luận văn công nghệ sinh học Thực nghiệm và phương pháp nghiên cứu Artemisinin

Artemisinin, mét sesquiterpen có trong cây Artemisia annua hay còn gọi là thanh hao hoa vàng có hoạt tính kháng sốt rét rất mạnh, hợp chất này đã được các nhà nghiên cứu Trung Quốc phân

LỜI MỞ ĐẦU

Việc nghiên cứu, sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc để chữa trị các bệnh của con người đang là hướng thu hút sự tập trung của các nhà khoa học, đặc biệt là các nhà hoá học hữu cơ và các nhà hoá học các hợp chất thiên nhiên Nhờ những nghiên cứu này mà một loạt các thuốc có nguồn gốc

từ thảo dược đã và đang được sử dụng rộng rãi trong y dược Điểm thuận lợi của các hợp chất này là Ýt độc, dễ hoà hợp với người và nguồn cung cấp chúng thường rất phong phú với việc gây trồng có thể thực hiện được dễ dàng

Artemisinin, mét sesquiterpen có trong cây Artemisia annua hay còn

gọi là thanh hao hoa vàng có hoạt tính kháng sốt rét rất mạnh, hợp chất này đã được các nhà nghiên cứu Trung Quốc phân lập từ những năm 70 Gần đây, các nhà khoa học Mỹ còn nhận thấy, hợp chất này có khả năng tiêu diệt các tế bào ung thư vú và bạch cầu Do vậy, việc phân lập, xác định cấu trúc và nghiên cứu hoạt tính chống sốt rét và chống ung thư của hợp chất này góp phần làm sáng tỏ phần động của hoá học các hợp chất thiên nhiên đó là môi tương quan giữa hoạt tính sinh học và cấu trúc của hợp chất hữu cơ

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 GIỚI THIỆU VỀ TERPEN.

1.1.1 Định nghĩa terpen và sự phân bố trong tự nhiên.

Khái niệm terpen được dùng để chỉ một lớp hợp chất thiên nhiên mà cấu trúc có thể phân chia ra thành các đơn vị isopren [1] Theo qui tắc isopren

mà người ta phân biệt ra các monoterpen C10, sesquiterpen C15, diterpen

C20,sesterterpen C25, triterpen C30, tetraterpen C40, và polyterpen Các terpen này có thể có cấu tạo mạch hở, hoặc một, hai, ba, bốn, năm vòng; các vòng có thể có từ ba đến mười bốn mắt vòng

Thông thường ở các mono-, sesqui-, di- và sesterterpen, các đơn vị isopren nối với nhau theo cách đầu nối với đuôi Các triterpen và nhiều tetraterpen (các carotenoid) thì hợp bởi hai mảnh C15 hoặc C20 nối với nhau ở giữa theo cách đầu nối với đầu Tính đồng nhất về mặt cấu trúc đó được thể hiện trong các thí dụ sau:

Lanosterol (Triterpen)

Hình 1: Sự đồng nhất về cấu trúc của các terpen.

Bên cạnh thuật ngữ “terpen” ta còn dùng khái niệm “terpenoid” [2] để bao hàm rộng rãi cả các sản phẩm thoái biến tự nhiên, thí dụ các ionon, và các dẫn xuất tự nhiên cũng như tổng hợp của các terpen, thí dụ như các terpen-ancol, -andehit, -xeton, -axit, -este, -epoxit, v.v Tuy nhiên trong khi sử dụng thường không có sự phân ranh giới thật rõ rệt giữa các khái niệm “terpen” và

“terpenoid” như vừa nêu Thuật ngữ “terpen” nhiều khi được dùng để bao hàm cả các terpen-hidrocacbon lẫn các dẫn xuất của chúng

Các terpen phân bố rộng rãi trong tự nhiên, xuất hiện trong tất cả các loài sinh vật nhất là trong giới thực vật bậc cao Mỗi loài cây riêng biệt thường có chứa những thành phần terpen đặc trưng vì vậy việc xác định thành phần các terpen trong cây có thể góp phần vào phân loại thực vật (Chemotaxonomie) Các mono- và sesquiterpen xuất hiện chủ yếu trong các tinh dầu; sesqui-, di- và triterpen có trong các dầu nhựa và nhựa; tetraterpen trong các chất màu thực vật (các carotenoid) và các polyterpen có trong nhựa

mủ cây

1.1.2 Cấu trúc của terpen

Các terpen được cấu tạo từ các đơn phân là

1.1.2.1 Monoterpen

Phần lớn các monoterpen xuất hiện trong thiên nhiên, nhất là các hợp chất chứa oxi, có mùi dễ chịu, và vì vậy ngoài việc lấy ra từ nguồn thiên nhiên chúng còn được tổng hợp với lượng lớn để dùng trong công nghiệp hương liệu [3]

Trong số các monoterpen không vòng gồm ocimen, myrcen và alloocimen thì myrcen tồn tại dưới hai đồng phân, còn mỗi hydrocacbon kia thì đều tồn tại dưới bốn đồng phân

α -myrcen β -myrcen cis- α -ocimen trans- α -ocimen cis- β -ocimen trans- β -ocimen

Ngoài ra các monoterpen còn chứa các nhóm chức ancol, aldehit, với các bộ khung khác nhau

Geraniol Neral Citronellal

Trong khoảng ba chục năm trở lại đây người ta tìm thấy trong các cây

thuộc họ Compositae một sè monoterpen có khung cacbon được cấu tạo

không tuân theo qui tắc isopren [4] Đó là các monoterpen mạch không vòng thuộc các kiểu khung artemisyl, santolinyl, lavandulyl cùng với một vài monoterpen đơn vòng thuộc khung chrysanthemyl Về mặt nguồn gốc sinh học, người ta cho rằng các monoterpen không vòng có cấu tạo bất bình

thường đó được hình thành từ một tiền chất, tiền chất này được giả định là chrysanthemyl pyrophosphat thông qua sự chuyển vị của ion cyclopropylcarbinyl.

Các kiểu khung:

artemisyl santolinyl lavandulyl chrysanthemyl

Ngoài ra, đáng chú ý là các monoterpen một vòng [3] Phần lớn các monoterpen một vòng có khung 1-metyl-4-isopropyl-xiclohexan, còn được

gọi là khung “p-menthan” Về phương diện cấu dạng ta có thể coi các

monoterpen một vòng này là các dẫn xuất thế hai lần của xiclohexan, ở đó nhóm isopropyl, do chiếm khoảng không gian lớn hơn nhóm metyl, nên

chiếm vị trí equatorial Các nguyên tử cacbon của khung p-menthan được

đánh số theo qui tắc chung của danh pháp hoá học

1 2 3

Nhóm aldehit: ví dô perillaldehit, phellandral

Nhóm xeton: ví dô menthon, pulegon, piperiton, carvon

Nhóm oxit: ví dô 1,8-cineole, ascaridole

Menthon Pulegon 1,8-Cineole Ascaridole

Trong công nghiệp hương liệu, chất α-terpineol được sử dụng khá nhiều cùng với este của nó - chất terpinylaxetat.terpineol có trong một số tinh dầu như tinh dầu từ gỗ của một số loại thông

Ngoài ra, các monoterpen có thể chứa 2 vòng, các monoterpen 2 vòng tiêu biểu:

CH 3

8 7

6

5

4 3

1.1.2.2 Sesquiterpen

Các sesquiterpen thường xuất hiện trong các thực vật thượng đẳng, một

số Ýt cũng gặp trong giới thực vật hạ đẳng và trong giới động vật (như sâu bọ) Đa số các sesquiterpen là các hidrocacbon không no (còn có cả một số ankyl), còn lại là các alcohol, xeton,aldehit, axit cacboxylic Ngoài ra, chúng còn có thể có thêm vòng este từ ba đến bảy cạnh cũng như vòng furan Ta cũng cần kể đến các sesquiterpen được thế bởi clo hoặc brom và các hợp chất

nitơ có 15 nguyên tử C (các sesquiterpenancaloid) Từ một số các sesquiterpen đã hình thành một số hợp chất với 12 hoặc 14 nguyên tử C (các nor-sesquiterpen).

Gần đây người ta chó ý nhiều đến việc nghiên cứu các sesquiterpenlacton, là chất phổ biến xuÊt hiện trong các cây thuộc họ cóc

(Compositae), tuy nhiên cũng có nhiều trong họ cây khác Hợp chất đầu tiên

thuộc nhóm này được phân lập dưới dạng tinh thể là α-santonin (1930) Đến nay, ta đã biết đến hàng trăm sesquiterpenlacton, phân ra thành các germacranolid, guaianolid, pseudoguaianolid, Đa số các hợp chất này là các γ-lacton no hoặc không no α, β Bên cạnh đó cũng có một Ýt δ-lacton, và một vài β-lacton (như anisatin, neoanisatin) Ngoài khoảng trên hai chục dilacton,

ta cũng biết đến một trilacton là chất bilabolid

Theo Ruzicka cũng như Hendrickson thì về mặt phát sinh sinh vật học, chất tiền thân của hầu hết các sesquiterpen là chất 2-cis-6-trans-farnesylpyrophosphat hoặc các hợp chất 2-trans-6-trans tương ứng, hình thành

từ coenzyme A đi qua axit mevalonic, iso pentenylpyrophosphat và geranylpyrophosphat Đối với một số Ýt sesquiterpen, do các nguyên nhân về hoá lập thể mà chất tiền thân có lẽ là một cấu trúc 2-trans-6-cis-farnesyl hoặc nerolidyl Do tách đi nhóm pyrophosphat ra khái 2-cis-6-trans-farnesylpyrophosphat hoặc 2-trans-6-trans-farnesylpyrophosphat mà hình thành các cacbocation, việc biểu diễn các ion này dưới dạng các cation không kinh điển cho phép ta hình dung được sự đóng vòng để từ mỗi cation này hình thành được hai cation dạng vòng Từ các cation này thông qua các chuyển dịch hidrua 1,2 hoặc 1,3 ; các phản ứng đóng vòng tiết chế bởi các hiệu ứng điện tử và lập thể thực hiện với hai nối đôi còn lại (đóng vòng tuân theo hoặc không tuân theo qui tắc Maccopnhicop), các chuyển vị Wagner-Meerwein và các chuyển dịch 1,2 của các nhóm metyl mà sinh ra đa số các sesquiterpen.Ở đây, sự tạo thành các đồng phân đối quang và các đồng phân quang học không đối quang theo con đường phát sinh sinh học có một ý nghĩa quan

trọng ở đây cũng cần nói thêm rằng nhiều giả thuyết về sự phát sinh sinh học của các sesquiterpen còn cần được chứng minh trong cơ thể sống.

Dưới đây là một số khung sesquiterpen và một số sesquiterpen tiêu biểu

Nerolidol Zingiberen Bisabolen

Ngoài ra còn có rất nhiều sesquiterpen một vòng khác tiêu biểu là Zingiberen

và Bisabolan, xuất hiện khá đông đảo và phổ biến trong thiên nhiên

Iresin ε-bulgaren γ-amorphen α-muurolen

Ta cũng cần kể đến một nhóm riêng các hợp chất khung cadinan có quan hệ với nhóm trên theo kiểu đối quang, nhóm chất này xuất hiện chủ yếu trong tinh dầu Hương lau của miền Bắc Ên độ Đại diện cho nhóm chất này là (-)-γ2-cadinen và chất norsesquiterpenoid khusiton

H H

O H H

γ2-cadinen khusiton

Nhóm này có rất nhiều trong những tinh dầu có màu xanh hoặc tím hoặc tạo nên những màu như thế sau khi khử hidro với sulfur, selenium hoặc palladium.

Cấu trúc của α- và β-vetivon được xem như là các hydroazulenon

Dưới đây là một số chất tiêu biểu cho nhóm

7 2

6 4

Ngoài ra còn một số sesquiterpen có cấu trúc lớn và phức tạp như caryophyllen

và chống ung thư Việc nghiên cứu các sesquiterpen trong thực vật giúp chúng ta hiểu rõ mối tương quan giữa hoạt tính và cấu trúc cũng như sự định hướng nghiên cứu được rõ ràng hơn

1.2 HOẠT TÍNH CHỐNG SỐT RÉT CỦA CÁC HỢP CHẤT THIÊN NHIÊN

Các thử nghiệm in vitro [6] trở thành phương pháp có thể dùng được

trong những năm gần đây Xa hơn nữa, từ những năm 1947, 600 thực vật từ

126 loài đã được chiết và dịch chiết đã được thử nghiệm hoạt tính in vitro

chống lại bệnh sốt rét của loài chim Một số cây từ hơn 30 loại đã được tìm thấy có một số hoạt tính này, nhưng sự ngoại suy với hoạt tính kháng sốt rét đối với các kÝ sinh trùng sốt rét của người thì vẫn không chắc chắn Sự tiếp

tục nuôi cấy in vitro các ký sinh trùng sốt rét người Plasmodium falciparum

đã dẫn đến một kĩ thuật cho việc đánh giá định tính về hoạt tính kháng các kÝ sinh trùng này Sự tiếp tục phát triển của kĩ thuật này rất tin cậy dựa vào việc

đo khả năng ức chế sự hợp nhất của 3H-hypoxanthin vào trong trùng sốt rét

Kĩ thuật này được ứng dụng dễ đánh giá hoạt tính của các dịch thô (etanol)

của Artermisia annua và A.vulgaris (cây ngải cứu) Thử nghiệm in vitro này

tách bạch giữa hai loại dịch chiết với giá trị IC50 lần lượt là 3.9 µl/ml và 250

µl/ml Artermisia annua được sử dụng trong việc điều trị bệnh sốt rét truyền

thống của Trung Quốc và chất thể hiện hoạt tính là artemisinin (1) mà chất này

không có trong A.vulgaris.

Điều đáng chú ý rằng hoạt tính chống sốt rét in vitro không song song

với việc thể hiện độc tính chống lại các tế bào KB (human epidernoid carcinomax of the mouth) Bởi vậy một chất có hoạt tính gấp nhiều lần chất kia trong việc thử nghiệm chống sốt rét nhưng lại có thể độc gấp 10 lần đối với các tế bào KB

1.2.1 Các phương pháp thử hoạt tính sinh học được dùng cho sự phát hiện thuốc có khả năng chống sốt rét.

1.2.1.1 Sàng lọc in vitro

Thông thường hai dòng P.falciparum được dùng để nghiên cứu, một

dòng nhạy đối với chloroquin như 3D7 và một dòng chống lại chloroquin như Dd2 Các hồng cầu ngoại biên của máu người được sử dụng trong các nghiên

cứu sàng lọc in vitro Các kÝ sinh trùng được thêm vào hồng cầu và nuôi cấy

ở 37oC trong khí quyển bao gồm 2% O2, 5%CO2 và 93% N2 [7] Ảnh hưởng của dịch chiết thực vật hoặc các phân đoạn dịch chiết lên sự phát triển của

P.falciparum được thử bằng việc thêm 50 µl dung dịch mẫu thử vào 50 µl hồng cầu đã được thêm kÝ sinh (5*108 tế bào/ml với một lượng trung bình

kÝ sinh trùng xấp xỉ 1%) Điều quan trọng là giữ nồng độ của dung môi đã sử dụng để hoà tan dịch chiết thực vật thấp (điển hình là dưới 5%) nếu như dung môi hữu cơ được sử dụng là DMSO (dimetylsulfoxit) Các kÝ sinh trùng được phát triển rất tốt trong đĩa nuôi cấy đặc chủng Sau đó, sự nuôi cấy được

ủ Êm 24h; 0,8 µCi của 3H-hypoxanthin hoặc amino axit đã đánh dấu phóng xạ chẳng hạn như phenylalanin được thêm vào và việc nuôi cấy được tiến hành thêm 24h nữa Sau khi việc nuôi cấy kết thúc, một khối lượng chất trao đổi đã đánh dấu phóng xạ đã được mang trên các kÝ sinh trùng, ta tiến hành đếm chúng Một sự hấp thụ nhỏ hơn trong các kÝ sinh trùng đã ủ Êm với các mẫu thử được quan sát cùng với các mẫu so sánh để đưa ra một số đo về khả năng

ức chế sự phát triển của các kÝ sinh trùng [8] Phương pháp khác có thể dùng

để đánh giá khả năng ức chế sự phát triển của các kÝ sinh trùng là đo phổ hoạt tính dehidro hoá lactat của các kÝ sinh trùng Phép thử này sử dụng sự chuyển hoá các tetrazolium nitro xanh thành fomazan

Một sù thay thế khác cũng thường được sử dụng để xác định khả năng

ức chế sự phát triển của kÝ sinh trùng là việc đếm các kÝ sinh trùng bằng kính hiển vi Các đốm bẩn mỏng của nuôi cấy kÝ sinh trùng nhận được sau khi ủ Êm với các nồng độ dịch chất khác nhau hoặc các mẫu thử khác nhau được nhuộm màu với Giemsa và kÝ sinh trùng được xác định như là phần trăm của hồng cầu bị nhiễm

Để thử hoạt tính của các mẫu thử trên các giai đoạn khác nhau của hồng cầu, sự nuôi cấy xảy ra đồng thời đối với giai đoạn mới tạo vòng do phân giải sorbitol Các hồng cầu có kÝ sinh trùng được li tâm và viên rắn được tạo huyền phù lại trong dung dịch D-sorbitol 5% trong 5 phút Chúng được phân lập bằng việc li tâm và thêm các hồng cầu vào trong các môi trường nuôi cấy trong đó tối thiểu 90% các kÝ sinh trùng có cùng giai đoạn phát triển Sau đó có thể tiến hành thử các mẫu chống lại các giai đoạn hồng cầu khác nhau của các kÝ sinh trùng bằng cách thêm chúng vào quá trình nuôi cấy tại thời điểm thích hợp

Sự chọn lọc của các phép thử sốt rét

Điều đặc biệt quan trọng cần biết khi tiến hành thử nghiệm là phương

pháp in vitro chỉ thể hiện kết quả nếu một hợp chất đã cho ức chế sự phát

triển của kÝ sinh trùng và nó không cho biết hợp chất này có độc hay không nếu như hợp chất thử giết chết tất cả các tế bào bao gồm cả các tế bào chủ [9]

Để minh chứng cho vấn đề này một loạt các phép thử có hệ thống phải được khảo sát Điều thường xuyên gặp phải trong khi thử các hợp chất có khả năng chống sốt rét là các hợp chất này lại thể hiện khả năng nghèo nàn trong việc

ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư (các tế bào KB) Một hợp chất có

khả năng ngăn ngừa cao sự phát triển của các kÝ sinh trùng trong in vitro

nhưng lại không ức chế sự phát triển của các tế bào ung thư cũng nên được quan tâm cho các nghiên cứu tiếp theo Và sự phát triển một qui trình cho việc kích thích các bạch cầu vôi phytobraemagglutinin được xuất hiện

Một phép thử in vitro cho phép sàng lọc các hợp chất chống lại một

dạng tế bào thuộc hệ miễn dịch Điều thuận lợi của protocol này là nó sẽ thể hiện kết quả nếu hợp chất thử có khả năng ức chế hệ thống miễn dịch và hợp chất này sẽ không được phép làm thành thuốc để chữa trị các bệnh viêm nhiễm như là bệnh nhiễm kÝ sinh trùng

và giết chết các động vật bị nhiễm mà không được xử lý trong vòng từ 7-12 ngày Trong các thử nghiệm như vậy các loài chuột khác nhau cũng được dùng để nghiên cứu

* Phép thử 4 ngày với chuột nhắt

Là phép thử phổ biến nhất, các động vật được tiêm chủng bằng đường ven với 106 hồng cầu nhiễm kÝ sinh trùng đã được tạo huyền phù trong

102ml Mẫu thử có thể được điều trị bằng đường tiêm ven hay đường uống đối với chuột Sự điều trị đầu tiên thường được bắt đầu 3 giê sau khi nhiễm và việc điều trị có thể được tiến hành từ 3-5 ngày phụ thuộc vào tác dụng của mẫu thử và nửa thời gian sống (tồn tại) trong thực vật của các hợp chất hoạt động Các con chuột đối chứng (so sánh) cho uống nước muối bình thường Chloroquin hoặc các thuốc khác có thể được dùng làm chất so sánh chuẩn Ngày thứ tư kể từ khi nhiễm, các vết bẩn mỏng được lấy từ đuôi chuột dùng

để xác định hàm lượng kÝ sinh trùng Số chuột tử vong được xác định đến 28 ngày kể từ lần điều trị cuối cùng [10]

Để xác định hiệu lực của thuốc trong quá trình điều trị, máu từ chuột đã điều trị được rót ra 28 ngày sau khi điều trị và được tiêm bằng đường ven vào trong chuột mới Hàm lượng kÝ sinh trùng và sự sống sót của chúng trong động vật được xác định, việc không phát hiện thấy kÝ sinh trùng trong máu

14 ngày sau khi nhiễm chứng tỏ tác dụng chữa bệnh của hợp chất thử

* Mô hình chuột cống

Các con chuột cống đã được gây nhiễm với 107 hồng cầu đã nhiễm kÝ

sinh trùng với dòng kÝ sinh trùng P.berghei được sử dụng Mặt khác, các

thực nghiệm được tiến hành như đã mô tả ở phần trên đối với chuột nhắt

Điều không thuận lợi ở các mô hình chuột

Các chuyển hoá thuốc trong các động vật này khác với người và trong chúng có hoạt tính huyết thanh giải độc cao Sinh học của các loài kÝ sinh trùng được thử trong các mô hình này là khác với sinh học của loài kÝ sinh trùng ở người , ví dụ không có sự hình thành hypnozoid trong bất kì kÝ sinh trùng của chuột nào Độ mẫn cảm của kÝ sinh trùng của chuột khác với người Cuối cùng sự ảnh hưởng lẫn nhau giữa thuốc và hệ thống miễn dịch chủ trong hệ thống của chuột cũng khác với người

b Mô hình khỉ

Các động vật có tay như các loài khỉ Aotus Lemurinus và Saimiri spp nói chung thường được dùng để thử nghiệm hiệu lực chống sốt rét in vitro của

các thuốc có khả năng kháng kÝ sinh trùng sốt rét [11], các thử nghiệm cho

thấy chúng chống lại sự nhiễm kÝ sinh trùng P.falciparum Giá cả chi phí

cũng như khả năng sẵn có của các loài khỉ làm cho mô hình này chỉ sử dụng

có giới hạn đối với các loại thuốc tiềm Èn những khả năng chữa bệnh tiềm tàng trong mô hình murine

Động vật có tay không phải là người như loài Macaques cũng được dùng để thử nghiệm thuốc lại chống kÝ sinh trùng của người (P.vivax) Trong

mô hình này P.knowlesi và P.cynomolgi được dùng để gây nhiễm các động vật Các kÝ sinh trùng này rất gần với kÝ sinh trùng P.vivax của người Các

mô hình này thuận lợi ở chỗ, chúng được dùng để thử nghiệm các thuốc

chống lại các kÝ sinh trùng của người P.vivax Khi lượng kÝ sinh trùng đạt

tới 1%, các con khỉ đã gây nhiễm được điều trị với hợp chất thử có thể bằng đường tiêm ven hoặc đường uống Lượng kÝ sinh trùng được xác định hàng ngày bởi các đốm dày và bất kì khi nào nếu thấy cần thiết thì xác định bằng PCR để nhận dạng DNA của các kÝ sinh trùng Các hợp chất sẽ được thử tại các điểm có hàm lượng kÝ sinh trùng cao nếu như chúng thể hiện tác dụng tốt tại thời điểm hàm lượng kÝ sinh trùng 1%

1.3 GIỚI THIỆU VỀ CÂY ARTEMISIA ANNUA

Artemisia annua còn gọi là cây ngải hoa vàng, hoàng hoa hao, thanh

hao thuộc họ cúc Asteraceae [12] Đây là cây thảo, mọc hàng năm, thơm, cao đến 1m, thân có rãnh và gần như không có lông Lá có phiến xoan, 2-3 lần kép thành đoạn hẹp , nhọn, không lông Chuỳ cao ở ngọn mang chùm dài, hẹp, hoa đầu cao 1,8-2mm, lá bắc ngoài hẹp có lông xanh, lá bắc giữa và lá bắc trong xoan rộng, hoa hình ống cỡ 15 cái, hoa ngoài cái, hoa trong lưỡng tính Quả bé nhẵn, cao 0,5mm, không có mào lông Hoa xuất hiện từ 6-11, có

quả từ tháng 10-3 và thường lụi vào tháng năm Artemisia annua phân bố ở

Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Ên Độ, Việt Nam Ở nước ta, cây mọc

hoang dại ở ruộng, bờ ruộng, dọc theo các làng mạc vùng núi Lạng Sơn, Quảng Ninh Hiện nay, chóng ta đã gây trồng và tạo được giống tốt, cho năng suất cao.

Thành phần hoá học của Artemisia annua gồm artemisinin và tinh dầu, chủ yếu là artermisia keton, pinene, cineol và L-campho Từ lâu, Artemisia annua được dùng để chữa sốt, nóng, khát nước, phiền nhiệt ra mồ hôi, tối

nóng sáng mát, thận có chứng lao nhiệt, sốt rét cơn, bệnh vàng da và các bệnh ngoài da Từ lâu ngải hoa vàng cùng các chiết xuất của nó đã được dùng để chữa bệnh sốt rét, với thành phần có hoạt tính chống sốt rét mạnh là artemisinin Ngày nay, chóng ta đã chọn được giống cây này cho năng suất artemisinin cao (từ 3,5-5 kg/tấn) và có thể trồng được ở nhiều nơi trên đất nước

1.3.1 Artemisinin và hoạt tính kháng sốt rét.

Artemisinin là hoạt chất chính của cây ngải hoa vàng [13] Vào thập kỉ

70, các nhà khoa học Trung Quốc là những người đầu tiên đã chiết suất thành công artemisinin trong cây này để làm thuốc chống sốt rét, một căn bệnh cướp

đi hàng triệu sinh mạng mỗi năm, chủ yếu ở các nước nghèo Châu Á, Châu Phi

Thập kỉ 90, các nhà khoa học Việt Nam và công ty dược liệu Trung Ương I đã trồng hàng trăm hecta cây thanh hao hoa vàng, chiết suất hàng tấn artemisinin với hiệu suất cao và bán tổng hợp các loại thuốc chống sốt rét từ artemisinin như artesunat, artemether, arteeter Các nhà khoa khọc cũng đã sản xuất ra hàng triệu liều thuốc chống sốt rét cung cấp cho các nhu cầu trong nước và xuất khẩu, thu về hàng triệu dola Mỹ mỗi năm Đầu thế kỉ 21, cụm công trình thanh hao hoa vàng đã được nhà nước trao giải thưởng Hồ Chí Minh

Artemisinin và các chế phẩm từ nó là loại thuốc tương đối an toàn Ở liều điều trị không độc, an toàn với phụ nữ có thai và những người suy gan, suy thận LD = 5015 mg/kg thể trọng, điều này cho thấy artemisinin và các

dẫn xuất từ nó an toàn cho người sử dụng Gần đây các nhà khoa học Mỹ đã phát hiện ra khả năng chữa ung thư của artemisinin Đây có thể được coi là một trong những thành công có giá trị mang lại hy vọng lớn lao cho người

bệnh bởi tính sẵn có, dễ phân lập của artemisinin từ Artemisia annua Các

nghiên cứu thuộc trường đại học Washington đã thử nghiệm trên động vật về khả năng chữa trị ung thư vú và ung thu bạch cầu Kết quả thật bất ngờ, với ung thư vú, sau khi dùng artemisinin 8 giờ thì 75% tế bào ung thư bị tiêu diệt

mà không có bất kì di chứng nào đối với các tế bào bình thường Tương tự vậy, các thử nghiệm với bệnh bạch cầu cũng đã chỉ ra rằng, artemisinin chỉ tiêu diệt các tế bào bị bệnh

1.3.2 Cơ chế tác dụng của artemisinin

Đối với các kÝ sinh trùng (KST) sốt rét thể vô tính trong hồng cầu Đây là giai đoạn KST sốt rét huỷ diệt hồng cầu rất nhanh, gây phản ứng rét run ở người bệnh Khi có mặt artemisinin, cầu “peroxit nội” của phân tử artemisinin kết hợp với sắt, tạo ra gốc tự do Gốc tự do mới hình thành có tác dụng mạnh, huỷ diệt protit và lipit của KST sốt rét Điều đáng nói là gốc tự do này chỉ tác động đến protit, lipit của KST sốt rét mà không hề tác động đến protit và lipit của người

Về khả năng tiêu diệt tế bào ung thư của artemisinin, các tác giả cho rằng, tế bào ung thư có chứa hàm lượng sắt cao cả trên bề mặt và trong tế bào Như đã trình bày ở trên, cầu “peroxit nội” của artemisinin rất dễ phản ứng với sắt để tạo ra các gốc tự do phá huỷ protit và lipit của tế bào ung thư Trong điều tri ung thư vú, các nhà khoa học phát hiện thấy artemisinin kết hợp với một muối sắt (sắt sulfat hoặc sắt citrat) để tiêu diệt tế bào ung thư mà không độc với tế bào lành Chỉ cần uống hoặc tiêm dẫn xuất của artemisinin và phối hợp với một muối sắt sẽ tạo ra được hiệu lực điều trị các loại ung thư

Artemisinin là hoá trị liệu rẻ tiền, dễ kiếm, Ýt độc, dung nạp tốt, có tác dụng chống ung thư và di căn Hiện nay, điều trị ung thư vú thường được tiến hành bằng phẫu thuật rồi xạ trị, kết hợp với hoá trị liệu (phần lớn là các độc

dược bảng A gồm các loại C.M.F hay cyclophosphamid-methotrexate-5, flusro uracib tamoxifen) và các liệu pháp miễn dịch Ở nước ta, các loại thuốc này phải nhập ngoại rất đắt tiền Người bệnh nghèo không có đủ tiền để mua đành chờ chết Để thực hiện chính sách y dược học cổ truyền đến năm 2010 của Chính phủ, các nhà khoa học và ngành y tế đang quan tâm đến việc nghiên cứu, sử dụng artemisinin và các dẫn xuất của nó để điều trị ung thư ngoài việc chữa trị các bệnh sốt rét Điều này thành công sẽ mở ra khả năng tiềm tàng về việc sử dụng các chất có nguồn gốc thiên nhiên, đặc biệt là các cây thuốc bản địa của Việt Nam để chữa trị các bệnh nan y với đặc tính ưu việt sẵn có, rẻ tiền hơn nhiều so với các loại hoá trị liệu chữa ung thư hiện dùng.

1.3.3 Sinh tổng hợp artemisinin trong Artemisia annua

Mặc dù con đường sinh tổng hợp hoàn toàn artemisinin và một vài tiền chất của nó đến nay vẫn chưa được thiết lập hoàn toàn [14,15], tuy vậy một

vài bước biến đổi sinh học cũng đã được minh chứng ở dạng in vitro và in vivo (Hình 2) Akhila và các cộng sự đã đề nghị một con đường sinh tổng hợp

hoàn toàn artemisinin từ axit mevalonic và izopentenyl pyrophosphat Thứ tự sinh tổng hợp do nhóm này đưa ra như sau

Farnesylpyrophosphat → khung germacrane → dihidrocostunolide → cadinanolid → arteanuin B → artemisinin

Tuy nhiên khi nghiên cứu thành phần hoá học của cây Artemisia annua

các nhà khoa học thấy rằng hàm lượng axit artemisinic là tiền chất của artemisinin, điều mà Akhila và các đồng sự đã không đưa ra trong báo cáo của mình Một điều lý thú khác, Eiferaly và các cộng sự cho công bố axit artemisinic là tiền chất sinh tổng hợp ra cả arteannuin B và artemisinin Wang

và các cộng sự đã chuyển hoá axit artemisinic có gắn nguyên tử 3H tại C15

(nhóm metylen exocyclic) thành cả arteannuin B và artemisinin Ngoài ra một

số tác giả khác cũng cho rằng axit dihidroartemisinic cũng là tiền chất của

artemisinin Tuy vây, các sản phẩm hoặc enzym sau fanesyl pyrophosphat và trước axit atermisinic, arteannuin B và artemisinin vẫn chưa được phân lập.

Axit dihidroartemisinic Artemisinin Arteannuin B

Hình 2: Các con đường sinh tổng hợp artemisinin

Như vậy con đường sinh tổng hợp artemisinin nói riêng và các terpen nói chung đều xuất phát từ axit mevalonic và đặc biệt từ isopentenyl pyrophosphat Mỗi sự chuyển hoá trong cây đều được kiểm soát bằng một enzym Trong sinh tổng hợp các terpenoid thì việc nghiên cứu các enzym đóng vòng là vô cùng quan trọng, bởi vì từ các tiền chất geranyl pyrophosphat (GPP), fanesyl pyrophosphat (FPP) và geranyl geranyl pyrophosphat (GGP), nhờ các enzym đóng vòng này mà sự chuyển hoá thứ cấp xảy ra và tạo ra các sản phẩm tương ứng là các monoterpen, sesquiterpen và diterpen nhờ rất nhiều các phản ứng electrophin nói chung mà cơ chế đã được chỉ ra Cũng nhờ sự định hướng này mà rất nhiều các enzym đóng vòng đã được phân lập, nhân dòng, biểu hiện trong thực vật và các vi sinh vật Dưới đây là hoạt động của một số enzym đóng vòng terpen.

Vetispiradiene

Germacrene C

OPP

H

δ-cadinene

epi-cedron

Hình 3: Hoạt động của các enzym đóng vòng sesquiterpen

Farnesyl pyrophosphat được chuyển hoá thành các sesquiterpen khác nhau bởi các enzym đóng vòng terpen

Trên cơ sở các tài liệu tham khảo, khoá luận xoay quanh việc nghiên cứu phân lập, xác định cấu trúc của các chất theo định hướng hoạt tính sinh học Mục tiêu của khoá luận được đưa ra như sau:

- Thu hái mẫu Artemisia annua và phân lập artemisinin.

- Xác định cấu trúc của sản phẩm phân lập được bằng các phương pháp phổ hiện đại như IR, GC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR và các phổ hai chiều

- Thử nghiệm hoạt tính chống sốt rét của artemisinin với kÝ sinh trùng sốt rét người

Công trình được hoàn thành vói sự trợ giúp về các kết quả nghiên cứu hoạt tính chống sốt rét của dự án Hàn - Việt "Nghiên cứu thành phần hoá học

và hoạt tính sinh học của một số thực vật Việt Nam" của Viện hoá học các hợp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam

PHẦN 2: THỰC NGHIỆM VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

HOÁ CHẤT DỤNG CỤ

*Các phương pháp sắc ký

- Sắc ký bản mỏng phân tích: Sử dụng bản nhôm tráng sẵn silicagel 60F254 (Merck), dộ dày 0,2mm và bản kính tự tráng với silicagel có bột

bó của viện kiểm nghiệm

- Sắc ký lỏng chân không, GC-MS (sắc kí khí - khối phổ)

- Sắc ký cột: Sử dụng silicagel Merck 60, cỡ hạt 100-160 mesh và silicagel của viện kiểm nghiệm, cỡ hạt 10 mesh

*Hệ dung môi sử dụng trong luận văn

+ n-hexan dùng để chiết nguyên liệu bằng bộ chiết Shoxlet

+ Hệ dung môi chạy bản mỏng:

n-+ Phát hiện vệt chất: Đèn UV 254 nm, dung dịch Iot/KI loãng dùng để phát hiện các sesquiterpen lacton

+ Thử nghiệm hoạt tính chống sốt rét của artemisinin: phương pháp thử hoạt tính chống sốt rét của artemisinin được tiến hành tại phòng hoá dược, Korea Research Institute of Biosciene and Biotechnology

+ Thiết bị

Thiết bị thuỷ tinh

-Bình cầu 2 lít ba cổ

-Phễu chiết Shoxlet

-Cột sắc kí

-Bình triển khai

-Máy cất quay chân không

-Cột sắc kí lỏng chân không, cột sắc kí đẩy, bản mỏng

Các máy đo: Máy đo điểm chảy, máy đo phổ hồng ngoại, máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân

CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 THU HÁI MẪU

Lá của cây Artemisia annua trồng đại trà ở Mê Linh – Vĩnh Phúc được

thu hái vào tháng 6 Mẫu cây này được sấy ở 1000C trong 30 phút để diệt nấm mốc, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 400C

2.2 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT HỒI LƯU NÓNG

0,5 kg lá cây Artemisia annua được cho vào phễu chiết Shoxlet, phễu này

được gắn trên bình cầu 2 lít được đặt vào trong bếp đun hồi lưu chuyên dụng.Phía trên của Shoxlet được lắp sinh hàn hồi lưu hiệu lực để sự thất thoát dung môi nhỏ nhất Đổ vào bình cầu 2 lit khoảng 1,4 – 1,5 lit n-hexan, cho vài viên

đá bọt và bắt đầu đun hồi lưu cho đến khi dung dịch từ Shoxlet chảy xuống bình cầu nhạt màu thì sự chiết đã hoàn thành Ngoài ra, quá trình chiết

Artemisia annua còn được tiến hành bằng máy chiết siêu âm.