công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp (1)

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR Ảnh hưởng của thành phần phản ứng  Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng  Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR... Ảnh hưởng của th

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

Giảng viên hướng dẫn: ……

1

BM CNSH TV – Khoa CNSH

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

1 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

2 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen

3 Các phương pháp lai phân tử

Polymerase Chain Reaction

3

Sự phát minh ra kỹ thuật PCR

• Kỹ thuật PCR hay còn được gọi là phản ứng chuỗi trùng hợp polymerase được Kary Mullis phát minh vào năm 1983.

• Hai năm sau (1985), phát minh này được chính thức công bố trên tạp chí khoa học quốc tế.

• Với công trình này, Kary Mullis được tặng giải thưởng Nobel hóa học năm 1993.

“Sự phát minh của kỹ thuật này xứng đáng được coi là một bước ngoặt hay một kỹ thuật mang tính cách mạng thúc đẩy sự phát triển của Công nghệ sinh học hiện đại” (J Watson)

4

Kỹ thuật PCR là một phương pháp cho phép nhân nhanh số lượng lớn một đoạn DNA

5

Khái niệm

Phương pháp này có độ nhạy rất cao và ngày nay đãtrở thành một công cụ nghiên cứu đầu tay trong phầnlớn các phòng thí nghiệm có liên quan đến gen và DNAthuộc các lĩnh vực khoa học sinh học, nông nghiệp, môitrường, y tế, dược phẩm, pháp y …

• Kỹ thuật PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để nhân bản một đoạn DNA nhờ hai đoạn mồi oligonucleotide (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở hai mạch đơn của đoạn DNA.

Kỹ thuật này được phát minh nhờ sự phát hiện

ra Taq polymerase, là một DNA polymerase từ vi

khuẩn Thermus aquaticus sống ở suối nước

nóng

6

Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Sự tái bản DNA trong cơ thể sống

• DNA khuôn : mang trình tự cần nhân

lên

• 2 mồi tổng hợp oligonucleotide

(mồi xuôi và mồi ngược)

• dNTPs : dATP, dTTP, dGTP, dCTP

• Polymerase chịu nhiệt

• Mg2 +: cofactor của enzyme

• Dung dịch đệm : ổn định pH và lực ion

của dung dịch phản ứng cho phù hợp

với hoạt động của enzyme

8

Thành phần của PCR

Có 3 giai đoạn chính trong một phản ứng PCR và

động hóa nhờ Thermo cycler, là thiết bị có khả năng tăng và giảm nhiệt độ của ống phản ứng trong thời gian ngắn.

1 Biến tính (denaturation): hai sợi của chuỗi xoắn kép

được duỗi xoắn và tách nhau rnhờ nhiệt cao (94-95oC)

2 Gắn mồi (primer annealing): Nhiệt độ phản ứng được

giảm xuống (55-50oC) để các mồi gắn vào các sợi DNAtương ứng theo nguyên tắc bổ sung của các base

3 Kéo dài (extension): Phản ứng trùng hợp phân tử DNA

được thực hiện nhờ enzyme DNA polymerase

(65-75oC) để kéo dài mạch tổng hợp theo nguyên tắc bổsung với sợi khuôn từ đầu 3’ – 5

9

Các giai đoạn trong phản ứng PCR

Chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước được lặp đi lặp lại nhiều lần Nhờ vậy, trong vài giờ ta có thể thu được hàng triệu bản copy của một đoạn DNA nào đó,

đủ cho các mục đích thí nghiệm khác nhau

10

Chu kỳ phản ứng PCR

Hçn hîp ph¶n øng PCR G§

Bước 6: 72 o C, 10 min Bước 7: 4 o C f- bảo quản Bước 8: Kết thúc

Thực hiện phản ứng

THERMOCYCLER ống phản ứng PCR

Biến t ính

Gắn mồi

K éo dài

DNA copies vs Cycle number

30 giây

Tách thành sợi đơn DNA (94 o C, 30 giây)

Tổng hợp chuỗi mới (65-75 o C, 2-5 phút)

Khuôn DNA được biến đổi

thành 2 sợi đơn (94 o C, 5 phút

Chu trình PCR

PCR animation

Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR

 Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

 Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

 Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

Ảnh hưởng của DNA khuôn

Độ tinh sạch của DNA khuôn

Không cần tinh sạch lắm

 Cần tránh các chất gây ức chế phản ứng

 Hàm lượng sử dụng: 0.1 – 1 mg cho 100 mL phảnứng

Hàm lượng ít: không đủ cho phản ứng khuếch đại

Hàm lượng cao: sản phẩm không đặc hiệu

Độ dài của trình tự mục tiêu: quá dài có thể dẫn đếnsai sót, hoặc không thực hiện được phản ứng

 Hàm lượng GC của DNA khuôn: liên quan đến sựhình thành cấu trúc thứ cấp

https://www.soils.org/publications/cs/articles/46/3/1064

dạng sợi đôi bền vững với

DNA khuôn trong PCR

 Tính tương thích:Mồi

được dùng như một cặp

nên cần hoạt động được

trong cùng điều kiện PCR

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

Ảnh hưởng của mồi

Độ dài mồi :

Mồi thường có kích thước 18-25 nts.

Kích thước quá ngắn  không đặc hiệu

Kích thước quá dài  giảm hiệu quả lai

Nhiệt độ gắn mồi (Ta- annealing

temperature)

Ta quá cao  mồi khó gắn vào khuôn

Ta quá thấp  mồi bám không đặc hiệu

Ta của mồi xuôi và mồi ngược nên tương đương

Cần xác định Ta lý thuyết, sau đó chạy PCR với gradient nhiệt độ để tìm nhiệt độ gắn mồi tối ưu

Ảnh hưởng của nhiệt độ gắn mồi đến kết quả PCR

http://www.qiagen.com/products/pcr/taqsystem/taqpcrcore.aspx#Tabs=t1

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

Ảnh hưởng của mồi

 Nên nằm trong khoảng 40-60%

 Không nên chứa polyG hoặc polyC  sự bắt cặp không đặchiệu của mồi

 Đầu tận cùng 3’ nên là G hoặc C hoặc GC hoặc CG  tăngkhả năng bắt cặp chính xác (liên kết H của G và C lớn hơn)

 Đầu tận cùng 3’ không nên có nhiều hơn 2 gốc liên tục G/C

 Không nên chứa toàn gốc G hoặc C vì giá trị DG cao

  bắt cặp không đặc hiệu

 Nếu đầu 3’ chứa quá nhiều gốc T hoặc A  khó bắt cặp

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

Ảnh hưởng của mồi

• Cấu trúc thứ cấp: mồi có cấu trúc thứ cấp  PCR giảm hiệu quả, thậm chí không có sản phẩm

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

Ảnh hưởng của mồi

• Các chuỗi lặp

– Mồi không nên chứa nhiều chuỗi lặp kép

– Trong một mồi, chỉ nên có tối đa 4 chuỗi lặp.

• Vùng thiết kế mồi của khuôn

– Vùng thiết kế mồi của khuôn không nên chứa nhiều cấu trúc thứ cấp Cấu trúc này mà ổn định ở nhiệt độ gắn mồi  mồi không bắt cặp được

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

Ảnh hưởng của mồi

 Nồng độ mồi

 Nồng độ mồi quá thấp  khả năng gắn mồi

có sản phẩm.

 Nồng độ mồi quá cao  mồi bắt cặp không

 Độ tinh sạch

chế PCR và các DNA tạp nhiễm khác.

Ảnh hưởng của thành phần phản ứng

Ảnh hưởng của enzyme DNA polymearase

polymerase, tùy thuộc vào mục đích và điều kiện nghiên cứu mà lựa chọn các loại enzyme phù hợp

• Nồng độ enzyme :

– Nồng độ quá thấp  lượng sản phẩm ít

– Nống độ quá cao  sản phẩm không đặc hiệu

– Thường sử dụng 1-2 đơn vị enzyme cho thể tích phản ứng 25 m L

Ảnh hưởng của nồng độ Mg 2+ đến kết quả PCR

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

 Số lượng chu kỳ phản ứng

 Giai đoạn biến tính

 Nhiệt độ biến tính

 Thời gian biến tính

 Giai đoạn gắn mồi

 Nhiệt độ gắn mồi

 Thời gian gắn mồi

 Giai đoạn kéo dài

 Nhiệt độ phản ứng kéo dài mạch

 Thời gian phản ứng kéo dài mạch

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Ảnh hưởng của số lượng chu kỳ phản ứng

 Số lượng chu kỳ phản ứng phụ thuộc vào:

 Lượng DNA khuôn mẫu

 Lượng sản phẩm mong muốn

 Trong thực tế thường không vượt quá 40 chu kỳ cho một phản ứng PCR vì:

 Trong giai đoạn đầu, số lượng bản sao sẽ tăng theocấp số nhân

 Giai đoạn sau, hiệu quả khuếch đại giảm do:

 Sự phân hủy và cạn kiệt thành phần phản ứng

 Sự xuất hiện sản phẩm phụ ức chế phản ứng

 Các bản sao không bắt cặp với mồi mà bắt cặp với nhau

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn biến tính

– Nhiệt độ biến tính thường sử dụng: 94 – 95oC

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn biến tính

– Thời gian quá ngắn  phân tử DNA không đượcbiến tính hoàn toàn  hiệu quả khuếch đại thấp

– Thời gian quá dài  phân tử DNA bị phân hủy, DNApolymerase bị mất hoạt tính  phản ứng không đặchiệu hoặc không xảy ra

– Thời gian biến tính thường sử dụng:

• Giai đoạn biến tính ban đầu: 3-5 phút

• Giai đoạn biến tính trong từng chu kỳ: 30-45 giây

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn gắn mồi

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn gắn mồi

• Thời gian gắn mồi

– Thời gian quá ngắn  mồi không đủ thời gian gắnvào khuôn

– Thời gian quá dài  tăng bắt cặp không chính xác– Thời gian gắn mồi thường sử dụng là 30 giây

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn kéo dài

• Nhiệt độ phản ứng kéo dài

– Phụ thuộc vào loại enzyme và kích thước sản phẩm.VD: khi sử dụng Taq DNA polymerase

• Đối với sản phẩm có kích thước <2kb  thường dùng 70-75 o C (thường dùng 72 o C)

• Đối với sản phẩm có kích thước >6 kb  thường dùng

68 o C để tránh enzyme bị biến tính.

Ảnh hưởng của chu kỳ và nhiệt độ phản ứng

Giai đoạn kéo dài

• Thời gian kéo dài

– Thời gian quá ngắn  trình tự mục tiêu nhân lênkhông hoàn chỉnh

– Thời gian kéo dài mạch quá dài  tạo thành sảnphẩm không đặc hiệu

– Tùy vào kích thước sản phẩm mong muốn và loại enzyme sử dụng mà thiết lập thời gian

thường sử dụng là 1 phút/1kb

30 giây

Tách thành sợi đơn DNA (94 o C, 30 giây)

Tổng hợp chuỗi mới (65-75 o C, 2-5 phút)

Khuôn DNA được biến tính thành 2 sợi đơn (94 o C, 5 phút)

Chu trình PCR

Ảnh hưởng của thiết bị và dụng cụ thực hiện PCR

• Thiết bị tiến hành PCR cần đáp ứng được yêu cầu thay đổi nhiệt độ nhanh và chính xác.

• Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm riêng nên mọi thí nghiệm trong cùng một nghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại thiết bị.

• Mọi dụng cụ, hóa chất sử dụng cho PCR cần phải sạch, tránh tạp nhiễm.

Bài tập

• Nêu nguyên nhân và biện pháp khắc phục cho các trường hợp sau:

1 2

Trường hợp không thấy tín

hiệu vạch hoặc tín hiệu thấp

1: không có vạch

2: vạch mờ

Trường hợp sản phẩm không đặc hiệu

Trường hợp tạo ra các vệt tín hiệu

a: Xuất hiện vết chất có khối lượng phân tử nhỏ

b: Xuất hiện vệt chất có khối lượng phân tử lớn

• Là kỹ thuật nền cho nhiều phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử quan trọng: xác định trình tự gene, xác định tính đa hình DNA, làm

cơ sở cho việc phân tích các chỉ thị phân tử phục vụ công tác giống (cây trồng, vật nuôi, vi sinh vật…), phát hiện các kiểu đột biến.

• Giúp xác định nguồn gốc hài cốt liệt sĩ vô danh, xác định nhanh với

độ chính xác cao các thủ phạm hình sự từ những dấu vết rất nhỏ: máu, nước dãi, sợi tóc…

• Khôi phục các gen của nhiều loài sinh vật tồn tại cách đây hàng chục triệu năm.