công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp các kỹ thuật nền của CNSH hiện đại

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI 10 TIẾT  Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn  Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dònggen  Các phương pháp lai phân

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dònggen

 Các phương pháp lai phân tử

 Phương pháp PCR, ứng dụng

 Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

Kiến thức ôn tập

• Cấu trúc phân tử DNA

Thành phần cấu tạo của DNA- các bazơ

Purines Pyrimidines

[structure of deoxyadenosine]

Nucleoside

Nucleotide

ii) Structure of the DNA double helix

5’

Cấu trúc của chuỗi DNA

polynucleotide

DNA  RNA  Protein  Function

Học thuyết trung tâm “The Central Dogma”

Transcription

Replication

Translation

Work

Phân loại Gene

coding genes non-coding genes

ribosomal RNA

otherRNA

Chromosome

(simplified)

intergenic region

2.1 ENZYME GIỚI HẠN (RESTRICTION ENZYME - RE)

• 1950s: một số dòng vi khuẩn có khả năng chống lại sựxâm nhiễm của một số bacteriophages.

• 1962: phát hiện các vi khuẩn này có chứa hệ thốngenzyme có khả năng nhận biết và phá huỷ DNA củaphage, đồng thời có khả năng tự biến đổi DNA của bảnthân để tránh bị phá huỷ

• 1970s: Haminton Smith (Johns Hopkins University), Phát

hiện được enzyme HindII từ Haemophilus influenzae: có

khả năng cắt đặc hiệu đồng thời tự methyl hoá DNA của

tế bào chủ để tự bảo vệ

Lịch sử phát hiện

Restriction Endonucleases

Tại sao DNA của vi khuẩn không bị phá hủy bởi chính các enzyme cắt

giới hạn của chúng?

Sự Methyl hóa (Methylation)

• Loại I : cắt tại điểm cách vị trí giới hạn khoảng 1000-5000 nucleotide

• Loại II : cắt ngay tại vị trí giới hạn.

• Loại III : cắt ở vị trí cách vị trí giới hạn đó khoảng 20 nucleotide.

Phân loại các RE

Genus (Tên chi)

Species (Tên loài)

Đặc điểm của trình tự nhận biết của RE loại II

Don't nod Dogma: I am God Never odd or even Too bad – I hid a boot Rats live on no evil star

No trace; not one carton Was it Eliot's toilet I saw? Murder for a jar of red rum Some men interpret nine memos Campus Motto: Bottoms up, Mac

Go deliver a dare, vile dog! Madam, in Eden I'm Adam Oozy rat in a sanitary zoo

Ah, Satan sees Natasha

Trình tự nhận biết là các

palindrome Đây là đoạn DNA

mạch kép, 2 mạch bổ sung có

trình tự giống nhau khi đọc theo

cùng chiều 5’3’ hoặc ngược lại

Nếu giả thiết trình tự sắp xếp của các loại base là ngẫunhiên thì xác suất để một đoạn trình tự đƣợc nhận biết sẽ

là 1/4 n (n là chiều dài (bp) của chuỗi đƣợc nhận biết).

Ví dụ một số RE loại II

• Tạo DNA tái tổ hợp

• Lập bản đồ giới hạn

Ứng dụng của RE loại II trong công nghệ gen

• DNA tái tổ hợp là các DNA được tạo thành

từ ít nhất hai đoạn DNA có nguồn gốc khác

nhau thông qua vi thao tác của con người

• Nếu như 2 (hay nhiều) DNA đều được cắt

bởi cùng một loại enzyme thì các đầu cắt

của các đoạn DNA được tạo ra hoàn toàn

khớp nhau (tương ứng theo quy tắc bổ

sung) gọi là các đầu dính và chúng rất dễ

dàng gắn lại với nhau khi có mặt enzym

ligase Từ đây xuất hiện khả năng ghép nối

các DNA có nguồn gốc khác nhau để tạo

nên DNA tái tổ hợp

Tạo DNA tái tổ hợp

Ligase

Bản đồ giới hạn

• Là bản đồ thể hiện loại enzyme giới hạn, số lượng

giới hạn.

• Một phân tử khi sử dụng các loại enzyme khác

• Được sử dụng trong xác định nguồn gốc hoặc sự

Phương pháp lập bản đồ giới hạn

• Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu và thực hiện PCR tạo ra một lượng DNA cần thiết.

• Lựa chọn các enzym giới hạn thích hợp, xử lý

• Điện di kết quả trên gel agarose cùng với thang

Sử dụng enzym 1 để cắt đoạn

tỏ enzym 1 có 2 vị trí cắt trên đoạn ADN nhưng chưa rõ đoạn

bằng enzym 2, kết quả cho 2 đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ

hợp hai enzym 1 và 2 cho thấy

VÍ DỤ VỀ LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN

Restriction enzyme animation

http://www.dnai.org/b/index.html