Nghiên cứu, chọn lọc cá thể f2 của một số tổ hợp lúa nếp chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm, waxy bằng chỉ thị phân tử DNA

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC---  ---ĐỀ CƯƠNG THỰC TẬP TỐT NGHIỆP ĐỀ TÀI: Nghiên cứu, chọn lọc cá thể F2 của một số tổ hợp lúa nếp chứa gen kháng bệnh bạc

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

- 

 -ĐỀ CƯƠNG

THỰC TẬP TỐT NGHIỆP

ĐỀ TÀI:

Nghiên cứu, chọn lọc cá thể F2 của một số tổ hợp lúa nếp

chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm, waxy

Sinh viên thực hiện : Nguyễn Thanh Phong

Mã sinh viên : 540341

HÀ NỘI - 2013

PHẦN I

MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề

Trên thế giới cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong 3 cây lương thực

quan trọng nhất không thể thiếu được trong đời sống hàng ngày của conngười Lúa là loại cây phổ biến được gieo trồng ở tất cả các châu lục vàkhoảng trên 100 nước, nhưng tập trung chủ yếu ở châu Á (chiếm 90 % vềdiện tích)

Ở Việt Nam, cây lúa được coi là cây lương thực quan trọng nhất trongnền sản xuất nông nghiệp Năm 2012, theo số liệu sơ bộ của Bộ Nông nghiệp

và Phát triển nông thôn, diện tích gieo trồng lúa là 7.750.000 ha chiếm trên90% tổng diện tích đất trồng cây lương thực có hạt, với sản lượng là 43 triệutấn được trồng tập trung chủ yếu ở đồng bằng Bắc Bộ và đồng bằng sôngCửu Long Hơn nữa, lượng gạo xuất khẩu năm 2012 đạt 7,75 triệu tấn,kim ngạch xuất khẩu đạt 3,23 tỉ đô la Mỹ, tăng 15,4% về lượng và 21,2% vềgiá trị so với năm 2011 ( theo số liệu của Hiệp hội Lương thực Việt Nam(VFA) – tháng 10/ 2012)

Trong đó, lúa nếp là một trong những nhóm lúa đặc sản lâu đờicủa nhân dân Việt Nam và được sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau như:nấu xôi, làm các loại bánh cổ truyền, bánh chưng, bánh dày, bánh dẻo, làm đồuống như rượu và nhiều loại đồ ăn khác Và các sản phẩm từ lúa nếp đã gópphần làm nên hương vị độc đáo, giàu tính nhân văn của văn hóa ẩm thựcViệt Nam Lúa nếp chiếm khoảng 10 % diện tích sản xuất lúa và khoảng 10%lượng gạo được tiêu dùng của người Việt Nam

Lúa nếp có giá thành cao, tuy nhiên các dòng lúa nếp Việt Namkhá nghèo nàn, có thể chia thành 2 nhóm:

- Giống nếp địa phương: Nếp cái hoa vàng, nếp cau, nếp hoa trắng…chất lượng gạo tốt, cơm thơm, dẻo và ngon, nhưng năng suất thấp, cây cao dễđổ

- Giống lúa nếp mới chọn tạo như TK90, 315, 415…năng suất khá,thấp cây nhưng chất lượng gạo kém,một số giống không thơm, cơm ít dẻo đặcbiệt dễ bị nhiễm bệnh đạo ôn, bạc lá và rầy nâu.

Trong đó, bệnh bạc lá do vi khuẩn Xanthomonas oryzea là loại bệnh

gây hại nghiêm trọng đến năng suất và phẩm chất cây lúa Có nhiều biện pháp

để phòng trừ bệnh bạc lá trong đó ưu việt hơn cả là chọn giống kháng bệnhvừa cho hiệu quả kinh tế cao, vừa cho sản phẩm sạch, lại không gây ô nhiễmmôi trường Nhiều gen đã được nghiên cứu ứng dụng trong chọn tạo giốnglúa kháng bệnh bạc lá và những giống lúa mang một trong các gen này cómức độ kháng cao, phổ kháng rộng

Như vậy, việc đánh giá nguồn gen lúa nếp đặc biệt là gen thơm, genwaxy, gen kháng bạc lá không chỉ có ý nghĩa trong việc bảo tồn các giốnglúa đặc sản mà còn có ý nghĩa quan trọng trong công tác chọn tạo giống lúachất lượng cao Đặc biệt với công tác chọn tạo giống hiện nay, việc lai tạonhiều dòng bố mẹ có gen mục tiêu mong muốn để tạo con lai có sự phối trộnnhiều gen hữu ích đã trở nên dễ dàng hơn Các con lai thế hệ F2 luôn mangcác phẩm chất quý: kháng sâu bệnh, chống lốp đổ…ngày càng phổ biến

Đồng thời, với sự phát triển của các kỹ thuật chỉ thị phân tử DNA đặcbiệt là kỹ thuật PCR thì việc tìm và phát hiện một đoạn DNA liên quan đếnmột tính trạng nào đó trở nên đơn giản và chính xác Có thể đánh giá ngay ởgiai đoạn cây non tiết kiệm được rất nhiều thời gian và công sức

Xuất phát từ cơ sở trên, để chọn tạo các dòng giống lúa nếp chất lượng

cao, kháng bệnh bạc lá, chúng tôi tiến hành đề tài : “Nghiên cứu, chọn lọc cá

thể F2 của một số tổ hợp lúa nếp chứa gen kháng bệnh bạc lá, gen thơm, waxy bằng chỉ thị phân tử DNA”.

1.2 Mục đích và yêu cầu

1.2.1 Mục đích

- Khảo sát các đặc điểm nông sinh học của tập đoàn giống lúa nếpnghiên cứu

- Khảo sát, đánh giá gen mùi thơm, gen waxy

- Khảo sát khả năng kháng bệnh bạc lá và khả năng mang gen kháng

bạc lá Xa4, Xa5, Xa7 trong tập đoàn mẫu giống lúa nếp.

- Tuyển chọn một số mẫu giống triển vọng để khảo nghiệm và nhữngmẫu giống có phẩm chất tốt, khả năng kháng bạc lá và năng suất cao

1.2.2 Yêu cầu

- Sử dụng chỉ thị phân tử xác định gen chính quy định mùi thơm, gen

waxy và gen kháng bệnh bạc lá lúa Xa4, Xa5, Xa7 của các thế hệ F2 dòng/

giống lúa nếp

- Đánh giá một số đặc điểm nông sinh học chính, năng suất, chất lượng

và khả năng kháng bệnh bạc lá của các dòng/giống lúa nếp

PHẦN II TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng

2.1.1 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng trên thế giới2.1.2 Tình hình chọn tạo giống lúa nếp chất lượng ở Việt Nam

2.2 Chỉ thị phân tử

2.3 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen mùi thơm

2.4 Nghiên cứu ứng dụng chỉ thị gen waxy

2.5 Nghiên cứu về bệnh bạc lá trên lúa nếp

2.5.1 Nguyên nhân gây bệnh

2.5.2 Triệu chứng

2.5.3 Tác hại của bệnh bạc lá lúa

2.5.4 Cơ sở khoa học của chọn giống kháng bạc lá

PHẦN III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu

- Địa điểm: Khu ruộng thí nghiệm và phòng thí nghiệm phòng sinh họcphân tử và công nghệ sinh học ứng dụng, khoa Công nghệ sinh học, trườngĐại học Nông Nghiệp Hà Nội

- Thời gian nghiên cứu: từ 01/ 2013 đến 06/ 2013

3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

3.2.1 Vật liệu

- 50 giống lúa nếp địa phương và giống đối chứng là TK90

- Các isolate vi khuẩn bạc lá được phân lập và bảo quản tại phòng thínghiệm bộ môn Công nghệ Sinh học Ứng dụng trường ĐHNN Hà Nội

3.2.2 Phương pháp nghiên cứu

3.2.2.1 Thí nghiệm đồng ruộng

a Bố trí thí ngiệm ngoài đồng ruộng

+ Thời vụ: Vụ xuân năm 2013

+ Thí nghiệm được bố trí theo từng ô, mỗi ô 1 giống

+ Các tổ hợp được bố trí tuần tự không nhắc lại

+ Mỗi giống cấy 5 m2

+ Hàng cách hàng 20 cm

+ Cây cách cây 11 cm, cấy 1 dảnh

+ Bón phân và chăm sóc như đại trà

b Theo dõi một số chỉ tiêu nông sinh học

Tiến hành theo phương pháp của IRRI

* Thời kì mạ

- Gieo riêng từng dòng, cắm thẻ ở mỗi dòng, che nilon chống rét vàchống chuột

- Khi mạ được 3 lá thì bắt đầu đánh dấu số lá: lá thứ 3 đánh dấu mộtchấm sơn trắng, lá thứ 5 đánh dấu 2 chấm, lá thứ 7 đánh dấu 3 chấm, theodõi đến khi ra lá đòng ghi số liệu số lá/ thân chính.

- Mỗi dòng đánh dấu 20 cây, chọn cấy 10 cây để theo dõi

- Theo dõi khả năng đẻ nhánh của cây mạ ở mỗi dòng

- Theo dõi màu sắc lá mạ ở mỗi dòng

- Theo dõi tình hình nhiễm sâu bệnh trên ruộng mạ, ghi tên sâu hoặcbệnh, cho điểm để đánh giá mức độ gây hại

- Theo dõi khả năng chịu rét của cây mạ trên đồng ruộng

- Đánh giá khả năng sinh trưởng phát triển của cây mạ thông qua chỉtiêu: chiều cao cây mạ, chiều rộng gân mạ

* Thời kì lúa

 Thời gian qua các giai đoạn sinh trưởng

- Tuổi mạ: được tính từ khi gieo đến khi cấy

- Ngày hồi xanh

- Ngày bắt đầu đẻ

- Ngày kết thúc đẻ

- Ngày trỗ (có 1 cây có 1 bông nhô ra ngoài bẹ lá đòng 3-5 cm) ghi làngày bắt đầu trỗ Nếu là ngày cây phân ly sớm hẳn thì ghi lại và bỏ cây phânly

- Ngày trỗ 10%, 50%, kết thúc trỗ

- Ngày chín vàng : >95% hạt chín vàng

- Ngày thu hoạch

 Theo dõi số lá/ thân chính

Cây đánh dấu ở ruộng mạ được cấy liên tục trên một hàng Hàng tuần đếnđánh dấu các lá theo số lẻ mới xuất hiện, khi ra lá đòng thì ghi số liệu của cả

10 cây, cộng và chia trung bình

 Mô tả đặc điểm hình thái

Trong quá trình sinh trưởng, mô tả trong sổ theo dõi đồng ruộng hàngtuần

Ở các thời điểm chính sau phải mô tả :

- Đẻ rộ mô tả : +Khả năng đẻ: Khoẻ, yếu, trung bình

+ Râu: Có - không- màu râu.

+ Xếp hạt/ bông: Thưa - sít- trung bình

 Theo dõi sâu bệnh tự nhiên.

Hàng tuần đi quan sát, thấy dòng nào xuất hiện sâu bệnh gây hại, ghi tênsâu, bệnh- mô tả mức độ sau 3 ngày quan sát lại nếu thấy mức độ tăng lên thìphun thuốc phòng trừ - ghi loại thuốc, nồng độ - thời gian ngừng gây hại sauphun - chỉ tiêu nào cho điểm thì ghi điểm

 Đánh giá độ thuần và kiểu hình:

Khi lúa trỗ xong tiến hành đánh giá:

- Đếm số cây phân ly:

+ Thời gian trỗ sớm muộn,+ Cao - thấp

+ Kiểu lá+ Kiểu đẻ nhánh+ Kiểu bông.v v

- Cho điểm kiểu hình theo IRRI

 Phân loại và tuyển chọn dòng tốt.

- Phân loại theo thời gian từ gieo đến trỗ

< 60 ngày61- 70 ngày71- 80 ngày81- 90 ngày91- 100 ngày101- 110 ngày

111- 120 ngày

> 120 ngày

- Phân loại theo chống chịu sâu bệnh : Nhẹ - trung bình- nặng

- Phân loại theo độ thuần và kiểu hình

Cuối cùng chọn ra khoảng 10-20 dòng tốt Các dòng này được lấy mẫu đểtheo dõi các chỉ tiêu

 Theo dõi các dòng có triển vọng.

Sau khi đánh giá tuyển chọn, tiến hành thu mẫu mỗi dòng 10 cây nhổ cả gốc,buộc thep bó, đo đếm các chỉ tiêu:

* Đo các chỉ tiêu :

- Chiều cao cây : Đo từ mặt đất đến hạt đỉnh bông cao nhất, không kể râu

- Chiều dài cổ bông : Đo từ cổ lá đòng đến đốt cổ bông

+ Nếu cổ bông vươn ra ngoài cổ lá đòng ký hiệu dấu ++ Nếu cổ bông nằm trong bẹ lá ký hiệu dấu -

- Chiều dài lá đòng : Đo từ gối lá đến mút đầu lá

- Chiều rộng lá đòng : Đo từ mép lá bên này đến mép lá bên kia chỗ rộngnhất

- Số bông hữu hiệu : Đếm tất cả các bông có hạt chắc và lép

- Số hạt /bông trung bình : Tuốt hạt cả khóm, đếm tổng số hạt (chắc và lép),tính tỷ lệ lép, chia tổng số hạt cho số bông

* Tỷ lệ hạt lép (%)

* Tính khối lượng 1000 hạt : Phơi khô đến độ ẩm 13% , cân 3 lần, mỗi lần

500 hạt Nếu độ sai số giữa các lần cân không quá 0,5% thì cộng 3 lần cân rồichia cho 3 tính được khối lượng trung bình 500 hạt Đem kết quả nhân với 2

để tính khối lượng 1000 hạt Nếu độ sai số giữa các lần cân vượt quá 0,5% thìtiến hành đếm và cân lại

* Mô tả mầu hạt : màu sắc vỏ trấu, mỏ hạt, râu

* Tính tỉ lệ gạo lật, gạo sát, gạo nguyên

* Đo chiều dài, chiều rộng hạt gạo lật

Với mỗi giai đoạn quan sát, tiến hành lập bảng.

- Công thức tính giá trị trung bình: X = Xi n

- Công thức tính phương sai: S2 =

n i

- Hệ số biến động: CV(%) = X S x100

Trong đó:

n: là số mẫu quan sát

X : là giá trị trung bình của tính trạng quan sát

S2 : là phương sai mẫuXi: là giá trị thực của tính trạng quan sát ở tính trạng thứ i

c Đánh giá các chỉ tiêu mùi thơm

Theo Sood và Siddiq (1978), mùi thơm được đánh giá cảm quan nhưsau:

Mùi thơm trên lá

Thu 10 lá của mỗi mẫu giống ở giai đoạn lúa đẻ nhánh rộ Lấy 1g lá,cắt thành những đoạn dài 5 mm, bỏ vào ống nghiệm, ngâm với 5ml dung dịchKOH 1,7%, đậy nắp lại và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Mức độ thơmđược chấm điểm bởi 5 người cho theo 3 mức rồi lấy trung bình

Điểm 1: không thơm, Điểm 2: hơi thơm, Điểm 3: thơm

Mùi thơm của gạo

Lấy 10 hạt của mỗi giống, vừa mới thu hoạch, bóc vỏ, làm trắng rồinghiền nhỏ Bột gạo của mỗi giống được cho vào một ống chứa 500µl KOH1,7%, đậy nắp và để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút Đánh giá mùi thơm cũngbằng phương pháp ngửi của 5 người rồi cho điểm như trên

d Đánh giá hàm lượng amylose, độ dẻo của cơm các giống lúa

* Nhiệt hoá hồ

Lấy 6 hạt gạo đã xát trắng, không có vết nứt, gãy, sắp vào đĩa petri.Cho vào mỗi đĩa 10 ml dung dịch KOH 1.7%, đậy nắp và để trong 23 giờ ởnhiệt độ 30oC Nhiệt trở hồ được xác định bằng mức lan rộng và độ trong suốtcủa gạo sau khi xử lý (theo phương pháp của Little và cs) Đánh giá nhiệt hoá

hồ và độ phân huỷ theo thang điểm IRRI (1996)

*Phân tích hàm lượng amylase

Định lượng amylose theo phương pháp của H Seko, 2003: hạt lúađược bóc vỏ, xát trắng, nghiền nhỏ Lấy 100 mg bột đã nghiền, bổ sung vào1ml Ethanol 95%, 9 ml NaOH 1N Đun sôi ở 100oC trong 10 phút và địnhmức cho đủ 100 ml Lấy 5 ml dung dịch hoà tan, cho thêm 1 ml CH3COOH1M, 2 ml dung dịch iodine Định mức cho đủ 100 ml, giữ ấm ở 30oC trongthời gian 20 phút rồi đo OD ở bước sóng 620 nm trên máy đo quang phổ vàđọc giá trị Đối chiếu bảng quy đổi tìm ra hàm lượng amylose Phân nhómhàm lượng amylose theo tiêu chuẩn IRRI (1988)

e Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá bằng lây nhiễm nhân tạo

* Môi trường nuôi cấy vi khuẩn

Vi khuẩn Xanthomonas oryzae được nuôi cấy trên môi trườngWakimoto

* Phương pháp lây nhiễm

Lây nhiễm theo phương pháp cắt đầu lá: dùng kéo đã khử trùng nhúngvào dung dịch chứa vi khuẩn gây bệnh bạc lá ( mỗi chủng vi khuẩn dùng mộtkéo vô trùng) cắt lên đầu lá lúa một đoạn dài khoảng 2-5 cm và lây nhiễm vàogiai đoạn lúa làm đòng-trỗ, mỗi chủng một cây, trên một cây cắt toàn bộ các

lá xanh trên đó

Trước khi lây nhiễm, tiến hành làm thí nghiệm để xác định khả năngduy trì độc tính của các chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng cáchlây thử trên dòng mẫn cảm IR24 Sau 5 ngày thấy đầu lá héo xanh và tái đichứng tỏ các chủng vi khuẩn này có độc tính có thể dùng để lây nhiễm được

* Đánh giá khả năng kháng bệnh bạc lá

Sau khi lây nhiễm được 20 ngày tiến hành đo chiều dài vết bệnh theophương pháp do giáo sư Satoru Taura đề xuất

Dựa vào chiều dài của vết bệnh để đánh giá tính kháng của các giốngnhư sau:

+ Chiều dài vết bệnh < 8cm: kháng bạc lá (R)

+ Chiều dài vết bệnh từ 8-12cm: nhiễm vừa (M)

+ Chiều dài vết bệnh >12cm: nhiễm nặng (S)

3.2.2.2 Thí nghiệm trong phòng

a Chiết tách DNA

Quy trình chiết tách DNA tổng số theo Zheng và cs (1995) có cải tiến

+ Bước 1: thu ngắt mẫu lá khoẻ dài khoảng 2 cm bỏ vào ống nghiệm códung tích 1.5 ml, đánh dấu tên giống rồi bỏ vào tủ lạnh

+ Bước 2: các mẫu lá được cắt nhỏ 0.5 cm rồi bổ vào cối sứ sạch

+ Bước 3: nhỏ 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào cối rồi lấy chàynghiền nhỏ mẫu lá

+ Bước 4: nghiền nhỏ mẫu lá cho đến khi dung dịch chuyển sang màuxanh đen chứng tỏ tế bào lá đã vỡ và diệp lục được giải phóng ra

+ Bước 5: đổ thêm 400 µl dung dịch chiết xuất DNA vào và trộn lẫn rồichuyển dung dịch đó vào ống nghiệm đã đánh số

+ Bước 6: đổ và ống nghiệm 400µl dung dịch hỗn hợp Phenol: chlorofom:isoaminalchohol (25:24:1) Sau đó li tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút.+ Bước 7: đổ vào ống nghiệm 400 µl (2 chlorofom: 1 isoaminalchohol).+ Bước 8: cho 800 µl ethanol (96%) trộn đều sau đó ly tâm 5 phút với tốc

độ 13000 vòng/ phút Đổ phần dung dịch phía trên, giữ lại phần kết tủa dướiđáy ống nghiệm

+ Bước 9: rửa kết tủa bằng ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt độphòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm

+ Bước 10: hoà tan kết tủa bằng 50µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt

độ -200C hoặc 40C

Bảng 3.1 Thành phần dung dịch chiết táchThành phần Nồng độ dd mẹ Nồng độ dd

làm việc

Hỗn hợp 50ml ddchiết tách

* Gen mùi thơm

- Sử dụng cặp mồi (theo Bradbury và cs., 2005)

ESP: 5’-TTG TTT GGA GTC TGC TGA TG-3’

IFAP: 5’-CAT AGG AGC AGC TGA AAT ATA TACC-3’

Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen thơmBước Nhiệt độ (0C) Thời gian

6 72 5 phút

* Gen waxy

Sử dụng cặp mồi (Ayres et al., 1997)

F 484: 5’-CTT TGT CTA TCT CAA GAC AC-3’

R 485: 5’ TTG CAG ATG TTC TTC CTG ATG-3’

Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Waxy

Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

*Gen kháng bạc lá Xa4, Xa5, Xa7

Quy trình PCR xác định gen kháng bệnh bạc lá do GS.TS.S Taura vàcộng sự đề xuất

Primer Forward 10 pmol/µl 1,0

Primer Reverse 10 pmol/µl 1,0

DNA taq polymerase 5unit/µl 0,1

ATC GGA- 3'

Chu kỳ nhiệt

Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen Xa4, Xa7

Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

Bảng: Chu kỳ nhiệt cho gen xa5

Bước Nhiệt độ (0C) Thời gian

từ từ cho tới khi dung dịch trong suốt

- Đổ dung dịch agarose 1.5% vào khuôn gel cho tới khi đông đặc thì rútlược ra Đổ đầy dung dịch TAE vào bể điện di sao cho ngập giếng

- Trải một màng parafin, nhỏ 1 µl loading dye, trộn với 8 µl dung dịch PCR, sau đó trộn đều và nhỏ hỗn hợp vào giếng Nhỏ theo thứ tự của các giống DNA của các giống đã được đánh số

- Cắm nguồn điện một chiều (75V) chạy điện di trong khoảng 25 đến

50 phút DNA mang điện tích âm sẽ chạy về cực dương của nguồn điện

- Sau khi chạy điện di xong, nhuộm bản điện di bằng ethilium bromide nồng độ 10mg/ml trong 10 phút

- Quan sát vệt băng dưới đèn chiếu tia UV và chụp ảnh bản điện di