công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp phương pháp và ứng dụng công nghệ sinh học vi sinh và môi trường

I.Khái niệm chung về CNSH vi sinh vật 1.1.KHÁI NIỆM  Là ngành công nghệ nhằm khai thác tốt nhất khả năng của vi sinh vật, tạo ra được điều kiện để vi sinh vật hoạt động với hiệu suất c

CHƯƠNG V

PHƯƠNG PHÁP VÀ ỨNG DỤNG CỦA CÔNG NGHỆ SINH HỌC VI

I.Khái niệm chung về CNSH vi

sinh vật

1.1.KHÁI NIỆM

 Là ngành công nghệ nhằm khai thác tốt nhất khả năng của

vi sinh vật, tạo ra được điều kiện để vi sinh vật hoạt động với hiệu suất cao nhất phục vụ việc làm tăng của cải vật chất của xã hội, đáp ứng nhu cầu của con người và cân

bằng sinh thái môi trường

 Công nghệ sinh học vi sinh được phát triển trên cơ sở các kiến thức về giới vi sinh vật cũng như các kỹ thuật và quy trình công nghệ đặc trưng

 Đây là bộ phận lớn nhất, ra đời sớm nhất, có quá trình

phát triển lâu dài và doanh số lớn nhất của CNSH Đến nay doanh số của lĩnh vực này đạt gần 100 tỷ dola/năm

1.2.Khả năng ứng dụng của

1.2.2.Trong nông nghiệp

 Sản xuất phân bón vi sinh vật

 Sản xuất thuốc bảo vệ thực vật

 Sản xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật, động vật

 Sản xuất chế phẩm xử lý thức ăn chăn nuôi gia súc, gia cầm, nuôi trồng thuỷ sản

 Sản xuất chế phẩm xử lý phế thải của sản xuất nông nghiệp

 …

1.2.Khả năng ứng dụng của

1.2.3.Trong công nghiệp và năng lượng

 Chế biến, bảo quản lương thực, thực phẩm,

đồ uống…

 Sản xuất cồn sinh học

 Sản xuất khí gas sinh học

 Chế phẩm vi sinh tong thăm dò, khai thác khoáng sản

1.2.Khả năng ứng dụng của

1.2.4.Trong bảo vệ môi trường

 Chỉ thị vi sinh vật môi trường

 Chế phẩm vi sinh vật xử lý chất thải, phế thải, nước thải làm sạch môi trường

1.3.KHÁI QUÁT VỀ PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT THƯƠNG MẠI SỬ DỤNG VI SINH VẬT

(Phương pháp lên men công nghiệp)

1.3.1 Khái niệm

 Lên men (Fermentation) là các quá trình

biến đổi do vi sinh vật thực hiện trong điều

kiện kị khí hay hiếu khí nhằm tích luỹ các sản phẩm trao đổi chất hữu ích cho con người

 Lên men với quy mô lớn: 10- 106lit thường

được gọi là lên men công nghiệp.

 Công nghiệp lên men được hình thành từ cuối thế kỷ 19 và phát triển mạnh mẽ Đến nay

doanh số của lĩnh vực này đạt gần 100 tỷ

dola/năm

1.3.2 Ưu thế của vi sinh vật

công nghiệp

 Nhờ kích thước nhỏ, vi sinh vật có tỷ lệ bề mắt/thể tích lớn nên hấp thu dinh dưỡng nhanh và đồng hoá ở tốc độ cao

 Nguồn nguyên liệu ban đầu cho sản xuất đơn giản, rẻ

 Vi sinh vật thích ứng với nhiều loại môi trường và điều kiện nuôi cấy khác nhau

 Chúng có thể thực hiện nhiều phản ứng hoá sinh khác

nhau nên đễ dàng biến đổi sản phẩm cuối của quá trình

sản xuất

 Dễ dàng dùng kỹ thuật di truyền để tạo nòi, chủng mới

mang đặc tính mong muốn và tăng sản lượng sản phẩm

1.3.3 Các kiểu lên men và

nhu cầu oxy

 Lên men bề mặt (lên men tĩnh) có hai

1.3.3 Các kiểu lên men và

 Lên men chìm:tế bào vi sinh vật được nuôi chìm trong môi trường lỏng Có hai cách:

 Nuôi cấy lắc:thường dùng trong phòng thí nghiệm và môi trường được khuấy trộn nhờ máy lắc tạo điều kiện thuận lợi cho sự hoà tan oxy trong dịch lỏng.Nếu môi trường nuôi chỉ chiếm 10-20 % thể tích bình có thể đạt mật độ

tế bào 1-2g khô/lit

 Nuôi trong bioreactor: thường dùng trong sản suất công nghiêp môi trường và tế bào vi sinh được đảo trộn bằng cánh khuấy Khi nuôi cấy quy mô lớn, oxy được cung cấp bằng bơm khí.Cần phải duy trì cung cấp oxy liên tục

trong cả quá trình lên men hiếu khí

1.3.3 Các kiểu lên men và

 Sự phát triển nhanh của tế bào vi sinh vật đòi hỏi lượng lớn oxy hoà tan trong môi trường để có

thể tiếp xúc trực tiếp với màng tế bào

 Nhu cầu trao đổi oxy của vi sinh vật phụ thuộc

đặc điểm tế bào và điều kiện môi trường

nuôi.Nếu nông độ oxy đạt 1mg/l thì nhu cầu oxy của hầu hết tế bào được thoả mãn

 Nếu mức oxy thấp hơn 1mg/l sẽ xảy ra lên men yếm khí

1.3.4.Các công đoạn chính của lên men công nghiệp

 Sau lên men: Tách sinh khối tế bào, tủa, tinh sạch

các chất, thực hiện phản ứng bổ sung để tạo thương phẩm, tinh chế , bảo quản dạng thương phẩm hoàn chỉnh, đóng gói, tận dụng phế liệu…

a) Nguồn dinh dưỡng và

nguyên liệu ban đầu

 Cần tạo môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng của vi

sinh vật hoặc cho sản xuất các sản phẩm mục tiêu

 Môi trường nuôi cấy thường ở dạng lỏng, trong một số

trường hợp có thể sử dụng môi trường rắn

 Trong sản xuất chủ yếu dùng môi trường tổng hợp

Nguyên liệu tạo môi trường ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm

 Thành phần chủ yếu của môi trường lên men gồm: nước, nguồn các bon hữu cơ, nguồn nitơ, các nguyên tố khoáng

và vitamin, các chất phá bọt khí

b) Hệ thống thiết bị

Thiết bị trước lên men gồm :

 Bồn hay bể chứa các cơ chất ban đầu (hàng chục

nghìn m3) là nguyên liệu sản xuất

 Thiết bị làm vụn, nghiền nguyên liệu thô

 Thiết bị xử lý nguyên liệu (đường hoá bột)

 Thiết bị phối trộn nguyên liệu và pha chế môi trường

 Thiết bị khử trùng môi trường (nồi hơi)

 Các thiết bị thường được làm bằng vật liệu chống tác động của hoá chất như inox, thép bọc nhựa epoxy ở

bề mặt tiếp xúc

nhiệt độ, pH, oxy …thoả mãn

điều kiện phát triển tối ƣu của

vi sinh vật nuôi cấy

 Bioreactor phải bảo đảm độ vô

trùng và sử dụng tiết kiệm

nguyên liệu

Sơ đồ bioreactor

Một số loại bioreactor

Bioreactor sản xuất bia Bioreactor ở phòng thí nghiệm

Bioreactor công nghiệp

b) Hệ thống thiết bị (tiếp)

Các thiết bị sau lên men

 Thiết bị tách tế bào: các bồn lắng, máy li tâm, bộ lọc

ép hay lọc chân không…

 Thiết bị phá vỡ tế bào dùng thu nhận sản phẩm nội bào

 Thiết bị cô đặc: làm bay hơi, lọc, màng trao đổi ion, hấp phụ

 Thiết bị kết tinh (dùng cho mỳ chính, axit citric)

 Hệ thống sắc ký dùng tinh chế sản phẩm

 Thiết bị sấy

 Thiết bị bảo quản sản phẩm

c)Vận hành quá trình lên men

Nhân giống

 Khâu đầu của quá trình lên men bằng bioreactor

là tẩy rửa sạch, khử trùng bioreactor và cho môi trường vô trùng vào

 Tiếp theo là cho giống vi sinh vật vào với tỷ lệ 10% tổng khối lượng của môi trường nuôi Để có

1-đủ giống cho bồn lên men lớn cuối cùng người ta

sử dụng một chuỗi các bồn lên men với thể tích tăng dần (sơ đồ sau)

Tiến trình nhân giống thường tiến hành như sau :Ống giống giữ ở nhiệt độ thấp nuôi 10ml nuôi 200ml nuôi 3lit nuôi 30 lit nuôi 300lit và có thể tiếp tục đến hàng chục, hàng trăm khối Thời gian nhân giống nhanh hay chậm phụ thuộc và chủng vi sinh vật sử dụng

c)Vận hành quá trình lên men

Các thông số kỹ thuật của bioreactor

 Sau khi cấy giống phải theo dõi và kiểm soát hoạt động của bioreactor và các

thông số của quá trình nuôi cấy :

 Hàm lượng oxy hoà tan

 Nhiệt độ

 pH tối ưu

 Khuấy trộn đều môi trường nuôi cấy

c)Vận hành quá trình lên men

Các phương thức lên men trong

bioreactor

 Lên men gián đoạn

 Lên men gián đoạn bổ sung

 Lên men liên tục

Lên men gián đoạn

Lờn men giỏn đoạn bổ sung

 Là kỹ thuật trong đó môi

tr-ờng nuôi cấy đ-ợc

cung cấp mới theo chu

kỳ để tổng thể tích môi

tr-ờng không đổi Có

nghĩa là thể tích của môi

tr-ờng t-ơi đ-ợc bổ sung

t-ơng đ-ơng với tổng số

môi tr-ờng cũ đã bị

dùng hết.

Lên men liên tục

 Trong ph-ơng pháp này sau 1

giai đoạn đều đặn cả tế bào và

một phần môi tr-ờng đ-ợc lấy

ra khỏi hệ thống nuôi cấy Sau

đó một l-ợng môi tr-ờng t-ơi

đ-ợc bổ sung để tổng l-ợng

môi tr-ờng vẫn giữ nguyên

nh- ban đầu Phần tế bào còn

lại tiếp tục sinh tr-ởng và lại

tăng số l-ợng

Lợi thế của ph-ơng pháp này là 1 phần sinh khối đ-ợc tái sử dụng khi cấy chuyển

c)Vận hành quá trình lên men

Điều khiển phản ứng sinh học

 Th«ng th-êng qu¸ tr×nh nu«i ph¶i tr¶i qua 2 giai

c)Vận hành quỏ trỡnh lờn men

 Chi phí cho công đoạn này có thể chiếm 50%giá thành sản phẩm hoặc cao hơn

 Tr-ớc hết cần tách n-ớc, sau đó thu đúng sản phẩm mong muốn bằng các ph-ơng

pháp của công nghệ hoá học và công nghệ thực phẩm

II Giới thiệu các nhóm vi sinh vật

2.1 Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật

2.1.1.Vi khuẩn thực (Eubacteria):

 Được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1676

 Chúng thuộc nhóm prokaryote, đa phần là

cơ thể đơn bào, kích thước nhỏ, không có màng nhân

 Một số loài có khả năng tạo bào tử, chịu

đựng và tồn tại thời gian dài trong các

điều kiện bất lợi

II Giới thiệu các nhóm vi sinh vật

2.1 Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật (tiếp)

2.1.2.Vi khuẩn cổ (Archeaa):

 Có khả năng sống trong điều kiện rất khắc nghiệt

 Khác với vi khuẩn thực là vách tế bào không có

peptidoglucan màng tế bào có thành phần lipid

khác thường và polymerase giống với polymerase của Eukaryote nhiều hơn

ARN- Bao gồm:

- Vi khuẩn metan: khử CO 2 bằng H 2 tạo CH 4

- Vi khuẩn chịu nhiệt và axit: chịu nhiệt độ cao hơn 100 0 C hay pH thấp hơn 2

- Các vi khuẩn cực đoan khác: chịu lạnh, chịu muối, chịu áp suất cao

II Giới thiệu các nhóm vi sinh vật

2.1 Giới thiệu chung về các nhóm vi sinh vật (tiếp)

2.1.3.Vi sinh vật thuộc nhóm nhân

II Giới thiệu các nhóm vi sinh vật

2.2 Các nhóm vi sinh vật công nghiệp chủ yếu

2.1.Vi khuẩn lactic

 Là vi khuẩn Gram dương, hình que,

không bào tử Có thể phân biệt 2 loại: vi khuẩn lên men lactic đồng hình và dị

hình

 Nhóm đồng hình gồm các loài: L.casei, L platarum, L.delbrueckii ssp bulgaricus, L.helveticus, Streptococcus

thermophilus, chúng tạo sản phẩm chủ yếu là axit lactic Các chủng sản xuất

trong công nghiệp thuộc loại này

 Nhóm dị hình sản sinh axit lactic và một

số sản phẩm phụ khác như axit acetic,

ethanol, CO2 Chúng gồm các loài như

L.brevis, L.kefir,…

2.1.Vi khuẩn lactic

 Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển của vi khuẩn lactic chịu nhiệt trung (mesophilic) là 28 – 45 0C và của vi khuẩn lactic chịu nhiệt (thermophilic) là 45 – 62 0C

 Vi khuẩn lactic có nhu cầu dinh dƣỡng phức tạp:

vitamin, amino axit và thậm chí là các peptit Nguồn carbon: glucose, fructose, lactose, maltose và

sucrose một vài chủng nhƣ: Lactobacillus

amylọhylus và Lactobacillus amylovorus

 Các chủng chính dùng trong sản xuất: L delbrrueckii ssp bulgaricus và L bulgaricus

 Là vi khuẩn Gram âm, hình que, di động nhờ roi ở đầu và không có bào tử Chúng sống dị dƣỡng, không quang hợp hay cố định nitơ

 Ứng dụng

 Pseudomonas hiếu khí tích luỹ polyester

polyhydroxybutyrate (PHB) Chủng tạo PHB chủ yếu là

P.oleovorans và Alcaligenes eutropus

 Sản xuất protease chịu nhiệt và lipase Lipase P của P fluorescens và lipase CC của Candida cilindrica đƣợc dùng nhiều nhất

 Một số chủng dùng trong sản xuất công nghiệp acrylamid

 Phân giải các hợp chất xenobiotic, đặc biệt là các hợp chất

bị halogen hoá, thuốc diệt cỏ, plastic, dung môi và các chất tẩy nhờn

 P putida tạo các alcohol có hoạt tính quang học từ cơ

chất achiral hoặc racemic… trong sự biến đổi axit

isobutyric thành axit (S) β- hydroxybutyric

 Là vi khuẩn Gram dương, hình que, có khả năng tạo nội bào tử, chịu nhiệt, hiếu khí Có khoảng 150 loài cực đoan: chịu nhiệt, chịu lạnh, ưa kiềm , ưa axit Một số loài có thể thực hiện chuyển hoá sinh học

 Ứng dụng chủ yếu:

 Sản xuất thực phẩm lên men từ đậu tương “itohiki-natto” với sản lượng 108 kg/năm bằng B natto (B.subtilis)

 Thuốc trừ sâu sinh học B thuringensis

 Sản xuất α-amylase chiụ nhiệt : B

licheniformis và B.amyloliqueciens

 Sản xuất serin protease subtilin trong bột giặt: B alcalophilus

 Là vi khuẩn Gram dương, không hình thành bào tử, sinh trưởng chậm và cần môi trường giàu dinh có bổ sung biotin

 C.glutamicum:Sản xuất axit glutamic

 C.glutamicum đột biến: Sản xuất lysin

do con đường điều hoà sinh tổng hợp nhóm amino axit aspartat (L-Lysin, L-Threonin, L-Methionin, L-isoleucin)

đơn giản hơn so với E.coli

2.5.Xạ khuẩn Stretomyces

 Là vi khuẩn Gram dương, tế bào dạng

sợi, khuẩn lạc có tia, ưa nhiệt

 Các ứng dụng:

 Sản xuất hơn 90% loại kháng sinh hiện

dùng

 Sản xuất nhiều enzym như hydrolase

nên có thể phân giải các hợp chất :

lignocelulose, polyphenol, chitosan,

keratin, pectin…

 Sản xuất một số chất diệt cỏ, chất diệt

côn trùng

 Spirunella : vi khuẩn lam, dùng sản xuất

sinh khối để cung

cấp protein đơn bào

2.7.Vi nấm

Nấm men

 Saccaromyces

cerevisiae : dùng rộng rãi trong công nghệ

lên men rƣợu

 Candida torula : dùng trong sản xuất protein

và sắc tố

2.7.Vi nấm:

Nấm mốc Aspergillus

 Dùng phổ biến là các loài

A.oryzae, A niger để sản xuất các loại enzym

2.7 Vi nấm

Nấm mốc

 Mucor miehei và Mucor pusilus sản sinh enzym thay thế renin làm đông

tụ sữa để chế biến

phomat

2.8 Vi tảo

 Dùng sản xuất protein đơn bào:

2.3.Các phương pháp chọn

tạo giống vi sinh vật

 Sàng lọc các chủng năng suất cao từ tự nhiên: rất tốn thời gian và công sức

 Chọn giống đột biến: thu nhận kết quả nhanh, VSV sản sinh lượng chất lớn hơn rất nhiều so với nhu cầu tế bào, thậm chí lớn hơn nhiều lần khối lượng khô của chúng

 Tạo giống nhờ kỹ thuật di truyền: đầu tiên là cải biến E.coli, nấm men để sản xuất protein tái tổ hợp và sau đó là tạo VSV chuyển gen sản xuất các hợp chất khác

III Các sản phẩm của vi sinh vật

 Enzym vi sinh vật: hàng loạt các enzym dùng trong công nghiệp thực phẩm, dƣợc phẩm, mỹ phẩm…

 Các sản phẩm trao đổi chất: rƣợu, axit amin, axit

hữu cơ, vitamin…

III Các sản phẩm của vi sinh vật

 Các sản phẩm chuyển hoá sinh học: các

steroit, vitamin C, acrylamid…

 Các sản phẩm tái tổ hợp gen: các protein

tái tổ hợp

 Các biopolymer và biosurfactant:các

polysaccarit ngoại bào (xanthan, alginat,

gellan, cellulose) các chất hoạt động bề mặt (chất nhũ hoá, tạo gel, tạo bọt…)

3.1.Sản xuất protein từ vi sinh vật tái tổ hợp

Nguyên lý:

 Tách dòng các gen mã hoá cho các protein cần sản

xuất (hoc môn tăng trưởng, insulin, interferon, …)

 Gài các gen này vào các vectơ biểu hiện thích hợp

và chuyển các vectơ tái tổ hợp vào tế bào vi sinh vật (vi khuẩn, nấm men…)

 Nhân dòng và tạo sinh khối các vi sinh vật mang gen nêu trên bằng công nghệ lên men để chúng sản xuất các proteintái tổ hợp

 Tách chiết, tinh sạch protein tái tổ hợp từ dịch nuôi

cấy và sinh khối vi sinh vật chuyển gen

Vớ dụ:

sản xuất hoc mụn tăng trưởng

 Tách chiết mRNA - GH từ các tế bào tuyến yên đang hoạt động.

 Tổng hợp phân tử DNA bổ sung (cDNA) nhờ enzyme phiên mã ng-ợc (reverse transciptase) và DNA-

Sơ đồ công nghệ protein tái tổ hợp

3.2.Sản xuất vắc xin

Vắc xin cổ điển :

 Vắc xin vi khuẩn chết: ho gà, sốt thương hàn

 Vắc xin vi khuẩn bất hoạt: Bạch hầu, uốn ván

 Vắc xin virus chết: bại liệt, quai bị, sởi, sốt vàng da, rubella

 Vắc xin virus bất hoạt: cúm

Vắc xin tái tổ hợp:

Xem phần vắc xin tái tổ hợp trong chương 3

Ví dụ:quy trình

sản xuất vắc xin tả uống

Vắc xin tả điều chế từ phẩy khuẩn tả (Vibrio cholerae hay Kommabacillus) là vắc xin toàn thân vi khuẩn đã được bất hoạt bằng formalin hay nhiệt độ.

Quy trình sản xuất vắc xin tả uống gồm các bước sau:

-Lựa chọn chủng sản xuất (4 đơn chủng tả)

-Nhân chủng lần 1 và 2 trên môi trườn hạch máu

-Nhân chủng lần 3 bằng nồi lên men 50 lit

-Nuôi chủng thu sinh khối bằng nồi lên men 200-300 lit

-Bất hoạt chủng bằng formalin hay nhiệt độ

-Thu cặn đơn chủng bằng lọc hay li tâm

-Pha vắc xin thành phẩm: hỗn hợp 4 chủng theo công thức

-Đóng ống, đóng hộp, dán nhãn

2.3 Sản xuất axit amin

 Axit amin được dùng rộng rãi làm chất dinh

dưỡng, tăng hương vị, chống oxy hoá…Hàng năm sản xuất khoảng 800.000 tấn axit amin với giá trị

5 tỷ đôla, trong đó 50% là axit glutamic

 Dùng công nghệ lên men để sản xuất axit amin có lợi thế:

 Hầu hết axit amin ở dạng L

 Ít tốn kém về đầu tư trang thiết bị

 Nguyên vật liệu dùng trong sản xuất rẻ tiền nên hạ

được giá thành