéo ở kén ra thường chứa 30% xerixin Chỉ cần một lượngnhỏ xerixin nằm lại trên tơ lụa sẽ làm giảm độ đàn hồi của lụa, làm cho lụa bắt màukhông đồng đều và khó trang trí lụa Để tách lượng xerixin còn lại đó ta dùng chếphẩm proteaza từ nấm mốc và đặc biệt từ vi khuẩn

1.2.4.10 Trong nghiên cứu khoa học

Proteaza được dùng để nghiên cứu cấu trúc phân tử protein Trong thời gian gầnđây người ta dùng chế phẩm proteaza không hoà tan bằng cách gắn vào những chấtkhông tan như xenlluloza, sephadex, sepharoza

Enzym được giữ trên chất mang nhờ lực hấp phụ, lực liên kết hoá trị để ứngdụng vào nhiều lĩnh vực khác nhau như: trong thực phẩm, nghiên cứu cấu trúc phân tửprotein

Ngoài ra proteaza còn được sử dụng để bổ sung vào các loại xà phòng giặt, xàphòng tắm, kem bôi mặt, thuốc đánh răng làm cho da mịn, làm sạch cao răng, chữaviêm lợi và trong chừng mực nhất định có tác dụng diệt vi khuẩn

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzym proteaza từ

vi sinh vật :

Quá trình sinh tổng hợp enzym nói chung cũng như quá trình tổng hợp proteaza

của vi sinh vật nói riêng chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như : độ ẩm, nhiệt

độ, pH, độ thông khí, thành phần môi trường v.v…do đó sự sinh tổng hợp proteaza

của Bacillus subtilis cũng không nằm ngoài quy luật chung đó

1.2.5.1 Ảnh hưởng của nhiệt độ:

Nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển, khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinhvật cũng như tính chất của enzym được tổng hợp Tuỳ theo từng loại vi sinh vật, nhiệt

độ thích hợp khác nhau: các loài nấm mốc topt= 22 ÷320C còn vi khuẩn thì thích hợp ởnhiệt độ cao hơn topt= 35 ÷550C Nói chung đa số các vi sinh vật sinh tổng hợp enzymkhông bền với nhiệt và bị kìm hãm nhanh chóng ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ thích hợp

1.2.5.2 Ảnh hưởng pH của môi trường :

Khi dùng phương pháp nuôi cấy bề mặt, pH môi truờng ít ảnh hưởng đến quátrình sinh tổng hợp enzym ở vi sinh vật Hơn nữa pH môi trường hầu như không thayđổi trong quá trình phát triển của vi sinh vật, với các nấm mốc pHopt=6 ÷6.5, với vikhuẩn thì pH= 6.6 ÷7.4

Khi dùng phương pháp bề sâu thì pH có ảnh hưởng rất lớn, nhiều khi có vai tròquyết định đối với sự tích luỹ proteaza trong môi trường pH môi trường có thể thayđổi sau khi khử trùng và trong quá trình phát triển của vi sinh vật pH ban đầu của môitrường thích hợp cho các loài vi khuẩn là khác nhau, với nấm mốc pH= 3.8 ÷5.6, cònvới vi khuẩn pH = 6.2÷ 7.4.

1.2.5.3 Độ thông khí :

Đây cũng là một yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp proteaza.Tuy nhiên ảnh hưởng này khác nhau tuỳ theo vi sinh vật.Trong một số trường hợp,thiếu oxi tuy có kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật nhưng lại làm tăng quá trìnhsinh tổng hợp proteaza Lượng oxi thích hợp cho quá trình sinh tổng hợp ở các vi sinhvật khác nhau là khác nhau Ngay cả đối với một vi sinh vật nhất định, sự hiếu khícũng ảnh hưởng khác nhau.Trong một số trường hợp, sự hiếu khí lại kìm hãm mạnh sựsinh tổng hợp enzym

1.2.5.4 Ảnh hưởng của thành phần môi trường :

Thành phần môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp enzym

Để tăng lượng enzym trong môi trường cần lựa chọn nguồn C, N, muối khoáng thíchhợp giữa các thành phần này và đặc biệt là cần sử dụng chất cảm ứng Đối với một visinh vật nhất định, điều kiện cho quá trình tổng hợp các enzym khác nhau không giốngnhau Nắm vững các quy luật ảnh hưởng của các yếu tố này có thể điều khiển vi sinhvật tổng hợp định hướng một enzym xác định

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon:

Ở vi khuẩn Bac.subtilis, quá trình tổng hợp proteaza xảy ra khá mạnh khi dùng

cacbon là tinh bột với nồng độ khoảng 2% Nếu giảm nồng độ tinh bột xuống dưới 2%

sẽ làm giảm một ít hoạt độ phân giải protein của dịch môi trường nuôi cấy

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ:

Nguồn nitơ hữu cơ thường ảnh hưởng tốt đến quá trình sinh tổng hợp proteaza vìchúng có vai trò như chất cảm ứng của quá trình này Các nguồn nitơ thường dùng là :

các loại bột khác nhau (có gluten), nước chiết của cám, nấm men đã tự phân giải,pepton, protein v.v…Ngoài việc chọn nguồn và lượng cacbon và nitơ thích hợp cầnphải chọn tỷ lệ thích hợp Có như vậy mới bảo đảm cho việc sinh proteaza là lớn nhất.Ngoài những yếu tố kể trên thì các nguyên tố vi lượng, NaCl, vitamin và các yếu tốkhác cũng ảnh hưởng đến quá sinh tổng hợp.

Người ta đã chứng minh được rằng với Bac.subtilis có thể dùng điều kiện nuôi

khác nhau để thu được các chế phẩm có tỷ lệ khác nhau hoặc là chủ yếu là phức hệamylaza hoặc chủ yếu là hệ proteaza Theo Ortrosko (1977) để thu proteaza từ

Bac.subtilis thì thành phần môi trường gồm: dịch thuỷ phân cazein :0.3%, glucoza :1%,

MgSO4.7H2O:0.05%, KH2PO4 :0.005% Còn để thu amylaza thì dùng bằng nước chiếtcám 20%

1.3 Một số nghiên cứu, ứng dụng của proteaza hiện nay :

1) Theo Thạc sĩ Vũ Xuân Dũng, năm 1997 đã làm nghiên cứu “Phân lập, lựa chọnchủng vi khuẩn chịu kiềm, chịu mặn, chịu nhiệt có hoạt tính proteaza cao và thăm dòkhả năng ứng dụng vào quá trình sản xuất nước mắm ngắn ngày” Sau khi phân lập

được chủng vi khuẩn sinh proteaza mạnh kí hiệu là Bacillus D15 và ứng dụng vào sản

xuất nước mắm ngắn ngày Khi bổ sung 5% dịch nuôi cấy vào chượp cá sau 30 ngàythuỷ phân thì hàm lượng nitơ toàn phần đạt :22.6g/kg, nitơ foocmol đạt:12.7g/kg, nitơamin đạt:7.5g/kg Dịch lọc từ chượp sau 30 ngày đạt được những chỉ tiêu chuẩn củachượp chín và đạt được các chỉ tiêu chất lượng về cảm quan: màu vàng sáng, mùithơm, vị mặn, ngọt [7,tr125_133]

2) Dùng Bacillus subtilis CNTP_B_08 có khả năng sinh tổng hợp α_amylaza

cao, để ứng dụng trong công nghệ sản xuất bia nhằm thay thế một phần malt đại mạchbằng các loại nguyên liệu có sẵn trong nước như: ngô: 30%; gạo: 30%; malt: 40% Do

đó giá thành sản phẩm hạ 22% (báo cáo khoa học, 43)

3) Nghiên cứu và triển khai sản xuất nước mắm ngắn ngày vào thực tiễn bằngbromelain từ dứa

4) Ảnh hưởng của muối ăn đến quá trình thuỷ phân cá mối bằng proteaza của

Bacillus và nồng độ muối thích hợp là 3% (Tạp chí thuỷ sản ,2003)

5) Theo kết quả nghiên cứu thu nhận và bảo quản proteaza từ chế phẩm lên men

bề mặt của vi khuẩn Bac.subtilis Proteaza của vi khuẩn hoạt động mạnh nhất 40 ÷50oC

ở nhiệt độ thấp hơn hoặc cao hơn ( trên 60oC ) thì proteaza mất hoạt độ đáng kể chỉcòn lại khoảng 40% pH thích hợp cho proteaza hoạt động là 6.4 ÷7 Proteaza vi khuẩnrất bền với nhiệt độ, ở nhiệt độ 50oC, hoạt độ proteaza không giảm sau 6h Ở nhiệt độcao hơn thì hoạt độ proteaza giảm dần theo thời gian và đặc biệt ở nhiệt độ 70oC thìhoạt độ proteaza giảm rất nhanh

6)"Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên khả năng sinh proteaza của

Bac.subtilis" là kết quả của quá trình nghiên cứu của Th.S Đỗ Thị Bích Thuỷ và TS

Trần Thị Xô, năm 2004 đã cho thấy nguồn cacbon và nitơ có tác dụng kích thích cao nhất là tinh bột hoà tan và cazein Thành phần nuôi cấy chủng Bac.subtilis ở quy mô

phòng thí nghiệm bao gồm: pepton 1%, cao thịt 0.3%, muối 0.5%, tinh bột hoà tan1.75%, cao nấm 0.1% pH ban đầu bằng 6.5 và nhiệt độ nuôi cấy thích hợp ứng với

môi trường tối ưu để Bac.sutillic sinh proteaza mạnh nhất là 35oC

CHƯƠNG II

NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên liệu và thiết bị

Nguyên liệu được sử dụng là cá cơm than được đánh bắt từ biển Quảng Nam-Đà Nẵng

Muối biển dạng hạt của Sa Quỳnh - Quảng Ngãi

Chủng vi khuẩn Bacillus subtillis C 10 từ phòng thí nghiệm bộ môn bảo quản chếbiến nông sản trường Đại học Nông Lâm - Huế

2.1.2 Các hoá chất

 Hoá chất :

Các hoá chất tinh khiết : K2HPO4, NaH2PO4.2H2O, foocmol 40%, cồn tuyệt đối,NaOH 0.1N, H2SO4 0.1N.Các chỉ thị màu: thimolphtalein, phenolphtalein, metyl đỏ.NaCl tinh khiết, cao nấm, agar-agar từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại HọcBách Khoa Đà Nẵng

Pepton, cazein tinh khiết, tinh bột sắn, tinh bột tan, phế liệu tôm từ phòng thínghiệm Hoá Sinh bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm_Sinh Học

 Thiết bị :

Máy li tâm : MIRRO 24R

Tủ ổn định nhiệt, máy lắc từ, thiết bị thanh trùng, thiết bị màng lọc vô khuẩn,thiết bị phân tích đạm Kiendal, tủ lạnh đông –200C

Máy đo pH, bút đo pH

Các thiết bị xay thô, xay mịn, nghiền

Các loại cân kỹ thuật chính xác đến 10-2, 10-4

Và các thiết bị thông dụng trong phòng thí nghiệm

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Quy trình thu nhận dịch chiết enzym :

 Qui trình thu nhận enzym proteaza từ Bacillus subtilis:

Các chế phẩm enzym được sử dụng trong thực tế dưới nhiều dạng khác nhau.Trong một số trường hợp, canh trường nuôi cấy vi sinh vật trong đó có chứa enzymđược sử dụng trực tiếp dưới dạng thô không cần tách tạp chất nếu các tạp chất đókhông gây tác hại đáng kể đến sản phẩm và kỹ thuật sản xuất sau này Cũng có nhiều

Phối trộn môi trường pH=6

Thanh trùng 1210C30phút

trường hợp người ta cần đến chế phẩm enzym tinh khiết với mức độ khác nhau tuỳtheo yêu cầu sử dụng

Qua tài liệu nghiên cứu về cách thu nhận proteaza vi sinh vật mà enzym đượckhuếch tán ra môi trường ( nuôi theo phương pháp chìm ) thì để thu dịch enzym người

ta thường tách sinh khối và các chất cặn bã ra khỏi canh trường bằng cách ly tâm hoặc

ép lọc với việc sử dụng thêm các chất trợ lọc hoặc các chất tạo kết tủa nếu cần thiết.Dựa vào các tài liệu đã nghiên cứu, tôi xây dựng qui trình thu nhận enzym để nghiêncứu như trên

 Thuyết minh qui trình công nghệ :

• Hoạt hoá giống Bacillus subtilis ( nuôi cấy tăng sinh ):

Giống Bacillus subtilis sau khi phân lập được giữ trong môi trường thạch nghiêng ở

50C Trước khi đưa vào sản xuất enzym, giống này được hoạt hoá bằng cách chuyểnvào 1ml môi trường tối ưu cơ bản trong ống nghiệm và nuôi cấy lắc 200vòng/phút,trong 24h, ở 350C

• Chuẩn bị môi trường: tiến hành theo mục 1 phụ lục

• Nuôi cấy sản xuất enzym: tiến hành theo mục 2 phụ lục:

Quá trình nuôi cấy như sau:

Cho giống tăng sinh vào nuôi trong môi trường thay thế với tỉ lệ giống là 1%.Quá trình nuôi được thực hiện trong tủ ấm có máy lắc 200vòng/phút, nhiệt độ 350C

• Tách và tinh chế enzym:

Dịch chiết enzym thô thu được bằng cách ly tâm lạnh ở 4000vòng/phút , ở nhiệt

độ 40C, trong 10 phút

2.2.2.1.Nguyên tắc: Theo mức độ thuỷ phân protein, các nhóm cacboxyl và

nhóm amin tự do trong dung dịch tăng dần, do đó dựa vào sự tăng của một trong cácnhóm này để xác định hoạt độ enzym Phương pháp này dựa trên cơ sở dùng foocmolbao vây nhóm acid amin và chuẩn độ nhóm cacboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ

xác định Từ lượng kiềm đã dùng để chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amintương ứng.

Hoạt độ enzym được tính bằng miligam đạm amin được tạo thành trong 1h ở điềukiện nhiệt độ và pH xác định Một đơn vị hoạt động là lượng enzym mà sau 1h ở 300C

và pH thích hợp có thể phân giải protein tạo thành 1mg đạm amin

2.2.2.2.Hoá chất : Được thực hiện theo mục 4 phụ lục

2.2.2.3.Cách tiến hành: Được thực hiện theo mục 3 phụ lục

2.2.2.4.Tính kết quả:

Hoạt độ phân giải protein của 1ml dung dịch nghiên cứu là:

HđP=( )

V t

f V

V1: số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình thí nghiệm

V2 : số ml dung dịch NaOH 0.1N dùng chuẩn bình kiểm tra

f: Hệ số chỉnh lý của dung dịch dung dịch NaOH 0.1N

t: thời gian enzym tác dụng, h

V: thể tích dung dịch enzym đã dùng, ml

1,42: là số mg đạm amin tương ứng với 1ml dung dịch NaOH 0.1N

2.2.3 Phương pháp xác định nitơ foocmol:

2.2.3.1.Nguyên tắc : Phương pháp này dựa trên cơ sở dụng foocmol bao vâynhóm amin và chuẩn độ nhóm carboxyl bằng dung dịch kiềm có nồng độ dung dịchxác định Từ lượng kiềm dùng chuẩn độ tính được lượng miligam đạm amin tươngứng

2.2.3.2.Cách tiến hành: được thực hiện theo mục 5 phụ lục

2 1 2

V1 -Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml

V2 -Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml

10 -Thể tích dịch lấy chuẩn

100 - Hệ số pha loãng0,0014-số gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N1000: hệ số quy đổi ra lít

đáng kể Trong các sản phẩm thực vật, NH3 có ở dạng tự do cũng như liên kết (chủ yếu

là ở dạng muối của các axit hữu cơ), ở một số phẩm vật thực phẩm như thịt,cá, chao,nước mắm, các loại đồ hộp thịt cá…amôniac tích tụ một lượng khá lớn, thường tồn tạidưới dạng muối NH4Cl, (NH4)2SO4 Việc xác định nó có ý nghĩa đặc trưng cho mức

độ hư hỏng của sản phẩm, để giải phóng NH3 ra khỏi dung dịch, người ta thường dùngcác kiềm yếu ít tan trong nước như MgO, CaO Cất amôniac ở nhiệt độ 35-400C vàdưới áp suất thấp khoảng 15-20mmHg

2.2.4.2.Hoá chất:

NaOH 30%, H2SO4 0.1N, NaOH 0.1N

Thuốc thử: + Thuốc thử metyl đỏ

+ Thuốc thử phenolphtalein 1% trong cồn tuyệt đối

2.2.4.2.Cách tiến hành: tiến hành theo mục 6 phụ lục

*0014,0)(

2 1 2

Trong đó : V1-Thể tích NaOH 0,1N tiêu tốn khi chuẩn mẫu trắng -ml

V2-Thể tích NaOH 0,1 N tiêu tốn khi chuẩn mẫu phân tích -ml

50-Thể tích nước mắm pha loãng cho vào bình cất máy cất đạm

0,0014- gam nitơ ứng với 1ml NaOH 0,1 N

1000:hệ số quy đổi ra lít

2.2.5 Xác định hàm lượng nitơ amin (đạm tan):

Hàm lượng nitơ amin chính là hiệu số giữa nitơ foocmol và nitơ amoniac, đặctrưng cho lượng đạm tan trong dung dịch

CHƯƠNG III

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 Nghiên cứu thu nhận enzym từ Bacillus subtilis :

3.1.1.Hoạt hoá giống và quan sát một số đặc điểm hình thái của

Bac.subtilis:

Chủng vi khuẩn Bac.subtilis sử dụng trong nghiên cứu được lấy từ phòng thí

nghiệm bộ môn bảo quản chế biến nông sản trường Đại học Nông Lâm -Huế Sau mộtthời gian bảo quản, để đảm bảo giống không bị thoái hoá, tôi tiến hành hoạt hoá vàtuyển chọn lại

Để thu được chủng vi khuẩn Bac.subtilis thuần khiết, chúng tôi tiến hành nuôi nó

trên môi trường thạch-thịt-pepton trong 24h ở 300C Rồi tiến hành phân lập lựa chọndựa trên nguyên tắc pha loãng để tách từng khuẩn lạc riêng biệt

Để thuần khiết vi khuẩn Bac.subtilis, chúng tôi sử dụng môi trường

thạch-thịt-pepton, được hấp tiệt trùng 1210C trong 30 phút Bằng phương pháp pha loãng thậpphân canh trường chứa vi khuẩn như ở sơ đồ hình 1 đã mô tả Tương ứng với mỗi độpha loãng thập phân lấy 0,1ml canh trường cho lên bề mặt của môi trường thạch trongmỗi hộp peptri Dùng que trang dàn đều canh trường trên bề mặt thạch nhằm thu đượccác khuẩn lạc riêng rẽ Các hộp peptri được nuôi trong 24h ở 350C, các khuẩn lạc xuấthiện thì đem ra quan sát Khuẩn lạc mọc trên hộp peptri phụ thuộc vào độ pha loãng

Sơ đồ pha loãng như sau:

Hình 1: Sơ đồ thí nghiệm phân lập và chọn giống

Bảng 1:Một số đặc điểm về hình thái của khuẩn lạc Bac.subtillis trên môi trường thạch-thịt-pepton

Độ pha loãng Số khuẩn lạc đếm được Đặc điểm khuẩn lạc

10-6 Rất nhiều Các khuẩn lạc rất nhỏ, dính lại với nhau

• Đặc tính mép khuẩn lạc: mép hình răng cưa, xẻ không đều

Sau đó chọn các khuẩn lạc còn trẻ, riêng biệt để cấy chuyền qua ống thạchnghiêng và được nuôi ở 300C trong 24h và được bảo quản ở 40C, sau một tháng thì cấychuyền qua ống thạch nghiêng để giữ và bảo quản giống

3.1.2.Khảo sát khả năng tổng hợp proteaza của Bac.subtillis trên môi

trường rắn:

Bac.subtilis từ ống thạch nghiêng, chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng phát

triển của nó trên môi trường đĩa thạch có thành phần môi trường sữa như đã trình bày ởmục 8 phần phụ lục

Sau khi Bac.subtilis được cấy trên đĩa thạch, chúng tôi tiến hành nuôi ở 300Ctrong 24h