Tiểu luận Tìm hiểu về các enzyme có thể thu nhận từ rau quả

Để xử lý mộtkhối lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao.Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao.Chính

Trường ĐH Công Nghiệp TPHCM

Viện CN Sinh Học và Thực Phẩm

Môn: Công nghệ chế biến Nông sản



BÁO CÁO TIỂU LUẬN

GVHD: ThS Nguyễn Thị Mai Hương

STT TÊN SINH VIÊN NHIỆM VỤ

1 Phạm Nguyễn Khánh Toàn - Tổng hợp bài báo cáo, làm powerpoint

2 Giới thiệu các phương pháp sản xuất enzyme

3 Giới thiệu enzyme protease và cách thu nhận

5 Nguyễn Chí Thịnh 1 Tổng quan về enzyme

4 Giới thiệu enzyme Bromelin và cách thu nhận

từ dứa

  

Trang

LỜI MỞ ĐẦU 4

NỘI DUNG 6

1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME 6

1.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme 6

1.2 Khái niệm về enzyme 7

1.2.1 Bản chất sinh học của enzyme 7

1.2.2 Bản chất hóa học của enzyme 8

2 GIỚI THIỆU CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ENZYME 9

2.1 Phương pháp tách phá vỡ tế bào 9

2.1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học 9

2.1.2 Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học 11

2.2 Các phương pháp tách enzyme 12

2.2.1 Các phương pháp cơ học 12

2.2.2 Phương pháp cô đặc 14

2.3 Phương pháp tinh sạch enzyme 15

3 GIỚI THIỆU ENZYME PROTEASE VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ MỦ MÍT 16

3.1 Sơ lược về enzyme protease trong mủ mít 17

3.1.1 Định nghĩa enzyme protease 17

3.1.2 Phân loại enzyme protease 17

3.2 Ứng dụng enzyme protease trong mủ mít 18

3.3 Các phương pháp tinh sạch 18

3.4 Phương pháp thu nhận 18

3.4.1 Thu nhận 18

3.4.2 Sơ đồ quy trình 18

3.4.3 Giải thích quy trình 19

3.5 Ứng dụng enzyme protease 22

4 GIỚI THIỆU ENZYME BROMELIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ DỨA 22

4.1 Đặc điển nguồn nguyên liệu và bromelin 22

4.1.1 Đặc điểm nguồn thu nguyên liệu 22

4.1.2 Đặc điểm enzyme Bromelin 23

4.2 Tính chất enzyme Bromelin 24

4.2.1 Cấu tạo hóa học 24

4.2.2 Cấu trúc không gian của bromelin 26

4.2.3 Tính chất vật lý 26

4.2.4 Hoạt tính của bromelin 27

4.3 Phương pháp thu nhận và tinh sạch Bromelin 29

4.3.1 Phương pháp thu nhận 29

4.3.2 Phương pháp tinh sạch 37

4.4 Ứng dụng của bromelin 40

5 GIỚI THIỆU ENZYME FICIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ SUNG 40

5.1 Đạc điểm enzyme ficin 40

5.1.1 Lịch sử nghiên cứu 41

5.1.2 Đặc điểm nguồn thu nhận enzyme ficin 41

5.2 Thành phần tính chất enzyme ficin 42

5.2.1 Cấu tạo hóa học 42

5.2.2 Tính chất vật lý 44

5.2.3 Tính chất hóa học 45

5.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự hoạt động của ficin 46

5.2.5 Một số yếu tố khác ảnh hưởng lên khả năng thùy phân protein của ficin .47

5.3 Phương pháp thu nhận ficin 48

5.3.1 Phương pháp thu nhận ficin thô 48

5.3.2 Một số phương pháp chiết tách enzyme 48

5.3.3 Các phương pháp tinh sạch enzyme ficin 51

5.3.3.1 Phương pháplọc gel 51

5.3.3.2 Phương pháp điện di mini-gel SDS-polyacrylamide 53

6 GIỚI THIỆU ENZYME PAPAIN VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ ĐU ĐỦ 56

6.1.Giới thiệu về enzyme papain 56

6.1.1 Đặc điểm chung 56

6.1.2 Tính chất vật lý 57

6.1.3 Tính chất hóa học 57

6.2 Phương pháp thu nhận enzyme papain 62

6.2.1 Thu nhận nhựa đu đủ 64

6.2.2 Thu nhận papain 64

6.2.3 Phương pháp tinh sạch enzyme papain 65

6.2.4 Lọc qua Sephadex G-75 66

7 GIỚI THIỆU ENZYME AMYLASE VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ THỰC VẬT

66

7.1 Enzyme amylase là gì 66

7.2 Lịch sử phát hiện 66

7.3 Phân loại 67

7.4 Hệ enzyme amylase 68

7.4.1 Enzyme α-Amylase 68

7.4.2 Enzyme β-Amylase 70

7.4.3 Enzyme γ-Amylase 71

7.5 Thu nhận enzyme amylase từ thực vật 72

7.5.1 Nguồn thu nhận 72

7.5.2 Thu nhận enzyme amylase 72

7.6 Phương pháp tinh sạch enzyme amylase 76

7.7 Ứng dụng enzyme Amylase 76

KẾT LUẬN 77

TÀI LIỆU THAM KHẢO 78

Cùng với sự phát triển của xã hội thì ngành sản xuất nói chung và ngành côngnghệ thực phẩm nói riêng, các công ty thực phẩm luôn tìm kiếm cái mới và tìm ranhững cách để làm tăng năng suất và hiệu quả trong sản xuất thì “công nghệ sản xuấtenzyme” đóng vai trò rất quan trọng trong ngành sản xuất nói chung Enzyme giúpchúng ta làm ra những sản phẩm chất lượng và thời gian nhanh hơn, từ đó làm thay đổicách sản xuất truyền thống với sự có mặt của enzyme.

Để có được những thay đổi mạnh mẽ trên thì các doanh nghiệp luôn tìm kiếmcác nguồn nguyên liệu có nhiều ưu điểm, đặc biệt là các phế liệu có thể sản xuất raenzyme Nước ta là 1 nước đang phát triển và có khí hậu nhiệt đới thì người Việt tựhào rằng đất nước chúng ta rất giàu có về mặt nông sản Vì thế các doanh nghiệp trongnước luôn biết tận dụng ưu thế đó để làm thế mạnh của mình về làm chủ nguồn nguyênliệu vốn có

Dựa vào những thế mạnh đó, mà ngành nông sản đóng vai trò hết sức quan trọngcủa ngành kinh tế Để ngành nông nghiệp ngày càng phát triển thì phải có sự đóng gópcủa rất nhiều thành phần trong xã hội, đặc biệt là sinh viên chúng em Sinh viên chúng

em dựa vào những kiến thức đã học , xin góp một phần nhỏ cho sự phát triển của ngànhnông sản nói chung và ngành “ công nghệ sản xuất enzyme” nói riêng

Với những kiến thức được trang bị trong trường lớp , nhóm chúng em đã chọnngành công nghệ enzyme là đề tài của chúng em nghiên cứu Để có được tài liệu vàkiến thức thì chúng em phải nói đến cô Mai Hương, cô đã tận tình dạy và hướng dẫnchúng em trong suốt trong quá trình làm bài Nhóm chúng em sẽ cùng nhau làm bài thậttốt và khi nghiên cứu đề tài hoàn thành thì chúng em mong có được những ứng dụngtrong sản xuất thực tiễn.

Nhóm SV thực hiện

  

1 TỔNG QUAN VỀ ENZYME

1.1 Lịch sử nghiên cứu và phát triển công nghệ enzyme

- Năm 1833: Payen và Persorz tách được diatase từ malt

- Năm 1874: Hansen là người đầu tiên tách được rennet từ bao tử cừu

- Năm 1876: Kiihne là người đầu tiên đề nghị gọi chất xúc tác sinh học làenzyme

- Năm 1897: Hai anh em Buchner chứng minh dich chiết từ nấm men có thểchuyển hóa đường glucose thành cồn và CO2

- Đầu năm 1900: Rohm sử dụng enzyme protease trong công nghệ thuộc da

- Năm 1913: Rohm là người đầu tiên sử dụng enzyme trong chất tẩy rửa

- Thế chiến lần thứ nhất: Weitzman sản xuất aceton ở Anh

- Năm 1917: Boidin và Effront nghiên cứu α Amylase của B Subtilis và ứngdụng trong nghành dệt

- Năm 1920 – 1928: Will Slitter tinh sạch được enzyme , Samner kết tinh đượcUrease, Northrop kết tinh được Protease, Fleming phát hiện ra Penicilline

- Thế chiến lần thứ hai: Bắt đầu sản xuất theo quy mô công nghiệp, sử dụngamyloglucosidase đường hóa tinh bột Sử dụng penricillineacylase trong sản xuấtpenicilline

- Năm 1969: Tanabe co đã xây dựng quy trình công nghiệp sản xuất amino acid

Sử dụng glucose isomerase trong sản xuất dung dịch giàu fructose

- Năm 1972: Boyer et al đưa ra kỹ thuật di truyền Kỹ thuật này có tác động tíchcực cho công nghệ enzyme

- Năm 1973: Tanabe co sản xuất aspartic acid bằng lên men cố định tế bàoWinter và Ferch đưa ra công nghệ sàn xuất protein

- Năm 1984: Nito xác lập quá trình cơ bản tạo acry – lamide và một loạt các quátrình sản xuất có sự tham gia của enzyme

- Từ năm 1984 đến nay: Đã phát hiện ra hàng trăm loại enzyme khác nhau, đãđưa vào sản xuất công nghiệp và ứng dụng rộng rãi enzyme trong sản xuất và đời sống

Kỹ thuật enzyme cố định, tế bào cố định đã đưa công nghệ enzyme đạt được nhiều kếtquả cao.

1.2 Khái niệm về enzyme

1.2.1 Bản chất sinh học enzyme

Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu về enzyme, và đã đi đến thống nhất:

Enzyme là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên, và tham gia vào cácphản ứng sinh học

Như vậy, bản chất sinh học của enzyme là sản phẩm của các quá trình sinh học,

và thực hiện các phản ứng sinh hóa trong và ngoài tế bào sinh vật Các loại enzyme đều

có những đặc tính chung như sau:

+ Enzyme được tạo ra trong tế bào sinh vật: Quá trình tổng hợp enzyme là mộtquá trình hết sức phức tạp và được điều khiển, kiểm soát chặt chẽ

+ Enzyme tham gia phản ứng cả trong tế bào sống và cả khi enzyme được táchkhỏi tế bào sống

+ Enzyme tham gia phản ứng trong điều kiện nhiệt độ ôn hòa: Vì trong quá trìnhsống của tế bào, enzyme được tổng hợp và hoạt động trong điều kiện nhiệt độ của tếbào và nhiệt độ của cơ thể Nhiệt độ của cơ thể và của tế bào sinh vật thường là nhiệt độthấp Phần lớn nhiệt độ cơ thể sinh vật dao động trong khoảng 30 – 40 oC

+ Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể từ giaiđoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóahọc: Quá trình chuyển hóa được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi phản ứng được xúctác bởi một loại enzyme Các enzyme này lần lượt thay nhau xúc tác để các phản ứnglần lượt xảy ra, để cuối cùng tạo thành CO2 ; H2O, một số chất khác và giải phóng nănglượng Cũng có thể chuỗi phản ứng sẽ tạo thành những chu kỳ chuyển hóa khép kín.Trong chuỗi chuyển hóa hở hay chuỗi chuyển hóa khép kín, sản phẩm của phản ứngtrước sẽ là cơ chất cho phản ứng sau

+ Enzyme có thể thực hiện được một phản ứng: Các phản ứng này thường xảy

ra ở ngoài tế bào (khi ta thực hiện chúng trong ống nghiệm) Trong tế bào thườngkhông xảy ra phản ứng enzyme đơn ( một phản ứng ) mà thường xảy ra các phản ứngtheo chuỗi phản ứng

+ Phản ứng enzyme là những phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít Trong khi đó,các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học đòi hỏi năng lượng rấtlớn Nhờ có hoạt động xúc tác của enzyme, các phản ứng sinh hóa xảy ra liên tục trongđiều kiện năng lượng ôn hòa.

+ Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng Gen quyết địnhtổng hợp ra một loại enzyme Mỗi một enzyme quyết định môt phản ứng sinh hóa Cácnhà khoa học đưa ra cơ chế như sau:

Một gen  một enzyme  một phản ứngNhư vậy, gen sẽ quyết định bản chất sinh học và bản chất hóa học của ezyme

Cơ chế này có một ý nghĩa rất lớn trong việc điều khiển tổng hợp enzyme trong tế bàosinh vật

1.2.2 Bản chất hóa học enzyme

Nếu tách enzyme ra khỏi tế bào và tiến hành phân tách thành phần hóa học củachúng, ta sẽ thấy chúng thuộc hai nhóm

 Nhóm ezyme đơn cấu tử

Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme chỉ được cấu tạo một thành phần hóahọc duy nhất là protein Những enzyme được tạo thành chỉ từ protein duy nhất được gọi

là enzyme đơn cấu tử

 Nhóm enzyme đa cấu tử

Thuộc nhóm này bao gồm những enzyme có hai thành phần:

- Phần protein thuần được gọi là apoprotein hay apoenzyme

- Phần thứ hai là thành phần không phải protein Phần này thường là những chấthữu cơ đặc hiệu có vai trò thúc đẩy quá trình xúc tác

Ở những enzyme đa cấu tử, phần apoenzyme đóng vai trò xúc tác nhưng nếuthiếu thành phần thứ hai (các chất hữu cơ đặc hiệu) thì enzyme không thể hoạt độngđược Chính vì thế, chất hữu cơ đặc hiệu này còn được gọi là chất cộng tác (cofactor).Các chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein, cũng có thể gắn rấtlỏng lẻo với phần protein Ta có thể dễ dàng tách chúng ra khi tiến hành thẩm tích quamàng Ở đây xảy ra hai hiện tượng:

- Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn chặt vào protein bằng liên kết đồng hóa trịđược gọi là nhóm phụ ( prosthetic ).

- Những chất hữu cơ đặc hiệu gắn không chặt với protein và dễ dàng tách chúngkhỏi protein được gọi là coenzyme

2 GIỚI THIỆU CÁC PHƯƠNG PHÁP SẢN XUẤT ENZYME

Enzyme có thể được phân tách từ nhiều nguồn như là động vật, thực vật và visinh vật Mỗi nguồn enzyme cho một số tính chất đặc trưng, cung cấp những enzymeđặc hiệu cho quá trình chế biến

Do đó, mặc dù vi sinh vật đóng vai trò là nguồn cung cấp enzyme chính cho quátrình chế biến bởi giá thành và đa dạng về chủng loại enzyme nhưng các enzyme từthực vật và động vật cũng góp phần làm cho ngành chiết tách enzyme trở nên đa dạng

và thêm hấp dẫn

Ví dụ: Từ động vật chúng ta có một số enzyme, trong đó có rennin là enzyme từngăn thứ 4 của dạ dày bê non giúp quá trình đông tụ casein trong sản xuất phomai Từthực vật, ta cũng có một số loại enzyme được ứng dụng trong quá trình chế biến như làbromelin từ dứa, papain từ đu đủ và ficin từ sung

Các enzyme thuỷ phân tinh bột (invertase, amylase,Glucoseamylase)

Các enzyme thủy phân pectin (Pectin-esterase, Polygalacturonase, Pectate lyase)Các enzyme thuỷ phân protein(bromelin, papain, ficin,…)

Enzyme oxi hoá thì chúng ta có những đại diện tiêu biểu là Poluphenoloxidase,Catalase, peroxidase, Glucoseoxidase,lypoxygenase…)

2.1 Các phương pháp tách phá vỡ tế bào

2.1.1 Phá vỡ tế bào bằng phương pháp cơ học

Mục đích của phá vỡ tế bào là giải phóng các chất có trong tế bào và đảm bảođược hoạt tính enzyme nội bào Việc phá vỡ tế bào sinh vật bao gồm cả phá vỡ tế bàođộng vật, thực vật và VSV Đối với tế bào động vật, người ta thường sử dụng toàn bộ

cơ quan (hay mô bào) của động vật có chứa enzyme và cần phải loại bỏ mỡ hoặc cácthành phần khác bám theo mô bào đó, các mẫu cần được xử lý nhanh và phải được thunhận enzyme trong thời gian không quá 4 giờ kể từ khi giết mỗ Đối với tế bào và mô

bào thực vật, cần phải được làm sạch và phải được trữ lạnh nếu chưa tiến hành thu nhậnenzyme ngay.

Tế bào động vật và thực vật thường rất dễ phá vỡ bằng các phương pháp cơ học.Riêng tế bào vi sinh vật, việc phá vỡ tế bào có những khó khăn nhất định

Tế bào vi sinh vật có kích thước quá nhỏ, việc phá vỡ tế bào bằng phương phápnghiền nếu không có chất trợ nghiền sẽ không có hiệu quả

Vi sinh vật là cơ thể đơn bào, khi phát triển trong môi trường, đặc biệt là môitrường lỏng có nhiều cơ chất thủy phân, chúng sẽ tạo ra nhiều enzyme ngoại bào tươngứng Các enzyme ngoại bào này được hòa tan trong môi trường và dễ dàng tách chúng

ra khỏi dung dịch nuôi cấy, do đó trong công nghiệp người ta ít khi tiến hành nghiền tếbào (trừ trường hợp phải thu nhận enzyme nội bào) Tuy nhiên, trong thời gian gần đây,việc nghiên cứu enzyme nội bào ở VSV ngày càng nhiều, do đó phương pháp cơ họcđược ứng dụng để phá vỡ tế bào VSV ngày càng nhiều

 Phương pháp đồng hóa áp lực cao:

Đây là phương pháp được ứng dụng rộng rãi nhất để phá vỡ tế bào quy mô côngnghiệp Theo phương pháp này, huyền phù tế bào sẽ được nén với một áp suất cao,chúng va chạm rất mạnh vào vành ống (máy đồng hóa maton-gaulin) Tế bào bị phá vỡbởi lực cắt và sức nén Tùy thuộc vào loại máy, công suất từ 50 – 5000 lít/giờ mà áp lựccần có khác nhau Mặt khác, tính chất, cấu tạo của tế bào khác nhau đòi hỏi áp lực khácnhau

Ví dụ đối với tế bào vi khuẩn người ta cần áp lực khoảng 550 bar Phương phápđồng hóa áp lực cao thường được áp dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khuẩn Tế bào độngvật và tế bào thực vật ít khi phải dùng phương pháp này

 Phương pháp nghiền ẩm:

Đây cũng là phương pháp được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp sản xuấtenzyme Trong quá trình nghiền, người ta thường sử dụng những viên bi thủy tinh cókích thước 0.2 – 1mm để tăng quá trình phá vỡ tế bào Trong nhiều trường hợp, người

ta không dùng viên bi thủy tinh mà người ta dùng hạt thủy tinh, vì hạt thủy tinh có độ

ma sát cao hơn viên bi thủy tinh nên hiệu suất nghiền tốt hơn

2.1.2 Phá vỡ tế bào không phải bằng phương pháp cơ học

Ngoài hai phương pháp cơ học trên, người ta còn phá vỡ tế bào bằng phươngpháp không phải là phương pháp cơ học Các phương pháp bao gồm phương pháp hóahọc, phương pháp nhiệt và phương pháp enzyme (ở một số tài liệu người ta còn gọi làphương pháp hóa học, phương pháp vật lý và phương pháp sinh học).

 Phương pháp hóa học

Là phương pháp dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh, hoặc khả năngoxy hóa mạnh của các chất hóa học để phá vỡ thành tế bào Phương pháp này không đòihỏi áp suất cao, nên ít chi phí và dễ thực hiện Tuy nhiên vì trong quá trình thực hiện,người ta sử dụng các hóa chất nên các hóa chất này thường lẫn vào trong hỗn hợp, đòihỏi quá trình tách rất phức tạp Một trong những hóa chất sử dụng nhiều là acetone

 Phương pháp - vật lý:

Là phương pháp sử dụng siêu âm, phương pháp này thường được sử dụng trongcác phòng thí nghiệm, chưa thấy sử dụng trong quy mô công nghiệp Một phương phápvật lý khác cũng được ứng dụng nhiều trong nghiên cứu và trong sản xuất ở dạng thửnghiệm là tạo shock nhiệt hay shock thẩm thấu

Nguyên tắc của phương pháp này là: khi đưa nhiệt độ của tế bào huyền phùxuống nhiệt độ rất thấp, ngay lập tức nâng nhiệt đến 400C (thao tác nâng nhiệt rấtnhanh), khi đó thành tế bào sẽ bị phá vỡ và người ta thu được huyền phù tế bào vỡ.Phương pháp này thường dễ thực hiện, đảm bảo được hoạt tính của enzyme nhưng hiệusuất phá vỡ tế bào không cao

 Phương pháp sinh học (phương pháp - enzyme):

Có hai phương pháp hiện đang được sử dụng rộng rãi là phương pháp tự phân vàphương pháp thủy phân bằng enzyme đưa từ bên ngoài vào Phương pháp tự phân làphương pháp tạo điều kiện tối ưu cho một số enzyme có khả năng phân giải cho một sốthành phần của thành tế bào, các enzyme này phải là những enzyme có trong tế bào và

là của tế bào đó Bình thường các enzyme này không hoạt động mạnh, nhưng nếu điềukiện nhiệt độ, pH, nước ở bên ngoài tế bào mà trùng với mức hoạt động tối ưu củachúng, thì chúng sẽ hoạt động mạnh và thủy phân thành tế bào, làm chết tế bào

Tự phân là quá trình được áp dụng nhiều trong quá trình phá vỡ thành tế bào các loạinấm men Người ta thường tiến hành quá trình tự phân huyền phù tế bào nấm men ở

nhiệt độ 48 – 520C, trong khoảng thời gian 6 – 24 giờ Phương pháp này có nhiều nhượcđiểm vì trong quá trình thủy phân, các enzyme có trong tế bào không chỉ thủy phân cácchất ở thành tế bào mà cả những chất có trong tế bào, thậm chí các enzyme cũng bị pháhủy Phương pháp này hiện nay không được sử dụng nhiều trong công nghiệp.

Một phương pháp khác đang được nghiên cứu nhiều là phương pháp sử dụngenzyme từ ngoài tế bào Các enzyme này được đưa vào huyền phù tế bào để tiến hànhcác quá trình thủy phân có định hướng các chất nhất định trong thành tế bào Người tathường sử dụng hệ enzyme cellulase để phá vỡ thành tế bào nấm men và thành tế bàothực vật Phương pháp này không gây hư hỏng các chất có trong tế bào và thực hiện dễdàng trong mọi điều kiện (phòng thí nghiệm, sản xuất thử nghiệm, và sản xuất côngnghiệp) Ngoài ra, người ta còn sử dụng lysozym trong các loại tế bào khác

Phần lớn các enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme hòa tan Như vậykhi tiến hành ly tâm, dung dịch được tách khỏi các thành phần rắn là dung dịch enzymethô, dung dịch enzyme thô này còn chứa các thành phần sau:

- Protein có hoạt tính sinh học

- Các chất hòa tan khác

- Nước

Phương pháp ly tâm chỉ tách được thành phần rắn có tỷ trọng lớn hơn dung dịch.Dịch thu được chưa phải là chế phẩm enzyme tinh khiết mà là chế phẩm enzyme thô, vìcòn chứa protein không hoạt động, nước và các chất hòa tan khác.

Đối với sinh khối động vật và thực vật, sau khi nghiền ta thu được hỗn hợp nhiềuthành phần Ly tâm hỗn hợp này ta thu được dung dịch enzyme thô tương tự như ởVSV Để tránh hiện tượng biến tính của enzyme, trong những mẫu nghiên cứu, người tathường tiến hành ly tâm lạnh, còn trong sản xuất theo quy mô công nghiệp, người tathường tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp

Trong quy mô công nghiệp, người ta thường tiến hành ly tâm thu nhận dung dịchenzyme bằng máy ly tâm liên tục Phương pháp ly tâm liên tục có những ưu điểm làthời gian thu nhận sản phẩm nhanh, liên tục, và không gây ảnh lớn đến hoạt tính củaenzyme Hiện nay, trong công nghệ enzyme, người ta đang sử dụng rông rãi ba kiểu lytâm: ly tâm hình trụ thẳng đứng, ly tâm liên tục nằm ngang, ly tâm liên tục nhiều đĩa

Ngoài ba kiểu ly tâm điển hình trên, ở một số nhà máy sản xuất enzyme có sửdụng một số kiểu ly tâm khác Việc chọn kiểu ly tâm này hay ly tâm khác phải xem xétđến hai yếu tố rất quan trọng: nồng độ chất rắn (%), kích thước vật lắng

 Phương pháp lọc

Trong công nghệ enzyme, sau khi phá vỡ thành tế bào sinh vật hay sau khi lênmen, người ta thường sử dụng quá trình lọc để thu nhận dung dịch enzyme nội bào,enzyme ngoại bào hòa tan

Lọc cũng là phương pháp tách thành phần rắn ra khỏi dung dịch Lọc là mộtphương pháp khi thực hiện thường gặp nhiều khó khăn như kích thước vật chất dưới tếbào thường rất nhỏ, và độ nhớt của dung dịch thường rất cao Cả hai yếu tố này đều làmcản trở quá trình lọc Tốc độ lọc phụ thuộc rất lớn vào: diện tích bề mặt vật liệu lọc, độnhớt dịch lọc, sức đề kháng

Trong công nghiệp sản xuất enzyme người ta thường sử dụng các kiểu sau:

- Lọc ép: Lọc ép (lọc đĩa, buồng lọc) thường được sử dụng trong trường hợpdung dịch cần lọc có khối lượng nhỏ Phương pháp này sử dụng để lọc enzyme rất cóhiệu quả

- Lọc chân không: Là phương pháp được ứng dụng nhiều nhất trong nghiên cứu

và trong sản xuất các sản phẩm sinh học có hoạt tính Trong đó, lọc chân không quayđược sử dụng nhiều hơn cả

- Lọc theo dòng chảy cắt ngang: Trong những năm gần đây, nhiều nhà máy sảnxuất enzyme sử dụng phương pháp lọc theo dòng chảy cắt ngang Theo đó, dòng dungdịch lọc sẽ chảy song song bề mặt nguyên liệu lọc Phần lọc sẽ được thoát qua vật liệulọc và đi xuống phía dưới Phương pháp này có ưu điểm là giảm sức đề kháng quá trìnhlọc của vật liệu chất rắn

- Lọc thông thường: Phương pháp lọc thông thường đã có từ rất lâu, hiện nay ởmột số nhà máy vẫn còn sử dụng Phương pháp lọc này đang được thay thế dần bằngnhững phương pháp khác nhanh hơn, có hiệu quả hơn

2.2.2 Phương pháp cô đặc

Dung dịch enzyme thô thường chứa lượng enzyme không nhiều Để xử lý mộtkhối lớn dung dịch enzyme phải tốn rất nhiều công sức và chi phí cho xử lý này rất cao.Mặt khác lượng enzyme có trong dịch enzyme thô quá ít, hoạt tính enzyme không cao.Chính vì thế, người ta phải cô đặc dung dịch enzyme nhằm một số mục đích sau:

- Làm tăng hoạt tính của enzyme trong một khối lượng dung dịch enzyme

- Làm giảm chi phí và công sức cho việc xử lý sau này

- Tăng khả năng bảo quản enzyme

- Giảm chi phí vận chuyển, bảo quản

- Tăng hiệu suất tác động của enzyme đối với cơ chất

Để đạt được mục đích đó, người ta tiến hành cô đặc enzyme bằng một trongnhững phương pháp sau:

 Phương pháp nhiệt

Chúng ta có thể tiến hành cô đặc enzyme bằng phương pháp nhiệt, nhưng sửdụng nhiệt để cô đặc enzyme thường gặp rất nhiều khó khăn vì enzyme là protein rấtnhạy cảm với nhiệt độ, nguyên nhân là hầu hết enzyme đều được tổng hợp trong tế bào(trừ enzyme nhân tạo)

Trong cơ thể, enzyme thường hoạt động trong điều kiện nhiệt hoạt động của tếbào sống Trường hợp nhiệt độ vượt quá nhiệt độ hoạt động của tế bào sống, thì tế bào

sẽ chết Enzyme mất hoạt tính là một trong những nguyên nhân làm tế bào chết, là vìkhi đó các phản ứng trao đổi chất của tế bào sẽ không còn xảy ra nữa, sự trao đổi chấtcủa tế bào bị ngưng trệ, tế bào không thể tồn tại.

Khi enzyme được tách ra khỏi tế bào thường hoạt động ở nhiệt tối ưu cao hơnnhiệt độ sinh lý của tế bào, hiện tượng này thấy ở hầu hết các loại enzyme Tùy theonguồn thu nhận enzyme và tính chất của từng loại enzyme mà quyết định chế độ gianhiệt trong quá trình cô đặc

Quá trình cô đặc là quá trình làm bốc hơi nước, làm cho lượng nước trong dungdịch giảm đi, hàm lượng enzyme trong dung dịch sẽ tăng lên, hoạt tính enzyme cũngtăng cao Tuy nhiên nếu không chú ý đến điều kiện nhiệt độ để khống chế nó trong mộtkhoảng cho phép thì hoạt tính của enzyme có thể sẽ bị mất nhiều, thậm chí có thể dẫnđến triệt tiêu hoạt tính Do đó, việc khống chế nhiệt độ cùng với thời gian cần thiếttrong quá trình cô đặc là điều rất cần thiết

Trong công nghiệp, người ta thường sử dụng những phương pháp sau:

- Kết tủa âm: là sự kết tủa protein tạp Phần protein cần thiết nằm trong dungdịch chứ không nằm trong phần tủa

- Kết tủa dương thì hoàn toàn ngược lại, các protein cần thiết lại nằm trong phầnkết tủa còn protein tạp nằm trong phần dung dịch

2.3 Phương pháp tinh sạch enzyme

 Phương pháp kết tinh

Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate

để kết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinhsạch phải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến

 Phương pháp điện di

Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm Người tacũng đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng chođến nay vẫn chưa được phát triển rộng rãi

 Phương pháp sắc ký

 Phương pháp sắc ký lọc gel

Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong cột dùng để táchenzyme Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc ký cột là:polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử được tách

ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng

 Sắc ký trao đổi ion

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử protein.Phương pháp trao đỏi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy môcông nghiệp Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH Từ

đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation

 Sắc ký kỵ nước

Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử proteinvới nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quá trìnhphân đoạn với muối Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đãđược làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate

3 GIỚI THIỆU ENZYME PROTEASE VÀ CÁCH THU NHẬN TỪ MỦ MÍT

3.1 Sơ lược về enzyme protease trong mủ mít

3.1.1 Định nghĩa enzyme protease:

Protease là nhóm enzyme xúc tác sự thủy phân liên kết peptide giữa các L-acidamin,là liên kết chủ yếu trong phân tử protein hay peptide Protease còn có tên gọi khácnhư :proteinase hay C-N hydrolase

3.1.2 Phân loại enzym protease:

a Dựa vào nguồn thu nhận enzyme:

- Protease động vật: pepsin, tripsin, chymotripsin

- Protease thực vật: papain, bromelin, ficin…

- Protease vi sinh vật: subtilisin, protease vi sinh vật…

b Dựa vào sự phân bố enzyme:

- Protease nội bào (endoprotease) :các enzyme hoạt động chủ yếu bên trong tếbào như: catepsin,…

- Protease ngoại bào(exoprotease): các enzyme này hoạt động ở các mô,các cơquan đặc hiệu ngoài tế bào như pepsin, chymotrypsin,…

c Dựa vào vị trí tác dụng của protease lên các liên kết peptide trong phân tử protein:

- Endopeptidase (proteinase):chủ yếu phân giải các liên kết peptide nằm trongphân tử protein tạo thành những đoạn peptide có trọng lượng phân tử nhỏ (polypeptidemạch ngắn, pepton…)

- Exopeptidase (polypeptidase): chủ yếu phân cắt liên kết peptide ở hai đầumạch

d Dựa vào các nhóm chức trong trung tâm hoạt động:

- Protease serin: Trung tâm hoạt động có nhóm (-OH) như: tripsin,subtilopeptidase

- Protease cystein: Trung tâm hoạt động có nhóm (-SH) như papain, bromelin…

- Protease acid: trung tâm hoạt động có nhóm (-COOH) như pepsin, renin…

- Protease kim loại:trung tâm hoạt động có các nguyên tố kim loại:cacboxypeptidase A…

e Dựa vào thành phần amino acid và vùng pH tối ưu của protease:

- Protease acid: pepsin, renin,… hoạt động ở vùng acid

- Protease kiềm: Trypsin,chymotrypsin,… hoạt động ở vùng pH kiềm.

- Protease trung tính: amylase,papain,… hoạt động ở vùng pH trung tính

3.2 Ứng dụng của enzyme protease trong mủ mít:

Khả năng thay thế renin của enzym protease mủ mít trong công nghệ chế biếnsữa:

Công nghệ chế biến các sản phẩm từ sữa không thể không sử dụng các chế phẩmenzym Có thể nói, các chế phẩm enzym đóng vai trò quyết định để tạo ra các sản phẩmsữa Thông thường để chế biến các sản phẩm từ sữa người ta sử dụng enzym renin thunhận từ dạ dày bê Trong 10 năm trở lại đây xu hướng sử dụng enzym protease thực vậtngày càng phát triển như papain từ nhựa cây đu đủ, bromelin từ trái dứa hoặc ficin từcây sung đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới Nhưng hiện nay enzym protease từ mủmít chỉ có một công trình nghiên cứu tại Ai Cập Nơi mà có những thử nghiệm đầu tiên

và tìm thấy một vài ứng dụng của enzym protease trong lĩnh vực sản xuất bơ, phomai…

Tủa (NH4)2SO4

Sắc ký lọc gel

Điện di

3.4.3 Giải thích qui trình

 Hòa tan

- Đối với mủ tươi: cân khối lượng mủ và hoà tan đệm phosphat 0.05M pH 7.5 đãlàm lạnh theo tỉ lệ: 1g mủ: 10ml đệm Khuấy bằng đũa khuấy trong 15 phút và thựchiện trong tủ lạnh (2oC)

- Đối với mủ đông khô: hòa tan mủ bằng đệm phosphat theo tỉ lệ 20mg: 3ml đệmphosphat 0.05M pH 7.5

- Đệm phosphat 0.05M pH 7.5 được pha như sau

- Dung dich mononatri orthophosphat 0.05M: cân 7.8005g NaH2PO4.12H2O hòatan và định mức đến 1000ml bằng nước cất (dung dịch a)

- Dung dịch đinatri hydrophosphat: 17.907g NaH2PO4.12H2O hòa tan và định mức đến 1000ml bằng nước cất (dung dịch b)

- Trộn 80ml dung dịch a, 420ml dung dịch b(tỉ lệ dung dịch a: dung dịch b là16:84)và định mức đến 1000ml thu dung dịch đệm phosphat 0.05M pH7.5 (nếu đo pHkhông phù hợp phải dùng dung dịch hoặc dung dịch b chỉnh pH).

 Lọc: Dùng giấy lọc thô để tách riêng phần không tan,dung dịch sau lọc tiếp tục

tinh sạch Thực hiện trong tủ lạnh (2oC)

 Tinh sạch

 Tinh sạch theo phương pháp tủa sunfat amon [(NH 4 ) 2 SO 4 ]:

Sunfat amon là muối trung tính có khả năng gây tủa thuận nghịch thường được

sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm để tủa protein, enzyme nhờ khả năng không gâybiến tính và có độ hòa tan cao Dung dịch protein và enzyme khi bổ sung (NH4)SO4 cácion NH4+ và SO4-2 sẽ trung hòa điện tích của protein hoặc enzym ,các phân tử mất điệntích không còn đẩy nhau mà liên kết lại thành tủa

Sau khi tủa ,protein và enzyme thu được còn giữ lại một lượng nhỏ muối (NH4)

2-SO4 do vậy phải loại muối nhờ quá trình thẩm tích qua màng bán thấm (túi cetophan)

 Tinh sạch theo phương pháp tủa cồn

Protein được bao bọc bởi lớp vỏ hydrat, cồn là dung môi hữu cơ háo nước nênkhi bổ sung cồn vào dung dịch có chứa enzym hòa tan, nó sẽ bóc lớp vỏ hydrat gây tủaprotein

Cách thực hiện: enzym rất dễ biến tính với dung môi hữu cơ nên trước khi tủacần làm lạnh dung dịch chứa protein và enzym, cồn ở nhiệt độ -40C Rót cồn chảy theothành cốc để tránh biến tính enzym Để lạnh cho đến khi xuất hiện tủa, tiến hành ly tâm4000v/phút trong 10 phút Thu tủa, để bay hơi tự nhiên trong tủ lạnh

 Tinh sạch theo phưong pháp tủa acetone

Acetone cũng là tác nhân tủa protein và enzym Khác với muối trungtính,acetone là dung môi hữu cơ háo nứơc, khi bổ sung acetone vào dung dịch có chứaenzym hòa tan, nó sẽ hút lớp áo nước của phân tử enzym, do vậy cá enzym kết với nhautủa xuống

 Sắc kí lọc gel

Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration) Cơ sở của phươngpháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích thước hình dạng và phân tử lượng củaenzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra.

Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ,không phản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền vớicác yếu tố về cơ học cũng như sinh học

Tóm lại bằng phương pháp lọc rây phân tử người ta thể tách các chất có trọnglượng phân tử khác nhau có trong hỗn hợp Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loạimuối thay cho quá trình thẩm tích

 Sắc kí trao đổi ion trên DEAE-cellulose

Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số củacác protein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phảnứng trao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tácnhân trao đổi ion

Để tách enzyme protease từ mủ mít ra khỏi hỗn hợp

Qua Sắc kí trao đổi ion các enzyme khác nhau sẽ được chiết ra khỏi cột theotừng phần chiết khác nhau trong đó chứa phần chiết có enzyme cần thu với nồng độ caonhất

Phương pháp điện di được dùng để kiểm tra độ tinh sạch protein sau khi qua quátrình tách chiết và tinh chế Ngoài ra nó còn được dùng để xác định gián tiếp trọnglượng phân tử của mẫu vừa tách

Nguyên tắc:

Dưới tác dụng của điện trường, các chất có phân tử lượng khác nhau có trongmẫu sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau, các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cựcdương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.Sự dichuyển phụ thuộc vào điện tích, hình dạng, kích thước, thành phần hóa học và lực điệntrường Khi quá trình phận tách kết thúc,các chất có cùng phân tử lượng tập trung lạithành dãy (vạch) ngang ở các vị trí khác nhau trên chất mang Sau đó những vạch nàyđược phát hiện nhờ các phương pháp nhuộm màu, autoradiography, định lượng bằngcác phương pháp quét qua dencitometer.

Tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của protein mà sử dụng gel có nồng độ thíchhợp.Nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn , cho phép phân tách các phân tử sinh học cókích thước lớn,ngược lại nồng độ cao sẽ cho lỗ gel nhỏ,vì vậy chỉ có khả năng phântách những phân tử sinh học có kích thước nhỏ

Quá trình điện di chịu ảnh hưởng bởi nhiệt độ, đệm, pH và sự ổn định của dòngđiện

3.5 Ứng dụng của enzyme protease

Enzyme protease từ mủ mít để đông tụ sữa

Đó là khả năng thay thế rennin trong quá trình đông tụ sữa sản xuất phomai

Ưu điểm đáng kể của enzyme này là có nguồn gốc từ thực vật (mủ mít) khônggây vị đắng Đây là phát hiện vô cùng quan trọng về khả năng dùng mủ mít thay thếrennin

4 GIỚI THIỆU ENZYME BROMELIN VÀ CÁCH THU NHẬN NHẬN TỪ DỨA

4.1 Đặc điểm nguồn nguyên liệu và bromelin

4.1.1 Đặc điềm nguồn thu nguyên liệu

Cây dứa (Ananas comusus) thuộc lớp đơn tử điệp, họ Bromeliaccac có nguồngốc từ Nam Mỹ Hiện nay, ở nước ta dứa được trồng nhiều nhất là Ananas comususđược sử dụng như nguồn thực phẩm tươi, đóng hộp, nguồn thu nhận enzyme và ngoài

ra còn được sử dụng trong 1 số lĩnh vực khác như dược, mỹ phẩm… Phần thân và lásau khi thu hoạch quả có thể được sử dụng làm giấy, lấy sợi hoặc làm phân bón

Trong quả dứa chín , nước chiếm đa số, hàm lượng 80-86%, phần còn lại làcacbohydat chiếm 10-18% (trong đó có 60-70% sacharose, glucose và fructose chiếm

30-40%) protein 2-3%, axit hữu cơ 0.1-1.6% (trong đó axit citric chiếm 87% và 13%còn lại là axit maleic), tro 0.3%, sắc tố 0.03-0.6% và các hợp chất phenolic (tạo màu),các hợp chất tạo mùi, các vitamin như: vitamin A (0.3mg carotene/100g thịt quả), B1 và

C (8.5mg/100g thịt quả) và enzyme bromelin là 1 enzyme thủy phân protein Ngoài ra,

ở lá non trong ngọn thân cây dứa co chứa rất nhiều vitamin C

4.1.2 Đặc điểm enzyme bromelin

Bromelin là tên gọi chung nhóm enzyme thực vật chứa nhóm sulfhydryl, có khảnăng phân giải protein được thu nhận từ họ bromelin, đặc biệt ở cây dứa (thân và trái).Trước đây, cây dứa được sử dụng như 1 loại cây làm thuốc Năm 1957, Heinicke nhậnthấy thân dứa có 1 lượng lớn bromelin và người ta bắt đầu tìm cách triết tách nó cà sảnxuất dưới dạng thuốc đễ chữa bệnh Tùytheo nguồn thu nhận mà người ta phân biệtbromelin thân hay bromelin quả và bromelin thân là nhóm enzyme có giá trị kinh tế Ởmỗi bộ phận khác nhau trên cây dứa, bromelin có pH tối ưu khác nhau và có cấu tạokhác nhau

Bromelin có vai trò trong y học nên được nghiên cứu rất nhiều Bromelin làenzyme thủy phân protein, nó phân cắt protein trong cơ thể sinh vật Một trong nhưnglợi ích của nó được chú ý đến đó lá 1 chất giúp cho tiêu hóa vì nó hoạt động trong môitrường axit trong dạ dày và cả trong môi trường kiềm ở ruột non Bromelin có thể thaythế được cho cả những enzyme tiêu hóa khác như pepsin và trypsin Bromelin có tácdụng kháng viêm, rất có hiệu quả trong chữa trị bệnh viêm thấp khớp do đó các chuyêngia y tế đề nghị sử dụng bromelin như chất làm giảm đau kháng viêm và kháng sưng.Hiệu quả của bromelin là làm giảm lượng protaglandin trong cơ thể gây ra đau, viêm,

và ngăn cản sự thấm các chất dinh dưỡng qua bơ bằng cách ngăn cản những tiền chấtgây viêm Bromelin có ảnh hưởng tích cực trên các protagladin hữu dụng

Bromelin chiếm 50% protein trong quả dứa Nó có khả năng thủy phân khámạnh và hoạt động tối ưu ở pH 6-8 Bromelin có hoạt tính xúc tác sự phân giải proteintương tự như papain trong mủ đu đủ hay ficin trong cây thuộc họ sung Enzymebromelin có trọng lượng phân tử khoảng 33000 Da , lớn gấp 1.5 lần so với papain

Thịt quả dứa chỉ có hoạt tính enzyme bromelin kể từ ba tháng trước khi chín, trong đóhoạt tính bromelin cao nhất là khoảng 20 ngày trước khi chín Khi trái chín, hoạt tínhbromelin giảm xuống như ko mất hẳn.

Bromelin còn có thể thu được từ trong thân dứa (trung bình có thể thu được 3.6

kg từ 3781 lít nước rút ra từ thân cây dứa)

4.2 Tính chất enzyme bromeline

Thành phần chủ yếu bromelin có chứa nhóm sulfhydryl thủy phân giải protein.Trong dịch chiết bromelin còn chứa 1 ít peroxydase, phosphatase axit và chất cảnproteinase Khi chiết tách và tinh sạch phân đoạn có chứa nhóm sulfhydryl củabromelin thì thu dược 1 enzyme thủy phân protein hiệu quả in vitro, nhưng lại bị bấthoat sinh lí in vitro ở 1 số điều kiện mà bromelin có hiệu quả Như vậy, rõ ràng rằngphần lớn các hoạt động sinh lí của bromelin ko chỉ phụ thuộc vào phân đoạn có hoạttính thủy phân protein mà nó còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác trong bromelin

Hiện tại người ta ghi nhận được bromelin trong thân dứa có tám thành phân cơ bản cóhoạt tính thủy phân protein Hai thành phần chính được gọi là F4 và F5 Phân đoạn cóhoạt tính mạnh nhất là F9 chiếm khoảng 2% protein trên tổng số Người ta ước tínhrằng khoảng 50% protein của F4 và F5 là glycosylate, trong khi đó ở F9 ko cóglycosylate Ph tối thích của các phân đoạn F4 và F5 là 4.0-4.5 và của F9 thì gần với pHtrung tính Dịch triết bromelin toàn phần có hoạt động trong khoảng pH 4.5-9.8.Bromelin được chiết tách từ các phần khác nhau nhưng hoạt tính thủy phân protein thìgiống nhau Bromelin ko ổn định với nhiệt độ do đó các hoạt động sinh lí của nó sẽgiảm đi nếu như quá trình chiết tách hay điều kiện bảo quản ko thích hợp

Bromelin có thể thấm hoàn toàn qua dạ dày và ruột của động vật Nồng độ caonhất của bromelin được tìm thấy trong máu sau khi ăn 1 giờ, tuy nhiên hoạt động thủyphân protein của nó bị bất hoạt nhanh chóng có lẽ là do tác động của các protease nộisinh và yếu tố α-2-macroglubuline cảu huyết thanh

4.2.1 Cấu tạo hóa học

Bromelin thân là 1 protease nhưng nó khác với protease thực vật khác nhưpapain, ficin ở chỗ nó lá 1 glycoprotein, mỗi phân tử có glycan gồm 3 manose, 2glucosamine, 1 xylose và 1 fructose Sợi liên kết cacbon này liên kết hoán vị với sợi

polypeptide Trong sợi hydrat cacbon này dường như 1 nửa sợi ko liên quan đến cơ chếtiếp xúc của phân tử Người ta đề nghị cấu trúc sợi hydratcacbon của phân tử bromelinnhư sau:

Hình 4.1: Cấu trúc sợi hydrat cacbon của bromelin

Khi phân tích thành phần amino axit của bromelin thân và bromelin quả thì tùytheo phương pháp thu nhận và phương pháp phân tích mà có thành phần amino axitthay đổi khác nhau Bromeline có thành phần amino axit thay đổi trong khoảng 312-144amono axit và bromelin quả là 283-161 amino axit

Bromeline thân là 1 sợi polypeptide có amino axit ở đầu amine là valine và ở đầucacbonhydrat là glycine , còn bromelin quả có amino axit ở đầu amine là alanine

Bảng 4.1: Thành phần amino axit và những nhóm chất khác của bromelin

Arginine 11.5-12 8.6 9.1

4.2.2 Cấu trúc không gian của bromelin

Murachi và busan phân tích cấu trúc bậc 1 của bromelin và nhận thấy cách sắpxếp trong phân tử bromelin như sau:

Bromelin là 1 protease trong tâm hoạt động có chứa cysteine và 2 sợipolypeptide liên kết với nhau bằng –S-S- Phân tử có dang hình cầu do có cách sắp xếpphức tạp

Trong phân tử bromelin thân có chứa nhóm sulfhydryl có vai trò chủ yếu tronghoạt tình xúc tác và trong mỗi phân tử có tất cả 5 cầu nối disulfite Ngoài ra, trong phân

tử còn có các ion Zn2+ có lẽ có vai trò trong duy trì cấu trúc ko gian của enzyme

4.2.3 Tính chất vật lí

Các nghiên cứu về tính chất vật lí của bromelin thân dứa được Murachi và công

sự nghiên cứu và công bố vào năm 1964 như sau :

Bảng 4.2: Những tính chất vật lí của bromelin thân

***: tính bằng phương pháp Archibald

4.2.4 Hoạt tính của bromeline

 Hoạt tính phân giải của bromelin

Bromelin có hoạt tính khác nhau: peptidase, amidase và esterase Bromelin thân

có nhiều cớ chất tự nhiên và có thể thủy phân cả cơ chất tự nhiên lẫn cơ chất tổng hợp.Khả năng phân giải các cơ chất tự nhiên của bromelin

Bảng 4.3: Hoạt tính phân giải casein của bromelin

Bảng 4.4: Hoạt tính phân giải Benzoyl-L-Arginine amide amide ( BAA) của

Với: * ở điều kiện nhiệt độ 50 C và pH 6.0; BAA : benzoyl-L-Arginine amide

BAEE : benzoyl-L-Arginine ethyl ester , BAEM : benzoyl-L-Arginine methyl ester

Bromelin quả xanh có hoạt tính phân giải BAA cao hơn bromelin thân vàbromeline quả chín

So với BAA , hằng số xúc tác cảu bromelin thân trên BAEE cao hơn gấp 140lần Sự khác biệt này có lẽ do cơ chế xúc tác khác nhau

 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính bromelin

Giống như các cấu trúc sinh học khác, bromelin chịu ảnh hưởng bởi các yếu tốnhư cơ chất, nồng độ enzyme, nhiệt độ, pH , ion kim loại, 1 số nhóm chức, phươngpháp trích ly…

Các yếu tố như nhiệt độ, pH thích hợp cho hoạt động của các phản ứng xúc táccủa bromelin ko ổ định mà phụ thuộc lẫn nhau và phụ thuộc các yếu tố khác như bảnchất cơ chất, nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, thời gian phản ứng…

Ảnh hưởng bởi cơ chất: trên những loại cơ chất khác nhau, bromelin có hoạt tínhkhác nhau Nếu cơ chất là hemoglobin thì khả năng phân giải cảu bromelin mạnh hơnpapain 4 lần Đối với cơ chất tổng hợp như BAA ( benzoyl-L-Arginine amide), BAEE(benzoyl-L-Arginine ethyl ester) thì khả năng thủy giải cảu bromelin yếu hơn papain

Ảnh hưởng bởi nhiệt độ: nhiệt độ cảu phản ứng xúc tác chịu ảnh hưởng bởinhiều yếu tố: thời gian tác dụng càng dài thì nhiệt độ sẽ có những thay đổi làm ảnhhưởng đến hoạt tình enzyme, nồng độ enzyme, nồng độ cơ chất, dạng tồn tại cảuenzyme

Ở dịch quả chiết (pH 3.5) khi tăng nhiệt độ lên đến 60oC thì bromelin vẫn cònhoạt tính nhưng bromelin tinh khiết nhạy cảm với nhiệt độ Ở 5oC, ph 5-10 thì enzymegiữ hoạt tính tối đa trên casein trong vòng 24 giờ Ở 55oC, pH 6.1 thì enzyme bị mất50% hoạt tính trong vòng 20 phút Quá trình đông khô làm mất 27% hoạt tính

Ảnh hưởng của độ pH: pH là yếu tố quan trong nhất ảnh hưởng đến hoạt tính xúctác cảu enzyme pH tối thích của bromelin ko ổn định mà tùy thuộc vào nhiệt độ thờigian phản ứng, bản chất và nồng độ cơ chất, độ tinh sạch của enzyme, bản chất cảudung dịch đệm, sự hiện diện của chất tăng hoạt

Khi thu nhận bromelin thân, nếu dùng tác nhân kết tủa là ammonium sulfatehoặc molypdeum carbonate thì enzyme có hoạt tính cao nhất ở pH 4.8 và ổn định ở pH4.6-5.4 Bromelin thân đã được tinh sạch 1 phần có hoạt tính cao nhất ở pH 6.0 và pH8.0 ổn định ở pH 3.5-4.6 với nhiệt độ 63oC Enzyme bromelin đã tinh sạch chỉ còn lại60-70% hoạt tính Bromelin có biên độ pH rộng (3-10) nhưng pH tối thích của enzyme

là 5-8 tùy thuộc vào cơ chất

Ảnh hưởng bởi các ion kim loại: các ion kim loại có ảnh hưởng đến hoạt tính củaenzyme do chúng thường gắn vào các trung tâm hoạt động của enzyme Muối thủy

phân có ảnh hưởng quan trọng đến hoạt tính enzyme bromelin và mức độ kìm hãm thayđổi theo nồng độ của muối.

Ngoài ra, còn ảnh hưởng những chất có tác động ức chế bromelin do chúng kếthợp với nhóm SH của trung tâm phản ứng của enzyme

Bảng 4.6: Ảnh hưởng bởi trạng thái và điều kiện bảo quản trên hoạt tính của bromelin

Hoạt tính ( UI/mg protein )

Bảo quản ở 4oC trong 5

Quả dứa hoặc thân được xay nhuyễn, vắt kĩ, lọc bỏ bã và thu dịch lọc, ly tâmdịch lọc với tốc độ 6000 vòng/phút trong 10 phút để loại bỏ chất xơ sẽ thu được dịchchiết chứa bromelin.

Tuy nhiên, khi sử dụng phương pháp siêu lọc để tinh sạch enzyme bromelin thìcác hợp chất pectin ở trong dịch chiết quả sẽ làm tăng độ nhớt của dịch chiết sẽ lảm trởngại cho quá trình lọc Các nhà khoa học S.Sathivel, K.Niranjan và W.prinyakiwatkul

đã tìm ra phương pháp đồng hóa nguyên liệu dưới điều kiện áp suất cao thì có thể phá

vỡ tế bào mô dứa, giảm độ nhớt của dịch chiết, phóng thích các enzyme nội bào mà kocần làm biến tính chúng

Theo nghiên cứu này thì khả năng đồng hóa nguyên liệu ở 15Mpa độ nhớt trongdịch chiết giảm xuống, giá trị của độ Bx và pH thay đổi ko đáng kể, sản lượng và hoạttín cảu enzyme gia tăng Ở 15Mpa, sản lượng enzyme tăng gấp 2 lần (1.27g/500ml dịchchiết từ quả kể cả phần lõi) với hoạt tính cao nhất là 2.06 UI/mgso với khi đồng hóa ởđiều kiện thường và ở 20Mpa thì sản lượng enzyme thu được từ vỏ quả là 0.9g/500mldịch chiết Vậy đồng hóa mẫu dưới áp suất cao có thể làm giảm độ nhớt của dịch chiếtgiúp cho việc sử dụng phương pháp siêu lọc thuận lợi hơn, đồng thời làm tăng sảnlượng và hoạt tính của enzyme bromelin từ qua dứa và các phế phẩm của nó

 Các phương pháp tách bromelin

 Phương pháp kết tủa enzyme

Nguyên tắc: điểm đảng điện của đa số protein thấp hơn pH 7 do đó trong điềukiện sinh lí, các phân tử protein có tích điện âm thừa và chính những điện tích âm thừanày đã kết hợp với đầu mang điện tích dương của phân tử nước hữu cực (ở trong dungdịch, protein liên kết với 1 lượng nước khá lớn) cũng như các ion dương Sự kết hợpvới nước tạo ra 1 lớp nước bao xung quanh phân tử protein và cản trở sự kết tủa củachúng Đối với enzyme protein cũng như các enzyme protein khác, để có thể kết tủađược enzyme, điều cần thiết là phải phá vỡ lớp nước liên kết xung quang phân từ nàybằng cách bổ sung vào dung dịch protein enzyme các dung môi hoặ các hóa chất ưanước có ái lực với nước mạnh hơn protein để lôi kéo nước ra khỏi phân tử protein đó,giúp cho protein tủa xuống

Các dung môi thường sử dụng dể kết tủa bromelin là acetone và ethanol, còn cáchóa chất khác như muối trung tính ở nồng độ cao cũng có thể kết tủa được enzyme.Ammonium sulfate là loại muối trung tính có độ hòa tan rất tốt do đó ở dung dịch bãohòa cảu muối này thì tất cả protein đều kết tủa.

Heinicker và Gortner đã dùng acetone để kết tủa bromelin từ thân và trái.Bromelin trong dung dịch nước rất nhạy cảm với các dung môi hữu cơ do đó để sự kếttủa đạt hiệu quả cao thượng tiến hành kết tủa trong điều kiện lạnh Như vậy nước ép từthân và trái dứa phải được làm lạnh ở 0-4oC và acetone tinh khiết ở 20oC Ethanol cũngphải được sử dụng để kết tủa protein và hỗn hợp bromelin-ethanol cũng phải giữ ở điềukiện nhiệt độ lạnh Sau khi thu được kết tủa, tủa protein phải được rửa bằng acetone vàlàm khô thật nhanh để bromelin ko bị biến tính

Renee Tisseau đã sử dụng ammonium sulfate với nồng độ bão hòa là 0.7 (70%bão hòa) để làm tác nhân kết tủa bromelin Sự kết hợp với tác nhân ammonium sulfate(đặc biệt ở nhiệt thấp) là 1 quá trình thuận nghịch, tủa dễ dàng hòa tan bằng nước vàmuối có thể được loại bỏ ra khỏi protein bằng cách thẩm tích Phương pháp này có thểthực hiện ở nhiệt độ thường

Để thu nhận enzyme, việc đầu tiên là phải phá vỡ tổ chức mô có chứa enzymebằng cách nghiền các mô để thu dịch chiết cò chứa bromelin rồi sau đó dùng tác nhânkhác nhau để kết tủa bromelin

Những yếu tố chính ảnh hưởng đến hiệu suất chất lượng của chế phẩm enzymelà:

- Nồng độ ammonium sulfate

- pH của dịch chiết

- Nhiệt độ kết tủa

- Thời gian tiếp xúc của tác nhân đệm và dịch chiết

Thông thường nếu sử dụng phương pháp kết tủa với ammonium sulfate thì cứ 60

kg nguyên liệu tươi sẽ thu được khoảng 1 kg bromelin thô

Cách làm:

- Tủa bằng muối ammonium sulfate : chuẩn bị 1 lít dung dịch nước dứa sau khi litâm, cho từ từ 532g ammonium sulfate vào và khuấy đều (dung dịch đạt độ bão hào

ammonium sulfate là 70%) Để yên ở nhiệt độ phóng 10-15 phút sau đó li tâm với tốc

độ 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu nhận kết tủa

- Tủa bằng ethanol: làm lạnh dung dịch nước dứa sau khi li tâm , cho ethanol 96o(cũng đã được làm lạnh) vào theo tỉ lệ 4.1 (4 nước dứa, 1 cồn), trộn đều, để ở nhiệt độ0oC trong 3-4 giờ Ly tâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút, rửa tủabằng acetone và thu nhận tủa

- Tủa bằng acetone: thêm 1 thể tích acetone lạnh hoặc 20% acetone lạnh vào 1thể tích dung dịch nước dứa sau ly tâm Để yên trong 1 giờ ở nhiệt độ 0oC-4oC Lytâm hỗn hợp với tốc độ 6000 vòng/phút trong 5 phút , loại bỏ tủa Thêm 2 thể tíchacetone lạnh vào , để 1 giờ 0oC-4oc ,ly tâm thu tủa và rửa tủa bằng acetone lạnh

Ở vị trí của 2 lớp sát cạnh nhau, các ion O2- ở bề mặt của lớp này mằn gần giữacác ion OH- ỏ bề mặt của lớp kia và do đó xuất hiện liên kết hydrogen giữa các ion tráidấu này lam cho các lớp kaolin dính sát lại gần nhau và khoảng cách giữa 2 lớp là 7.1Ao

Kaolon có cấu tạo thành từng lớp và có độ phân tán cao, do đó chúng có tính dẻođặc biệt và có khả năng tạo thành kết dính Một tính chất quan trong là do kaolin có độphân tán cao nên nó có ảnh hưởng đến hấp phụ các chất

Kaolin là 1 chất có tính hấp phụ tốt Kích thước hạt nhỏ hơn 1µm do đó diệntích tiếp xúc giữa hạt kaolin và chất bị hấp phụ tăng lên rất nhiều Một lí do khác dẫnđến khả năng hấp phụ vật chất cảu kaolin cao , là do bề mặt kaolin co rất nhiều ion OH-

và O2- , những ion này có khả liên kết tương đối bền vững với các chất bị hấp phụ

Cách làm: cho kaolin khô (hoặc đã ngâm cho trương nở) vào dung dịch nướcdứa sau khi li tâm với tỉ lệ 25mg kaolin/ml dung dịch nước dứa Khấy đều bằng máykhuấy từ, sau đó ly tâm để thu tủa Tủa được gọi là bromelin-kaolin.

 Phương pháp siêu lọc

Siêu lọc là quá trình chảy qua 1 màng lọc dưới 1 áp suất để tách phân đoạn cácthành phần trong chất lỏng đó Sự phân chia các phân đoạn phụ thuộc vào kích thước lỗtren màng và tùy theo trọng lượng phân tử của chất thấm qua Tùy theo kích thước của

lỗ trên màng (giá trị loại từ cut-off) mà sau khi thực hiện quá trình siêu lọc sẽ thu đượcnước và các chất có phân tử nhỏ còn những chất có phân tử lớn sẽ bị giữ lại trên màng

Dung dịch enzyme sau khi thu được từ nguyên liệu thực vật sẽ có chứa nhữngtạp chất có trọng lượng phân tử khác nhau Đầu tiên sử dụng phương pháp lọc để loạitrừ các chất bển Sau đó chyển sang dùng phương pháp siêu lco5 thì sẽ loại được cácchất có trọng lượng phân tử thấp hơn các protein enzyme và đồng thời cô đặc đượcenzyme

Phương pháp siêu lọc được sử dụng trong ngành công nghệ thực phẩm và cácquá trình sản xuất sinh học để tách các chất dễ bị biến tính bởi nhiệt như lọc và ổn địnhrượu vang , lọc nươc ép trái cây , cô đặc sữa làm phô mai, làm bơ, cô đặc lòng trắngtrứng , cô đặc huyết thanh động vật và tinh sạch các chất pectin, gum, gelatin… cô đặc

và tinh sạch các enzyme, kháng thể, polysaccharide, polipeptide, vaccine… thu hồi cácprotein và các cacbonhydrat từ nước thải và các sản phẩm phụ

Màng siêu lọc: màng siêu lọc được cấu tạo bởi các sợi giống Trong mỗi sợigiống lại có nhiều sợi giống xếp song song và gắn chặt với lớp ngoài tạo thành các lỗ đểcác chất thấm qua Các sợi này được chế tạo từ polime bền như fluoro polimer ( FS),cellulose acetate (CA), polysulphone (GR)… Tùy theo mục đích cụ thể mà người ta sửdụng loại màng thích hợp Ví dụ cô đặc protein: dùng màng FS, GR, cô đặc enzymedùng màng GR

Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình siêu lọc: trong quá trình siêu lọc cần chú ýđến các yếu tố sau:

- Nhiệt độ: nhiệt độ phải thích hợp với sản phẩm và loại màng sử dụng Khi chọnnhiệt độ cần lưu ý đến khả năng kết tủa của protein và sự tăng nhiệt độ trong quá trìnhsiêu lọc vì các yếu tố này có thể làm bít màng.

- Áp suất: thường tốc độ của dỏng chảy (số lít chất lỏng chảy qua 1m2 màngtrong 1 giờ) sẽ tăng cùng với sự gia tăng áp suất cho đến khi đạt giá trị tốc độ cực đại.Nếu áp suất tăng cao hơn thì tốc độ dòng chảy sẽ giảm Người ta đề nghị tốc độ dòngchảy nên được chỉnh từ 4-5 lít/phút, tương ưng với hiệu số PI1 – PI2 ở trong khoảng 0.5-3bar Áp suất dòng vào lớn nhất (PI1 max) là 7bar (tương ứng 102Psi), áp suất dòng ranhỏ nhất (PI2 min) là 0.5bar (tương ứng 7.25bar)

Các kiểu siêu lọc : có 3 kiểu hệ thống siêu lọc

- Kiểu 1 bước (single pass oparation)

- Kiểu lô (batch operation): chất lỏng được tuần hoàn qua màng đến nòng độ củadịch cô đặc ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu

- Kiểu thể tích ko đổi (constant volume operation): dòng chất lỏng được cungcấp liên tục đạt thể tích ở trong chậu chứa ko thay đổi và chất lỏng được tuần hoàn quamàng đến nồng độ dịch cô ở trong chậu chứa đạt được như yêu cầu

Những thuận lợi của phương pháp siêu lọc

- Có thể chọn lựa màng thích hợp với tùng mục đích cụ thể

- Đối với enzyme: enzyme có thể cô đặc 25 lần mà ko bị mất hoạt tính

- Quá trình siêu lọc vừa làm cô đặc, vừa tinh sạch được enzyme Trong quá trìnhthực hiện nếu them nước vào thì độ tinh sạch cảu enzyme càng cao

Trong quá trình siêu lọc, nhiệt độ cao có thể làm mất hoạt tính của enzyme, do

đó nhiệt độ 10-20oC được xem là khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho năng suất mà kolàm mất hoạt tính enzyme Quá trình siêu lọc có thể thực hiện tốt ngay ở nhiệt độ thấp(5oC)

 Các quá trình thu nhận bromelin

Thu nhận bromelin bằng phương pháp sử dụng cacbonul methyl cellulose(CMC) Phương pháp tách bromelin bằng CMC cho phép thu được bromelin ở dạng bộttrắng có hoạt tính cao, thời gian nhanh và đơn giản hơn so với các phương pháp khác

Công nghệ chế tạo CM: CMC được chế tạo từ vải màn, bông, vải, gạc loại tốt.Cân 300g vải mềm hay gạc ngâm trong 2 lít dung dịch NaOH 45% trong 10 phút, thỉnhthoảng trộn cho đều, thêm 2 lít dung dịch monochoacetic 15% cho vào thành 4 lần, vùacho vừa đảo trộn đều Đun cách thủy hỗn hợp ở nhiệt độ 60oC trong thời gian 30 phút.Sau đó làm lạnh băng nước đá đến khi hỗn hợp có màu vàng Thêm vào đó 100mldungdịch acetic axit 10% từ từ từng ít một Sau 2 giờ pha loãng với nước cất đến 20 lít Đểyên gạn bỏ rồi thêm nước dung dịch acetic axit rồi rửa lại axit Ngâm trong H2SO40.1N trong thời gian 48 giờ, sau đó rửa băng nước cất đến pH trung tính, sấy khô ở

50oC Quá trình phản ứng xảy ra như sau:

Tách chiết bromelin từ dịch chiết dứa bằng CMC

CMC vải màn được tẩm ướt bằng dung dịch đệm phosphate 0.005M, pH 6.1, sau

đó cho dịch chiết dứa vào thỉnh thoảng khuất trộn Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt, vẩy sạchchất bển bám vào CMC rửa protein bằng đệm photphate 0.05M, pH 6.5 Sau đó tiếnhành phản ứng hấp phụ lần thứ nhất, cho dung dịch phản ứng hấp phụ là đệm phosphate0.05M , pH 7.1 và NaCl 0.5 khuấy trộn 3-4 lần Sau 2 giờ lấy ra vắt kiệt thì thu đượcdung dịch đậm đặc chứa bromelin Tiếp tục phản ứng hập phụ lần thứ 2 như lần thứnhất Sau đó gộp các dịch chiết lại và tủa bằng acetone hay cồn lạnh để tách lấyenzyme

Với phương pháp này hiệu suất thu đạt 0.1% so với chồi dứa tươi có hoạt tính 24nk/mg chế phẩm enzyme So với tủa (NH4)2SO4 thì độ sạch chế phẩm enzyme cao hơngấp 2 lần , thời gian tiến hành nhanh hơn và tiến hành thuận lợi

4.3.2 Phương pháp tinh sạch enzyme bromelin

Enzyme bromelin được tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích, lọc quasephadex, phương pháp sắc kí

 Tinh sạch bằng phương pháp thẩm tích

Cân 1g enzyme thô, pha trong 100ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M có

pH 7.2 Sau khi tất cả enzyme đã hòa tan thì cho hỗn hợp vào túi cellophane rồi đặt túivào cốc có chứa 1 lít dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M , pH 7.2 Túi cellophaneđực chuẩn bị bằng cách trước khi dùng được tráng đầy bằng dung dịch đệm tương tựtrên Tiến hành thẩm tích trong 6 gờ và cứ sau 2 giờ thay đổi đệm bên ngoài 1 lần.Dung dịch đệm phái ngoài túi được khuấy liên tục bằng 1 mày khuấy từ

Trong quá trình thẩm tích, khi thay đồi nhiệt độ trong 1 giới hạn nhất định thìvận tốc khếch tán sẽ tăng theo sự gia tăng nhiệt độ Nhưng nếu sự gia tăng nhiệt độvượt quá mức cho phép thì protein enzyme bị biến tính do nhiệt độ cao làm ảnh hưởngđến những mối tương tác giúp cho sự ổn định cấu trúc enzyme Chính vù vậy để làmgiảm sự biến tính của enzyme do nhiệt , người ta thường tinh sạch enzyme ở nhiệt độthấp

 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex

 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-50

Saphadex G-50 được đun cách thủy ở 100oC trong 1 giờ rồi nhồi vào cột kíchthước (kích thước cột 23.5 x 0.9 cm) Đặt 1 cái phểu thủy tinh phía trên cột m chosephadex từ từ vào phễu và khuấy liên tục Các hạt sẽ lắng từ từ xuống cột , chú ý phảikhuấy liên tục đến khi nhồi xong cột Khi nhồi cột phải cố gắng nhồi sao cho mật độ hạtđồng nhất và ko có bọt khí Trong quá trình nhồi cột vẩn phải xả cột trong 1 giờ với vậntốc 1ml/7 phút

Cân 100mg enzyme thô vào trong 1ml dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M,

pH 7.2 Khi enzyme đã hòa tan hoàn toàn chi cho hỗn hợp enzyme từ từ vào cột Chodung môi phân ly enzyme qua cột và điều chỉnh tốc độ chảy khoảng 2ml/7phút Loại

bỏ 5ml đầu tiên rồi mới bắt đầu thu dịch enzyme Dịch enzyme thu được đến khi dùngBa(NO3)2 để thử ( NH4)2SO4 và thấy có xuất hiện kết tủa trắng thì ngừng quá trình thudịch enzyme Dịch enzyme thu nhận được làm đông khô Quá trình lọc enzyme quasaphadex G-50 nên được tiến hành trong điều kiện nhiệt độ thấp có khả năng giảm thiểu

sự biến tính của enzyme Quá trình lọc enzyme qua saphedex diễn ra trong khoảng thờigian 1h

 Tinh sạch bằng cách lọc qua sephadex G-100

Saphadex G-100 được đun cách thủy ở 100oc trong 5 giờ, sau đó ngồi vào cộtkích thước 28 x 1cm Thực hiện nhồi cột tương tự như saphedex G-50 Sau khi hoàn tấtviệc nhồi cột, cho dung dịch đệm sodium phosphate 0.03M, pH 7.2 chảy qua cộtkhoảng 3-4 giờ để cân bằng cột

Cân 100g enzyme thô hòa vào 1ml dung dịch đệm như trên rồi cho vào cột.Chỉnh cho tốc độ của dung môi phân ly enzyme là 1ml/5 phút Thu từng phân đoạnenzyme (mỗi phân đoạn là 3ml) và đo OD ở bước sóng 280nm Tính trọng lượng phân

tử của bromelin theo công thức:

LgM = 5,941 – 0.847 ( Ve/Vo)Trong đó : Vo = 40% Vt (Vt : thể tích tổng cộng của cột)

Ve: thể tích dung môi phân ly enzyme được tính từ lúc cho mẫu vào đến khi thu nhậnmẫu