luận văn công nghệ thực phẩm Nghiên cứu sự nhiễm khuẩn một số chỉ tiêu vi sinh vật trong tương Bần trên địa bàn thành phố Thái Nguyên

Trong sốnhững loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp, 3 lọai vi khuẩn Clostridium perfringens, Coliform và Escherichia coli thường thấy nhiều và phổ biến trong các loại thực phẩm

Để hoàn thành được khóa luận tốt nghiệp này tôi đã nhận được sự hướngdẫn, giúp đỡ, chỉ bảo và động viên của thầy cô, bạn bè và gia đình

Trước tiên tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s Nguyễn Thị LanHương và Th.s Lương Hùng Tiến đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọiđiều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ nhân viên khoa xét nghiệm Trung tâm y tế dự phòng Thỏi Nguyờn đã cho phép và tạo điều kiện cho tôitrong quá trình hoàn thành khóa luận

-Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong ban chủ nhiệm khoacông nghệ sinh học và công nghệ thực phẩm đã dạy dỗ và giúp đỡ tôi trongsuốt thời gian qua

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã động viên,giúp đỡ, hỗ trợ để tôi có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Ngày … tháng … năm 2011

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Thanh Hoàn

DANH MỤC CÁC HèNH 8

Phần 1 9

MỞ ĐẦU 9

1.1 Đặt vấn đề 9

1.2 Mục đích và yêu cầu 10

Phần 2 11

TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

2.1 Giới thiệu về Tương Bần 11

2.1.1 Tương Bần trong nét đẹp ẩm thực Việt Nam 11

2.1.2 Thuyết minh quy trình sản xuất tương Bần 11

2.1.3 Thực trạng sản xuất tương Bần và vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm.13 2.2 Quy đinh giới hạn vi sinh vật trong tương Bần 14

2.3 Một số vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thường gặp 15

2.3.1 Clostridium perfringens (C perfringens) 15

2.3.2 Coliform 19

2.3.3 Escherichia coli (E coli) 20

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 25

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 25

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 25

Phần 3 27

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 27

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 27

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành 27

3.3 Nội dung nghiên cứu 27

3.4 Phương pháp nghiên cứu 27

3.4.1 Trang thiết bị và y dụng cụ dùng trong kiểm nghiệm 27

Các trang thiết bị và y dụng cụ gồm: 27

3.4.2 Phương pháp lấy mẫu 27

Số lượng quầy 28

Tổng số mẫu 28

(Nguồn: Kết quả điều tra) 28

3.4.3 Phương pháp định lượng vi khuẩn C perfringens trong Tương Bần 28

3.4.4 Phương pháp định lượng tổng số Coliform 30

3.4.5 Phương pháp định lượng tổng số E coli 32

3.5 Phương pháp xử lý số liệu 39

Số liệu được xử lí bằng phần mềm Office - Microsoft Excel và các phương pháp thống kê thông thường 39

4.1 Xác định chỉ tiêu C perfringens trong tương Bần 40

4.2 Xác định chỉ tiêu Coliform trong tương Bần 41

4.3 Xác định chỉ tiêu E coli trong tương Bần 43

4.4 So sánh tỷ lệ nhiễm các loại khuẩn trong tương Bần 45

4.5 Xác định tần xuất nhiễm các loại vi khuẩn Coliform, E coli và C perfringens trong tương Bần 46

4.6 So sánh các sản phẩm tương Bần không đạt tiêu chuẩn thực phẩm 47

4.7 Xác định đặc tính sinh vật hóa học của vi khuẩn E coli 49

Phần 5 51

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 51

5.1 Kết luận 51

5.2 Kiến nghị 52

PHỤ LỤC ẢNH 55

55

55

55

Hình 1: Hình thái và tính chất bắt màu Hình 2: Hình thái và tính chất bắt 55

Gram dương của vi khuẩn C.perfringens màu của vi khuẩn E coli 55

Hình 3: khuẩn lạc C perfringens trờn Hỡnh 4: Khuẩn lạc E coli trên

thạch 55

thạch Wilson Blair MacConkey 55

Hình 5: Coliform trên môi trường BGBL Hình 6: Khuẩn lạc E coli trên thạch Endo 56

56

56

A B A B 56

Hình 7: Thử nghiệm sinh indol Hình 8: Thử nghiệm Urea Indol 56

A: Phản ứng indol âm tính với E coli A: Phản ứng Urea âm tính với E.coli 56

B: Phản ứng indol dương tính với E col.i B: Phản ứng Indol dương tính với E coli 56

56

56

56

56

56

A B A B 56

Hình 9: Thử nghiệm đặc tính E.coli trên Hình 10: Thử nghiệm đặc tính E.coli 56

môi trường KIA trên môi trường Mannitol di động 56

A: Môi trường KIA màu đỏ A: Môi trường Mannitol di động màu 56

B: Phản ứng dương tính, E coli sử dụng đỏ da cam 56

đường glucose, lactose và sinh khí đẩy B: Phản ứng dương tính, E coli sử 56

môi trường lên trên và chuyển sang màu đường Mannitol, vi khuẩn di động lan 56

vàng chanh Phản ứng âm tính với H2S ra khỏi đường cấy 56

Bảng 2.1: Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong tương Bần

STT 14 Tên chỉ tiêu

Đơn vị 14 Giới hạn tối đa

1 14 Coliform 14 MPN/ml 14 102 14 2 14 MPN/ml 14 0 14 3 14 Clostridium perfringens

CFU/ml 14 10 14 (Nguồn: QĐ số 46/2007/ QĐ – BYT)

Bảng 4.1: Kết quả xác định chỉ tiêu C perfringens trong mẫu tương Bần

Bảng 4.2: Kết quả xác định chỉ tiêu Coliform trong mẫu tương Bần

Bảng 4.3 Kết quả xác định chỉ tiêu E coli trong mẫu tương Bần

Bảng 4.4: Tỷ lệ nhiễm khuẩn trong tương Bần

Bảng 4.5: Kết quả xác định tần xuất nhiễm các loại vi khuẩn trong tương Bần

Bảng 4.6: So sánh các sản phẩm tương Bần không đạt tiêu chuẩn thực phẩm

Hình 4.1: Đồ thị mức độ nhiễm khuẩn C perfringens trong tương Bần 41

Hình 4.2: Đồ thị mức độ nhiễm khuẩn Coliform trong tương Bần 42

44

Hình 4.3: Đồ thị mức độ nhiễm khuẩn E coli trong tương Bần 44

Hình 4.4: Biểu đồ so sánh tỷ lệ nhiễm khuẩn trong tương Bần 46

vụ ngộ độc hàng loạt trên 30 người xảy ra tại 47 tỉnh/thành, làm 5.664 ngườimắc và 42 trường hợp tử vong; so sánh với số liệu trung bỡnh/năm của giaiđoạn 2006 - 2009, số vụ ngộ độc thực phẩm giảm 9,1%, số mắc giảm 17,6%

và số tử vong giảm 19,2%”

Tuy nhiên số vụ ngộ độc thực phẩm vẫn gia tăng chủ yếu là do công tác

vệ sinh an toàn thực phẩm chưa được coi trọng, nhất là trong quá trình bảoquản, chế biến và tiêu thụ thực phẩm Chính vì vậy, ngộ độc liên tiếp xảy ratrờn cỏc quỏn hố phố, bếp ăn tập thể và ngay cả trong mỗi gia đình, gây ảnhhưởng lớn tới sức khỏe con người, thậm chí còn dẫn tới tử vong

Có rất nhiều nguyên nhân khác nhau dẫn tới các vụ ngộ độc thực phẩmxong phần lớn các trường hợp có nguồn gốc từ vi sinh vật gây ra Do có kíchthước rất nhỏ bé mắt thường không thể nhìn thấy được, trong khi khả nănggây bệnh và nguy cơ lây nhiễm rất cao và có thể trở thành một dịch bệnh lâylan ra cả cộng đồng Việc lựa chọn thức ăn đã trở thành bài toán khó chongười tiêu dùng có thể chọn cho mình được loại thực phẩm tốt, an toàn chomỗi bữa ăn Vì vậy công tác kiểm nghiệm chất lượng thực phẩm có vai trò rấtquan trọng trong việc bảo vệ sức khỏe con người, góp phần giảm nguy cơ lâynhiễm thành dịch bệnh và nâng cao chất lượng đời sống dân sinh Trong sốnhững loại vi khuẩn gây ngộ độc thực phẩm thường gặp, 3 lọai vi khuẩn

Clostridium perfringens, Coliform và Escherichia coli thường thấy nhiều và

phổ biến trong các loại thực phẩm thông thường như trong tương Bần

Tương Bần là một loại thực phẩm ngon, rẻ tiền và được làm nước chấmkhông thể thiếu trong nhiều món ăn Tuy nhiên với phương pháp làm thủcông, lên men theo phương pháp truyền thống, nếu công tác vệ sinh an toànthực phẩm của các cơ sở sản xuất chưa thực sự được chú trọng, thì rất dễ có

khả năng nhiễm khuẩn (Clostridium perfringens, Coliform và Escherichia coli) vào trong tương Bần, có thể gây ngộ độc thức phẩm, ảnh hưởng xấu tới

sức khỏe con người Vì vậy, tụi đó lựa chọn đề tài: “Nghiờn cứu sự nhiễm khuẩn một số chỉ tiêu vi sinh vật trong tương Bần trên địa bàn thành phố Thỏi Nguyờn”.

1.3 Ý nghĩa của đề tài

− Ý nghĩa trong học tập nghiên cứu khoa học

Giúp sinh viên củng cố và hệ thống lại các kiến thức đã học vànghiên cứu khoa học

Nắm được quy trình kiểm nghiệm Vi khuẩn C perfringens, Coliform

và E coli trong thực phẩm

− Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu của đề tài làm cơ sở khoa học để khuyến cáo chongười tiêu dùng về mức độ an toàn khi sử dụng tương Bần làm thực phẩm,nhằm góp phần nâng cao ý thức an toàn vệ sinh thực phẩm và bảo vệ sứckhỏe con người

Phần 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về Tương Bần

2.1.1 Tương Bần trong nét đẹp ẩm thực Việt Nam

Tương Bần là một loại tương được sản xuất ở thôn Bần Yờn Nhõn, trướcđây thuộc xã Văn Phú, huyện Mỹ Hảo (Thôn Bần Yờn Nhõn hiện nay đã đượcnâng lên thành thị trấn, thuộc tỉnh Hưng Yờn, cỏch Hà Nội 25 km)

Tương Bần xuất hiện ở nước ta từ khoảng cuối thế kỷ 19, khi đó tươngBần được biết đến là một loại thực phẩm dùng để tiến Vua, về sau tương Bần

đã trở thành món ăn đặc sản, và là một nét đẹp trong văn hóa ẩm thực ViệtNam Tương Bần là món ăn dân dã với hương vị thơm ngon, lại rẻ tiềnkhiến nó xuất hiện như một món ăn quen thuộc và không thể thiếu trongnhững bữa cơm của người dân Việt mà hễ ai đi xa quê đều không thểkhông nhớ tới Tương Bần đã được dân gian đưa vào danh mục nhữngphẩm vật ngon nhất Việt Nam qua một tác văn vần có những câu như: Dưa

La, hỳng Lỏng, nem Báng, tương Bần, nước mắm Vạn Vân, cá rô ĐầmSét Tương Bần ngon nổi tiếng bởi mỗi một công đoạn trong quá trình làmtương đều được chăm chút tỉ mỉ Ngay từ khâu chọn nguyên liệu đã đượcngười làm tương chú trọng, rồi cỏc khõu ủ lên men để trở thành tươngthành phẩm

2.1.2 Thuyết minh quy trình sản xuất tương Bần

2.1.2.1 Dụng cụ, nguyên liệu và xử lý nguyên liệu

2.1.2.1.1 Dụng cụ

Cối xay đá: xay vỡ hạt đỗ tương sau khi rang chín

Nồi đồng hoặc chõ : để nấu xôi

Chảo gang : có đường kính khoảng 100cm để rang đỗ

Nong, nia: dày khoảng 2-3cm, để tãi cơm và ủ mốc

Chum sành: có nhiều loại 50l, 80l, 100l

2.1.2.1.2 Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu:

Đỗ tương được rửa sạch và ngâm qua đêm

Gạo nếp: Nếp cái hoa vàng, khụng vũ kỹ mà chỉ xát nhẹ để gạo giữ đượclớp vỏ cám bên ngoài góp phần làm tương thêm vị ngọt

Muối: Muối được dùng là muối tinh khiết

Nước: được lấy từ nhiều nguồn: nước mưa, giếng khoan và nước máy

2.1.2.2 Làm tương

Làm mốc: Gạo nếp cho vào chậu nước khoảng 6 giờ rồi vớt ra, đợi nướcsôi mới cho gạo vào chõ để đồ thành xụi Xụi chín tới mang dỡ tơi ra nia,hoặc mẹt, xếp một lượt lỏ nhón hoặc vải màn, ủ chờ lên mốc Ủ hai ngày đêmcơm xôi xuất hiện nấm mốc tơ trắng, cậy mốc ra đảo cho mốc rời từng hạt vàtãi đều ra nia, phủ vải màn ủ tiếp, đến 3 hoặc 4 ngày sau nấm mốc phát triển,khi mở vải ra xem thấy mốc lên đều, ngả màu hoa cau, hoặc hoa thiên lý thì

hạ nia dùng nậy mốc (hay gọi là xẻng nậy mốc) bậy, lấy mốc ra bóp nhỏ trộnđều chuẩn bị muối mốc

Rang đỗ: Đỗ được rang trong chảo, rang phải nhỏ lửa, đảo đều, cho tớikhi đỗ chín vừa tầm, vỏ ngoài vẫn giữ được màu trắng nhưng cùi đỗ thì chínvàng, tỏa mùi thơm Rang đỗ xong cho vào cối đá xay nát đỗ ra, ngày hômsau cho vào chum sành, đổ nước vào ngâm Chum nước đỗ tương phải để chỗrâm mát, nhiệt độ vừa phải, không để núng quỏ nước tương mau ngả mùi thiu.Muối mốc (ủ mật): Mốc ủ 7 ngày ngả màu hoa cau, hoa thiên lý thì mang

ra bóp nhỏ, vẩy nước tương trong (nước ngâm đỗ chưa có muối) trộn đều.Bốc mốc trộn nước tương cho vào thúng ủ kín 3 đến 4 ngày

Lọc nước muối: Muối trắng tinh cho vào chậu đổ nước mưa hay nướcngầm vào quấy đều để đất cát lắng xuống đỏy, vỏng nổi lên mặt nước và lọcnước muối trong ra một chậu khác

Ngả tương: Cho nước muối vào chum trước, tiếp theo là nước tươngcùng bột đậu, sau cùng cho mốc đã được muối vào chum, sau đó quấy tương

và đánh tan mốc hoà với đỗ tương, nước muối Lượng muối cần điều chỉnh

cho vừa phải, không được mặn quá sẽ làm tương mất vị ngọt, cho nhạt tương

dễ chua, không để được lâu

Đánh tương: Tương sau khi ngả phải được đánh thường xuyên, buổisáng ngả buổi chiều cần đánh đều từ dưới lên và phơi nắng cho đến tối thì đậynắp lại Việc đánh mốc phải làm liên tục khoảng một tháng để cho bay hết hơimốc và tương chìm xuống, nước cốt tương nổi lên Tương cần được phơinắng ít nhất 3 tháng cho ngấu mới lấy ra Đến khi nào tương đạt chuẩn màuvàng sẫm như mật ong, hoặc màu cánh gián Tương rót ra sánh đặc không cómùi ngái, dậy lên mùi thơm Nếm tương có vị bùi béo, đậm vị ngọt mặn làtương tốt, để được lâu

2.1.3 Thực trạng sản xuất tương Bần và vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm

Ngày nay ta có thể tìm thấy tương Bần được bày bỏn khỏ phổ biến trongcác gian hàng thực phẩm với nhiều loại thương hiệu, thể tích khác nhau vàcũng có cả những loại tương không thấy cú nhón mỏc, không rõ nguồn gốcxuất xứ, được bán với giá rẻ hơn các loại tương có thương hiệu Liệu nhữngsản phẩm này có đảm bảo chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm? Đú chớnh làcâu hỏi và mối lo ngại của người tiêu dùng, cũng như là một rào cản để tươngBần trở thành một thực phẩm chiếm lĩnh thị trường trong và ngoài nước.Trên thực tế ở nước ta tương Bần được sản xuất theo phương thức lênmen thủ công Các công đoạn làm tương diễn ra hết sức đơn giản và có nguy

cơ nhiễm khuẩn cao nếu người làm tương không đảm bảo được các vấn đề về

an toàn vệ sinh thực phẩm Qua các đợt thanh tra kiểm tra của Cục An toàn vệsinh thực phẩm và Trung tâm y tế dự phòng cho biết đa phần các cơ sở sảnxuất tương Bần chưa chú trọng tới vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm, khu vựcchế biến nguyên liệu với những nia gạo lên men mốc xanh, mốc vàng đượcđặt ngay dưới sàn nhà ẩm thấp Những giá cơm thiu đặt ngổn ngang trong nhàchứa Không những vậy, hàng trăm chum tương mở nắp để phơi nắng, thu hútnhiều ruồi, muỗi bõu bỏm, thậm chí có cả những chum tương có cả xác ruồinhặng Chai đựng sản phẩm có cả những vỏ nhựa được tái sử dụng Phần lớn

những người lao động trong các cơ sở chế biến đều không đeo găng tay haymặc quần áo bảo hộ Có nhiều cơ sở cũng chưa được cấp giấy chứng nhận đủđiều kiện về an toàn vệ sinh thực phẩm, chưa có công bố tiêu chuẩn chấtlượng sản phẩm, cùng với đú, cỏc trang thiết bị phục vụ chế biến đều khôngđạt tiêu chuẩn Đặc biệt, trờn nhón mỏc không ghi rõ nhà sản xuất, hạn sửdụng đối với từng đơn vị tương thành phẩm

Tuy tương Bần có chứa muối, giúp cho tương có vị mặn và có khả năngkháng khuẩn, ức chế được một số loại vi khuẩn chịu được ở nồng độ muốithấp Nhưng việc thêm muối bao nhiêu tùy thuộc ở mỗi công thức của ngườilàm tương, có người chỉ cho ít muối để tương có vị ngọt dễ ăn, tuy nhiên lạilàm giảm khả năng bảo quản của tương Những người làm tương lâu năm chobiết tương phải ủ ít nhất 6 - 8 tháng để đảm bảo quân bình âm dương tức là đủthời gian cho tương ngấu Nhưng hiện nay có nhiều cơ sở làm tương chạytheo lợi nhuận sản xuất với số lượng lớn, mà tương vừa ngả đã mang ra thịtrường tiêu thụ, những loại tương này thường rất loóng, ớt muối, có vị ngọt và

để lâu sẽ bị chua, tức là tương đã bị nhiễm khuẩn nên thời hạn sử dụng ngắn

và không đảm bảo cho người sử dụng

2.2 Quy đinh giới hạn vi sinh vật trong tương Bần

Theo quy định của Bộ Y tế ban hành (2008) [5], các loại nước chấm cónguồn gốc thực vật trong đó có tương Bần thì giới hạn vi sinh vật được ápdụng theo tiêu chuẩn sau:

Bảng 2.1: Quy định giới hạn cho phép vi sinh vật trong tương Bần

(Nguồn: QĐ số 46/2007/ QĐ – BYT)

2.3 Một số vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm thường gặp

2.3.1 Clostridium perfringens (C perfringens)

C perfringens lần đầu tiên được biết đến là một nguyên nhân gây nhiễm

trùng vết thương nghiêm trọng Đến năm 1892, Welch đã phân lập và đặt tên

là Clostridium Welchii Tiếp đú nú lại được đề cập vào năm 1895 và 1899 với

sự bựng phỏt của bệnh viêm dạ dày, ruột ở bệnh viện St Bartholomew's,

London, cho đến giữa những năm 1940 với tên gọi C perfringens là nguyên

nhân của ngộ độc thực phẩm tại trường học ở Anh (1943) và món gà nấu sẵn

tại Mỹ (1945), Mặc dù C perfringens là không phải là nguyên nhân gây ngộ

độc thực phẩm nghiêm trọng nhưng là loại gây bệnh phổ biến trong các vụngộ độc thực phẩm [16], [20]

C perfringens là một vi khuẩn điển hình về type huyết thanh gây ngộ độc thực phẩm trong giống Clostridia, chúng chiếm vị trí khá đặc biệt vì loại

khuẩn này đồng thời là tác nhân gây bệnh do ngộ độc thực phẩm và cũng là

tác nhân gây ngộ độc thực phẩm Một mặt C perfringens gây bệnh khi nạn

nhân ăn có chứa một lượng lớn tế bào sống vi khuẩn, mặt khác chỳng cũnsinh độc tố gây ngộ độc, chúng thường tạo bào tử trong những điều kiện kịkhí thuận lợi ở ruột non [4]

C perfringens dễ thấy được ở thịt nguyên liệu, thịt gia cầm, chim, thú

săn bắt được và cả gia vị Chúng thường cư trú trong ruột người và động vật,chúng phổ biến trong tự nhiên ở đất, nước, phõn, rỏc, bựn, ao hồ …Chỳngnhiễm vào thực phẩm bằng nhiều cách và ở trong các sản phẩm thực phẩm

và sẽ phát triển Chúng chịu được một số tác động bên ngoài, như gianhiệt cao trong chế biến, chả rán hoặc giò luộc vẫn có thể có loài vi khuẩnnày còn sống [12]

Các nhà điều tra ở Mĩ đã phát hiện ra có khoảng 2 - 6% dân số mangchủng chịu nhiệt, khoảng 20 - 30% nhân viên y tế và gia đình là người lànhmang trựng Cỏc chủng vi khuẩn không chịu nhiệt rất phổ biến trong ống tiêuhóa của người khỏe mạnh [18]

2.3.1.1 Đặc điểm hình thái và tính bắt màu của C perfringens

C perfringens là một loại trực khuẩn ngắn, hai đầu hơi tròn, hình gậy, có

kích thước từ 0,6 - 0,8µm x 2 - 4µm Vi khuẩn không di động, hình thànhgiỏp mụ trong cơ thể động vật Vi khuẩn hình thành nha bào trong môi trườngtrung tính hoặc kiềm, nha bào to hơn thân vi khuẩn, có hình oval cân xứnghay lệch tâm Vi khuẩn bắt mầu Gram dương [7], [16], [22]

2.3.1.2 Đặc điểm nuôi cấy

− C perfringens là một vi khuẩn kị khí vì vậy trong quá trình nuôi cấy

phải đảm bảo môi trường không có oxi

− Nhiệt độ thích hợp để phát triển từ 200C - 500C, tốt nhất từ 370C

-450C, hình thành bào tử trong môi trường Ellner ở nhiệt độ 370C đến 400C pH

thích hợp cho sự phát triển của C perfringens từ 5,5 - 8,0 Vi khuẩn này có

thể mọc ở hoạt độ nước từ 0,95 - 0,97 trong môi trường có sucrose hoặc

NaCl Chúng mọc tốt nhất ở điểm đẳng điện (Eh) + 320 mv C perfringens

cần ít nhất 13 acid amin cho quá trình phát triển cùng với biotin, pantotheate,pyridoxal và các thành phần khác [18]

− Trong môi trường nuôi cấy nhân tạo C perfringens rất ít khi tạo bào

tử, tuy nhiên có thể quan sát được bào tử khi nuôi cấy trong môi trườngEllner, môi trường có bổ sung muối mật và bicarbonate hay quinoline [13]

− Nuôi cấy trên môi trường thạch Wilson Blair hoặc thạch Perfringenssau 24h cho khuẩn lạc đen, tròn, có đường kính > 3mm Trong môi trườngnuôi cấy bổ sung thêm natrisunfat, do vi khuẩn kị khí sẽ oxi hóa cơ chất bằngoxi của gốc sunfat và sunfat, đây cũng là chất nhận hidro cuối cùng để bị khửthành H2S (quá trình phản sunfat) [14]

−Trên môi trường thạch máu: hình thành các khuẩn lạc tròn, trơn, sáng,bao quanh bởi 1 vùng dung huyết kép (double haemolysis)

−Khi nuôi cấy vào môi trường sữa quỳ (Litmus milk medium): vi khuẩnphát triển tạo thành dạng vẩn mây điển hình do đường lactose trong môi

trường bị lên men, tạo ra acid, làm đụng vún casein và làm chuyển màu môitrường, từ màu xanh da trời thành màu hồng

−Vi khuẩn C perfringens lên men đường glucose, lactose, sucrose,

maltose, fructose, mannose, không lên men đường arabinose, xylose

−Thử nghiệm sinh hóa

Tùy theo chủng bào tử có thể chống chịu được nhiệt độ hay không từ 1

-30 phút ở 1000C Phần lớn các chủng nhạy cảm với nhiệt độ nhưng nhữngchủng gây bệnh (gây nhiễm độc) lại chịu được nhiệt độ cao Các bào tử sốngsót rất lâu trong môi trường và chịu được điều kiện lạnh đông

C perfringens sinh sản chậm ở 140C, sinh sản cực nhanh ở 410C, các tếbào sinh sản nhạy cảm với nhiệt độ lạnh (dưới 100C) và với nhiệt độ lạnhđông Một vài chủng bị ức chế bởi nitrit natri và muối ăn (2,5 ữ 6,5%), nhưngphần lớn có khả năng chịu được nồng độ muối cao Ngược lại với bào tử, các

tế bào sinh sản và độc tố của chúng rất nhạy cảm với thanh trùng Pasteur [9]

2.3.1.4 Tính gây bệnh:

− C perfringens sinh ra ngoại độc tố, có tác động mạnh gây hoại tử các

tổ chức liên kết làm nhiễm độc thần kinh Chúng gây bệnh cho người, thườnggây bệnh hoại thư sinh hơi ở các vết thương, kèm theo nhiễm độc toàn cơ thể

có thể gây ra tử vong Khi vi khuẩn xâm nhiễm vào thức ăn với một lượngnhất định sẽ gây ra ngộ độc thực phẩm

− C perfringens có 5 type A, B, C, D, E cú cỏc loại độc tố, tính chất gây

bệnh và đối tượng khác nhau

Type A thường gây ra ngộ độc thức ăn, gây viêm ruột hoại tử ở người vàđộng vật (bê, thỏ ), với các độc tố chủ yếu là Alpha (Alpha- toxin), có vai tròquan trọng nhất và nó có khả năng gây chết làm tan máu và gây hoại tử tổchức, các bào tử của type này được phân bố rộng rãi trong môi trường, vàthường có trong đất đặc biệt là đất mùn [16], [22].

Type B có khả năng sản sinh nhiều loại độc tố như: Alpha, Beta,Epsilon, Muy, Lamda, Theta gây bệnh chủ yếu ở dê con, ngựa con [14].Type C gây viêm ruột hoại tử ở trẻ em, trên gia súc thường gặp ở bê, nghộ, dê cừu, lợn con Type này thường sản sinh ra một số loại độc tố chủ yếu

như: Alpha, Beta (là độc tố chính gây ra viêm ruột hoại tử) và các độc tố thứyếu như: Lamda, Delta, Kappha, Gamma [18], [20]

Type D sản sinh độc tố chủ yếu là: Alpha và Epsilon và các độc tố thứyếu như: Beta, Gamma, Muy, Lamda, Kappa Tính gây bệnh thường gặp củatype này là nhiễm độc ruột - huyết và nhuyễn thận ở người và nhiều loài độngvật như cừu, trâu bò, dê và một số loài khác Độc tố Epsilon có khả năng tựgia tăng tính thẩm thấu trong đường ruột để hấp thu nhiều nhất vào hệ tuầnhoàn và đến cả não Độc tố phá huỷ vi mạch ở tổ chức, gây thẩm suất dịch vàphù cấp tính, vì vậy nên ngoài tên gọi là độc tố đường ruột (Enterotoxin),Epsilon - toxin còn được gọi là độc tố thần kinh (Neurotoxin) [22], [15]

Type E thường gây nhiễm độc ruột, gây bệnh lỵ, độc tố chủ yếu do typenày sản sinh ra là: Alpha, Iota [22]

2.3.1.5 Ngộ độc do C perfringens:

− Triệu chứng ngộ độc thực phẩm: C perfringens gây ngộ độc thường

không sốt, triệu chứng đặc trưng bởi buồn nôn, đau bụng và tiêu chảy, thường

ít ói mửa Thời gian ủ bệnh là 8 – 24 giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm nhiễm

một lượng lớn C perfringens, bệnh thường tự khỏi và tử vong thường không

xảy ra nên không cần phải đến bệnh viện, tuy nhiên với những người cao tuổi

và người có hệ miễn dịch yếu hay đang bị tổn thương cần phải đặt dưới sựgiám sát chặt chẽ của các bác sĩ [9], [10], [16].

− Cơ chế gây ngộ độc và gõy viờm nhiễm ruột ở người và động vật:

C perfringens xâm nhập vào cơ thể từ nguồn thức ăn bị nhiễm khuẩn

hoặc có sẵn ngay trong hệ vi sinh vật đường ruột, cùng với một số thay đổiđột ngột về môi trường, khẩu phần thức ăn, thức ăn chứa nhiều protein hoặc

do lao tổn quá mức, dẫn tới cơ thể bị giảm nhu động ruột, giữ lại vi khuẩntrong cơ thể và cuối cùng thì cơ thể hấp thu các độc tố gây bệnh Cacbonhydrat không tiêu hoá được là môi trường thuận lợi cho vi khuẩn

C perfringens sinh trưởng và phát triển nhanh chóng Bình thường, vi khuẩn

này có nhiều ở ruột già nhưng khi sức đề kháng của cơ thể giảm, vi khuẩn lạixâm nhập lên ruột non và sản sinh ra một lượng lớn độc tố, gây nhiễm độchuyết đường ruột Trong đường tiờu hoỏ, với sự bội nhiễm về số lượng, vi

khuẩn C perfringens tấn công vào lớp màng nhày rồi vào lớp biểu mô ruột,

dưới tác dụng của độc tố gây xuất huyết, hoại tử tổ chức nhung mao ruột, từ

đó lan dần vào sâu tới các lớp niêm mạc ruột Trong nhiều trường hợp, vikhuẩn xâm nhập sâu vào thành ruột tạo thành những ổ viêm nhiễm, gõy khớthũng dưới lớp niêm mạc hoặc lớp cơ hay đi sâu vào trong các tổ chức haycác hạch lympho lân cận [22]

được định nghĩa là các vi khuẩn có khả năng lên men sinh hơi trong khoảng

48 giờ khi được ủ ở 370C trong môi trường canh Lauryl Sulphate và canh

Brilliant Green Lactose Bile Salt Nhóm Coliform có mặt rộng rãi trong tự

nhiên, trong ruột người, động vật

Coliform được xem là nhóm vi sinh vật chỉ thị Số lượng hiện diện của

chúng trong thực phẩm, nước hay các loại mẫu môi trường được dùng để chỉthị khả năng hiện diện của các vi sinh vật gây bệnh khác Nhiều nghiên cứu

cho thấy khi số Coliform của thực phẩm cao thì khả năng hiện diện của các vi

sinh vật gây bệnh khác cũng cao Tính chất sinh hóa đặc trưng của nhóm nàyđược thể hiện qua các thử nghiệm Indol, Methyl Red, Voges Proskauer và

Citrate thường được gọi chung là IMViC Coliform gồm 4 giống Escherichia, Citrobacter, Klebsiella và Enterobacter.

Coliform phát triển tốt trên nhiều loại môi trường, nhiều loại thực phẩm.

Có những nghiên cứu cho thấy chúng có thể phát triển ở nhiệt độ thấp đến-20C và cao đến 500C Trong thực phẩm chúng phát triển yếu và rất chậm ở

50C Ngưỡng pH để Coliform phát triển từ 4,4 - 9 Chúng phát triển tốt trên

môi trường thạch thường, cho những khuẩn lạc thấy được sau 12 - 16 giờ ở

370C, phát triển tốt ở rất nhiều loại thực phẩm trong điều kiện thích hợp

Số lượng Coliform trong mẫu nước, thực phẩm chứa mật độ thấp của

nhóm vi khuẩn này có thể xác định bằng phương pháp MPN (Most ProbableNumber)

Đặc điểm gây bệnh của các chủng Coliform có trong hệ tiêu hóa của

người bình thường là vô hại, chúng là những tác nhân gây bệnh cơ hội, chúngchỉ gây bệnh ở những người có hệ miễn dịch bị tổn thương [4]

2.3.3 Escherichia coli (E coli)

Vi khuẩn E coli trước đây gọi là Bacterium coli commune hay Bacilus coli communis Thuộc họ Enterobacteriaceae, giống Escherichia, loài Escherichia coli.

Năm 1885, E coli lần đầu tiên được Thedor Escherich phân lập từ phân của trẻ em Từ đó E coli trở thành mối quan tâm của các nhà khoa học và là đối tượng nghiên cứu khá hấp dẫn, do vậy cho tới ngày nay E coli là một trong những loài sinh vật sống được con người hiểu biết rõ nhất E coli là loài

vi khuẩn đường ruột gần như phổ biến ở người và động vật máu nóng, có thể

tìm thấy nhiều nhất trong ruột già của người và gia súc trưởng thành chiếm tới75% tổng số vi khuẩn ở đây [10], [14], [20].

Hầu hết cỏc dũng E coli không gây hại và đóng vai trò quan trọng trong việc ổn định sinh lý đường ruột Lợi chủng E coli thường xâm nhập vào

đường tiêu hóa của trẻ sơ sinh trong vòng vài giờ sau khi sinh Sự hiện diệncủa quần thể vi khuẩn trong ruột ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn có hại

và rất quan trọng để tổng hợp các dạng tiền vitamin B Tuy nhiên có 4 dòng

có thể gây bệnh cho người và động vật là Enteropathogenic E.coli (EPEC), Enterotoxigenic E coli (ETEC), Enteroinvasive E coli (EIEC) và E coli O157: H7 hay Enterohaemorrhagic (VTEC) Các loài E coli hiện diện rộng

rãi trong môi trường bị ô nhiễm phân hay chất thải hữu cơ, phát triển và tồn

tại rất lâu trong môi trường Do sự phân bố rộng nên E coli dễ dàng nhiễm

vào thực phẩm từ nguyên liệu hay thông qua nguồn nước trong quá trình sảnxuất chế biến [11], [13]

Từ ruột già, vi khuẩn E coli thường xuyên được bài xuất ra ngoài môi trường, do vậy E coli được chọn làm vi sinh vật chỉ thị xem sản phẩm cũng

như nguồn nước có nhiễm phân hay không, nó đại diện cho nhóm vi khuẩnquan trọng nhất trong việc đánh giá mức độ vệ sinh và nó có đủ các tiêuchuẩn lý tưởng cho vi sinh vật chỉ thị [12]

E coli là nguyên nhân gây ra một số bệnh ở người và động vật.

2.3.3.1 Đặc điểm hình thái và tính bắt màu

E coli là một trực khuẩn ngắn 2 đầu tròn, hiếu khí tùy tiện, kích thước

trung bình từ (0,3 – 0,6) x (2 - 3)μm, đường kính ngang tế bào dưới 1µm.Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn đứng riêng lẻ, đôi khi xếp thành chuỗingắn Trong môi trường nuôi cấy, có khi quan sát thấy những trực khuẩn dài

4 - 8 μm và thường gặp trong canh khuẩn già Phần lớn vi khuẩn E coli có

khả năng di động do cú tiờm mao quanh tế bào, nhưng cũng có một số chủngkhông có khả năng di động Vi khuẩn không sinh nha bào, có thể có giỏp mụ

Vi khuẩn bắt màu gram âm, có thể bắt màu đều hoặc sẫm ở hai đầu.Nhuộm vi khuẩn từ khuẩn lạc nhày có thể thấy giỏp mụ, quan sát bằng kínhhiển vi điện tử người ta còn phát hiện được cấu trúc pilli - yếu tố mang kháng

nguyên bỏm dớnh của vi khuẩn E coli [9], [10].

2.3.3.2 Đặc điểm nuôi cấy

− E coli là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng

và phát triển được ở nhiệt độ từ 15 - 240C, nhiệt độ thích hợp là 370C, pH

thích hợp 7,4 E coli phát triển dễ dàng trờn cỏc môi trường nuôi cấy thông

thường [16]

− Trên môi trường thạch thường: Vi khuẩn phát triển sau 24h hìnhthành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro hoặc trắng nhạt,hơi lồi, đường kính 2 - 3 mm Nuụi lõu khuẩn lạc trở thành gần như nâu nhạt

và mọc rộng ra Có thể quan sát thấy cả những khuẩn lạc dạng R (Rough) vàdạng M (Mucous)

− Môi trường nước thịt: Sau thời gian nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ

nuôi cấy, vi khuẩn E coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu

tro trắng nhạt lắng xuống đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên

bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối (phản ứng Indol dương tính)

− Môi trường Endo: E coli hình thành khuẩn lạc màu đỏ

− Môi trường MacConkey: E coli hình thành khuẩn lạc màu hồng

− Môi trường EMB : E coli hình thành khuẩn lạc màu tím đen

− Môi trường Wilson Blaire: E coli bị kiềm chế

− Môi trường Muler Kauffman: E coli không mọc

− E coli lên men sinh hơi các loại đường lactose, maltose, mannitol, mannose, xylose, saccarose, fructose, glucose, galactose Hầu hết E coli đều

lên men đường lactose và sinh hơi

− Thử nghiệm sinh hóa

+ H2S âm tính

+ Indol dương tính

+ Methyl Red dương tính.

+ Ureaza âm tính

2.3.3.3 Sức đề kháng

Như các vi khuẩn không sinh nha bào khác, E coli không chịu được

nhiệt độ Đun 550C/ 1h, 600C/ 30phút, đun sôi 1000C chết ngay Các chất sát

trùng thông thường axit phenic, formol có thể diệt E coli sau 5 phút, E coli

đề kháng với sự sấy khô, ở môi trường bên ngoài E coli độc có thể tồn tại đến

4 tháng [16]

2.3.3.4 Tính gây bệnh:

− E coli gõy viêm nhiễm có mủ ở nhiều nơi thường ở bộ phận niệu

-sinh dục (viêm bể thận, viêm bàng quang, viêm vòi trứng, viêm tinh hoàn) ởmàng bụng nhất là sau thủng ruột, nó có thể gây nhiễm trùng huyết Tính gâybệnh thường găp nhiều nhất là chứng ỉa chảy, đặc biệt ở trẻ em dưới 2 tuổi,bệnh này xảy ra có tính chất dịch tễ và gây tử vong tương đối cao [11]

− Cỏc dòng E coli gây bệnh thường gặp :

Enteropathogenic E.coli (EPEC) gây viêm ruột và gây ỉa chảy đa

phần là ở trẻ em dưới 2 tuổi, tuy nhiên cũng gặp ở người lớn và có thểtrở thành dịch

Enterotoxigenic E coli (ETEC) không giống như EPEC, ETEC gây tiêu

chảy cả ở trẻ em và người lớn và là một trong những nguyên nhân hàng đầucủa những người đi du lịch đến cỏc vựng lạ, gây ra những vụ ỉa chảy nặngkiểu giống tả [9]

Enteroinvasive E coli (EIEC) gây ra các vụ ỉa chảy giống lỵ, nhóm này

có khả năng gõy viờm kết giác mạc chuột lang kiểu xâm nhập [11]

Enterohaemorrhagic (VTEC) hay E coli O157: H7, sản xuất ra

verotoxins có thể gây ra viêm đại tràng xuất huyết, tiêu chảy nhẹ, tuy nhiên

nó cũng có thể gây bệnh nghiêm trọng, gây buồn nôn, đi ngoài đẫm máu.VTEC còn là nguyên nhân hàng đầu của suy thận cấp tính ở trẻ em, có thểgây tử vong ở trẻ em từ 2 - 10 tuổi và những người trên 60 tuổi Những thực

phẩm dễ nhiễm vi khuẩn này là: xúc xích, nước trái cây, sữa chua,mayonnaise, rau bina, mầm cỏ đinh năng [16].

Vi khuẩn E coli có khả năng sản sinh hai loại độc tố: Độc tố chịu nhiệt

(Heat Stable Toxin - ST) và độc tố không chịu nhiệt (Heat Labile Toxin - LT)

Những chủng E coli sản sinh độc tố là nguyên nhân gây nên bệnh tiêu chảy ở

người Trong đó, độc tố chịu nhiệt ST (ST) chịu được 1200C trong vòng 1h vàbền vững khi ở nhiệt độ thấp (bảo quản ở 200C) nhưng bị phá hủy nhanhchóng khi hấp cao áp Còn độc tố không chịu nhiệt (LT) bị vô hoạt ở 600Ctrong vòng 15phút [18]

2.3.3.5 Ngộ độc do E coli

− Ngộ độc E coli xảy ra khi ăn phải thực phẩm có nhiễm E coli gây độc

còn sống Đặc điểm của các bệnh này là thời gian ủ bệnh và bị bệnh ngắn.Thời kỳ ủ bệnh 2 - 20 giờ Người ngộ độc thấy đau bụng dữ dội, đi phân lỏng,

ít khi nôn mửa, thân nhiệt có thể hơi sốt Trường hợp nặng bệnh nhân có thểsốt cao, người mỏi mệt, chân tay co quắp vã mồ hôi [7], [16]

− Cơ chế: Để có thể gây bệnh, trước hết vi khuẩn E coli phải bám dính

vào tế bào nhung mao ruột bằng các yếu tố bỏm dớnh như kháng nguyên F.Sau đó, nhờ các yếu tố xâm nhập (Invasion), vi khuẩn sẽ xâm nhập vào tế bàobiểu mô của thành ruột Ở đó, vi khuẩn phát triển, nhân lên, phá huỷ lớp tếbào biểu mụ, gõy viêm ruột, đồng thời sản sinh độc tố đường ruộtEnterotoxin Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối, nước,làm rối loạn chu trình này Nước từ cơ thể tập trung vào lòng ruột làm căngruột, cùng với khí do lên men ở ruột gây nên một tác dụng cơ học, làm nhuđộng ruột tăng, đẩy nước và chất chứa ra ngoài, gây nên hiện tượng tiêu chảy.Sau khi đã phát triển ở thành ruột, vi khuẩn vào hệ lâm ba, đến hệ tuần hoàn,gây nhiễm trùng máu Trong máu, vi khuẩn chống lại hiện tượng thực bào,gây dung huyết, làm cho cơ thể thiếu máu Từ hệ tuần hoàn, vi khuẩn đến các

tổ chức cơ quan Ở đây, vi khuẩn lại phát triển nhân lên lần thứ hai, phá huỷ

tế bào tổ chức, gõy viờm và sản sinh độc tố như: Enterotoxin, Verotoxin, pháhuỷ tế bào tổ chức, gây tụ huyết và xuất huyết

2.4 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

2.4.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Trong những năm gần đây, chưa tìm thấy có đề tài nghiên cứu nào vềthực trạng nhiễm vi sinh vật trong tương Bần Việc xác định sự nhiễm khuẩntrong tương Bần chỉ dừng lại ở việc thanh tra kiểm tra của Bộ Y tế và cácTrung tâm y tế dự phòng tại các cơ sở sản xuất và thị trường tiêu thụ tươngBần Tuy nhiên những kết quả chưa được công bố rộng rãi cho công chúngnắm được về mức độ an toàn vệ sinh thực phẩm khi sử dụng tương Bần làmthực phẩm Chính vì vậy đề tài “Nghiờn cứu sự nhiễm khuẩn của một số chỉtiêu vi sinh vật trong tương Bần” là một đề tài có tính ý nghĩa thực tiễn cao

2.4.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Trên thế giới, có rất nhiều loại thực phẩm giống với tương Bần của ViệtNam, đó là các thực phẩm được sản xuất từ đỗ tương lên men, được làm gia

vị và nước chấm trong nhiều món ăn, được đánh giá là loại thực phẩm có lợicho sức khỏe và có nhiều đề tài khoa học nghiên cứu về thực trạng nhiễm visinh vật trong những loại thực phẩm này

M J R Nout , D Bakshi và P K Sarkar nghiên cứu vi sinh vật an toàntrong Kinema, đây là một loại đậu nành lên men truyền thống của Nhật Bản vàcỏc vựng đồi núi của Ấn Độ Tác giả sử dụng đối tượng là 15 mẫu Kinemathương mại để xét nghiệm sự nhiễm khuẩn, bằng bộ kit chẩn đoán phát hiện độc

tố của vi khuẩn trong thực phẩm Kết quả trong tổng số 15 mẫu, Bacillus cereus

có mặt trong 5 mẫu với số lượng vượt quá 104 CFU/g, Enterobacteriaceae và vi khuẩn Coliform vượt quá 105 CFU/g ở 10 mẫu Escherichia coli trên 105 CFU/g đã được tìm thấy trong hai mẫu Staphylococcus aureus không được phát

hiện trong bất kỳ của các mẫu thử nghiệm Tác giả kết luận rằng cách làmtruyền thống của Kinema và sử dụng nó trong nấu món cà ri là an toàn Tuy

nhiên, đối với cỏc mún khỏc khi sử dụng Kinema (không qua xử lý nhiệt)biện pháp phòng ngừa an toàn cũng phải chú trọng [21].

Nhóm tác giả Hsien-Feng Kung, Yung-Hsiang Tsai và Cheng-I Weinghiên cứu về sự nhiễm khuẩn vi sinh vật trong Miso, đây là một loại thựcphẩm được sản xuất rất giống với món tương Bần của Việt Nam, nguyên liệuchủ yếu cũng là đỗ tương, gạo, muối, thêm một phần lúa mạch được trộn đều

và ủ lên men Tuy nhiên Miso chủ yếu được sản xuất theo quy mô côngnghiệp ớt cũn thấy làm tại gia đình Chính vì vậy về mức độ vệ sinh an toànthực phẩm được chú trọng hơn Tác giả thu thập 27 mẫu Miso tại các siêu thị

và 13 mẫu tại các thị trường bán lẻ tại miền nam Đài Loan Các mẫu Misođược xác định có nồng độ muối từ 6.1- 11.3 % Với phương pháp ứng dụng kĩthuật di truyền PCR khuếch đại trình tự DNA và được phân tích bằng phầnmềm BLAST (NCBI) để xác định vi khuẩn hình thành histamin Kết quả cho

thấy chỉ có một mẫu không đạt về chỉ tiêu Coliform tổng số, ở mức 100 CFU/g, không có bất cứ mẫu nào nhiễm E coli, tác giả ghi nhận rằng Miso ở

nồng độ muối cao đã có tác dụng ức chế về tăng trưởng của vi khuẩn [19]

Có một đề tài khác nghiên cứu tại Trung Quốc do M J R Nout, D.Bakshi và P K Sarkar trên đối tượng Sufu Trong nghiên cứu này các tác giảtiến hành phân tích các chỉ tiêu độ ẩm, nồng độ muối, độ pH và các chỉ tiêu visinh trên 3 loại Sufu trắng, Sufu đỏ và Sufu xám Kết quả trong 23 mẫu thu

thập, vi khuẩn hiếu khí mesophilic và vi khuẩn endospores nhiễm >105

CFU/g được tìm thấy ở hầu hết các mẫu Một phần ba số mẫu có chứa ít hơn

103 CFU/g B cereus, nhưng ba mẫu đó cú trờn 105 CFU/g cho thấy tiềm

năng gây nguy hiểm cho người tiêu dùng Tất cả các mẫu có ít hơn 103

CFU/g C perfringens, ngoại trừ 1 mẫu có chứa 105 CFU/g S Aureus, chủng nấm Enterobacteriaceae, và L monocytogenes đã không được phát hiện trong

bất kỳ của các mẫu Dựa trên các kết quả này, có thể khẳng định Sufu là antoàn về các chỉ tiêu vi sinh không gây hại cho người cho người sử dụng [17]

Phần 3

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Một số sản phẩm tương Bần đang tiêu thụ tại chợ Thái và chợ Đồng Quang –

TP Thỏi Nguyờn – Tỉnh Thỏi Nguyờn

3.2 Địa điểm và thời gian tiến hành

− Thời gian nghiên cứu: 1/2011 - 5/2011

− Địa điểm: Khoa xét nghiệm - Trung tâm y tế dự phòng Thỏi Nguyờn

3.3 Nội dung nghiên cứu

− Xác định tổng số vi khuẩn Clostridium perfringens (C perfringens)

trong tương Bần

− Xác định tổng số vi khuẩn Coliform trong tương Bần

− Xác định tổng số vi khuẩn Escherichia coli (E coli) trong tương Bần

3.4 Phương pháp nghiên cứu

Đề tài thực hiện dựa theo những phương pháp nghiên cứu thường quytrong phòng xét nghiệm được chuẩn hóa theo tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN)

và tiêu chuẩn quốc tế (ISO) các số: 499:1991, 4882:2007 và 6846:2007

3.4.1 Trang thiết bị và y dụng cụ dùng trong kiểm nghiệm

Các trang thiết bị và y dụng cụ gồm:

− Tủ ấm (SANYO)

− Tủ lạnh (SANYO)

− Tủ cấy an toàn sinh học (BIOAIR)

− Nồi hấp cách thủy (HYTHERMCO)

− Cân điện (SATORIUS)

− Mẫu được lấy theo phương pháp lấy ngẫu nhiên tại các quầy bán tươngBần thuộc 4 loại sản phẩm, trong đó có 3 sản phẩm đã đăng kí thương hiệuđược mã hóa kí hiệu: TBTT, TBBH, TBNS và 1 loại sản phẩm không cóthương hiệu TB.

− Nguyên tắc lấy mẫu: Lấy mẫu phải đảm bảo tính khách quan, trungthực, đại diện, các mẫu phải còn nguyên vẹn

− Lấy mẫu: Trước khi lấy mẫu phải đeo khẩu trang và gang tay y tế Tạimỗi địa điểm lấy mẫu, chọn ngẫu nhiên các chai tương có thể tích 500ml, sau

đó tiến hành bao gói sản phẩm vào túi nilon vô trùng, dựng bỳt dạ đỏnh kớhiệu sản phẩm và vào nhật kí thu mẫu, chuyển vào thùng chứa để vận chuyển

về nơi xét nghiệm

− Mẫu sau khi được đưa về nơi xét nghiệm, nếu chưa được phân tíchngay phải được bảo quản vào nơi thoáng mát, vô trùng

− Kết quả lấy mẫu được trình bày ở bảng 3.1

Bảng 3.1: Kết quả lấy mẫu

(Nguồn: Kết quả điều tra)

3.4.3 Phương pháp định lượng vi khuẩn C perfringens trong Tương Bần

Áp dụng theo TCVN 499:89 (ISO 7937:1985) - Vi sinh vật học Hướng

dẫn chung đếm Clostridium perfringens - Kỹ thuật đếm khuẩn lạc bằng

phương pháp ống thạch [1]

3.4.3.1 Nguyên tắc:

Vi khuẩn C perfringens nuôi cấy trong môi trường thạch Wilson Blair ở

370C, trong điều kiện kị khí sau 24 giờ sẽ phát triển thành các khuẩn lạc cómàu đen, tròn lồi

3.4.3.2 Môi trường sử dụng

− Dung dịch đệm pepton BPW Thành phần gồm:

+ Nước cất 1000ml

+ Pepton wasser 25,5g

− Môi trường nuôi cấy khẳng định C perfringens là môi trường thạch

Wilson Blair, pH 7,2 - 7,4 Thành phần môi trường gồm các hóa chất thuộchãng MERCK của nước Đức, được pha theo công thức:

Đun sôi hòa tan các chất, thử độ pH = 7,2 - 7,4, sau đó rót vào ống khuẩn

tà, mỗi ống chứa 20 - 30ml môi trường Hấp ở 1100C/ 30 phút, nếu chưa dùngngay phải bảo quản trong tủ lạnh 0 - 40C

3.4.3.3 Chuẩn dung dịch mẫu thử

− Hút chính xác 25ml thực phẩm đã được chuẩn bị cho vào bỡnh núnchứa sẵn 225ml nước muối đệm pepton (BPW)

− Lắc đều 2 - 3 phút Thu được dung dịch mẫu thử 10-1

− Hút chính xác 10ml dung dịch mẫu thử 10-1 cho sang ống nghiệm chứasẵn 90ml nước muối đệm pepton Lắc đều trong 2 - 3 phút Thu được dungdịch 10-2 Tiếp theo làm như vậy, ta thu được các dung dịch mẫu thử tươngứng 10-2, 10-3, 10-4…