công nghệ sinh học đại cương học viện nông nghiệp

– Trongmột số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm vector nhân dòng cho haitế bào chủ không có liên quan với nhau như E.coli và Bacillus subtilis.. Nhóm plasmid pUC 13 • Gốc tá

CÔNG NGHỆ SINH HỌC ĐẠI CƯƠNG

(SH3014)

1

Giới thiệu các vector nhân dòng

và kỹ thuật nhân dòng gen

CHƯƠNG II: CÁC KỸTHUẬT NỀN CỦA CNSH HIỆN ĐẠI

(10 TIẾT)

 Chức năng và ứng dụng của các enzyme giới hạn

 Giới thiệu các vector nhân dòng và kỹ thuật nhân dòng gen

 Cácphương pháp lai phân tử

 Phương pháp PCR, ứng dụng

 Kỹ thuật xác định trình tự DNA

 Kỹ thuật tạo thư viện genome và cDNA

2

• Nhân dòng DNA là kỹ thuật dùng để tái sản xuất

các đoạn DNA.

− sử dụng tế bào chủ

• Một vector là yêu cầu cần thiết để mang đoạn

DNA mục tiêu vào trong tế bào chủ.

3

1 Vector nhân dòng 1.1 Khái niệm

• Vector là các phân tử được dùng để mang các đoạn DNA/genđã được tách dòng

−Trongthực tế, một đoạn DNA lạ không thể duy trì và nhân bản trongtế bào chủ mới nếu như nó được chuyển vào tế bào chủ mới chỉ ở dạng một đoạn DNA đơn độc

Do enzyme DNA polymerase làmnhiệm vụ tái bản DNA khôngthể khởi đầu quá trình tái bản từ bất kỳ địa điểm nào trên DNA màchỉ ở những địa điểm đặc hiệu gọi là“điểm tái bản”(origins of replication)Cácđoạn DNA (hay các gen) muốn tái bản được trong tế bào chủ mới cần phải được gắn vàomột vector(cloning vectors)

Vector nhân dòngthực chất là một phân tử DNA có gốc táibản và có thể nhân lên trong tế bào chủ đã chọn

4

1 Vector nhân dòng 1.1 Khái niệm (tiếp…)

• Chỉ có một điểm nhận biết cho một RE nào đó.

– Nếu như số địa điểm này lớn hơn 1 sẽ gây rối loạn cho sự nhân dòng sau này.Một vector nhân dòng sẽ càng có ý nghĩa hơn nếu như nó có thể được cắt nhờ nhiều loại RE và tất nhiên ứng với mỗi loại cũng chỉ có một địa điểm nhận biết

• Phải có một hoặc nhiều chỉ thị di truyền chọn lọc

– Thídụ như tính kháng kháng sinh, tính xúc tác cho các phản ứng tạo màu Điều này cần thiết để có thể chọn lọc được các tế bào đã được chuyển nạp, dựa trên cơ sở kháng kháng sinh, tạo phản ứng mầu của chúng

• Phải có điểm tái bản để đảm bảo sự nhân lên của chúng trong tế bào chủ mới.

– Trongmột số trường hợp một plasmid có thể được sử dụng làm vector nhân dòng cho haitế bào chủ không có liên quan với nhau

như E.coli và Bacillus subtilis Các vector hai chức năng này phải

cósố điểm tái bản lớn hơn 1

6

1 Vector nhân dòng 1.2 Tiêu chuẩn của vector nhân dòng

• Các loại vector nhân dòng khác nhau

được sử dụng cho các thí nghiệm nhân

dòng khác nhau.

• Việc lựa chọn vector phụ thuộc vào kích

thước và loại DNA cần nhân dòng.

1 Vector nhân dòng 1.3 Các loại vector nhân dòng

vectors

Chromosome-based

Phage-based

Eukaryotic virus- based

YAC

Hybrid (phagemid, cosmid …)

8

1 Vector nhân dòng 1.3 Các loại vector nhân dòng

Khả năng chèn đoạn DNA ngoại lai của

một số vector nhân dòng

1 Plasmid <10 kb

2 Bacteriophage 9– 20 kb

3 Cosmid 33– 47 kb

5 YAC 100– 1000 kb

9

• Các tế bào vi khuẩn có thể chứa các DNA ngoài

là các plasmid.

vòng, có khả năng nhân

nhiễm sắc thể.

trong tế bào với nhiều bản sao.

10

1 Vector nhân dòng 1.4 Vector plasmid

Một số plasmid vector

• pBR plasmid

“p” : plasmid

“BR” : tên của hai nhà khoa học F Bolivar và R.Rodrigues

“332”: số thứ tự

4363bp

Nhóm plasmid pBR

12

• Đây là nhóm các plasmid được phát triển từ plasmid pBR322.

• Phần chứa gen kháng tetracyline (khoảng 40% DNA) được cắt bỏ còn

phần gen kháng ampicillin và gốc tái bản của pBR322 được giữ lại

• Ngoài ra, cácvị trí nhân dòng hay vị trí gắn các đoạn DNA ngoại lai (cũng

là cácvị trí cắt của các enzym giới hạn) của pUC được phân bố tập trung

vàomột vị trí gọi là vị trí đa nhân dòng (multiple cloning site-MCS)

Nhóm plasmid pUC

13

• Gốc tái bản

• Markerchọn lọc

• Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS/polylinker)

Older cloning vector

Thành phần của một plasmid

14

• Làmột đoạn DNA với nhiều

vị trí nhận biết duy nhất cho

các enzymegiới hạn Việc

cắt plasmids với một trong

các RE trong vùng MCS

không ảnh hưởng gì đến

cácđặc tình cần thiết khác

của vector

• Gene cần nhân dòng được

gắn vào vector nhân dòng ở

một vị trí giới hạn trong

vùngđa nhân dòng

Vị trí đa nhân dòng (Multiple cloning site – MCS / polylinker)

•Kíchthước nhỏ (3-20kb).

•Genomeđã được giải mã

•Số bản copy cao

•Chứa gen chỉ thị hoặc chọn lọc

− gen kháng kanamycin (kanR)

− gen kháng tetracycline (tetR)

− gen kháng ampicillin (ampR)

− ….

•Chứa trình tự nhận biết duy nhất cho nhiều RE

Ưu điểm của plasmid vectors:

17

thước lớn.

• Thường nhân đoạn 4 - 10 kb.

• Hiệu suất biến nạp thường không cao.

Hạn chế của vector plasmid

18

lọc và sao chép bất kỳ một đoạn trình tự đặc thù

của DNA (hoặc RNA) và sản xuất với một lượng

không giới hạn

• Là bước đầu tiên trong một loạt các thí nghiệm

về kỹ thuật di truyền

19

2 Nhân dòng DNA

1 Táchchiết DNA từ mẫu nghiên cứu, cắt DNA bằng enzym cắt giới hạn để tạo ra các đoạn DNA là nguyên liệu cho quá trình nhân dòng (tách dòng)

2.Gắn các đoạn cắt vào một vector nhân dòng

3.Chuyển nạp các vector nhân dòng sau phản ứng gắn trên vào tế bào sinh vật chủ để nhân bản các đoạn DNA đã được gắn cùng với vector

4.Chọn lọc, tập hợp các đoạn gắn thành từng dòng riêng hình thành thư viện mẫu đã nhân dòng Từ đây có thể chọn lọc ra các trình tự cần quan tâm

Xử lý vector với enzyme cắt giới hạn hình thành đoạn bổ đoạn DNA cần nhân

Đoạn DNA cần nhân dòng đã được xử lý enzyme giới hạn

Nối đoạn DNA với vector nhờ enzyme DNA ligase

Phân tử DNA tái tổ hợp Chuyển vào tế bào vi khuẩn

Nhiễm sắc thể vi khuẩn

Phân tử DNA tái

tổ hợp

20

2 Nhân dòng DNA 2.1 Các bước cơ bản của nhân dòng gen

Bước 1: Cắt DNA mẫu và plasmid bằng RE

Xử lý enzyme EcoRI

Xử lý enzyme EcoRI

21

2 Nhân dòng

DNA

2.2 Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

Bước 2: Nối mẫu DNA vào pUC19

Mẫu DNA đã được xử lý bằng

EcoRI

Vector plasmid được xử lý bằng

EcoRI

22

Quá trình lai thực hiện nhờ DNA ligase

2 Nhân dòng DNA

2.2 Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

Bước 3 Biến nạp

• Biến nạp ( transformation ): là quá trình chuyển DNA

ngoại sinh vào trong 1 tế bào.

khuẩn, 2 phương pháp thường sử dụng đó là:

–Phương pháp hóa học sử dụngCaCl2vàsốc nhiệt để

thúcđẩy DNA đi vào trong tế bào

–Dùng xungđiện (electroporation)để kích thích quá trình

23

2 Nhân dòng

DNA

2.2 Nhân dòng DNA sử

24

Biến nạp bằng xung điện

25

Bước 4 Chọn lọc

• Nuôi dịch khuẩn vừa biến nạp trên môi trường chọn lọc.

26

2 Nhân dòng DNA

2.2 Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

Các sản phẩm thu được sau biến nạp

plasmid + đoạn DNA

ngoại

Kháng ampicillin

Plasmid không mang

đoạn DNA ngoại

Kháng ampicillin

Không mang plasmid

Không kháng ampicillin

Làm thế nào để phân biệt và chọn lọc được

sản phẩm mong muốn?

27

Chọn lọc trắng xanh

Dựa vào hệ thống lac Operon (điều khiển phản ứng

đối với lactose trong tế bào E coli)

28

 - galactosidase

Lactose Galactose + Glucose  - galactosidase

 -D-glucuronid + H2O Glucuronic acid + Glucose  - glucuronidase

X-Gal

5-Brom-4-chlor-3-idolyl--D-galactoside

5-Brom-4-chlor-indigo

Không màu

Màu xanh sẫm

http://www.eppendorfna.com/applications/images/gel _cleanup1.jpg

29

LacZ gene

promotor

RNA pol.

Gene LacZ ở trạng thái hoạt động

DNA

LacZ mRNA

Ribosome

β-galactosidase

RNA

Protein

Khuẩn lạc trắng X-gal

30

31

LacZ

promotor operator

Repressor

Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc

LacZ

promotor

RNA pol.

RNA pol.

IPTG IPTG IPTG LacZ

promotor operator

IPTG IPTG

RNA pol.

IPTG

MÀU TRẮNG MÀU XANH

32

X X X

X

X

Plasmid không chứa đoạn DNA ngoại Plasmid + đoạn DNA ngoại Không chứa plasmid

LacZ Insert

Khuẩn lạc TRẮNG Khuẩn lạc XANH

Mô hình sử dụng gene LacZ trong chọn lọc

33

Như vậy:

• Chỉ các vi khuẩn nào có chứa plasmid đã biến nạp thì tồn tại được trên môi trường và hình thành khuẩn lạc (vì có plasmidchuyển nạp thì mới có gen chịu kháng sinh)

• Docấu trúc của plasmid, vùng gen chịu trách nhiệm sinh màu (gen mã hoá -galactosidase)sẽ là vùng bị cắt để gắn DNA ngoại vào, cho nên các khuẩn lạc có mầu xanh

là khuẩn lạc có chứa plasmid nhưng không gắn DNA ngoại lai, còn khuẩn lạc có màu trắng chính là khuẩn lạc

cóchứa 1 đoạn DNA cần nhân dòng được ghép vào

34

2 Nhân dòng DNA

2.2 Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

Bước 4:

(tiếp )

• Chọn các khuẩn lạc trắng nuôi trong môi trường lỏng có

bổ sung ampicillin để nhân nhanh sinh khối

• Táchchiết plasmid và tiến hành kiểm tra kết quả nối DNA

vào plasmid(khẳng định sự có mặt của đoạn DNA mong

muốn trong plasmid) bằng các phương pháp như PCR, sử

dụng RE

35

2 Nhân dòng

DNA

2.2 Nhân dòng DNA sử dụng vector pUC19

Movie on making recombinant DNA

36

1 Vẽ sơ đồ cấu trúc và giải thích các đặc điểm chính của

vector pBR322 khi nóđược sử dụng làm vector để nhân

dòngmột đoạn DNA?

2 Giải thích vai trò các thành phần của một plasmid: (a) các

gen kháng kháng sinh, (b)gốc tái bản, (c) vị trí đa nhân

dòng được sử dụng như thế nào trong kỹ thuật nhân

dòng?

3 Vector nhân dòng là gì? Nêu cácđặc trưng chung của

một vector dùng để nhân dòng DNA?

4 Trình bày cácbước của kỹ thuật nhân dòng gen bằng

vector plasmid pUC19.Giải thích làm thế nào có thể chọn

lọc được dòng vi khuẩn mang DNA tái tổ hợp?

CÂU HỎI ÔN TẬP