luận văn công nghệ thực phẩm Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn Lactic phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống tại Hà Nội

vật thể hiện nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo, cũng như khắc phụcđược những khó khăn và hạn chế ở trên [3].Tuy nhiên, các nghiên cứu và ứng dụng mới chỉ tập trung vào đối tư

ĐẶT VẤN ĐỀ

Tinh bột, protein và cellulose là các sản phẩm tự nhiên có vai trò quantrọng, có nhiều ứng dụng trong sản xuất và trong đời sống con người Trong chếbiến tinh bột, cellulose, protein, mục đích của các nhà máy hay các cơ sở sảnxuất chế biến là chuyển hóa chúng từ các hợp chất có phân tử lượng cao hệ sốhấp thu kém, giá trị thương phẩm thấp thành các sản phẩm mới có hệ số hấp thucao hơn, có giá trị thương phẩm cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi vào nhiềungành công nghiệp chế biến liên quan khác Công đoạn quan trọng nhất để đạtđược mục đích này là thuỷ phõn chỳng thành những hợp chất đơn giản, đó là cácđường đơn, các axit amin Tinh bột, cellulose, protein được thủy phân là nhờ vào

ba nhóm enzyme chủ yếu là amylase, cellulase và protease, tuy nhiên trên thực tếviệc tách chiết các enzyme này từ những nguồn nguyên liệu tương ứng là rất khókhăn và hiệu xuất thu được là không cao, vi dụ như amylase được tách chiết từmầm của các loại ngũ cốc, cellulase được tách chiết từ dịch chiết dạ dày bò haytrong hạt ngũ cốc nảy mầm, còn protease cũng được tách chiết từ thực vật hayđộng vật (đu đủ, dạ dày bờ,…) [2]

Chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu thực vật và động vật không thểdùng để sản xuất các chế phẩm enzyme với quy mô công nghiệp bởi một sốnhược điểm như; chu kỳ sinh trưởng của chúng dài, hai nguồn nguyên liệu nàykhó cải tạo Trong khi đó cả ba loại enzyme trên đều được sản sinh bởi tế bào visinh vật, nguồn enzyme ở vi sinh vật vô cùng phong phú và có ở hầu hết cỏcnhúm vi sinh vật như vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc, [3]

Có thể nói vi sinh vật là nguồn tài nguyên phong phú, thích hợp nhất đểsản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng trong công nghiệp và đời sống So với

vật thể hiện nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo, cũng như khắc phụcđược những khó khăn và hạn chế ở trên [3].

Tuy nhiên, các nghiên cứu và ứng dụng mới chỉ tập trung vào đối tượng

chính là nấm men và vi khuẩn Bacillus mà chưa nghiên cứu đến vi khuẩn lactic,

dựa trên những hiểu biết về vi khuẩn lactic thì đây là một nguồn thu enzyme từ

vi sinh vật rất có ưu thế khi ứng dụng vào lên men, bởi lẽ vi khuẩn lactic là vikhuẩn sinh axit lactic nên có khả năng sinh trưởng bình thường trên môi trường

có pH thấp, như vậy trong điều kiện môi trường axit cao hiệu suất lên men nhờ

vi khuẩn lactic vẫn cao và đảm bảo chất lượng sản phẩm lên men Những ưuđiểm này của vi khuẩn lactic sẽ rất có lợi cho các ngành sản xuất thực phẩm và

đồ uống lên men như sản xuất bia, rượu từ hạt ngũ cốc hay trong việc sản xuấtcác chế phẩm dùng trong chăn nuôi

Xuất phát từ thực tế trên và tiềm năng sẵn có trong nước, đồng thời đểphát hiện và lưu giữ những chủng vi khuẩn lactic có hoạt tính sinh học quý,

chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn Lactic phân lập từ các sản phẩm lên men truyền thống tại Hà Nụ̣i”.

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

được xác định là Lactobacillus delbrueckki, đó là một trong số những vi khuẩn

sử dụng trong sản xuất sữa chua [17]

Ngày nay, những hiểu biết về vi khuẩn lactic đó khỏ đầy đủ Vi khuẩnlactic là nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến, và nó có khả năng sinh ra cácenzyme, vitamin, chất kích thích sinh trưởng và các chất có khả năng ức chếhoặc tiêu diệt nhóm vi sinh vật gây bệnh, điều đó giúp cho chúng có khả năngtồn tại và sinh trưởng tốt trên nhiều loại nguyên liệu khi đem lên men Loại cơchất mà vi khuẩn lactic có thể chuyển hóa rất phong phú, có thể là protein,cellulose, glucose hay tinh bột nhờ vào hệ enzyme phong phú Vì vậy ba hoạt

trọng để tuyển chọn ra các chủng vi khuẩn lactic có những đặc tính sinh họcmong muốn sử dụng trong các quá trình lên men Đây là hướng nghiên cứu rất

có triển vọng để nhằm phát hiện và ứng dụng những nguồn enzyme mới trong tựnhiên làm tăng hiệu suất lên men trong sản xuất các sản phẩm lên men, từ đógiúp giảm bớt tác hại của các chất hóa học và giảm giá thành sản phẩm

1.1.2 Phân loại vi khuẩn lactic

1.1.2.1 Phân loại vi khuẩn lactic theo Orla-Jensen

Orla-Jensen đã phân loại vi khuẩn lactic dựa vào những đặc điểm hình tháihọc (cầu khuẩn hoặc trực khuẩn), kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt

độ khác nhau, mức độ sử dụng đường Ông xếp chúng thành bốn giống:

Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus [17] Ngày nay người

ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi.

INCLUDEPICTURE

"http://i01.i.aliimg.com/photo/v1/111544661/Lactic_acid_bacillus.jpg" \*

MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE

"http://www.itqb.unl.pt/labs/lactic-acid-bacteria-and-in-vivo-nmr/

streptococcus20pneumoniae.jpg" \* MERGEFORMATINET

Hình 1.1: Một số hình ảnh về vi khuẩn lactic

- Lactobacillus: Trực khuẩn, kích thước từ 0,7-1,1àm đến 3-8àm có thể xếp

đôi, chuỗi hoặc đứng riêng rẽ Nhiệt độ tối ưu là 30 - 45oC Lên men được đường

galactose, glucose, fructose…Gồm có ba nhóm với ba loài đặc trưng: L bulgaricus, L brevis, L casei.

- Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hoặc hình trứng đường kính từ 0,5-0,8àm

và chiều dài khoảng 1,6àm Lên men đường dextran, trioza, sản phẩm tạo thành là axitD-lactic, etanol, CO2 Có 2 loài đặc trưng là L mensenteroides và L lactic.

- Pediococus: Trực khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn Lên

men đường glucose theo con đường EMP, axit tạo thành có dạng DL, D(-) hay

- Streptococus và Lactococus: Cầu khuẩn, đường kính khoảng 0,5-1,0àm, sắp

xếp riêng biệt, cặp đôi hoặc thành chuỗi dài xếp đôi Có khả năng lên men đườnghexoza thành axit lactic và các loại đường khỏc Cú ba loài đặc trưng được sử

dụng trong sữa: S lactic, S cremoris, S thermophilus.

- Bifidobacterium: Trực khuẩn, gram dương, không chuyển động, không bào

tử Phát triển ở nhiệt độ tối ưu từ 36 - 38O, pH tối ưu 6,5 - 7 Có khả năng lênmen lactoza sản phẩm tạo thành là axit lactic và axit axetic [18]

1.1.2.2 Phân loại vi khuẩn lactic dựa vào quá trình lên men

Lên men lactic là một trong những quá trình sinh hoá phổ biến trong thiênnhiên, đó là quá trình chuyển hoỏ cỏc chất gluxit thành axit lactic nhờ hoạt độngsống trực tiếp của hệ vi sinh vật lactic

Trong thiên nhiên vi khuẩn lactic tồn tại dưới hai dạng:

• Nhóm vi khuẩn lactic đồng hình: có khả năng phân huỷ đường đơn giản và tạonên axit lactic, đây là quá trình lên men lactic đồng hình

C6H12O6 → 2CH3CH(OH)COOH + 22,5 Kcalo

Do hệ enzyme trong những vi sinh vật khác nhau thường khác nhau nên

cơ chế hoá học của quá trình lên men lactic ở các giống vi sinh vật thường khônggiống nhau

Ở vi khuẩn lactic đồng hình sự chuyển hoá đường thành axit lactic đi theocon đường lên men rượu đến giai đoạn tạo axit pyruvic, axit này được khử hainguyên tử hidro nhờ hoạt động của lacticodehydrogenase để trở thành axit lactic

• Nhóm vi khuẩn lactic dị hình: tạo ra quá trình lên men phức tạp hơn, gọi là lênmen lactic dị hình, chúng tạo nên trong môi trường ngoài axit lactic còn có nhiều

sản phẩm phụ: axit axetic, rượu etylic, CO2, H2, một số chất thơm như diacetyleste.

C 6 H 12 O 6 →CH 3 CHOHCOOH +COOHCH 2 CH 2 COOH +CH 3 COOH + CH 3 CH 2 OH + CO 2 + H 2

Số lượng các sản phẩm phụ này hoàn toàn phụ thuộc vào giống vi sinhvật, môi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh Nói chung axit lacticthường chiếm 40% lượng đường đó phõn huỷ, axit succinic gần 20%, rượu etylickhoảng 10% và cỏc khớ vào khoảng 20% Đôi khi lượng khí ít hơn và thay vào

đó là lượng axit formic

Lên men lactic cần có sự lên men đồng thời của vi khuẩn lactic đồng hình

và dị hình Vì quá trình lên men dị hình ngoài việc tạo thành axit lactic còn tạocác sản phẩm phụ như axit và rượu sinh ra este có mùi thơm làm cho sản phẩm

có hương vị đặc trưng [14]

1.1.3 Đặc điểm chung của vi khuẩn lactic

Trong sinh giới có khoảng 400 – 500 chi vi khuẩn được biết đến, trong đó

đó cú 13 chi được biết đến là vi khuẩn lactic (xem bảng 1.1)

Bảng 1.1: Các chi và số loài của vi khuẩn lactic được biết đến.

6 Streptococus 50 13 Tetragenococcus 2

Vi khuẩn lactic là nhóm vi khuẩn sinh axit lactic phổ biến trong tự nhiên,loại cơ chất mà vi khuẩn lactic tham gia chuyển hoá rất phong phú từ tinh bột,cellulose, protein, vì vậy vi khuẩn lactic đã được phân lập từ rất nhiều nguồnmẫu khác nhau từ thịt chua, cỏ ủ chua,

Nhìn chung vi khuẩn lactic cú cỏc đặc điểm về hình thái, sinh lý, sinh hóanhư sau:

- Thuộc vi khuẩn Gram dương

- Không sinh bào tử, không có khả năng di động

- Hình dạng tế bào có thể là hình cầu như Streptococcus, Lactococcus, Leuconostos, Pediococcus, hoặc hình que như Lactobacillus) Người ta phân

biệt chúng bằng khả năng lên men đồng hình hay dị hình

- Phản ứng âm tính với catalase (đây là dấu hiệu của vi khuẩn kỵ khí)

- Có khả năng lên men đường để tạo axit lactic

- Cấu tạo tế bào cũng mang đầy đủ cấu trúc của một tế bào nhân thật (thành tếbào, màng tế bào, tế bào chất, thể nhân, )

- Mỗi loài vi khuẩn khác nhau có nhu cầu về dinh dưỡng cũng khác nhau.Chúng không những cần cung cấp đủ các chất dinh dưỡng: cacbon, nito, muốikhoáng mà còn cần các chất kích thích sinh trưởng [12, 13]

1.1.4 Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy đến vi khuẩn latic

1.1.4.1 Ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng

Trong công nghiệp, vật liệu dùng để làm môi trường cho vi sinh vật phỏttrỉờn cần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệusuất thu hồi lớn nhất và giá thành rẻ Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy mà còn ảnhhưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩm sinh khối sau này.

 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexose(glucose, fructose, manose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose,maltose) cho đến các polysaccarit (tinh bột, dextrin)

Glucose ở dạng D- glucose, là loại monosaccarit hấp thụ dễ dàng nhất.Chúng được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hoáhơn Vì vậy trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường này cho

vi sinh vật dễ sử dụng

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccrit vàdisaccarit Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựngcấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit citric, malic, pyruvic, fumaric,axetic… Một vài loài vi khuẩn lactic lên men dị hình phân lập từ các sản phẩmthực phẩm, có thể sử dụng các axit gluconic và galacturonic tạo thành CO2, axitaxetic và axit lactic Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩnlactic có thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làmnguồn cung cấp năng lượng Khi đó tạo ra quá trình đề cacboxyl và tạo ra CO2.Các loại vi khuẩn khác nhau đòi hỏi nguồn cacbon khác nhau Một số loài vikhuẩn lactic có thể sử dụng được dextrin và tinh bột Sự phát triển của vi khuẩnlactic với mỗi loại đường khác nhau sẽ tạo ra các tế bào có đặc điểm hình thái vàsinh lý khác nhau, vì vậy cũng sẽ có khả năng chống chịu khác nhau trước những

 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau Phầnlớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phức tạp cóchứa nitơ nờn chỳng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường Để sinh trưởng

và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩnlactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phânprotein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thuỷ phân, dịchchiết thịt, trypton…Đõy cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng đểchuẩn bị môi trường nuôi cấy Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp ta cần nghiêncứu những nguồn nitơ thích hợp để sản xuất giúp giảm giá thành sản phẩm mànâng cao được hiệu quả sản xuất Trong đó dịch nấm men thuỷ phân được sửdụng khá nhiều [15, 16]

 Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng

Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với lượng rất nhỏ nhưng lại có ảnhhưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Chẳng hạn đối với

Lactobacillus, Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩn lactic,hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc protease thuỷ phân một số protein là nguồn dinhdưỡng nuôi tế bào Nhìn chung mangan và magie là những chất đúng cỏc vai tròchủ yếu như: tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme,giải độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy, ổn định cấu trúc tế bào

Các chất chứa axit béo có mặt trong môi trường cũng có ảnh hưởng khôngnhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Chúng không nhữngkích thích sinh trưởng mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đông sau này Ví

dụ Tween 80 sẽ làm thay đổi một số axit béo trong tế bào vi khuẩn lactic, sự thayđổi này ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mặncủa vi khuẩn lactic [15, 16]

1.1.4.2 Ảnh hưởng của pH

Trong quá trình lên men, vi khuẩn lactic sản sinh ra axit làm pH môi trườnggiảm, khi pH môi trường giảm đến một mức nào đó nó sẽ ức chế chính sự pháttriển của vi khuẩn lactic Vì vậy trong quá trình nuôi người ta phải luôn điềuchỉnh pH về khoảng tối thích cho vi khuẩn phát triển Mỗi một loài vi khuẩnlactic có một khoảng pH tối thích khác nhau, dao động trong khoảng 4,5-6,5,nhưng cũng có một số chủng có thể phát triển ở pH=9,6 và một số hoạt động ở

pH=3,2 như Lactobacillus fermentum có thể chịu được pH=3 [17]

1.1.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ

Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vikhuẩn Nhiệt độ ảnh hưởng đến các phản ứng enzyme của tế bào vi sinh vật.Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzyme, làmđình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng

và phát triển của vi khuẩn Ví dụ vi khuẩn Lactobacillus fermentum là loài ưa

ấm, phát triển tốt ở nhiệt độ 370 C [16]

1.1.2 Những ứng dụng của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic được ứng dụng rất rộng rãi trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt làtrong các ngành công nghiệp như: công nghiệp chế biến sữa, công nghiệp sảnxuất axit lactic, công nghiệp chế biến, bảo quản rau quả và trong chế biến thức

ăn gia súc

Trong công nghiệp chế biến sữa, vi khuẩn lactic đóng vai trò quyết định vàtạo hương vị cho sản phẩm Chúng được sử dụng để chế biến nhiều loại sữa

Streptococcus, S cremoris, và một số loại sinh hương Sữa được làm chín tạo thành phomat nhờ một số chủng vi khuẩn như: Streptococcus, S cremoris, Lactococcus casei, L helventicum Để sản xuất bơ, nguyên liệu váng sữa được cấy là Streptococcus lactic, S cremoris, Leuconostoc cremoris Ngoài ra cũn cú cỏc chủng vi khuẩn khác sinh hương tốt như: Streptococcus citrovorus, S parcitrovorus, S diacetylactic [13].

Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, vi khuẩn lactic có tác dụng làm chobột chua và làm nở bột bánh mỳ

Từ những năm 1894, vi khuẩn lactic đã được ứng dụng để sản xuất axitlactic phục vụ cho các ngành công nghiệp thuộc da, vải sợi, dược phẩm

Ngày nay, hơn một nửa sản phẩm axit lactic trên thế giới được sử dụngtrong công nghiệp thực phẩm, khoảng một phần năm là sử dụng Stearoyl -2-lactylate trong sản xuất công nghiệp, còn lại sử dụng ở công nghiệp dược và một

số ngành kỹ thuật khác Axit lactic được bổ sung vào nước chiết quả, nướcchanh, nước cam,… dùng trong công nghiệp đồ hộp, thịt cá, rau quả

Vi khuẩn lactic còn được sử dụng làm vi khuẩn chỉ định trong nhiềuphương pháp xác định vitamin và axit amin, dựa trên nguyên lý là khi sinhtrưởng vi khuẩn này bắt buộc phải có một số axit amin hoặc vitamin riêng biệt

Do tính nhạy cảm với những axit amin và vitamin đú nờn một số vi khuẩn lacticđược dùng để phân tích các chất này trong các môi trường khác nhau

Vi khuẩn lactic còn được ứng dụng trong việc bảo vệ sức khỏe con người,tăng cường tính miễn dịch, làm giảm lượng cholesterol trong máu, chống ungthư và tăng cường cạnh tranh với vi sinh vật gây hại

Ngoài ra vi khuẩn lactic còn có khả năng sinh bacterioxin, có thể ức chế các

vi khuẩn Gram dương Nhờ đặc tính quý giá này mà vi khuẩn lactic được sửdụng rất hiệu quả trong việc bảo quản thực phẩm để kéo dài thời hạn sử dụng.Trong lĩnh vực chăn nuôi, vi khuẩn lactic cũng có một vai trò quan trọng,

nó được dùng để ủ chua thức ăn cho gia súc nhờ sự lên men lactic làm nâng caochất lượng thức ăn, giảm tỷ lệ hư hỏng, làm giàu thêm một số hoạt chất có lợicho quá trình sống của vi sinh vật Đây là phương pháp được sử dụng phổ biếntrong các trang trại chăn nuôi Phương pháp này dựa vào sự chuyển hóa đường

có sẵn trong nguyên liệu của vi khuẩn lactic [9, 14]

1.2 Enzyme ngoại bào của vi khuẩn lactic

1.2.1 Khái niệm enzyme ngoại bào

Enzyme ngoại bào là những enzyme được tạo ra trong tế bào vi sinh vậtsau đó tiết vào môi trường trong quá trình nuôi cấy tế bào, để thực hiện chứcnăng cụ thể phục vụ cho các hoạt động sống của vi sinh vật [1]

1.2.2 Đặc điểm – tính chất

Nếu như để thu nhận các enzyme nội bào thì công việc trước tiên là phảiphá vỡ tế bào để thu lấy dịch chiết mô hoặc tế bào có chứa enzyme Còn đối vớicác enzyme ngoại bào thỡ chúng được tiết vào môi trường nuôi cấy nên khôngcần phải dựng cỏc biện pháp để phá vỡ tế bào, mà chỉ cần tinh sạch chúng từ môitrường nuôi cấy, mặt khác các biện pháp phá vỡ tế bào thường rất khó khăn vàphức tạp như dùng siêu âm, dùng enzyme, máy nén sốc nhiệt, nghiền với thủytinh, … nhưng các phương pháp này cũng ảnh hưởng một phần đến hoạt tính củaenzyme [1]

Enzyme ngoại bào chủ yếu là enzyme thuỷ phân khử những khoáng chất

những phân tử ngậm nước Điều này giúp phóng thích những phân tử nhỏ hơn,

có thể được vận chuyển vào tế bào và tiờu hoỏ [3]

Các enzyme ngoại bào tham gia thuỷ phõn cỏc hợp chất hữu cơ phổ biến,

đó là thuỷ phân tinh bột, thuỷ phân lipid, thuỷ phân casein, thuỷ phân gelatin

1.2.2 Một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase,protease) của vi khuẩn lactic

1.2.2.1 Amylase

Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến có vai trò chuyển hóa tinh bột đã

hồ hóa, thậm chí cả tinh bột sống Dựa trên tính chất và cách tác dụng lên tinhbột mà phân biệt amylase thành α – amylase, β – amylase, glucoamylase, vàoligo 1- 6 glucozitase

Hình 1.2: Cấu trúc không gian phân tử α – amylase

Amylase phân hủy tinh bột giải phóng ra glucose ở dạng α – amutanmernên được gọi là  - amylase  - amylase từ các nguồn khác nhau có thành phầnaxit amin khác nhau, mỗi loại α - amylase có một tổ hợp axit amin đặc hiệuriêng α – amylase là một protein giàu thyrosine, tryptophan, axit glutamic vàaspartic Nó có khả năng phân cắt các liên kết α – 1,4- glucozit nằm ở phía bêntrong phân tử cơ chất một cách ngẫu nhiên, không theo trật tự Liên kết α – 1,6 –

glucozit không bị thủy phân sẽ kìm tỏa các mối liên kết α – 1,4- glucozit gần nólàm cho α - amylase không được tác dụng, vì thế với amylopectin thì sản phẩmtạo ra là các dextrin chứa cả liên kết α – 1,4 và α – 1,6 – glucozit [ ] Điều kiệntối ưu cho sự hoạt động của α – amylase từ các nguồn khác nhau thường khônggiống nhau Những khác biệt về tính chất (nhiệt độ, pH tối thích, mức độ thủyphân) của α – amylase từ các nguồn khác nhau đang mở ra nhiều khả năng to lớncho việc ứng dụng chúng một cách thích hợp và đầy hiệu quả ở các giai đoạnkhác nhau trong quá trình lên men [6].

β – Amylase phân giải 100% amylose thành mantose, phân giải 55%amylopectin thành mantose Mantose tạo thành có cấu hình β, do vậy enzyme

này được gọi là β – amylase β – Amylase xúc tác thủy phân liờn kết 1,4 –

glycozit trong tinh bột, glycogen và polysaccarit đồng loại, phân cắt tuần tự gốcglucose từ đầu không khử mạch β – amylase hầu như không thủy phân hạt tinhbột nguyên vẹn mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột [6]

Glucoamylase là một exoenzyme, thủy phân liên kết α – 1,4 glycozit trongphân tử polysaccarit tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử củamạch Nó cũng thủy phân liên kết α– 1,6 glucozit và α– 1,3 glucozit chịu ảnhhưởng của kích cỡ cấu trúc phân tử và các liên kết kế bờn.Tại cỏc điểm phânnhánh tốc độ thủy phân chậm hơn Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàntoàn tinh bột, amylopectin, dextrin cuối, izomantra và mantose tới glucose

Oligo – 1,6 glucozitase thủy phân các liên kết α – 1,6 glycozit trongizomantose, trong các dextrin tới hạn có khả năng chuyển hóa chất này tới đườnglên men được Oligo – 1,6 glucozitase thủy phân mạnh hơn α, β – amylase

* Ứng dụng của amylase

Ngày nay với sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật cũng như công nghệ sinhhọc, amylase được sản xuất với lượng lớn và ứng dụng rộng rãi vào công nghiệplên men, y học và nhiều lĩnh vực liên quan khác Cụ thể là:

Trong chăn nuôi: Kết hợp giữa các chủng vi sinh vật có hoạt tính amylase

mạnh với nhau và từ đó sản xuất ra các chế phẩm dùng để ủ thức ăn chăn nuôicho gia súc rất giàu dinh dưỡng giúp tăng năng suất trong chăn nuôi mà giáthành lại không cao, nước ta đã ứng dụng rộng rãi phương pháp này vào các trạichăn nuôi bò sữa, trại chăn nuôi lợn và thu được hiệu quả kinh tế cao

Trong công nghiệp rượu cồn: Nhiều năm gần đây chế phẩm α – amylase

đã hoàn toàn thay thế malt trong sản xuất rượu, cồn và kết quả đem lại là tiếtkiệm được hàng chục tấn lúa mạch có chất lượng, tăng năng suất rượu, thời giansản xuất chế phẩm được rút ngắn, giảm chi phí cho sản xuất và tiết kiệm điệnnăng

Trong công nghiệp bia: Nguyên liệu chính trong quy trình sản xuất bia là

malt đại mạch, trong những trường hợp malt không đảm bảo chất lượng thì hiệnnay ở nhiều nước trên thế giới người ta thay thế 25 – 50% malt bằng các nguyênliệu thay thế (nguyên liệu phi malt) đó là các hạt chưa nảy mầm như đại mạchloại hai, loại ba, ngụ…trong trường hợp này người ta phải bổ sung chế phẩmamylase để có được chất lượng dịch lên men được đảm bảo [8]

Trong sản xuất bánh mỳ: Nếu thêm vào bột nhào 0,002-0,003g chế phẩm

amylase sẽ làm cho hương vị, màu sắc, thể tích riêng và độ xốp của bánh mỳtăng lên một cách rõ rệt

Trong công nghiệp dệt: Chế phẩm amylase được dùng để rũ hồ vải trước

khi nhuộm, rũ hồ bằng enzyme không những nhanh, không hại vải, độ mao dẫntốt mà còn đảm bảo vệ sinh do đó tăng được năng suất lao động

Trong y học: Dùng α – amylase sản xuất glucose tiêm hoặc bổ trợ cho bữa

ăn của bệnh nhân khi cơ thể bị yếu

19, 20]

- Exoglucanase thủy phân từ đầu mạch cellulose tạo thành các sản phẩmchính là cellobiose hoặc glucose Có hai loại exoglucanase(cellobiohydrolase – CBH), một loại thuỷ phân từ đầu khử, một loạithuỷ phân từ đầu không khử [18, 19, 20]

- - glucosidase thủy phân cellodextrin và cellobiose thành glucose [18,

19, 20]

Cấu trúc chung của hầu hết các cellulase là cấu trúc module Cấu trúc nàythường bao gồm: module xúc tác (catalytic module) và module liên kết vớicarbohydrate (carbohydrate binding module – CBM) [18] CBM gắn với bềmặt cellulose, làm cho module xúc tác gần với cơ chất Sự có mặt của CBMđặc biệt quan trọng với việc khởi đầu cũng như toàn bộ quá trình hoạt độngcủa exoglucanase CBM còn có khả năng “búc” cỏc sợi cellulose khỏi cấu trúc

vi sợi do đó làm tăng tốc quỏ trỡnh thuỷ phân [118] Các enzyme trong hệcellulase không hoạt động riêng lẻ mà kết hợp với nhau để thuỷ phân cellulosemột cách hiệu quả nhất

Hình 1.3: Cấu trúc không gian của phân tử cellulase

 Ứng dụng của cellulase

Cellulase có rất nhiều ứng dụng trong đời sống, cũng như trong côngnghiệp chế biến Chế phẩm cellulase thường dùng để:

- Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc

Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

- Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dựng nú

để tăng độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thựcphẩm thực vật

Trong sản xuất bia: Dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong

đó có cellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt chotác động của protease và đường hóa

Trong sản xuất agar-agar: Tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng

chất lượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng axit để phá vỡ thành tế bào.Đặt biệt là việc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đemthủy phân, dùng làm thức ăn gia súc và công nghệ lên men

Sử dụng cellulase để phá vỡ thành tế bào để tạo tế bào trần (protoplast),

có ý nghĩa rất lớn trong việc tiến hành các kỹ thuật chuyển nạp gen: dung hợp tếbào trần tạo tế bào lai mang đặc điểm của cả tế bào bố và tế bào mẹ

1.2.2.3 Protease

Protease (peptit – hidrolase 3.4) là tên gọi chung cho nhóm enzyme xúctác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO-NH-)n trong phân tửprotein, polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin, pepton hoặc di-tripepton Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phõn liờn kết este

và vận chuyển axit amin [17]

Hình 1.4: Cấu trúc không gian của phân tử Protease

* Các loại protease:

Protease được phân loại dựa trên các đặc điểm riêng của chúng cũngnhư cấu tạo trung tâm hoạt động enzyme, hiện tại được chia làm hai loạiendopeptidase và exopeptidase

 Dựa vào vị trí tác động trên mạch polypeptide, exopeptidase được chia làmhai loại:

Aminopeptidase: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptid ở đầu Ncủa chuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, một dipeptid hoặc mộttripeptid

Cacboxypeptidase: xúc tác phản ứng thuỷ phân liên kết peptid ở đầu C củachuỗi polypeptide để giải phóng ra một axit amin, hoặc một dipeptid

 Dựa vào động học của cơ chế xúc tác endopeptidase được chia ra làmbốn nhóm:

Serine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –OH của gốc Serinetrong trung tâm hoạt động và có vai trò đặc biệt quan trọng trong hoạt động xúctác của enzyme Nhóm này bao gồm hai nhóm nhỏ: chymotripsin và subtilisin.Các serine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tínhđặc hiệu cơ chất tương đối rộng

Cysteine proteinase: là những proteinase chứa nhóm –SH trong trung tâmhoạt động Các cysteine proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính

và thể hiện tính đặc hiệu cơ chất tương đối rộng

Aspartic acid proteinase: hầu hết các aspartic proteinase đều thuộc nhómpepsin Nhóm pepsin bao gồm các enzyme tiờu hoỏ như pepsin, chymosin,rennin,… các aspartic proteinase có chứa các cacboxyl trong trung tâm hoạtđộng và thường hoạt động mạnh ở vùng pH trung tính

Metallo proteinase: Các metallo proteinase thường hoạt động mạnh ở vùng

pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới tác dụng của EDTA [18]

 Ngoài ra protease còn được phân loại theo cách đơn giản hơn thành

ba nhóm:

Trong công nghiệp chế biến thịt: Protease được dùng làm mềm thịt nhờ

sự thuỷ phân một phần protein trong thịt, kết quả làm cho thịt có một độ mềmthích hợp Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: nếu dùng axit để thuỷ phân

sẽ mất đi hoàn toàn các axit amin chứa lưu huỳnh, nếu dùng kiềm để thuỷphân sẽ bị rexamic hoá (chuyển dạng L sang dạng D làm giảm giá trị sinh họccủa axit amin) Ưu điểm của việc thuỷ phân protease bởi enzyme là bảo toànđược vitamin của nguyên liệu, không tạo ra các sản phẩm phụ, không làm sẫmmàu dịch thuỷ phân

Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm, thời gian chế biến

thường dài nhất, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc vào rất nhiều địaphương, phương pháp gài nén nguyên liệu cỏ Nờn hiện nay quy trình sản xuấtnước mắm đã được hoàn thiện trong đó sử dụng chế phẩm enzyme vi sinh vật đểrút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm

Trong công nghiệp sữa: Protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ

hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng Trong công nghiệp sản xuất bánh mỳ, bánhquy, … protease làm giảm thời gian trộn, tăng độ dẻo và làm nhuyễn bột, tạo độxốp và nở tốt hơn

Trong sản xuất bia: Chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc

làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc

Trong công nghiệp da: Protease được sử dụng làm mềm da nhờ sự thuỷ

phân một phần protein của da, chủ yếu là collagen, thành phần chính làm cho da

bị cứng Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻonhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da

Trong công nghiệp dệt: Protease được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ

nhân tạo (các sợi nhân tạo được bằng các dung dịch casein, gelatin) để sợi đượcbóng, dễ nhuộm Protease có tác dụng thuỷ phân lớp protein serisin đã làm dínhbết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các sợi tơ tằm, do đó làm giảmlượng hoá chất để tẩy trắng

Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong rất nhiều ngành khácnhư: điều chế dịch đạm thuỷ phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trongthực phẩm, và sản xuất một số thức ăn kiêng

CHƯƠNG 2 MỤC TIÊU, NỘI DUNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Mục tiêu nghiên cứu

Phân lập và tuyển chọn được một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinhaxit lactic và enzyme ngoại bào (amylase, cellulase và protease) cao

2.2 Nội dung nghiên cứu

- Phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn mẫu lànước bún ủ chua, nước dưa muối, cà muối, nem chua thu thập tại Hà Nội;

- Xác định hoạt tính một số enzyme ngoại bào (amylase, cellulase vàprotease) của các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn;

- Xác định một số đặc điểm hình thái khuẩn lạc, hình dạng tế bào, đặc điểmsinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic đã tuyển chọn được;

- Xác định một số nhân tố (nguồn cacbon, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy)ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme ngoại bào của các chủng đã tuyểnchọn;

- Xác định tên loài các chủng vi khuẩn lactic sinh enzyme ngoại bào cao đãđược tuyển chọn

2.3 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Vật liệu

2.3.1.1 Nguồn mẫu chứa vi sinh vật

Nguồn mẫu là từ nước bún ủ chua, nước dưa muối, cà muối và nem chuađược thu thập ở các chợ và một số gia đình làm bún thủ công tại Hà Nội

2.3.1.2 Hóa chất

Các hóa chất được sử dụng nhiều trong nghiên cứu là những hóa chất hiện

có ở phòng Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) do Việt Nam, Nhật Bản vàTrung Quốc sản xuất như cao thịt, cao nấm men, peptone, glucose, …

2.3.1.3 Dụng cụ

- Tủ cấy (Box laminar PII) – Đức

- Tủ ấm Memmert – Đức

- Tủ lạnh

- Tủ sấy

- Máy lắc ổn nhiệt

- Máy ly tâm Sigma – Mỹ

- Kính hiển vi điện tử Axio

- Kính lúp 3D

- Nồi hấp khử trùng Lequenx – Pháp

- Máy đo pH Accument – Mỹ

- Cân điện tử AL300 – Mỹ

Ngoài ra còn có rất nhiều dụng cụ phục vụ công tác nghiên cứu làm thínghiệm khác như hộp lồng (đĩa petri), ống nghiệm, pipet, bình tam giác với đủcác dung tích khác nhau, đèn cồn, que cấy, que gạt,…

2.3.1.4 Môi trường dùng trong nghiên cứu

Môi trường MRS (g/l) dùng cho giai đoạn phân lập và nuôi cấy vi khuẩn

lactic

Thạch - 15,0 g; Glucose - 20,0 g; CaCO3 - 5,0 g; Cao thịt - 10,0 g; Caomen - 5,0 g; Pepton - 10,0 g; Tween 80 - 1,0 ml; K2HPO4 - 2,0g; CH3COONa-5,0 g; Triamoniumcitrat - 2,0 g; MgSO4.7H2O - 0,58g; MnSO4.4H2O - 0,28 g;

H2O - 1000,0ml pH = 7, khử trùng ở 121oC/ 15 phút

Khi nuôi cấy vi khuẩn lactic với mục đích thu sinh khối hoặc thu nhận cácenzyme ngoại bào, axit lactic thì sử dụng môi trường MRS ở dạng dịch thểkhông bổ sung thạch và CaCO3

Môi trường nuôi cấy xác định các đặc điểm sinh lý, sinh hóa:

Các môi trường dùng cho bước xác định hoạt tính của các enzyme ngoạibào (amylase, cellulose, protease) của vi khuẩn lactic

Môi trường tinh bột (g/l) để xác định hoạt tính amylase.

Môi trường Casein (g/l) để xác định hoạt tính protease.

Thạch - 17,0 g; Casein không thủy phõn - 1,0 g;H2O - 1000,0 ml; pH = 7,khử trùng ở 121OC/ 15 phút

Chú ý: Với môi trường có chứa cơ chất là casein, phải hòa tan caseintrong dung dịch NaOH 0,1N đến khi casein tan hoàn toàn, sau đó chỉnh pHmôi trường bằng 7

Môi trường thạch thường (g/l) dùng cho bước kiểm tra hoạt tính kháng

khuẩn của vi khuẩn lactic

Thạch - 15,0 g; Pepton - 5,0 g; NaCl - 1,0 g; Cao thịt - 2,0 g;H2O - 1000,0ml; pH = 7, khử trùng ở 121OC/ 15 phút

2.3.2 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

2.3.2.1 Phân lập và thuần khiết giống

 Phân lập

Để phân lập được các chủng vi khuẩn lactic từ các nguồn mẫu trước tiêncần nuôi cấy mẫu trên môi trường chọn lọc của vi khuẩn lactic, đó là môi trườngMRS bằng phương pháp cấy gạt, sau đó dựa vào sự khác nhau về hình dạng,kích thước của khuẩn lạc hình thành trên đĩa thạch mà chọn ra được các chủngkhác nhau Cấy gạt mẫu được thực hiện theo phương pháp: cấy gạt hiếu khí.

Tiến hành:

- Lấy 1ml mẫu đem pha loãng đến nồng độ 10-4

- Dùng pipet hút 0.05 ml dịch mẫu ở nồng độ 10-4 nhỏ lên đĩa petri chứa môitrường MRS đặc

- Dùng que gạt, gạt đều cho dịch mẫu chải đều trên mặt thạch, khi gạt tuyệt đối không làm cày mặt thạch

- Đĩa thạch sau khi được cấy gạt, quấn prafilm và để trong tủ ấm ở 37OC trong 48 giờ

 Tinh sạch khuẩn lạc

Các đĩa petri đã cấy mẫu đặt trong tủ ấm sau 48 giờ đem ra kiểm tra, quansát sự xuất hiện cỏc vũng khuẩn lạc tuyển chọn những khuẩn lạc mọc riêng rẽ,hình thành tròn, có màu trắng đục, nhẵn và có vòng phân giải CaCO3, tiến hànhdùng que cấy vô trùng bắt lấy một khuẩn lạc trên cấy sang đĩa thạch MRS khác,khi cấy cần cấy theo đường zich zăc nhằm làm các khuẩn lạc mọc tách rời nhau

Các đĩa vừa cấy riêng mỗi loại khuẩn lạc được đánh ký hiệu khác nhau,càng tinh sạch được nhiều khuẩn lạc càng phân lập được nhiều chủng vi khuẩnlactic phục vụ cho các nghiên cứu về sau Các đĩa thạch này cũng được quấnparafilm và để trong tủ ấm 37OC, sau 48 giờ đem ra kiểm tra sự xuất hiện khuẩnlạc Vì mật độ tế bào giảm dần theo vết cấy cho nên sau khi ủ các khuẩn lạc xuấthiện thưa dần Những khuẩn lạc mọc riêng rẽ trên vết cấy cuối có nhiều khẳ năng

được hình thành từ một tế bào riêng rẽ, cần phân biệt được các khuẩn lạc đượchình thành do các tế bào tạp nhiễm.

Sau đó tiếp tục dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc mọc riêng rẽ cấychuyển sang ống thạch nghiêng chứa môi trường MRS, để vào tủ ấm 37OC, sau

48 giờ thì chuyển sang để trong tủ lạnh bảo quản ở 4OC để dùng cho nhữngnghiên cứu tiếp theo

2.3.2.2 Xác định đặc điểm hỡnh thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi khuẩn lactic.

 Xác định khả năng sinh axit lactic

Nguyên tắc: Để khẳng định được những chủng đã phân lập được là vi

khuẩn lactic cần tiến hành nuôi lắc ổn nhiệt trong môi trường chọn lọc đó là môitrường MRS dịch thể, nếu là vi khuẩn lactic, chúng sẽ sống trong môi trườngMRS và tạo sinh khối tế bào làm môi trường sau khi nuôi lắc bị vẩn đục

Tiến hành: Phương pháp được tiến hành theo các bước sau:

- Dùng que cấy vô trùng lấy một đầu que cấy sinh khối tế bào trong ốnggiống thạch nghiêng hoặc trong đĩa thạch, cấy vào môi trường MRS dịchthể trong bình tam giác nhỏ (50ml)

- Nuôi lắc trong tủ ấm 37OC, tốc độ lắc 200 vũng/phỳt, trong thời gian 48giờ

- Sau 48 giờ nuôi lắc đem ra kiểm tra, nếu bình môi trường bị vẩn đục tức là

đó cú chứa sinh khối của chủng vi khuẩn lactic cấy vào, ngược lại nếubình môi trường không thấy thay đổi màu sắc tức là chủng vi khuẩn nuôicấy trong đó không phải là vi khuẩn lactic

- Chọn cỏc bỡnh cú sinh khối vi khuẩn lactic, hút lấy dịch nuôi đem ly tâm

- Thu lấy dịch ly tâm và bảo quản ở 4OC để sử dụng cho các thí nghiệm sau.Khẳ năng sinh axit lactic mạnh hay yếu của các chủng vi khuẩn lacticđược xác định bằng phướng pháp chuẩn độ Therner Phương pháp này được tiếnhành như sau:

- Lấy 10ml dịch nuôi lắc đã ly tâm cho vào ống nghiệm, bổ sung thêm 20mlnước cất và 1- 2 giọt Phenolphtalein (nồng độ 1% trong cồn 90O)

- Chuẩn độ bằng dung dịch NaOH 0,1N đến khi dung dịch trong ốngnghiệm xuất hiện màu hồng nhạt bền trong 30 giõy thỡ dừng lại

- Ghi lại thể tích dung dịch NaOH 0,1N đó dựng để chuẩn độ

Độ axit được tính theo độ Therner theo công thức:

OT = VNaOH tiêu tốn x 10

% axit lactic = OT x 0,009Trong đó: OT là độ Therner, 1OT tương ứng với 9 mg axit

 Xác định khả năng sinh enzyme ngoại bào (amylase, cellulose, protease)

Trong quá trình sống, vi khuẩn lactic thực hiện trao đổi chất với môitrường nuôi cấy và sẽ tiết ra môi trường các loại enzyme ngoại bào Dựa vào đặcđiểm đó, để chọn lọc được các chủng vi khuẩn lactic có khả năng sinh một sốenzyme ngoại bào (amylase, cellulase, protease), dựa theo sự xuất hiện vòngphân giải cơ chất trên môi trường thạch có chứa cơ chất hay còn gọi là phươngpháp đục lỗ thạch Nếu trong dịch nuôi cấy của chủng nào có chứa enzyme ngoạibào (amylase, cellulase, protease), chúng sẽ khuếch tán vào môi trường thạch cóchứa cơ chất, làm cắt đứt các liên kết của hợp chất cao phân tử làm cho môitrường thạch có chứa cơ chất không còn khả năng bắt màu dung dịch thuốc

nhuộm và tạo thành một vòng tròn màu trắng xung quanh lỗ thạch và ta gọi đó làvòng phân giải.

Các bước tiến hành thử hoạt tính của một số enzyme ngoại bào (amylase,cellulase, protease) của vi khuẩn lactic như sau:

- Dựng nút khoan bằng ống nhựa đã được đo đường kính trước, đục lỗ thạchtrên đĩa petri của 3 loại môi trường: môi trường tinh bột, môi trường CMC,môi trường Casein

- Với mỗi chủng vi khuẩn lactic tiến hành nhỏ 0,1 ml dịch ly tâm đã thu vào lỗthạch

- Sau khi nhỏ lỗ để đĩa thạch trong tủ lạnh ở 4OC khoảng 2 giờ nhằm mục đích

để dịch ly tâm khuếch tán đều vào trong thạch

- Để vào tủ ấm 37OC sau 48 giờ để cho lượng dịch trong lỗ thạch khuếch tán hết.Với đĩa thạch thử hoạt tính amylase và cellulase tiến hành đổ dungdịch Lugol nhuộm màu để quan sát vòng phân giải tinh bột và vòng phângiải CMC Khác với phương pháp xác định hoạt tính của hai enzymeamylase và cellulase, phương pháp xác định hoạt tính của enzyme protease

có vài điểm khác biệt như sau:

- Sau 48 giờ nuôi lắc các chủng vi khuẩn lactic trên môi trường MRSkhông bổ xung cơ chất, tiến hành nhỏ trực tiếp dịch vi khuẩn lactic vào

lỗ thạch và để trong tủ ấm 37OC trong 48 giờ ( không cần ly tâm đểloại bỏ cặn tế bào)

- Đĩa thạch thử hoạt tính protease không cần dùng đến thuốc nhuộm mà

có thể trực tiếp quan sát vòng phân giải cơ chất trên môi trường thạch Hoạt tính của các enzyme ngoại bào được xác định bằng cách đo đường