công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các phương pháp và ứng dụng của CNSH động vật, người và y sinh

PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC Theo tiềm năng biệt hóa• 2 các TB phôi ở giai đoạn tiếp sau giai đoạn nêu trên nút thành các TB vài tiềm năng 3 TB có khả năng phân hóa thành một loại hay một họ các

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

Giảng viên:

CHƯƠNG III: CÁC PHƯƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG CỦA CNSH ĐỘNG VẬT,

NGƯỜI VÀ Y SINH (8 TIẾT)

3.6 Dự án genom người và các ứng dụng 3.7 Công nghệ hỗ trợ sinh sản

3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

·Các tế bào rất nhạy cảm để tác động điều khiển ở thời điểm này

S Phase: Tổng hợp DNA

G2 Phase: Tế bào chuẩn bị cho nguyên phân Mitosis

3.1 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

3.1.1 KHÁI NIỆM

nhất định tiến hành rửa và bổ sung dung dịch nuôi cấy mới.

người, phôi gà, thận khỉ, phôi lợn, màng ối người…

3.1.2 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY

• NUÔI CẤY CƠ QUAN

• NUÔI CẤY MÔ

3.1 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO

ĐỘNG VẬT

6

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Nuôi cấy cơ quan (Organ Culture): là quá trình nuôi cấy toàn bộ phôi,

cơ quan hoặc mô được cắt ra khỏi cơ thể bằng giải phẫu mẫu sống (vivisection) hoặc ngay sau khi não dừng hoạt động

Đặc điểm:

Kiến trúc và các chức năng sinh lý bình thường được duy trì.

Các tế bào vẫn ở trạng thái phân hóa (fully differentiated).

Tốc độ sinh trưởng chậm.

Cần mẫu tươi cho mỗi lần thí nghiệm.

Hạn chế khi nuôi cấy trên quy mô lớn.

Nuôi cấy mô (Tissue Culture): Nuôi cấy những mẩu cắt ra từ các mô cắt

rời

Đặc điểm:

Một số chức năng bình thường có thể vẫn được duy trì.

Tổ chức ban đầu của mô bị phá huỷ.

Có thể ứng dụng cho nuôi cấy quy mô lớn

3.1 PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY MÔ

TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

Nuôi cấy tế bào (Cell Culture): Mô hoặc một phần của mẫu

được làm tan rã ra, chủ yếu là bằng xử lý enzyme, thành

dịch huyền phù tế bào Nguồn nguyên liệu này được sử dụng cho nuôi cấy đơn lớp hoặc nuôi cấy huyền phù.

Đặc điểm:

NUÔI CẤY ĐƠN LỚP

8

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Ưu điểm:

Dễ dàng thay đổi môi trường và rửa tế bào trước khi bổ

loại tế bào

Nhược điểm:

Cần nhiều không gian hơn so với nuôi cấy huyền phù

Việc đo Oxygen và pH gặp khó khăn

Nuôi cấy các tế bào phát triển theo kiêu liên kết bám

dính (Anchorage Dependent Cultures)

Đặc điểm:

bước:

• Sự bám của các yếu tố dinh kết với bề mặt nuôi cấy (Cold insoluble

globulin or other attachment glycoproteins)

• Sự liên kết giữa tế bào với bề mặt nuôi cấy

• Sự dính kết các tế bào với bề mặt được bao phủ (các chất heparan

sulfate đa dạng được tổng hợp bởi tế bào )

• Sự phát triển lan rộng của các tế bào đã liên kết

ưu trước khi qúa trình dính kết xảy ra.

NUÔI CẤY HUYỀN PHÙ TẾ BÀO

Phương pháp nuôi cấy

Một số khái niệm dòng tế bào

BM CNSH TV – Khoa CNSH

D òng tế bào ( Cell Lines) – là thuật ngữ dùng để chỉ một quần thể tế bào giống hệt nhau bắt nguồn từ một tế bào ban đầu

D òng tế bào liên tục ( Continuous Cell Lines) –là dòng tế

khả năng duy trì khả năng phân bào trong thời gian rất dài hoặc vĩnh viễn mà không thay đổi đặc tính.

Sự sinh trưởng của tế bào nuôi cấy

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Một số dụng cụ sử dụng trong nuôi cấy tế bào động vật

MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY

Thành phần : các muối vô cơ,

Các tế bào biến nạp pH 7.0-7.4 Các tế bào Epidermal đôi khi cần

pH 5.5

Sử dụng chỉ thị Phenol Red

– Có mầu tím ở pH 7.8 – Mầu hồng ở pH 7.6 – Mầu đỏ ở pH 7.4 – Da cam ở pH 7.0 – Vàng ở pH 6.5

Ví dụ về nuôi cấy

mô não chuột

ỨNG DỤNG CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO ĐỘNG VẬT

• Mô hình thử nghiệm và chẩn đoán bệnh

• Tạo các nguyên liệu cấy ghép

• Tạo cơ quan từ tế bào động vật nuôi cấy

• Sản xuất các virus diệt côn trùng

+Bacolovirus

3.2.2 ĐẶC TRƯNG CƠ BẢN CỦA TẾ BÀO GỐC

– có khả năng tự tái tạo mới

– có thể biệt hoá thành những tế bào và tổ chức chuyên biệt đảm nhiệm những chức năng đặc biệt

– có thể phân lập và duy trì được ở trạng thái chưa bịêt hoá

– có thể tăng sinh và biệt hoá khi được chuyển vào động vật có hệ thống miễn dịch đã bị tổn thương

PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo tiềm năng biệt hóa)

•

2

các TB phôi ở giai đoạn tiếp sau giai đoạn nêu trên (nút

thành các TB vài tiềm năng

3

TB có khả năng phân hóa thành một loại hay một họ các

TB chuyên hóa xác định

Day 1

Fertilized egg

Day 3-4 Multi-cell embryo

Day 5-6 Blastocyst Day 11-14

Tissue Differentiation

PHÂN LOẠI TẾ BÀO GỐC (Theo nguồn gốc)

Tế bào gốc phôi (Embryogenic Stem Cells)

Tế bào gốc trưởng thành (Adult/Mature Stem Cells)

ĐẶC ĐiỂM CỦA ASC VÀ ESC

22

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Tế bào gốc trưởng thành Tế bào gốc của phôi/ bào thai

có mặt trong nhiều tổ chức của cơ thể

mặc dù với một số lượng rất ít

mature body tissues, umbilical cord,

placenta

chỉ có ở một số vị trí, trong một số tổ chức nhất định của phôi, phôi nang và bào thai

có khả năng biệt hoá thấp hơn và chỉ

sản xuất ra những tế bào đặc hiệu

cho loại tổ chức cội nguồn của

chúng

có thể tạo nên những cụm tế bào có thể biệt hoá tự nhiên tạo ra nhiều loại tế bào (toàn năng, đa năng)

Được phân lần đầu năm 1960s Phân lập lần đầu năm 1998

Đã áp dụng trị liệu thành công trên

bệnh nhân

Chỉ nên áp dụng trên động vật

NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI

BM CNSH TV – Khoa CNSH

phôi thụ tinh in vitro

phôi nạo

NGUỒN CUNG CẤP TẾ BÀO GỐC PHÔI

chuyển nhân soma

ƢU ĐiỂM CỦA TẾ BÀO GỐC PHÔI

•Có thể tạo thành tất cả các loại tế bào trong cơ

HẠN CHẾ CỦA TẾ BÀO GỐC PHÔI

BM CNSH TV – Khoa CNSH

•Nếu lấy từ IVF, có thể bị đào thải

•Khó điều khiển quá trình phân hoá

•Yêu cầu nhiều bước trung gian để định hướng sinh ra loại tế bào mong muốn

TẾ BÀO GỐC TRƯỞNG THÀNH

Có nhiều trong tổ chức của động vật và người: não, tuỷ xương, máu, tuỷ răng, tuỷ sống, võng mạc, gan

• Không có quá trình thụ tinh

bào khác

Từ các mô trưởng thành

Khả Năng Phân Hoá của ASC

ƢU ĐiỂM CỦA ASC

NHƯỢC ĐIỂM CỦA ASC

 Thời gian duy trì trong nuôi cấy ngắn

 Khó phân lập và tách chiết

 Chỉ phân hoá thành một số loại tế bào chuyên hoá

 Không phổ biến, hầu như rất hiếm ở người cao tuổi

 Sự phát triển và tăng trưởng cần được định hướng khi cấy vào cơ thể nhận.

 Khả năng bị đào thải như một mô lạ là khá cao

 Sự nhiễm bởi viruses, bacteria, fungi, and Mycoplasma.

• Còn đang được nghiên cứu: “vì sao có tế bào gốc không biệt hoá trong khi các tế bào lân cận đã biệt hoá”?

• Có bao nhiêu loại? Có ở tổ chức nào?

• Có khả năng biệt hoá đa năng không?

• Chưa biết các tế bào gốc nuôi cấy in vitro (ngoài phôi) có thể hiện đầy đủ các chức năng như tế bào tự nhiên hay không

• Các tế bào gốc cần được cho phân hóa thành tế bào thích hợp trước khi dùng để trị bệnh.

• Gần đây đã phát hiện một số bất thường về số lượng và cấu trúc của nhiễm sắc thể trong ba dòng ESC của người.

1968, cấy ghép thành công tế bào tuỷ cho bệnh nhân

bị suy giảm hệ thống miễn dịch (SCID-Severe

• 1954 – John Enders nhận giải thưởng Nobel về y tế về công trình nuôi cấy virus bại liệt trong tế bào thận của người

• In 1998, James Thomson (University of Wisconsin-Madison) phân lập đám tế bào lớp trong của phôi non và phát triển dòng tế bào gốc phôi người đầu tiên.

• 1998, John Gearhart (Johns Hopkins University) phát triển tế bào mầm thai từ các tế bào trong các mô sinh dục của thai (Tế bào mầm nguyên thuỷ-primordial germ cells).

• Các dòng tế bào đa tiềm năng(Pluripotent stem cell “lines”) được phát triển từ hai nguồn trên

• 2001 – phôi người lần đầu tiên được nhân

dòng (chỉ nhân đến giai đoạn 6 tế bào) bởi

Advanced Cell Technology (USA)

• 2004* – First human cloned blastocyst

created and a cell line established (Korea)

KHẢ NĂNG ỨNG DỤNG CỦA TẾ BÀO GỐC

Trong nghiên cứu cơ bản

• Tìm hiểu các tác nhân tham gia vào quá trình xác định hướng biệt hóa của tế bào, Trong quá trình này sự đóng

mở các gen có vai trò quyết định

• Nắm được cơ chế điều khiển các gen biệt hóa sẽ góp phần quan trọng trong việc phòng và chữa các bệnh do rối loạn chức năng của các gen này ( ưng thư, sự phát

• Là cơ sở cho việc điều khiển một tế bào qua thao tác

Tế bào trị liệu

Bệnh gây nên do rối loạn chức năng tế bào, sự thoái hóa các tế bào mô cơ thể Thay thế các cơ

quan lấy từ cơ thể

khác

Nguồn cung hạn

chế

Kích thích các tế bào đa tiềm năng phát triển thành tế bào chuyên biệt, cấy các tế bào này vào cơ thể

TẾ BÀO TRỊ LiỆU

BM CNSH TV – Khoa CNSH

• Tế bào trị liệu

–Sử dụng tế bào gốc tạo máu:

–Sử dụng tế bào gốc phôi thai:

• Điều trị đái tháo đường

• Tái tạo hệ thống thần kinh bằng tế bào gốc

• Điều trị bệnh lý tim mạch

• Điều trị thực nghiệm bằng gen

–Tế bào gốc tạo máu có tác dụng điều trị nhiều

bệnh ung thư khác: ung thư phổi, tuyến tiền liệt, ung thư vú… có khả năng chống khối u, tế bào bệnh lý

SỬ DỤNG TẾ BÀO GỐC THAI

BM CNSH TV – Khoa CNSH

• Sử dụng tế bào gốc bào thai: điều trị các bệnh của

bệnh tim mạch, bệnh sưng khớp.

– Bệnh đái tháo đường: tế bào gốc có thể sinh ra tế

– Parkinson: tế bào gốc biệt hoá thành tế bào sản xuất

– Tim mạch: Thay thế tế bào cơ tim tổn thương: tế bào gốc sẽ phát triển thành tế bào nội mạc mạch máu và

tế bào cơ trơn tạo thành mạch máu đây là hai loại tế

Thần kinh-Neural Võng mạc-Retinal

Xương-Bone Sụn-Cartilage Biểu mô -Epithelial

Ví dụ bệnh tiểu đường

Nhân bản vô tính động vật thành công đã chứng minh đƣợc tính toàn năng của tế bào động vật.

thành một cơ thể trưởng thành, có 2 quá trình diễn ra song hành:

Sinh trưởng

là quá trình tăng không thuận nghịch số

lượng và kích thước tế bào: từ 1 tế bào

ban đầu chúng sẽ phân chia nguyên

nhiễm liên tiếp: 1 tế bào  2 tế bào 

4 tế bào  8 tế bào  16 tế bào

.vv… 200 tỷ tế bào Cơ thể con

người có tới 200 tỷ tế bào nhưng gần

như tất cả đều có số lượng và chất

lượng gen giống nhau

Phát triển

là quá trình biến đổi về chất trong tếbào dẫn tới sự thay đổi về hình thái,chức năng của tế bào Qúa trình nàythực chất là sự biến đổi các tế bàophôi sinh ban đầu giống nhau thànhcác tế bào chuyên hóa của các mô

cơ quan khác nhau Thí dụ như tếbào thận, tế bào gan, tế bào máu…

Qúa trình này còn được gọi là biệt hóa hay phân hóa.

SỰ PHẢN BIỆT HÓA

Thực vật

khi nuôi cấy mô tế bào trong môi

trường nhân tạo, từ các tế bào đã phân

hóa như ở mô lá, mô thân lại có thể

phản phân hóa trở về dạng tế bào ban

đầu rồi từ đấy lại phân hóa tiếp tục theo

vú (tế bào thân thể đã biệt hóa) đã chức minhđược tế bào động vật còn có khả năng phản phânhoá

là sự trở về trạng thái phôi sinh của các tế bào đã biệt hoá rồi từ đấy lại tái

biệt hóa theo định hướng khác

TÍNH TOÀN NĂNG Ở TẾ BÀO ĐỘNG VẬT BẬC CAO

Ngày nay

1997 (cừu Dolly)

Trước 1997 tế bào phôi ở giai đoạn sớm tế bào hợp tử

Năm 1997, J.Wilmus và cộng sự Viện Roslin

đã tạo ra chú cừu Dolly.

Thành công này khẳng định học thuyết về tính toàn năng của tế bào không chỉ thể hiện ở thực vật mà còn ở cả động vật.

Hiện nay việc ứng dụng tính toàn năng của tế bào động vật thông qua sử dụng tế bào gốc trong y sinh học trị liệu – hướng mới trong

HIỆN TƢỢNG NHÂN BẢN VÔ TÍNH TRONG TỰ NHIÊN

Nảy chồi:Thủy tức

Phân mảnh:hải quì, giun đốt

Tái sinh: Sao biển,

Trinh sản: ong, thằn lằn kỳ giông

Mẫu sinh: cá

Phụ sinh: cá

Trinh sản giả: (trứng chỉ chứa vật chất di truyền từ mẹ)

3.3.4.THÀNH TỰU CỪU DOLLY

Do nhóm nghiên cứu J Wilmut,

A.E Schnicke, J.Mc Whir, A.J

Kind và K.H.S Campbell công bố

QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN BẢN CỪU DOLLY

BM CNSH TV – Khoa CNSH

• Lấy nhân của tế bào thƣợng bì tuyến vú của con cừu Dorset cho dung hợp vào

tế bào trứng đã loại bỏ nhân (1n) của một cừu khác (cừu Black face –mặt đen)hình thành nên tế bào trứng chứa nhân tế bào soma (2n)

• Nuôi cấy tế bào trứng này cho phát triển thành phôi

• Sau đó cấy vào tử cung của một cừu khác (mặt đen) để “chửa” hộ

• Sau 5 tháng cừu cái này đã sinh ra cừu con và đƣợc đặt tên là Dolly có các đặcđiểm giống hệt nhƣ cừu cho nhân (Dorset –mặt trắng)

ChuÈn bÞ  Dung hîp  Ph©n bµo  Nu«i ph«i  CÊy ph«i  Sinh con nh©n b¶n

3.3.5 CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG KỸ THUẬT TẠO DÕNG VÔ TÍNH

BẰNG CHUYỂN NHÂN 2n

BM CNSH TV – Khoa CNSH

•Bước 3: Chuyển tế bào cho nhân vào tế bào trứng đã khử nhân

•Bước 4: Dung hợp 2 tế bào

CÁC BƯỚC CƠ BẢN TRONG KỸ THUẬT TẠO DÒNG VÔ TÍNH BẰNG CHUYỂN NHÂN 2n

3.3.6.MỘT SỐ THÀNH CÔNG VỀ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT

July 1998

cloned calves Cloned

mouse Cloned mule

MỘT SỐ THÀNH CÔNG VỀ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT

BM CNSH TV – Khoa CNSH

December 2001 Five cloned female piglets, named

Noel, Angel, Star, Joy and Mary December 2001

The world's first cloned kitten,

named Cece

MỘT SỐ THÀNH CÔNG VỀ NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT

- Tháng 11.2008, các nhà khoa học Nhật Bản đã thành công trong việc tạochuột sống từ mẫu chuột chết cách đó 16 năm

Chó ngùa nh©n b¶n

Prometea

H-¬u Dewey ®-îc nh©n b¶n vµo th¸ng 05/2003 t¹i Mü

Lîn Millie, Christa, Alexis, Carel vµ Dotcom ®-îc sinh vµo ngµy 05/05/2000 qua nh©n b¶n sö dông c¸c tÕ bµo tr-ëng thµnh.

MÌo "Carbon Copy" (03/2002)

¶nh MÌo Tabouli vµ Baba Ganoush ®-îc nh©n b¶n b»ng c¸ch chuyÓn nhiÔm s¾c

thÓ (05/2004)

• 2001 – Cat cloned

“CC” Carbon Copy

NHÂN BẢN ĐỘNG VẬT Ở VIỆT NAM

BM CNSH TV – Khoa CNSH

 Từ 2006 đến nay, Viện công nghệ sinh học bước đầu thành công trong tạo phôi vô tính một số loài vật nuôi và động vật hoang dã, quý hiếm (chuột, trâu, bò nhà, bò tót, gấu, khỉ và sao la).

3.3.7.HẠN CHẾ CỦA NHÂN BẢN VÔ TÍNH ĐỘNG VẬT

- Tỷ lệ sống thấp

- Con vật mang thai có thể gặp

nguy hiểm

- Tuổi thọ ngắn

- Xác suất thất bại cao

Gần đây người ta đã phát hiện có

sự thoái hoá telomer (các trình tự

cuối của nhiễm sắc thể có tác dụng

như “mũ bảo vệ” cho chuỗi ADN)

-theo hướng ngắn dần khi cơ thể

già hoá Khi toàn bộ telomer bị tiêu

huỷ, nhiễm sắc thể sẽ bị hỏng, cơ

thể dễ dàng nhiễm bệnh và chết.

Người ta đã xác định được độ dài

telomer của cừu Dolly ngắn hơn

Con vật Cừu Dolly Chó Snuppy

Hiệu suất 277 trứng

29 phôi 3 con cừu và duy nhất Dolly sống sót

1095 phôi

123 con chó cái mang thai hộ

3 con có chửa (1 chó con chết ngay sau sinh, 1con chết sau 22 ngày , còn sống sót 1 con tên Snuppy)

Sinh lý Lão hóa sớm,

mắc bệnh viêm phổi…

Viêm phổi,

Tuổi thọ 7 năm

ỨNG DỤNG CỦA TẠO DÕNG VÔ TÍNH ĐỘNG VẬT

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Nhân dòng các nguồn gen quí hiếm

Mô hình nghiên cứu về gen của người

Mô hình nghiên cứu quá trình biệt hóa của tế bào

Bioreactor: sản xuất sản phẩm trị liệu

Dị ghép:

Liệu pháp tế bào

Hỗ trợ sinh sản…

3.4 KỸ THUẬT CHUYỂN GEN VÀO ĐỘNG VẬT

3.4.1 KHÁI NIỆM

Kỹ thuật chuyển gen là kỹ thuật đƣa một hay nhiều gen lạ đã đƣợc thiết kế ở dạng DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ của động vật làm cho gen lạ có thể tồn tại ở dạng plasmit tái tổ hợp hoặc gắn vào bộ gen tế bào chủ Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein đặc trƣng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen

Đối với các thể nhân chuẩn, việc chuyển gen đƣợc xem là thành công khi gen chuyển vào đƣợc tổ hợp vào genom của tế bào chủ, đặc tính của gen chuyển nạp đƣợc duy trì ổn định qua các thế hệ con cháu

3.4.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP CHUYỂN GEN VÀO ĐỘNG VẬT

BM CNSH TV – Khoa CNSH

Phương pháp chuyển gen trực tiếp :

– Chuyển gen nhờ phốt phát canxi

– Chuyển gen nhờ xung điện

– Chuyển gen nhờ vi tiêm

– Chuyển gen nhờ liposom

– Chuyển gen nhờ tinh trùng

Phương pháp chuyển gen gián tiếp: nhờ

virus

Chuyển gen nhờ phốt phát canxi

ngƣng kết (coprecipitate) giữa canxi phosphat và DNA sẽ đƣợc hình thành, phức hợp này sẽ đƣợc các tế bào động vật có vú tiếp nhận khi nuôi cấy, kết quả là có sự thể hiện

Kỹ thuật này có thể sử dụng để đƣa bất kì DNA vào tế bào động vật có vú với mục đích các test thể hiện chuyển nạp

Chuyển gen nhờ xung điện

Máy electroporation thường được lắp đặt một công suất ổn định (và

cả thời gian gây xung ổn định) với các điện thế biến đổi từ 500-1500 v/cm Đối với hầu hết tế bào, sự thiết lập như vậy đảm bảo 20-50%

số tế bào còn sống sau khi thực nghiệm chuyển DNA.

Quá trình chuyển gen nhờ electroporation được thực hiện ở nhiệt

độ phòng còn các tế bào được gi? liên tục trong đá để kéo dài thời gian mở lỗ các tế bào.