luận văn công nghệ sinh học Nghiên cứu chế biến tinh bột thành tinh bột biến tính để ứng dụng trong tinh bột hoà tan và công nghiệp giấy

I.1.1.2.Các tính chất của amiloza Amiloza dễ tan trong nước Êm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao.Dung dịch của amiloza không bền khi nhiệt độ hạ thấp các dung dịch đậm đặc củaam

Mở đầu

Nước ta nằm ở vùng nhiệt đới nên có nhiều điều kiện thuận lợi về tự nhiên đểphát triển nông nghiệp Trong những năm gần đây nước ta sản xuất ra rất nhiềulương thực, nhu cầu nhân dân được đáp ứng đầy đủ, một phần lương thực đã đượcxuất khẩu nhưng chủ yếu là gạo Các cây lương thực khác như ngô, khoai, sắncũng được trồng ở nhiều nơi và có sản lượng cao Theo niên giám thống kê năm

1998, diện tích trồng khoai lang là 4018 ha, sản lượng 2399900 tấn /năm Diện tíchtrồng sắn 2777400 ha, sản lượng 2211500 tấn/năm Với nguồn tinh bét khoai vàsắn dồi dào như vậy thì trên thực tế ta chỉ sử dụng trực tiếp cho chăn nuôi là chủyếu, còn phần để chế biến thành các sản phẩm có giá trị còn Ýt Đời sống nhân dân

ở các vùng trồng khoai và sắn rất khó khăn vì sắn và khoai có giá trị thương phẩmthấp, những vùng đó lại chỉ thích hợp cho các loại cây trên phát triển Để từngbước tháo gỡ khó khăn thì việc nghiên cứu làm tăng giá trị sử dụng, đa dạng cácsản phẩm từ các nguyên liệu rẻ tiền là cần thiết Một trong những biện pháp là sảnxuất tinh bột biến tính để sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và các ngành côngnghiệp khác Nhu cầu về tinh bột biến tính ở nước ta rất lớn và chủ yếu phải nhậpkhẩu Để nâng cao đời sống nhân dân, sử dụng nguồn nguyên liệu sẵn có em đượcgiao nhiệm vụ :Nghiên cứu chế biến tinh bột thành tinh bột biến tính để ứng dụngtrong tinh bột hoà tan và công nghiệp giấy”

Nội dung bao gồm:

-Xác định một số đặc tính của tinh bét khoai và sắn

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Tinh bét

Trong thiên nhiên, tinh bột là hợp chất hữu cơ rất phổ biến và dồi dào chỉ sau

xenluloza Tinh bột là nguồn dự trữ năng lượng chủ yếu của cây trồng Nó có mặt

ở hầu hết các bộ phận của cây xanh: cành, lá, rễ, củ và quả Tinh bột giữ chức năngsinh học giống nhau đối với người, động vật cũng như đối với các sinh vật bậcthấp Người ta chia tinh bột thực phẩm thành ba hệ thống:

+Tinh bột các hạt cốc: Lúa, ngô, kê, lúa mì

+Tinh bột các cây họ đậu: Đậu Hà lan, đậu đỗ

+Tinh bột các loại củ: Sắn, khoai, khoai lang,rong riềng

Trong các nguồn nguyên liệu kể trên thì tinh bột sắn và tinh bét khoai lang cóhàm lượng cao, giá rẻ Cây sắn và khoai lang dễ trồng năng suất cao

Tinh bột tồn tại dưới dạng hạt, có kích thước biến đổi từ 0,020,12 mm Tuỳvào nguồn gốc và điều kiện canh tác mà các hạt tinh bột có hình dáng và kíchthước khác nhau Bên ngoài hạt tinh bột là vỏ, có nhiều lỗ nhỏ và có cấu trúc rắnhơn, Ýt Èm hơn so với lớp bên trong Bên trong hạt có cấu tạo lớp, trong mỗi lớp

là các tinh thể amiloza và amilopectin xắp xếp theo phương hướng tâm Hạt tinhbột có cấu tạo lỗ xốp nên có khả năng hút Èm, hấp phụ và phản hấp phụ các chấtkhí, lỏng tốt Với lỗ xốp thì khi tương tác với các chất hoà tan thì bề mặt bên trong

và bên ngoài điều tham dù

I.1.Hợp phần amiloza và amilopectin của tinh bét

Tinh bột có nguồn gốc thực vật chứa hai loại polysaccarit khác amyloza(20-30%) và amilopectin(70-80%)

nhau-I.1.1.1 Amiloza

Amiloza cấu tạo từ vài trăm đơn vị D-glucopyranoza liên kết với nhau bằngliên kết -1,4-glucozit(Hình 1) Các mạch này hoàn toàn thẳng hoặc phân nhánh ởmức độ rất thấp tạo nên một chuỗi dài 2001000 gốc glucoza Amiloza trong hạttinh bét, trong dung dịch hoặc trong trạng thái thoái hoá có cấu hình mạch dãn Khithêm tác nhân kết tủa mới chuyển thành dạng xoắn ốc Amiloza ở trạng thái tinhthể thì có cấu hình xoắn ốc Mỗi vòng xoắn ốc gồm 6 gốc glucoza Đường kínhxoắn ốc là 12,97A0 chiều cao là 9,71A0 Các nhóm Hydroxyl của các gốc glucozađược bố trí phía ngoài xoắn ốc, bên trong là các nhóm C-H Kích thước bên trongvòng phải đủ lớn để chứa được phân tử Iôt, Butanol Phân tử lượng của amilozatrong khoảng 50.000-160.000 Theo Stepanenko thì amiloza có hai loại:

+Amiloza có mức độ trùng hợp tương đối thÊp ( khoảng 2000) thì không có cấutrúc bất thường và bị phân ly hoàn toàn bởi -amilaza

+Amiloza có mức độ trùng hợp lớn (trên 6000)có cấu trúc án ngữ với -amilazanên chỉ bị phân giải 60%

Hình 1

I.1.1.2.Các tính chất của amiloza

Amiloza dễ tan trong nước Êm và tạo nên dung dịch có độ nhớt không cao.Dung dịch của amiloza không bền khi nhiệt độ hạ thấp các dung dịch đậm đặc củaamiloza nhanh chóng tạo gel tinh thể và các chất kết tủa không thuận nghịch Hiện tượng tinh bột đã được hồ hoá chuyển trở về trạng thái ban đầu là hiệntượng thoái hoá Hiện tượng này là kết quả của sự tạo thành liên kết hydro giữa cácphân tử amiloza vừa có nhóm hydroxyl vừa có nhóm tiếp nhận hydro giữa các

giữa các phân tử amilopectin cứng nhắc Sự thoái hoá chỉ liên quan chủ yếu đếnamiloza Qúa trình thoái hoá giồm ba giai đoạn:

+Đầu tiên các mạch được uấn thẳng lại

+Tiếp theo vá hydrat bị mất và các mạch được định hướng

+Cuối cùng là sự tạo thành liên kết hydro giữa các nhóm hydroxyl của amilozaTốc độ thoái hoá chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như pH, nhiệt độ, nồng độ dịch

và sự tồn tại của các ion kim loại Tốc độ thoái hoá tăng khi nhiệt độ giảm và cựcđại khi pH =7 và sẽ giảm khi tăng hoặc giảm pH Với pH >10 không cho hiệntượng thoái hoá, pH <2 thì tốc độ thoái hoá vô cùng nhỏ

Amilaza tương tác với Iod cho phức màu xanh đặc trưng Dựa vào tính chấtnày để xác định hàm lượng amiloza của tinh bột bằng phương pháp trắc quang Phản ứng với Iôt xảy ra khi phân tử amiloza có dạng vòng hoặc xoắn ốc Cácdextrim có Ýt hơn 6 gốc glucoza không cho phản ứng màu với Iod vì không tạođược một vòng xoắn ốc hoàn chỉnh Amiloza với hình thể xoắn ốc hấp thụ được26%khối lượng Iod tương ứng với một vòng xoắn ốc một phân tử Iod Phản ứngxảy ra dễ dàng khi amiloza khô với hơi Iot cũng như chúng tồn tại dưới dạng dungdịnh Trong phức amiloza-Iod trục của mạch polyiot trùng với trục của xoắn ốc.Phức amiloza-Iod bền được là do tương tác của các ngẫu cực cảm ứng vốn tạo ranhờ các đơn vị glucoza trong xoắn ốc và mạch polyiot Ngoài ra amiloza còn cókhả năng tạo phức với một số lớn các hợp chất hữu cơ có cực và có độ hoà tankhác trong nước cũng như với các hợp chất không cực kiểu Cacbuahydro loạiparafin và Cacbuahydro vòng như rượu izomilic, rượu butanol

I.1.2 Amilopectin

Amilopectin là phân tử có độ phân nhánh rất cao, được cấu tạo từ vài trămđoạn mạch Mỗi đoạn mạch này chứa 2025 măt xích glucoza liên kết -1,4-

glucozit Các đoạn mạch nối với nhau chủ yếu bằng liên kết -1,6-glucozit(hình1.2)

Hình 2

Amylopectin rất gần với glucogen hay tinh bột của động vật

Amilopectin không có khả năng liên kết với butanol hoặc các hợp chất hữu cơkhác Khi hoà tan trong nước sôi amilopectin tạo thành dung dịch có độ nhớt cao

và rất bền vững Vì có cấu trúc phân tử cồng kềnh lập thể nên các phân tửamilopectin không có xu hướng kết tinh và do đó chúng có khả năng giữ nướclớn Các dung dịch amilopectin không có hiện tượng thoái hoá Amilopectin chomàu xanh tím với I2 và khả năng hấp thụ này rất thấp

I.2 Tính chất của tinh bét

I.2.1 Tính lưỡng chiết

Cấu trúc tinh thể của tinh bột được tao thành nhờ liên kết hydro giữa các phân

tử amyloza và các mạch nhánh của amylopectin tạo nên các mixen Cấu trúc nàyảnh hưởng đến sự xuyên qua của ánh sáng vào hoạt tinh bột, làm lệch mặt phẳngcủa ánh sáng phân cực, nhờ thế mà ta có thể quan sát được tính lưỡng chiết củatinh bét hay còn gọi là hiện tượng chữ thập đen khi quan sát ở dưới kính hiển vi

Ở nhiệt độ thấp trong nước, hạt tinh bột không có sự thay đổi về hình dạng bênngoài đáng kể Khi tăng nhiệt độ lên, hạt tinh bét trong dịch huyền phù bắt đầutrương lên cùng với sự hút nước tăng dần Tính lưỡng chiết sẽ mất đi khi hạt tinhbột tiếp tục giãn nở, hút nước nhiều hơn, trở nên trong hơn, thể tích và độ nhớttăng lên và thu được hồ tinh bét.

Nhiệt độ hồ hoá không phải là nhiệt độ xác định mà là một khoảng (bảng 1.1),thấp nhất là nhiệt độ mà ở đó phân tử tinh bột đầu tiên mất lưỡng tính chiết và caonhất là nhiệt độ mà ở đó chỉ còn 10% tinh bột giữ được tính lưỡng chiết

Bảng 1.1Khoảng nhiệt độ hồ hoá của một sốloại tinh bét

I.2.3Khả năng tạo gel

Khi các hạt tinh bột trương nở, một số phân tử amyloza có phân tử lượngthấp chuyển ra ngoài và chúng có thể liên hợp với nhau tạo thành các chùm dàyđặc Các chùm này sẽ kết tủa khi nồng độ thấp hoặc tạo thành gel khi ở nồng độcao Lượng amyloza trong tinh bột càng cao thì khả năng tạo gel càng lớn

I.2.4 Khả năng bị phân bởi enzin

Hầu hết các amylaza đều thuỷ phân tốt hồ tinh bột Sản phẩm thuỷ phân củatinh bột phụ thuộc vào bản chất của enzim amylaza và cơ chất Một số loạiamylaza có khẩ năng thuỷ phân được tinh bột sống

I.3 Sắn (Manihot utlissma pohl)

Sắn (Manihot) là cây lương thực ưa Êm và Èm, phát nguồn từ sông AmaronNam Mỹ Đến thế kỷ 16 mới trồng ở châu Á và Phi Cây sắn được trồng ở nhiềunơi trên nước ta, nhất là vùng trung du và miền núi Sắn dễ trồng, Ýt tốn công sức ,

Ýt bị côn trùng phá hoại, có thể sinh trưởng tốt ở nhiều loại đất, chịu được khô cằn.Chính vì vậy mà diện tích cũng như sản lượng sắn rất lớn Cây sắn có chiều caotrung bình 15m, bình thường cao 23 m, củ dài 15100cm, đường kính315cm Năng suất 560 tấn /1ha

Cấu tạo của củ sắn gồm bốn phần :

-Vỏ gỗ chiếm 0,53% khối lượng củ Cấu tạo chủ yếu từ xenluloza có màutrắng vàng đỏ, có tác dụng bảo vệ củ khỏi tác dụng của ngoại cảnh

-Vỏ cùi chiếm 8% đến 10% khối lượng củ Vỏ cùi mề gồm các tế bào thành dàyngoài xenlluloza còn chứa gỗ chiếm 58% tinh bét Trong vỏ cùi có chứa các sắc

tố, độc tố và enzin

-Thịt sắn là phần chủ yếu của củ, bao gồm các tế bào nhu mô thành mỏng Bênngoài có tế bào nhu mô là xelluloza, pentozan, bên trong là các hạt thịt sắn, nhiềunhất ở lớp vỏ ngoài và giảm giần vào trong

sắn cũng bao gồm hai cấu tử amiloza và amilopectin Hàm lượng hai cấu tử nàykhác với các tinh bột khác Hàm lượng amiloza của tinh bột sắn từ 1218% ,amylopectin7880% Nhiệt độ hồ hoá trong khoảng từ 580C680C nhiều tác giảcho rằng 51790C (Nguyễn Tố Tâm) 6180,50C (Nguyễn Đình Thưởng).

Tinh bột sắn nhìn bề ngoài có màu sáng trắng, gồm nhiều hạt nhỏ, khi hồ hoátrở lên trong và có màu sám Khi hồ hoá độ nhớt tăng rất nhanh, độ kết dính caohơn các loại tinh bột khác như khoai tây, khoai lang Ở nước ta tinh bét sắn lànguồn nguyên liệu dồi dào và rẻ tiền nhất vì vậy tinh bột sắn được dùng nhiềutrong nghành công nghiệp như: công nghiệp giấy, công nghiệp dệt, công nghiệpdược, công nghiệp thực phẩm

I.4 Khoai lang (Batats edulis chois)

Khoai lang là cây màu ưa Èm lên được trồng phổ bién ở các nước nhiệt ônđới Ở nước ta khoai lang chiếm vị chí quan trọng sau lúa và ngô, nó được trồng từđồng bằng đến trung du, nhất là ở đất cát và cát phù xa khoai lang được trồngnhiều sản lượng cao khó bảo quản được lâu, giá trị hàng hoá thấp nên chủ yếu làmthức ăn cho chăn nuôi Cấu tạo củ khoai lang gồm ba phần:

-Vá bao chiếm 1%trọng lượng củ

-Vỏ cùi chiếm từ 512% gồm những tế bào thành mỏng, chứa tinh bột nguyênsinh chất và dịch thể Trong dịch thể chứa chất tanin, sắc tố, enzin

-Thịt củ, gồm các tế bào nhu mô có chứa tinh bột, các hợp chất Nitơ và một sốnguyên tố vi lượng Tinh bét khoai lang chủ yếu tập trung ở phần thịt củ

II.1 Khái niệm chung

Tinh bột biến tiÕn là tinh bột được sản xuất từ tinh bột thường dưới tác dụngcủa các tác nhân gây biến tính như axit, kiềm nhiệt độ, enzim

Với mỗi một sản phẩm thực phẩm hoặc các sản phẩm khác đòi hỏi một dạngtinh bột hoặc dẫn xuất tinh bột Để có loại tinh bét phù hợp với yêu cầu sản xuất thìngười ta phải biến hình tinh bột Mục đích của biến hình tinh bột là cải biến tínhchất của sản phẩm, tăng giá trị cảm quan, tạo mặt hàng mới

Tinh bột biến tính về cảm quan không có gì khác biệt so với ban đầu Song vÒcấu tạo phân tử và các tính chất có các đặc điểm khác biệt so với tinh bét ban đầu: -Liên kết với iot yếu hơn

-Độ nhớt của paste tinh bột ở nhiệt độ cao giảm do cấu trúc vô địnhhình bị yếu khi phân cắt

-Độ trương nở của tinh bột biến tính Ýt hơn trong thời gian hồ hoá -Độ hoà tan trong nước nóng tăng

-Nhiệt độ hồ hoá cao hơn

-Trọng lượng phân tử thấp hơn

-Số lượng nhóm -OH trong phân tử lớn hơn

Trong nước nóng tính chất của tinh bột biến tính thay đổi rất rõ rệt so với tinhbột thường Các hạt tinh bột biến tính trương nở Ýt hơn trong thời gian tạo gel vàthể tính gel tạo thành cũng nhỏ hơn, cấu trúc đặc trưng tạo thành làm giảm độ nhớtcủa dịch hồ tinh bột Nhiệt độ tạo gel của tinh bột biến tính trong nước nóng cũngthấp hơn, tinh bột biến tính hoà tan nhiều trong nước nóng tại nhiệt độ thấp vàbằng nhiệt độ tạo gel Hồ tinh bét biÕn tính có độ nhớt giảm do tinh bột biến tínhchứa Ýt phần thể tích của pha gel, điều này dẫn tới độ hoà tan lớn và độ trương nởcủa hạt trong nước nóng càng giảm.

II.2 Các phưong pháp sản xuất tinh bột biến tính

Có khá nhiều phương pháp sản xuất tinh bột biến tính, tuỳ điều kiện và mụcđích mà người ta duy trì phương pháp này hay phương pháp khác Song haiphương pháp đựoc dùng phổ biến là : Biến tính tinh bột bằng axit và Biến tính tinhbột bằng enzim

II.2.1 Biến tính tinh bột bằng axit

Phương pháp sản xuất tinh bột bằng axit đã xuất hiện khá lâu trên thế giới.+Năm 1886 Linlner cho tinh bét khoai tây vào dung dịch HCl 7,5% và H2SO4 15%tại nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian, sau đó đem loại bỏ axit và sấy khô +Năm 1897 G.Bellmas cho tinh bột vào dung dịch có nồng độ 1 đến 3% và gianhiệt ở 50 đến 55,50C trong thời gan 12 đén 14 giê Sau đó loại bỏ axit và sấy khô.+Duyea đưa ra phương pháp huyền phù tinh bột có nồng đô 12 đến 15Bé vào dungdịch axit có nồng độ 0,5 đến 2% tại nhiệt độ 55 đến 600C trong 0,5 đến 4,5 giê

Ở Việt nam cũng đã nghiên cứu sản xuất tinh bột biến tính bằng phưong pháp axit+ Phạm Văn Tuyên nghiên cứu và đưa ra phương pháp sản xuất tinh bột hoà tan từtiunh bột sắn bằng axit HCl 6,5%, nhiệt độ 350C thời gian 120 phót

+Nguyễn Thị Minh Hạnh và cộng sự đã nghiên cứu và đưa ra phương pháp sảntinh bột từ tinh bột sắn bằng HCl 8% , nhiệt độ 300C thời gian 5 ngày

+Nguyễn Văn Hùng nghiên cứu và đưa ra chế độ công nghệ sản xuất tinh bột hoàtan và tinh bột sắn biến tính từ tinh bột bằng axit HCl 1,5%

-Tinh bột hoà tan:

Nhiệt độ xử lý 450C , Thời gian 270 phót

Nhiệt độ xử lý 500C , Thời gian 210 phót

Nhiệt độ xử lý 550C , Thời gian 120 phót

-Tinh bột sử dụng trong công ngiệp giấy , HCl 1,5% Nhiệt độ xử lý 450C , Thời gian 270 phót

Nhiệt độ xử lý 500C , Thời gian 40 phót

Nhiệt độ xử lý 550C , Thời gian 20 phót

II.2.2 Phương pháp biến tinh bột bằng enzim

Hiện nay sự phát triển của công nghệ sinh học nhất là công nghệ enzim nênviệc sử dụng enzim vào mục đích biến tính tinh bột được áp dụng ở nhiều nơi trênthế giới

Phương pháp này sử dụng tác nhân là enzim là -amilaza tác dụng lên cácmối liên kết -1,4glucozit của amilaza và amilopectin làm giảm độ nhớt một cáchnhanh chóng Sản phẩm tinh bột biến tính bằng enzim có độ nhớt thấp hơn nhiều

so với tinh bét ban đầu, có chất lượng cao và không cần rửa nước nhiều như ởphương pháp thuỷ phân bằng axit và điều kiện làm việc của thiết bị mềm dẻo hơn Tại Viện công nghệ thực phẩm đã nghiên cứu và đưa ra sơ đồ quy trình sảnxuất tinh bột biến tính bằng phương pháp enzim Sử dụng enzim -amilaza 0,6%thời gian thuỷ phân 10, ở nhiệt độ 95 đến 1000C Sản phẩm thu được là tinh bột hoàtan dùng cho dược phẩm

II.3 Ứng dụng của tinh bột biến tính

Tinh bột biến tính được sử dụng rất nhiều trong các ngành công nghiệp nhưthực phẩm , dệt , giấy , giặt là và trong y dược

Trong công nghiệp thực phÈm, tinh bột biến tính được sử dụng như các chấtphụ gia trong sản xuất các sản phẩm thực phẩm cho trẻ em, thực phẩm chức năng,dùng để chế biến các loại thức ăn hàng ngày như thịt, đồ ăn tráng miệng, nước sốt ,tạo huyền phù cho các đồ uống Dùng làm giấy kẹo, sản xuất kẹo gum Ví dụ trongchế biến thịt dùng để liên kết nước Ðp, trong sôda cam nó làm ổn định nhũtương.Tinh bột biến tính làm tăng độ dẻo dai của kạo cao su, làm giảm độ hồiđường trong kẹo Tinh bột biến tính (dạng maltodextrin) còn có thể sử dông thaythế cho các chất béo trong các sản phẩm như bơ , mỡ gâỳ

Trong công nghiệp dệt thì tinh bột biến tính được dùng kéo tăng độ dài, dai sợidọc của vải dệt và làm mịn mặt vải

Trong công nghiệp giặt là sử dụng tinh bột biến tính nhàm tăng khả năng thẩmthấu qua vải và dàn đều tinh bột lên mặt vảI, khi là vải sẽ đẹp hơn

Trong công nghiệp giấy sử dụng tinh bột biến tính nhàm tăng khả năng độ bềncủa giấy, khả năng in mực lên giấy dễ dàng

Trong y dược tinh bột biến tính làm tá dược và thuốc dập viên, chúng đượctrọn vào các hoạt chất của các loại thuốc viên dạng nén

Như vậy tinh bột biến tính có phạm vi sử dụng rất rộng lớn, nếu đáp ứng đượccác yêu cầu về kỹ thuật thì việc sản xuất tại Việt nam tinh bột biến tÝnh sẽ manglại hiệu quả kinh tế và nhiều thuận lợi về mặt xã hội

III Các enzim thuỷ phân tinh bét

Các enzim thuỷ phân tinh bột đã được sử dụng từ rất lâu mặc dù lúc đó người

ta chưa có khái niệm gì về chúng Mốc đánh dấu sự khởi đầu của các nghiên cứu

về enzim là phát minh của nhà bác học người Nga Kieckhôp vào năm 1814 khi sửdụng dịch chiết từ bột đại mạch nảy mầm để chuyển hoá dịch hồ tinh bột thànhđường

Các enzim thuỷ phân tinh bột được xếp vào nhóm 3.2 theo Khoá phân loạienzim quèc tế; đây là nhóm các enzim thuỷ phân mối liên kết glucozit

Ngày nay nhờ công nghệ gen phát triển, Khoá phân loại enzim được hoànchỉnh hơn Chỉ riêng đối với các enzim thuỷ phân liên kết glucozit, năm 1991 trongngân hàng gen thế giới mới có hơn 300 trình tự gen được xác dịnh và xắp xếpthành 35 họ (family) thì đến năm1996 số trình tự gen được xác định đã là hơn 950

và được xếp thành 57 họ Enzim thuỷ phân tinh bột có các loại chủ yếu sau:

II.1 Alpha-amylaza (EC.3.2.1.1)

Alpha-amylaza ( -1,4-D-glucan-glucanohydrolaza ) hay còn gọi là amilaza là enzim quan trọng nhất trong nhóm enzim thuỷ phân tinh bét Hai trong

endo-sè ba giai đoạn của quá trình đường hoá tinh bột là làm loãng tinh bột (dịch hoá) vàdextrim hoá phụ thuộc vào -amylaza Alpha-amylaza thuỷ phân các liên kết -1,4-glucozit trên nhiều mạch và tại nhiều vị chí của cùng một mạch, giải phóng rachủ yếu là dextrim, và một lượng nhỏ glucoza và maltoza do thuỷ phân cục bộ

II.1.1.Các tính chất chung

Mặc dù được thu nhận từ các nguồn khác nhau nhưng -amylaza có rất nhiềuđiểm chung

II.1.1.1 Độ hoà tan

Enzim -amylaza có bản chất protein đơn cấu tử được tạo từ một chuỗipolypeptit Hầu hết -amylaza điều tan tốt trong nước Trong dung dịch nướcprotein-enzim dược đóng gói ở dạng hình cầu, đường kính dài không vượt quáđường kính ngắn Ở Các nồng độ muối cao > 20% protein- enzim bị kết tủa Hiệntượng kết tủa cũng xảy ra trong các dung môi hữu cơ như etanol, axeton,izopropanol Nồng độ muối và dung môi hữu cơ làm kết tủa enzim phụ thuộc vàokích thước, cấu tạo, phân tử của protein và điểm đẳng điện của nó

II.1.1.2 Cơ chế tác dụng của -amylaza

Tuỳ nguồn gốc thu nhận khác nhau nhưng phần lớn các enzim -amylazađiều có chung một cơ chế thuỷ phân Enzim -amylaza thuỷ phân liên kết -1,4-D- glucozit nội mạch ở vị trí ngẫu nhiên Cơ chế này được mô tả ở hình 1().

Sản phẩm tạo thành của quá trình thuỷ phân bao gồm glucoza, maltoza, vàdextrim Giai đoạn đầu của quá trình thuỷ phân diễn ra rất nhanh, sản phẩm thuđược chủ yếu là dextrim mạch dài ( lớn hơn 15 đơn vị glucoza) cho nên được gọi

là giai đoạn dịch hoá Thời gian thuỷ phân kéo dài, tinh bột sẽ bị thuỷ phân sâu sắchơn Vận tốc phản ứng ở giai đoạn này chậm hơn rất nhiều so với giai đoạn đầu.Sản phẩm chủ yếu của phản ứng thuỷ phân thu được là các dextrim phân tử lựợngthấp (613 đơn vị glucoza) Đối với amylopectin sản phẩm thuỷ phân thu đượccòn có một số Ýt dextrim với mối liên kết -1,6-glucozit tại điểm phân nhánh

Cơ chế thuỷ phân dựa trên nguyên lý tác động liên kết định hướng của cácnhóm chức nhận proton và điện tử của enzim với cơ chất, làm suy yếu mối liên kếtcần thuỷ phân do kết quả của việc tạo nên phức enzim cơ chất Liên kết này lại mộtlần nữa bị yếu đi dưới tác dụng của một trong các axit amin tính axit đong vai trò

là chất cho proton tới nguyên tử oxy O Khi liên kết glucozit bị đứt sẽ tạo nên mộtion oxycacboni Ion này được ổn định điện bởi một điện tích âm của một axit aminkhác trong trung tâm xúc tác Cuối cùng ion oxycacboni kÕt hợp với một phân tửnước và hai oligosacarit được tạo thành, tách ra khái trung tâm hoạt động củaenzim Cơ chế này được Jerebchov giải thích theo sơ đồ ()

Các axit amin tham gia vào tâm xúc tác của -amylaza được xác định gồm 2axit Aspartic và Glutamic Điều đó chứng minh bằng phương pháp đột biến địnhhướng

II.1.2 Các tính chất riêng của -amylaza

Alpha- amylaza thu nhận từ những nguồn khác nhau, ngoài những tính chấtchung như đã trình bày ở trên, còn có nhiều tính chất riêng Nhũng tính chất này

tạo nên sự đa dạng của -amylaza Chính sự đa dạng này làm cho các nghiên cứu

về -amylaza ngày càng phong phú và thu hút được nhiều sự quan tâm

II.1.2.1.Trọng lượng phân tử

Trọng lượng phân tử (MW) của -amylaza phụ thuộc vào thành phần axitamin của mạch polypectit cấu tạo nên nó Protein enzim do gen -amylaza quyếtđịnh Sự đa dạng sinh học rất lớn của gen -amylaza dẫn đến sự đa dạng về MWprotein enzim

Trọng lượng phân tử của -amylaza từ nấm mốc, nấm men và cả động vậtthực vật có sự khác biệt nhau không nhiều Thường gặp nhất ở nhóm này là các -amylaza có MW 50.00060.000 Da

II.1.2.2 Ảnh hưởng của pH lên hoạt động của -amylaza

Mỗi -amylaza phụ thuộc vào nguồn gốc thu nhận có pH hoạt động đặctrưng riêng Phần lớn các -amylaza cũng như các enzim khác của cơ thể sốngsinh ra nó điều có pHopt phù hợp với pH của môi trường sống của vi sinh vật Chính

vì vậy đối với thực vật, động vật, các -amylaza thường gặp có pHopt ở vùng axithơi yếu hoặc trung tính

Vi sinh vật là cơ thể sống dễ thích nghi với các thay đổi của điều kiện môitrường sống hơn so với các sinh vật bậc cao Vì vậy ở vi sinh vật pHopt cũng có sựkhác biệt khá lớn Vùng pH hoạt động của -amylaza có ngồn gốc từ vi sinh vậttương đối rộng Thường gặp nhất là các -amylaza có vùng pHopt =5,07,0 Một

số loại -amylaza của vi sinh vật có pHopt khá cao 7,510 Các enzim này thườnggặp ở các chủng ưa kiềm Chúng được phân thành nhóm enzim kiềm tính ( alkaline

-amylaza )

Ngược lại có những -amylaza lại có hoạt động tối ưu và bền ở vùng pH thấp(<4,5) Những enzim này được phân thành nhóm enzim bền axit (acid stable -amylaza) Một số loại -amylaza có vùng pH hoạt động khá rộng Tuy tối ưu ở pH

tính Đặc biệt hơn ở một số chủng người ta tách được -amylaza có hai hoặc bapHopt nằm ở vùng pH khác nhau.

II.1.2.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt động của -amylaza

Nhiệt độ và pH là hai yếu tố ảnh hưởng lớn nhất đến hoạt động của amylaza Bất kỳ một nghiên cứu nào về -amylaza cũng đIều đề cập đến các tínhchất này Enzim -amylaza có nguồn gốc khác nhau có topt rất khác nhau

Phần lớn -amylaza của thực vật, động vật và một số loài vi sinh vật có nhiệt

độ tối ưu nằm trong khoảng 40500C

Ở một số loài vi khuẩn ưa lạnh người ta tìm thấy -amylaza thích nghilạnh( cold- adaptable -amylase) Tuy nhiên các nghiên cứu về enzim này còn rấthạn chế

Được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất là nhãm enzim có topt cao Các enzimnày được gọi là enzim chịu nhiệt (thermostable -amylase)

Giới hạn phân biệt giữa -amylaza chịu nhiệt với các enzim khác chưa có tácgiả nào xác định cụ thể Tuy nhiên hầu hết các công trình có liên quan đến -amylaza chịu nhiệt cho thấy topt của enzim lớn hơn 650C Phần lớn các -amylazanày điều có nguồn gốc từ vi sinh vật

II.1.2.4 Các chất kìm hãm hoạt động của -amylaza

Các chất kìm hãm hoạt động của enzim có cơ chế tác động hoàn toàn khác với

cơ chế tác động của các chất bất hoạt enzim Các chất kìm hãm hoạt động enzimtác động theo cơ chế cạnh tranh và không cạnh tranh với cơ chất Khi được giải toảkhỏi chất kìm hãm, enzim lại hoạt động trở lại Nghiên cứu cơ chế tác dụng củachất kìm hãm là một trong những biện pháp hữu hiệu để nghiên cứu cơ chế hoạtđộng của enzim, xác định vị trí của tâm gắn cơ chất, tâm hoạt động trên cấu trúcbậc ba của -amylaza Các chất kìm hãm của -amylaza được phân làm hai loại: -Chất kìm hãm có cấu trúc tương tự cơ chất

-Chất kìm hãm có bản chất protein

Nhiều chất kìm hãm có cấu trúc protein được tìm thấy chỉ ở thực vật và ở visinh vật Các chất này có tính chất đặc biệt là kìm hãm hoạt động -amylaza của

động vật và một số chủng Streptomyces, nhưng lại không kìm hãm hoạt động

-amylaza của thực vật và hầu hết các loại vinh vật khác Tất cả các chất kìm hãmnày điều có vùng đặc trưng có chứa trình tự Trp-Arg-Tyr

II.1.2.5 Ảnh hưởng của Ca+2 lên hoạt tính và độ bền nhiệt của -amylaza

Phần lớn -amylaza có hoạt tính và độ bền nhiệt phụ thuộc vào Ca+2, nhưng ởmức độ khác nhau Ở một sè -amylaza cả hoạt tính và độ bền nhiệt phụ thuộc vào

Ca+2 Ở một sè -amylaza khác, Ca+2 chỉ làm tăng độ bền nhiệt mà không ảnhhưởng tới hoạt tính của -amylaza Ở trường hợp đầu, Ca+2vừa đóng vai trò ổnđịnh cấu trúc vừa đóng vai trò là chất hoạt hoá dị lập thể Còn ở dạng thứ hai,

Ca+2chỉ tham gia ổ định cấu trúc bậc ba của enzim

Theo Heinen và Lauwes, Ca+2chỉ có tác dụng làm tăng độ bền nhiệt và hoạttính của -amylaza ở nhiệt độ cao Ở nhiệt độ thấp Ca+2 hoàn toàn có thể được thaythế bằng các ion kim loại hoá trị 2 thuộc nhóm kiềm thổ, trong khi đó ở nhiệt độcao Ca+2 không thể thay thế được bằng các ion kim loại khác Ở một sè Ýt -amylaza của cổ khuẩn, Ca+2 không ảnh hưởng tới hoạt tính cũng như độ bền nhiệt

của enzim Alpha-amylaza của chủng B licheniformis MY10bị ức chế và giảm độ

Kết quả ở bảng 2 cho thấy Ca2+, Na+ và Glyxerin điều ảnh hưởng tới hoạt tính

-amylaza của cả hai chủng gốc và chủng tái tổ hợp Chủng 3BT2 được phân lập

từ môI trường nước biển có nồng độ muối cao Có thể đó là nguyên nhân của khảnăng chịu Na+ của -amylaza Kết quả trên cho thấy glyxerin và NaCl điều làmgiảm hoạt độ của nước nên có thể sử dụng làm chất bảo quản enzim cho chủng3BT2 EDTA ngược lại là chất khử Ca2+ nên làm giảm hoạt tính -amylaza Cu2+làm giảm hoạt tính -amylaza mạnh nhất ( gần 80% ) ở nồng độ 5 mM

III.2 Beta-amylaza (EC.3.2.1.2)

Niếu -amylaza thuỷ phân mọi liên kết -1,4-glucozit nội mạch giải phóng

ra chủ yếu dextrim thì -amylaza là enzim thuỷ phân mối liên kết -1,4-glucozit ởngoại mạch giải phóng ra chủ yếu là maltoza Beta-amylaza (-1,4-glucan-maltohydrolaza) hay còn gọi là exoamylaza chủ yếu có nguồn gốc thực vật ( từmầm đại mạch,lúa mì, đỗ xanh, khoai lang ) Ở vi sinh vật, enzim này rất Ýt gặp.Cho tới nay người ta mới chỉ tìm thấy -amylaza ở một vài vi khuẩn thuộc các

giống Bacillus, Pseudomonas, Clostridium và xạ khuẩn thuộc giống Streptomyces Tham gia vào cơ chế tác dụng của -amylaza thường có nhóm

cacboxyl thể hiện tính ưa proton và một số nhóm imidazol thể hiện tính ưaelectron ( Hình 3)

Các -amylaza có pH tác dụng tối ưu trong khoảng 56 và nhiệt độ tối ưukhoảng 500C và kém bền nhiệt Các -amylaza của vi khuẩn thường bền nhiệt hơn

so với -amylaza của thực vật

Enzim này thuỷ phân các liên kết -1,4-glucozit của amylopectin và amyloza

từ đầu không khử của mạch và giải phóng ra maltoza có dạng  và ngừng lại ở vịtrí -1,4-glucozit sát với vị trí -1,6-glucozit của amylopectin Các enzim thuỷphân tinh bột ngoại mạch nhưng không thuộc nhóm -amylaza là các amylaza tạo

ra các oligosacarit đặc thù như: amylaza từ Streptomyces griseus giải phóng ra maltotrioza, amyloza từ Pseudomonas stutzeri giải phóng ra maltoteraoza

cơ chất Cơ chế quá trình thuỷ phân tinh bột bằng glucoamylaza được trình bày ởhình

III.4 Một số chế phÈm Alpha-amylaza có trên thị trường

III.4.1 Termamyl

+MIÊU TẢ

Termamyl là chế phẩm enzim dạng nước có chứa Alpha-amylase, chịu được

nhiệt độ cao và được sản xuất bởi chủng Bacillus licheniformis Enzim này là một

endo-amylase Nó thuỷ phân mối nối 1,4 alpha glucosidic của amyloza vàamylopectin Vì thế tinh bét nhanh chóng bị thuỷ phân thành dextrin vàoligosaccharide tan trong nước Tên sản phẩm : Termanyl 120L

Được dùng cho thực phẩm tuân thủ những quy định và được đề nghị bởi FAO/WHO, JECFA và FCC Được dùng với giới hạn tối đa 5.104/g và 102 cho nấm mốc.+Xác định hoạt tính

Một đơn vị Kilo Novo Alpha Amylaza là lượng enzim cần thiết để thuỷ phân5,26 g tinh bét trong 1h theo phương pháp tiêu chuẩn của hãng Novo Để xác địnhalpha amylaza những điều kiện sau được áp dụng:

Chất nền : Tinh bột hoà tan

Trong kỹ nghệ nấu cồn, Termamyl được dùng để phân tán tinh bét khi nghiền

và chưng cất Và ở giai đoạn này, cũng lợi dụng được độ ổn định nhiệt của enzim.Hơn nữa rất có thể thực hiện việc chưng cất không cần điều chỉnh pH và thêm Camặc dù các điều kiện có hơi khác với điều kiện tối ưu Điều này do phạm vi pHtương đối lớn và việc đòi hỏi Canxi của enzim tươmg đối thấp Nó làm cho quytrình sản xuất được đơn giản và mức độ rủi ro của cặn bẩn Canxi được giảm thiểutrong cột chưng cất

Trong kỹ nghệ tinh bét, Termamyl được dùng cho việc dịch hoá liên tục tinhbét trong nồi hơi hoặc trong những thiết bị tương tự hoạt động ở nhiệt độ từ 1050-

1100C và vì vậy lợi dụng được tính ổn định nhiệt độ cực cao của enzim

Trong kỹ nghệ nấu bia, Termamyl được dùng để phụ giúp cho việc dịch hoádược dễ dàng Do đó ổn định nhiệt cao của enzim thì quá trình nấu có thể được đơngiản hoá Nhờ thế việc gia tăng tỷ lệ các phụ gia cũng có thể thực hiện được

Trong kỹ nghệ đường, Termamyl được dùng để phá vỡ lượng tinh bột hiệndiện trong nước mía Vì vậy hàm lượng tinh bét trong đường thô giảm và việc lọc

dễ dàng thực hiện hơn

Trong kỹ nghệ dệt, Termamyl được sử dụng ở nhiệt độ cao, tốc độ cao để rũ

hồ trước khi nhuộm Loại enzim kỹ thuật được áp dụng cho công nghệ này

+Độ hoà tan

Các phần tạo ra hoạt tính của enzim Termamyl thì dễ dàng tan trong nước ở mọinồng độ trong điều kiện thường dùng Độ vẩn đục có thể xảy ra trong chế phẩmenzim và không có ảnh hưởng tới hoạt tính chung hoặc tính năng của sản phẩm.+Biện pháp đề phòng khi sử dụng

Sản phẩm enzim này không cháy và hoàn toàn tan trong nước Nên tránh trongtrường hợp không cần thiết phải tiếp xúc và hít phải Trường hợp nỡ nuốt hay tiếpxúc với da, mặt phải rửa ngay với nhiều nước

+Các thông số về hoạt tính

Hoạt tính của enzim cũng có thể được biểu thị bằng tốc độ gia tăng ban đầu của

DE (đương lượng dextrose) với nồng độ enzim cho sẵn Tốc độ gia tăng trung bìnhđương lượng DE trên một thời gian cho sẵn cũng sẽ tuỳ thuộc vào độ ổn định.+ Độ ổn định của termamyl

- Ảnh hưởng của Canxi

Trong bột nhão, tính ổn định của termamyl được thoả mãn với sự hiện diện từ 50 –

70 ppm ion Ca 2+ Các số liệu cho thấy độ ổn định của Termamyl trong bột nhão ởnồng độ 30% trong cùng đIÒu kiện nhiệt độ và pH ở các nồng độ ion Ca2+- khácnhau (ppm) Các số liệu được so sách có cùng trị giá đương lượng DE và trongphạm vi từ 0  12

Bảng 1: Độ ổn định của Termamyl (thời gian, phút cần thiết để mất 50% hoạt tính)

930C 980C 1030C 1070C

Ion Ca2+ 70 ppm

PH 6.5 1500 400 100 40

PH 6.0 800 200 75 20

PH 5.5 300 200 25 10 -Ion Ca 2+ 20ppm

PH 6.5 450 125 40 10

PH 6.0 250 75 20 5

PH 5.5 100 25 5 2 -Ion Ca+ 5ppm

PH 6.5 150 40 10 4

PH 6.0 75 20 5 2

Sự mất hoạt tính của Termamyl

Trong một số mục đích nhất định (kỹ nghệ giấy và một số kỹ nghệ chế biếnthực phẩm), việc làm mất hoạt tính của lượng Termamyl còn sót lại trong dextrinhay sirop rất là quan trọng

Sử lý nhiệt ở pH thấp là cách tốt nhát Bảng 2 cho thấy các số liệu của độ ổn địnhTermamyl ở pH thấp có thể cung cấp một số chỉ dẫn cho việc sử lý này

Bảo quản

Khi Termamy được chứa ở nhiệt độ 250C, hoạt tính đã cho biết được duy trì tốithiểu là 3 tháng Khi chứa ở 50C, hoạt tính đã cho biết duy trì tối thiểu là 1 năm.Dịch vụ kỹ thuật

Hãng Novo có các phòng thí nghiệm ở Mỹ, Nhật, Đông Nam á, Thuỵ Sĩ, BaTây và Đan Mạch, và rất hân hạnh được giúp khách hàng thêm nhièu thông tin vềcác đặc tính và cách sử dụng Termamyl một cách tối ưu

III.4.2 Fungamyl

Fungamyl là một loại alpha-amylase từ nám mốc thu được từ một chủng loại

khủn chon lọc có tên là Aspergillus oryzae Tên theo danh pháp là

1,4-alpha-D-glucan-hydrase (EC3.2.1.1)

Enzim này thuỷ giảI cầu nối 1,4-alpha glucosidic của amylose và amylopectin.Phản ứng kéo dàI đưa tới kết quả là sự thành lập một số lượng lớn đường matôQuy cách sản phẩm- Hình dạng bên ngoài

Sản phẩm dạng lỏng (L) là một dung dịch có màu nâu với tỉ trọng xấp xỉ là 1,25 g/ml

Bét Fungamyl 1600S màu hổ phách lót được tiêu chuẩn hoá với NaCl

Bét Fungamyl 180 S được tiêu chuẩn hoá với bột mì

Loại vi năng MG 35.000 là dạng dễ chảy tuột, không bụi với kích thước cầu từtrung bình xấp xỉ 300 microns

Chất nền tinh bột hoà tan

Thời gian phản ứng 7-20 phót

Nhiệt độ 370c

PH 4.7