công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp kỹ thuật xác định trình tự DNA

Khái niệmXác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA... • Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàntoàn đặc trưng cho từng p

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

Giảng viên hướng dẫn: ……

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

1 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

2 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen

3 Các phương pháp lai phân tử

4 Phương pháp PCR, ứng dụng

5 Kỹ thuật xác định trình tự DNA

6 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

BM CNSH TV – Khoa CNSHBM-CNSHTV

KỸ THUẬT XÁC ĐỊNH

TRÌNH TỰ DNA

Khái niệm

Xác định trình tự DNA là phương pháp xác định trật

tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA.

BM-CNSHTV

Các mốc giải mã hệ gen của các sinh vật khác nhau

Cho đến nay, hệ gen của hơn 100 tổ chức sinh vật

đã đƣợc giải mã trình tự

Phương pháp Maxam-Gilbert

• Là phương pháp phân giải hóa học

• Sử dụng hóa chất để phân hủy

DNA ở các vị trí base đặc hiệu

tạo ra các đoạn có chiều dài khác

nhau

Walter Gilbert

 Dimethyl sulfat methyl hóa G.

 Axit formic pH=2 gây biến đổi và loại A + G.

 Hydrazin gây biến đổi tại C và T.

đổi tại C.

 Piperidine được dùng để loại bỏ các

base sau khi bị biến đổi và cắt mạch.

Các loại hóa chất sử dụng

BM-CNSHTV

G Dimethylsulphate Piperidine Piperidine

A+G Acid Acid Piperidine

C+T Hydrazine Piperidine Piperidine

C Hydrazine + alkali Piperidine Piperidine

A>C Alkali Piperidine Piperidine

G C T G C T A

A T

C T

G

CH 3

T C

T C

T C

T C

• Các chất hoá học dùng để cắt mạch đơn không hoàntoàn đặc trưng cho từng phản ứng riêng biệt, phản ứngphụ sẽ diễn ra ảnh hưởng đến kết quả của sản phẩm cắt.

• Đây là phương pháp xác định trình tự trực tiếp của DNA, do

đó số lượng DNA mẫu cần dùng là rất lớn, nếu lượngmẫu ban đầu ít thì các băng điện di kết quả bằng phóng xạ

tự ghi bị mờ, không rõ ràng, khó đọc chính xác

• Phản ứng đòi hỏi DNA mẫu hoàn toàn là mạch đơn, dovậy phải phân tách DNA thành các sợi đơn trước khi tiếnhành xác định trỡnh tự

• Chỉ áp dụng xác định trình tự đoạn gen tương đối ngắn,khoảng 250 bp

Hạn chế của phương pháp

Maxam- Gilbert

Phương pháp Sanger (chain termination or dideoxy method)

•Phương pháp enzyme

•Nguyên tắc hoạt động: trình tự của một sợi DNA đơnđược xác định dựa vào hoạt động của enzyme DNApolymerase trong quá trình tổng hợp sợi DNA bổ sung.Các sợi DNA được tổng hợp mới này được kết thúc tạicác vị trí đặc hiệu

•DNA polymerase xúc tác gắn các Nu vào mạch đơnđang tổng hợp ở vị trí 3'OH, khi gặp nucleotid không

có nhóm 3'OH, phản ứng tổng hợp bị dừng lại

• Nhân tố kết thúc đặc hiệu được sử dụng là các

dideoxynucleotide (phương pháp dideoxynucleotid)

Cho phép kéo dài mạch ở đầu 3’ Ngăn cản sự kéo dài mạch ở đầu 3’

BM-CNSHTV

Sự kéo dài mạch DNA

khi xuất hiện ddNTP BM-CNSHTV

Có 4 ống hỗn hợp phản ứng, mỗi ống chứa các thành phần như sau:

− DNA khuôn mạch đơn

− Mồi được tổng hợp hóa học (có thể đánh dấu phóng xạ)

DNA khuôn và mồi

Các đoạn kết thúc bằng ddT

Phân tách mạch mới được tổng hợp ra

khỏi mạch khuôn

Lớn nhất

Nhỏ nhất

Chia thành 4 ống phản ứng

VD bản gel điện di xác định trình tự theo phương pháp Sanger

Bài tập tại lớp

Cho biết thông tin về trình tự DNA thông qua bản gel điện di bên

BM-CNSHTV

• Tính ổn định cao, có thể tiến hành với quy mô lớn.

• Phản ứng không phụ thuộc vào tính đặc trưng

phụ.

• Nếu kết hợp dùng với phản ứng PCR thì chỉ cần lượng DNA mẫu nhỏ, đồng thời có thể giảm được ảnh hưởng của DNA cấu trúc bậc 2.

• Xác định được trình tự đoạn gen tương đối dài, khoảng 300 ~ 400 bp.

Ưu điểm của phương pháp Sanger

Xác định trình tự DNA tự động

Nguyên lý:

• Hoạt động trên cơ sở của phương pháp Sanger Nhưng :

• Quá trình tổng hợp DNA thực hiện nhờ kỹ thuật PCR

• Các chất đánh dấu phát huỳnh quang được đưa vào mạch DNA tổng hợp mới nhờ sử dụng các mồi được gắn chất đánh dấu phát huỳnh quang ở đầu 5’ hoặc các ddNTP được gắn chất phát huỳnh quang

• Hệ thống xác định trình tự DNA phát hiện sự phát huỳnh quang từ

4 chất nhuộm khác nhau được sử dụng để phân biệt A, C, G và T trong các phản ứng kéo dài Mỗi chất nhuộm hấp thu ánh sáng ở các bước sóng ở bước sóng khác nhau Có 4 màu và do đó 4 loại base có thể được phát hiện và phân biệt được với nhau Máy

cũng như hệ thống phần mềm sẽ thu nhận thông tin về màu sắc

và từ đó chuyển đổi sang thông tin về trình tự của DNA

• Đọc kết quả điện di tự động nhờ tia laze và phần mềm xử lý số liệu

• Chuẩn bị DNA khuôn

• Nhân DNA bằng PCR

• Nạp sản phẩm PCR vào máy giải trình tự sequencer, chạy máy

• Phân tích kết kết quả từ các dữ liệu do

máy cung cấp, so sánh kết quả đọc trên hai mạch và đồ thị.

Các bước tiến hành

BM-CNSHTV

Bigdye terminator

Sequencing với BigDye terminator

BM-CNSHTV

Điện di gel

Điện di mao quản

BM-CNSHTV

Điện di gel

Applied Biosystems PRISM

377

(Gel, 34-96 lanes)

Điện di mao quản

Applied Biosystems PRISM 3700

(Capillary, 96 capillaries)

Sequencing (Sanger) – kết quả

BM-CNSHTV

Xác định trình tự thế hệ mới

BM-CNSHTV

Pyrosequencing là một phương pháp xác định trình tự DNA dựa trên nguyên lý đọc trình tự qua "tổng hợp“ dựa vào khả năng phát hiện sự giải phóng pyrophosphate mỗi khi một nucleotide được gắn vào mạch.

tính của DNA polymerase với một enzym phát quang (chemiluminescent.)

- Về bản chất, phương pháp cho phép đọc trình tự của một sợi đơn của DNA bằng cách tổng hợp sợi bổ sung dọc theo nó, và phát hiện những bazơ đã thực sự được gắn vào ở mỗi bước Các mẫu DNA được cố định, và các dung dịch của A, C, G, và T nucleotide được thêm vào và bỏ đi sau mỗi phản ứng một cách tuần tự.

Pyrosequencing

 Việc thêm một nucleotid vào đầu cuối của sợi là có thể nhận biết bởi nó được kèm theo sự giải phóng một phân tử pyrophosphate, là phân tử sau đó được chuyển hóa thành tín hiệu phát sáng nhờ enzyme sulfurylase Ánh sáng sản xuất bởi phản ứng xúc tác luciferase-được phát hiện bởi một máy ảnh và phân tích trong một chương trình

 Mỗi dNTP được thêm vào riêng rẽ một cách tuần tự nucleotidase enzyme (apyrase ) cũng có trong thành phần phản ứng nên những dNTP không được gắn vào mạch sẽ được phân hủy trước khi các dNTP tiếp theo được bổ sung.

BM-CNSHTV

Hiện nay, một hạn chế của phương pháp là độ dài của mỗilần đọc chỉ xung quanh 300-500 nucleotide, Điều này có thểlàm cho quá trình lắp ráp bộ gen khó khăn hơn, đặc biệt làcho các hệ gen có chứa một lượng lớn ADN lặp đi lặp lại.

Đến năm 2007, pyrosequencing là phổ biến nhất là sử dụngcho resequencing hoặc đọc trình tự của bộ gen mà hệ gencủa loài họ hàng gần gũi đã hoàn tất

BM-CNSHTV