Tiểu luận hóa sinh thực phẩm Các phương pháp tách và tinh chế enzyme

Thể tích tính theo ml của dungdịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hòa ban đầu S1 để đạt đến một độbão hòa S2 cần thiết được tính theo công thức sau: 100 S2 - S1 V ml = 1 -

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC&THỰC PHẨM

HÓA SINH THỰC PHẨM

CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ

TINH CHẾ ENZYME

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME

GVHD: NGUYỄN THỊ MAI HƯƠNG LỚP: ĐHTP5LT

NHÓM: 1

SVTH: NGUYỄN VĂN GIỚI 09253801

NGUYỄN TRẦN THANH HẢI 09258251

NGUYỄN ĐỨC HẬU 09278921

TRẦN THỊ THANH VÂN 09240921

1.1 Khái niệm về enzyme

Trong các phản ứng hóa học, nếu ta cho thêm vào phản ứng một chất nào đó phảnứng sẽ xảy ra với tốc độ tăng hàng chục lần Chất cho thêm vào này gọi là chất xúc tác.Chất xúc tác hóa học có hai đặc điểm quan trọng:

1- Làm tăng phản ứng hóa học

2- Bản thân chất xúc tác không có sự thay đổi nào sau phản ứng

Sau này các nhà khoa học thấy rằng các chất xúc tác hóa học chỉ làm tăng tốc độ phảnứng, chứ không tham gia làm thay đổi chiều hướng phản ứng, trạng thái phản ứng haynăng lượng sử dụng trong phản ứng Trong các phản ứng sinh học (các phản ứng xảy ratrong cơ thể sinh vật) cũng có chất làm tăng các phản ứng, chất đó gọi là enzyme

Chữ “enzyme” được bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp có nghĩa là chất trong nấu men.Enzyme được các cơ thể sinh vật tổng hợp nên và tham gia các phản ứng hóa học trong

cơ thể Enzyme là một chất hữu cơ, trong khi đó các chất xúc tác hóa học thường là chất

vô cơ Sau này, các nhà khoa học xác định chúng là protein

Như vậy enzyme là một protein có khả năng tham gia xúc tác các phản ứng hóa họctrong và ngoài cơ thể Điểm rất đặc biệt của enzyme là chúng hoạt động trong diều kiện

ôn hòa giống như nhiệt độ ôn hòa của cơ thể sinh vật Trong khi đó, các chất hóa học cầnphải có nhiệt độ cần thiết cho phản ứng Nhiệt độ càng cao, tốc độ xúc tác phản ứng hóahọc càng cao Ưu điểm cơ bản của enzyme khi tham gia các phản ứng sinh hóa có thểtóm tắt như sau:

1- Enzyme có thể tham gia hàng loạt các phản ứng trong chuỗi phản ứng sinh hóa đểgiải phóng hoàn toàn năng lượng hóa học có trong vật chất

2- Enzyme có thể tham gia những phản ứng độc lập nhờ khả năng chuyển hóa rấtcao

3- Enzyme có thể tạo ra những phản ứng dây chuyền Khi đó sản phẩm phản ứng đầu

sẽ là nguyên liệu hay cơ chất cho những phản ứng tiếp theo

4- Trong các phản ứng enzyme, sự tiêu hao năng lượng thường rất ít

5- Enzyme luôn luôn được tổng hợp trong tế bào của sinh vật Số lượng enzyme đượctổng hợp rất lớn và luôn luôn tương ứng với số lượng các phản ứng xảy ra trong cơ

thể Các phản ứng xảy ra trong cơ thể luôn luôn có sự tham gia xúc tác bởienzyme.

6- Có nhiều enzyme không bị mất đi sau phản ứng Ngày nay, các nhà khoa học đãtìm ra trên 1000 loại enzyme khác nhau có trong tế bào sinh vật, số lượng này làrất nhỏ so với số lượng có thật trong mỗi tế bào Trong hơn 1000 loại enzyme đãbiết, loài người mới thu nhận và kết tinh được khoảng 200 loại

1.2 Cấu tạo của enzyme

Enzyme là những protein có phân tử lượng từ 20000 đến 1000000 dalton

Các enzyme được cấu tạo từ L – axit amin Các axit amin này liên kết với nhau bởi liênkết peptit Khi thủy phân protein enzyme, ta sẽ thu nhận được các axitamin Trong một sốtrường hợp, ngoài axit amin ra người ta còn thu được những thành phần khác

- Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta chỉ thu được các axit amin thì enzyme nàyđược gọi là enzyme đơn cấu tử hay còn gọi là enzyme đơn giản

- Nếu một enzyme, khi bị thủy phân, ta thu được ngoài axit amin còn các thành phầnkhác thì enzyme này được gọi là enzyme đa cấu tử hay còn gọi là enzyme phức tạp Các enzyme phức tạp, ngoài protein ra còn có các thành phần khác như ion kim loại,vitamin, glutation dạng khử, … đa số enzyme có trong cơ thể thuộc enzyme đa cấu tử.Trong thành phần enzyme đa cấu tử người ta phân biệt rõ các phần như sau:

- Phần protein được gọi là feron hay apoenzyme

- Phần không phải protein gọi là nhóm ngoại “agon”

Nhóm ngoại, khi được tách ra khỏi enzyme, có thể tồn tại độc lập Trong khi tham giaxúc tác, không phải toàn bộ tất cả các phần trong cấu trúc của enzyme tham gia mà chỉ cómột phần giới hạn của phân tử enzyme tham gia phản ứng Phần giới hạn tham gia phảnứng này được gọi là trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt đông của enzyme do một sốaxit amin đảm trách Như vậy, trong trường hợp cơ thể bị đột biến thì không phải bất kỳđột biến nào cũng dẫn tới hiện tượng làm sai lệch các phản ứng sinh hóa của tế bào, chỉ

có những đột biến làm thay đổi axit amin hoặc làm thay đổi thứ tự sắp xếp của các axitamin thì mới có ý nghĩa

Trung tâm hoạt động của các enzyme đơn cấu tử thường bao gồm một tổ hợp cácnhóm định chức của axit amin không tham gia vào trục chính của sợi polypeptit Cácnhóm này có thể ở xa nhau trong mạch polypeptit nhưng chúng lại gần nhau trong khônggian Khoảng cách này được xác định sao cho chúng có thể tương tác với nhau trong quátrình xúc tác Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động thường giống cấu trúc khônggian của cơ chất mà chúng tham gia xúc tác.

Trung tâm hoạt động của các enzyme đa cấu tử là nhóm ngoại và nhóm định chứccủa axitamin nằm ở apoenzyme Khi enzyme tương tác với cơ chất các nhóm định chứccủa trung tâm hoạt động sẽ thay đổi cấu trúc không gian sao cho tương ứng với cấu trúckhông gian của cơ chất

Ở tế bào động vật tồn tại một loại enzyme không có khả năng tham gia phản ứngngay, muốn có khả năng hoạt động chúng phải được hoạt hóa Trung tâm hoạt động củaloại enzyme này tồn tại ở dạng chưa được hoạt hóa và được gọi là zymogen hayproenzym, ví dụ như enzyme pepxinogen, tripxinogen, kimotripxinogen hay protrombin.Các enzyme này có thể tự hoạt hóa hoặc nhờ tác dụng của một enzyme nào đó hoặc mộtyếu tố nào đó Khi đó một số liên kết peptit trong phân tử zymogen bị mất, enzyme sẽđược hoạt hóa Trong một số trường hợp khác có sự sắp xếp lại các nhóm chức trongphân tử enzyme Khi đó trung tâm hoạt động của enzyme ở trạng thái hoạt hóa

Ở những enzyme dị lập thể hay enzyme điều hòa còn có trung tâm dị lập thể (enzymeđiều hòa) Các trung tâm này có khả năng tương tác với cơ chất khác Các cơ chất tươngtác với trung tâm này gọi là chất điều hòa Khi trung tâm điều hòa này tương tác với chấtđiều hòa, chúng sẽ làm thay đổi cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động, khi đó tốc

độ phản ứng enzyme sẽ bị thay đổi Trong trường hợp phản ứng enzyme được tăng lênkhi chất điều hòa tương tác với trung tâm điều hòa thì chất điều hòa này được gọi là chấtđiều hòa dương Ngược lại nếu phản ứng enzyme giảm đi khi chất điều hòa tương tác vớitrung tâm điều hòa thì chất diều hòa này được gọi là chất điều hòa âm Các chất điều hòahoàn toàn không biến đổi khi chúng tương tác với enzyme

Các nhóm chức năng của axit amin thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzymebao gồm:

- Nhóm sulfridril của xistein.

- Nhóm amin ở đầu N hoặc nhóm ε – amin của lizin

- Nhóm cacboxyl của axit aspartic và axit glutamiz

- Nhóm hydroxyl của serin, treonin, và trirozin

Trung tâm hoạt động của các enzyme một thành phần bao gồm từ 3 – 7 nhóm chứcnăng trên Các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động được định hướng xác định sau

đó để đảm bảo cho chúng có khả năng tương tác với nhau trong khi phản ứng

Trung tâm hoạt động của enzyme hai thành phần bao gồm một số nhóm chức năngcủa axit amin trong thành phần apoenzyme và trong nhiều trường hợp còn cần cả ion kimloại Các kim loại thường gặp trong trung tâm hoạt động của enzyme là nhũng ion kimloại hóa trị 2 như Fe, Co, Mn, Zn, Cu …chúng có mặt ở cả trung tâm hoạt động củaenzyme một thành phần và enzyme hai thành phần Các kim loại này có thể tham gia trựctiếp trong các phản ứng xúc tác, chúng liên kết bền với phân tử enzyme Trong nhiềutrường hợp enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính khi bị loại bỏ kim loại ra khỏi thành phầncủa enzyme Trong trường hợp này enzyme này được gọi là metaloenzyme Hoạt độngcủa enzyme này sẽ được phục hồi khi cho kim loại vào

1.3 Cách gọi tên và phân loại enzyme

Trước kia thường gọi tên enzyme một cách tùy tiện, tùy theo tác giả Các tên đã quendùng như tripxin, pepxin, kimotripxin, …hiện nay vẫn được dùng gọi là tên thông dụng.Tên gọi đầy đủ, chính xác theo quy ước quốc tế - tên gọi hệ thống của enzyme được gọitheo tên cơ chất đặc hiệu của nó cùng với tên của kiểu phản ứng mà nó xúc tác, cộngthêm đuôi “aza”

Tên gọi hệ thống thường gồm hai phần:

- Phần thứ nhất là tên gọi cơ chất (nếu phản ứng lưỡng phân thì phần thứ nhất là têngọi của hai cơ chất viết cách nhau bằng hai chấm);

- Chỉ một cách khái quát bản chất của phản ứng xúc tác

Ví dụ: + Tên thông dụng: ureaza

+ Tên gọi hệ thống: cacbamit – amidohydrolaza

Nếu phản ứng bao gồm hai sự chuyển hóa tương hổ thì người ta còn thêm vào sau phầnthứ hai của tên gọi một phần tương ứng trong dấu ngoặc.

Ví dụ, enzyme xúc tác oxy hóa axit amin trong phản ứng:

L – axit amin

Có tên gọi: L – axit amin: oxydoreductaza (deamin)

Dựa vào tính đặc hiệu phản ứng của enzyme, từ năm 1960 Hội hóa sinh quốc tế (IUB) đãthống nhất phân loại enzyme thành sáu lớp, đánh số từ 1- 6 Các số thứ tự này là cố địnhcho mỗi lớp:

L – aspartat + α – xetoglutarat = oxaloaxetat + glutamate

(Nhóm amin được chuyển từ L – aspactat đến α – xetoglutarct)

- Oxygenase: tác động oxy hóa

- Peroxydase: tác động khi có H2O2, có tác dụng loại khả năng gây độc của H2O2 trong

- Acyltransferase: có nhóm acyl (coenzyme A)

- Glucosyltransferase: chuyển nhóm glucose Enzyme chuyển hóa tinh bột

- Amino transferase: chuyển nhóm amin

- Photpho transferase: ATP  ADP

ATP + AMP  ADP + ADP

- Peptit hydroláe: có khả năng thủy phân liên kết peptit

- Lipase có khả năng thủy phân lipit Ví dụ triacylglycerol lipase (3.1.1.3)

1.3.4 Lyase

Có tác động đến phản ứng nhờ bổ sung nhóm chức vào nối đôi hoặc tạo nối đôi nhờlấy đi nhóm chức Phương trình phản ứng tổng quát:

liệu thích hợp cho việc chiết rút và tinh chế enzyme Có ba nguồn nguyên liệu sinh học

cơ bản: các mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh vật

Trong tất cả các nguyên liệu có nguồn gốc động vật thì tuyến tụy, màng nhầy dạdày, tim dùng để tách enzyme rất thuận lợi Dịch tụy tạng có chứa amylase, lipase,protease, ribonuclease và một số enzyme khác Từ ngăn tư của dạ dày bê nghé người ta

có thể thu nhận chế phẩm renin để làm đông sữa trong sản xuất fomat Người ta cũngsản xuất pepsin từ dạ dày động vật Nhưng khác với pepsin, renin có khả năng đông tụsữa cao mà không thủy phân sâu sắc casein Renin là chế phẩm enzyme có giá trị lớntrong công nghiệp Ở thực vật: thông thường enzyme hay có mặt ở các cơ quan dự trữnhư hạt, củ, quả Cơ quan dự trữ giàu chất gì thì nhiều enzyme chuyển hóa chất ấy Ví

dụ trong hạt cây thầu dầu có nhiều lipase, trong hạt đậu tương có nhiều enzyme urease.Thóc nảy mầm chứa nhiều a - amylase, ở củ khoai lang lại có nhiều b - amylase Người

ta đã thu được một số chế phẩm enzyme thủy phân như papain, bromelain, fixin từ thựcvật bậc cao Papain thu được từ mẫu nhựa đu đủ xanh, bromelain thu được từ các bộphận (lá, thân, quả) cây dứa, còn fixin được tách từ dịch ép thân và lá cây Ficus Quacác nguồn nguyên liệu động, thực vật chính có thể từ đó chiết xuất các chế phẩmenzyme, chúng ta thấy rằng hai nguồn nguyên liệu này không thể dùng để sản xuất cácchế phẩm enzyme với quy mô lớn bởi các nhược điểm sau đây:

- Chu kỳ sinh trưởng của chúng dài

- Nguồn nguyên liệu này không cải tạo được

- Nhiều nguyên liệu dùng làm thực phẩm (dùng để ăn) không thể dùng làm nguyênliệu để sản xuất với quy mô lớn các chế phẩm enzyme nhằm thoả mãn các nhu cầu củanền kinh tế quốc dân Dùng vi sinh vật làm nguồn nguyên liệu để sản xuất các chế phẩmenzyme có nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với nguồn nguyênliệu từ động vật, thực vật, cũng như sẽ khắc phục được mọi khó khăn và hạn chế ở trên.Trước hết vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn.Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con người chủ động tạo ra được Chu kỳ sinh trưởngcủa vi sinh vật ngắn (từ 16 – 100 giờ) vì vậy có thể nuôi cấy hàng trăm lần trong năm.Enzyme vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác Vì vậy chỉ cần mộtlượng nhỏ enzyme có thể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất Số liệu tính toán cho biết,trong vòng 24 giờ, vi sinh vật có khả năng chuyển hóa một lượng thức ăn gấp 30 - 40lần so với trọng lượng cơ thể chúng Trong khi đó, hệ enzyme của con lợn trên 50 kgchỉ có thể chuyển hóa được vài kg thức ăn trong ngày Hệ enzyme vi sinh vật vô cùngphong phú Vi sinh vật có khả năng tổng hợp nhiều loại enzyme khác nhau, trong đó cónhững enzyme ở động, thực vật không tổng hợp được Ví dụ cellulase, raxemase Phầnlớn các thức ăn để nuôi vi sinh vật lại dễ kiếm và giá rẻ Nhiều vi sinh vật cho enzymethường có khả năng phát triển trên các môi trường đơn giản, giá rẻ, dễ kiếm như các phếliệu của các ngành sản xuất Hơn nữa, có thể dùng những nguyên liệu không phải thựcphẩm, những dung dịch muối vô cơ để nuôi vi sinh vật Vì vậy dùng vi sinh vật làmnguồn thu enzyme sẽ mang lại giá thành rẻ, thời gian nhanh và hiệu quả kinh tế cao Visinh vật sinh sản phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ, kíchthước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất chế

phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao Lượng enzyme có thể được sản xuất

ra trong một thời gian ngắn Đối với một số trường hợp có thể dùng 100% sinh khối visinh vật làm nguồn enzyme

Vi sinh vật rất nhạy cảm đối với tác động của môi trường, thành phần dinh dưỡngnuôi chúng cũng như một số tác nhân lí hóa, cơ học khác Do đó có thể thay đổi nhữngđiều kiện nuôi cấy để chọn giống tạo những chủng đột biến cho ta hàm lượng enzymeđáng kể với hoạt tính xúc tác cao Có thể nói rằng, nhờ nguồn enzyme vi sinh vật, người

ta có thể điều khiển sự tổng hợp enzyme dễ dàng hơn các nguồn nguyên liệu khác đểtăng lượng enzyme được tổng hợp hoặc tổng hợp định hướng enzyme Tuy vậy trongquá trình chọn nguồn nguyên liệu từ vi sinh vật, cần lưu ý một số vi sinh vật có khảnăng sinh độc tố để có biện pháp xử lý thích hợp Nói chung các vi sinh vật muốn được

sử dụng làm nguồn nguyên liệu tách enzyme cần phải thoả mãn các điều kiện sau:

- Khả năng tổng hợp enzyme mạnh trong một thời gian ngắn

- Dễ tách enzyme và không sinh độc tố

Có một điều lí thú là: trong điều kiện bình thường, vi sinh vật chỉ tổng hợp ra một lượngenzyme vừa đủ cho hoạt động sinh lý cơ thể của chúng ( thường được gọi là sự tổng hợpenzyme "bản thể") Nếu khi tăng hàm lượng một số chất hoặc thêm một số chất mới vàomôi trường nuôi cấy, đặc biệt là cơ chất của enzyme, thì sự tổng hợp enzyme tương ứngtăng lên một cách đáng kể, khác thường có khi còn tổng hợp enzyme mới: hiện tượngtrên gọi là sự cảm ứng sinh tổng hợp enzyme Chất gây nên sự cảm ứng sinh tổng hợpgọi là chất cảm ứng Sự tổng hợp một lượng đáng kể enzyme gọi là siêu tổng hợpenzyme Để thu được nguồn enzyme dồi dào từ vi sinh vật, cần phải nuôi cấy chúng Cóhai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật để thu enzyme: phương pháp nuôi cấy bề mặt vàphương pháp nuôi cấy bề sâu hay là phương pháp nổi và phương pháp chìm

Trong phương pháp nuôi cấy bề mặt, người ta cho vi sinh vật phát triển và bao phủ trên

bề mặt các hoạt chất dinh dưỡng rắn, đã được làm ẩm, dùng làm môi trường (cám gạo,cám nếp, cám m., bắp xay nhỏ ) Để môi trường xốp người ta trộn thêm một lượng nhỏmạt cưa Sau khi nuôi đủ thời gian để vi sinh vật tổng hợp enzyme môi trường đượcsấy nhẹ nghiền nhỏ Chế phẩm thu được ở dạng rắn - thô Muốn có chế phẩm tinh khiếtphải qua giai đoạn tách và tinh chế enzyme

Khác với phương pháp nuôi cấy bề mặt, trong phương pháp nuôi cấy bề sâu người

ta cho vi sinh vật phát triển trong môi trường lỏng Nguyên liệu chính và phổ biến làdịch đường glucose, fructose, maltose, saccharose dịch thủy phân cellulose, tinh bột Nguồn nitơ hữu cơ thường dùng là nước chiết bắp, chiết malt, dịch tự phân nấm men.Cần chọn pH phù hợp với chủng vi sinh vật và sự tổng hợp enzyme theo mong muốn.Sau khi nuôi, ta thu được canh trường lỏng - dạng thô Để làm tăng lượng enzyme ở visinh vật chúng ta cần chú ý tuyển lựa và chọn giống các chủng vi sinh vật có hoạt tínhenzyme cao, tổng hợp được enzyme cần thiết và với số lượng nhiều Các chủng đượcphân lập theo phương pháp thông thường chỉ tổng hợp một lượng nhỏ enzyme

(enzyme bản thể), do đó cần tiến hành gây đột biến bằng các phương pháp sinh học, lý,hóa học để tạo chủng có khả năng siêu tổng hợp enzyme Vi sinh vật sau khi được

tuyển chọn, cần được nhân giống và nuôi trong điều kiện tối ưu để chúng sinh trưởngtốt, tổng hợp nhiều enzyme Ngoài ra cần phải chọn môi trường vì thành phần môitrường dinh dưỡng có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme của

vi sinh vật Trong thành phần môi trường phải có đủ các chất đảm bảo được sự sinhtrưởng bình thường của vi sinh vật và tổng hợp enzyme

Đặc biệt lưu ý là để tăng sự tổng hợp enzyme người ta thường dựa vào hiện tượngcảm ứng Vì nếu như trong thành phần môi trường có các chất cảm ứng thì chất đó haysản phẩm phân giải của nó sẽ kìm hãm hoặc làm yếu tác dụng kìm toả của chất kìm hãmnhằm bảo đảm khả năng sinh tổng hợp enzyme đã cho không bị cản trở Chất cảm ứngtổng hợp enzyme cho thêm vào môi trường nuôi thường là cơ chất tương ứng củaenzyme cần tổng hợp

Ví dụ: Muốn tách α - amylase ở nấm mốc (Asp Oryzae), người ta cho vào môitrường nuôi cấy tinh bột, maltose, isomaltose, oligosaccharid có chứa liên kết α - 1,6glucozid Muốn tách pectinase ở Asp Niger, người ta cho thêm vào môi trường pectin.Đối với hemicellulase thì chất cảm ứng là hemicellulose; còn đối với proteinase chấtcảm ứng có hiệu lực là protein, bột đậu nành, lông, sừng nghiền nhỏ (ở Actinomycesfradiae) Chất cảm ứng cũng có thể là những chất giống cơ chất và những sản phẩmthủy phân của chúng Ví dụ: thay cho protein thì peptid và thay cho tinh bột thìerithrodextrin đều có tác dụng cảm ứng Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đối với môi trườngnuôi cấy Nhiệt độ nuôi cấy thông thường từ 25 - 300C Trị số pH ban đầu của môitrường (chủ yếu ở môi trường nước) cũng có thể gây ảnh hưởng nào đó đến sự tạo thànhenzyme, nhưng khi đó cũng cần tính đến khả năng biến đổi nhanh chóng chỉ số đó bởi

vi sinh vật Thông thường đối với α amylase, pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp (pH = 7 8) khác với pH tối ưu cho hoạt động của nó (pH = 4,7 - 4,9) Các enzyme đường hóakhác của nấm mốc như glucoamylase thì pH tối ưu cho sự sinh tổng hợp và cho hoạtđộng là chung nhau (4,5 - 5,0) Độ thông khí cũng rất cần thiết cho việc sinh tổng hợpenzyme Vì vậy ở môi trường bề mặt người ta thường thêm chất xốp như trấu vào, còn ởmôi trường bề sâu (môi trường dịch thể), thì người ta thường lắc (nếu enzyme cần lắcthì việc này cực kỳ quan trọng) Độ ẩm cũng rất quan trọng (chỉ có tác dụng ở nuôi cấy

-bề mặt), phụ thuộc vào thành phần môi trường -bề mặt Một điều cần nói thêm nữa làenzyme thường chứa ở các tế bào sinh vật gọi là các enzyme trong tế bào (intracellular),nhưng nó cũng có thể được các sinh vật tiết ra môi trường sống Đó là các enzyme ngoài

tế bào (extracellular) Enzyme vi sinh vật thường chiết là enzyme ngoại bào

2.2 Nguyên tắc chung:

Muốn tìm hiểu toàn bộ hoạt động sống của cơ thể sinh vật, chúng ta phải biết bảnchất của những biến đổi hóa học xảy ra trong từng mô tế bào Điều đó chỉ thực hiệnđược khi chúng ta tách được các tế bào ra khỏi các mô và chiết rút cũng như làm sạchcác enzyme chứa trong chúng Từ các dạng enzyme tinh khiết thu được chúng ta có thểnghiên cứu sâu sắc cơ chế tác dụng, tính đặc hiệu trong hoạt động xúc tác của chúng.Tùy theo những đặc tính riêng biệt của từng loại enzyme mà lựa chọn phương pháp làmsạch cho thích hợp Trong quá trình tinh chế enzyme, mặc dầu trình tự và các thủ thuật

ở các bước có thể thay đổi , song vẫn có những nguyên tắc chung Như chúng ta đã biết,trong cơ thể sinh vật, enzyme có trong tế bào chất và các cấu tử (nhân, microsome, tythể, lysosome ) của tế bào Tế bào được bao bọc bằng một lớp màng Lớp màng này ở

vi khuẩn đôi khi rất bền và dày Người ta còn thấy nhiều enzyme liên kết rất chặt chẽvới các cấu tử của tế bào Các phân tử enzyme không có khả năng đi qua màng của tếbào và màng của các cấu tử của tế bào Do đó để có thể chiết rút các enzyme nội bào,bước đầu tiên là phải phá vỡ cấu trúc của các tế bào có chứa enzyme và chuyển chúngvào dung dịch Có thể phá vỡ cấu trúc của các tế bào bằng các biện pháp cơ học nhưnghiền với bột thủy tinh hoặc cát thạch anh, làm đồng hóa bằng thiết bị đồng hóa(homogenizator) Thiết bị có chày thủy tinh gắn với một môtơ quay và có thể điều chỉnhđược tốc độ quay theo yêu cầu Các tế bào giữa chày thủy tinh và thành cối sẽ bị pháhủy

Để việc phá vỡ có hiệu quả ở mô thực vật, trước khi nghiền người ta thường tháinhỏ mẫu để vào ngăn đá hoặc cho trương nước (ví dụ như đối với mẫu hạt khô) Còn ởcác mô của động vật như gan hoặc thận, khi chiết enzyme người ta cần cắt bỏ các môliên kết Muốn tách được các enzyme trong các cấu tử của tế bào, người ta còn phảidùng các yếu tố vật lí và hóa học khác nhau như sóng siêu âm, dùng các dung môi hữu

cơ như butanol, aceton, glycerin, ethyl acetate và chất detergent Các hóa chất có tácdụng tốt cho việc phá vỡ các cấu tử của tế bào vì trong các cơ quan này thường chứa

mỡ Sau khi đã phá vỡ các cấu trúc của tế bào, enzyme được chiết bằng nước cất, bằngcác dung dịch đệm thích hợp hoặc các dung dịch muối trung tính Có một số yếu tố ảnhhưởng đến quá trình chiết rút cần lưu ý:

Trước hết đó là nhiệt độ Để tránh mất hoạt tính hoặc thậm chí vô hoạt, cần chiết rút

và tiến hành kết tủa enzyme ở nhiệt độ thấp (từ 3 đến 50C) Các thao tác phải nhanh.Một số chất điện ly làm tăng quá trình chiết rút enzyme như NaCl, ZnCl2, CaCl2 Tácdụng của chúng còn phụ thuộc vào phương pháp dùng khi chiết rút Ví dụ như nếu dùngmáy nung thì cả ba chất trên đều có tác dụng Nếu chỉ để lắng thì chỉ NaCl có tác dụng

Vì vậy cần dùng chất điện ly thích hợp Ví dụ khi chiết rút amylase, nếu cho thêm NaCl0,1 - 0,2 % vào dung dịch chiết rút thì hiệu suất chiết rút tăng lên 30% Người ta cònnhận thấy, nếu thêm vào dịch chiết CaCl2 0,2% sẽ làm cho kết tủa enzyme tốt hơn vàcấu trúc của kết tủa cũng tốt hơn Trong quá trình chiết rút enzyme ở các đối tượngđộng, thực vật, có trường hợp còn có mặt chất màu làm ảnh hưởng đến việc làm sạchhoặc xác định hoạt độ enzyme Trong trường hợp này người ta còn cho thêm vào chấtkhử để loại màu Màu của hemoglobin ở hồng cầu hoặc của chlorophyll và một số chấtmàu khác ở lá có thể bị loại trừ bởi hỗn hợp ethanol, chloroform với tỷ lệ thích hợp.Hoạt độ enzyme superoxide dismutase (SOD) - một enzyme chống ôxy hóa có thể xácđịnh sau khi đã loại màu khỏi dịch chiết enzyme Ở các mẫu từ động vật có sắc tốmelanin màu nâu Người ta thường loại màu trên cột nhựa trao đổi ion bằng cách chodịch enzyme qua cột hoặc lắc Khi qua cột, chất màu bị giữ lại và enzyme không bị giữ

Ví dụ người ta hay dùng DEAE – cellulose (Diethylamino ethyl - cellulose) hoặc thanhoạt tính Trong quá trình này phải chú ý kiểm tra pH Sau khi loại màu cần kiểm tra lạihoạt độ của enzyme

Trong dịch chiết, ngoài enzyme còn có các protein cấu trúc, các chất cao phân tửkhác nhau như polysaccharid nucleic acid, các chất có phân tử nhỏ như đường monose,các chất lipid, muối khoáng Để loại chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khácnhau Để loại bỏ muối khoáng và các loại đường là các tạp chất có phân tử lượng thấp,người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối các dung dịchđệm lỏng hoặc bằng cách lọc qua gel sephadex Cách làm thẩm tích như sau: cho dungdịch enzyme vào túi colodion hoặc cellophane (thông thường người ta dùng cellophanetốt hơn), sau đó đặt cả túi vào nước cất hoặc dung dịch đệm pha loãng (như đệmphosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M chẳng hạn) Màng cellophane là màng bán thấm,

có kích thước lỗ cho các chất có phân tử nhỏ xuyên và đi qua vào các dung dịch đệmloãng theo định luật khuếch tán Còn lại trong màng là các chất protein có phân tử lớn

Để loại bỏ các protein tạp (protein cấu trúc, protein trơ) và các chất có phân tửlượng cao khác người ta hay dùng kết hợp các phương pháp khác nhau: phương phápbiến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt độ hoặc pH của môi trường, phương pháp kếttủa phân đoạn bằng muối trung tính hoặc các dung môi hữu cơ, các phương pháp sắc kí(sắc kí hấp phụ, sắc kí trao đổi ion), điện di, phương pháp lọc gel

Phương pháp biến tích chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt hoặc pH của môi trường chỉdùng đối với trường hợp các enzyme bền với nhiệt hoặc bền với acid Thủ thuật đượctiến hành như sau: dịch enzyme được giữ ở 50 - 700C hay ở pH = 5 trong một thời gianxác định Protein bị biến tính được loại bỏ bằng cách lọc hoặc ly tâm

Cơ quan, tế bào động vật Cơ quan, tế bào thực vật Vi sinh vật

NghiềnTrich ly

Nuôi cấy(lên men)Enzyme nội bào Enzyme ngoại bàoPhá vở tế bào

Lọc hoặc ly tâm

Cô đặc

Hình 2.1 Quy trình tách chiết và tinh chế enzyme

2.3 Các phương pháp tách từng phần protein enzyme:

Ở một chỉ số pH xác định, mỗi phân tử protein có một điện tích tổng số nào đấy mà

độ lớn của nó phụ thuộc vào số lượng các nhóm tích điện dương và tích điện âm Kếtquả là ở chỉ số nồng độ ion hydro cố định, các protein khác nhau trong hỗn hợp sẽ cótổng điện tích khác nhau Nhiều phương pháp dùng để tách các hỗn hợp protein đều dựavào đặc tính này Các phân tử protein mang điện tích tổng số (dương hoặc âm) cùng dấuđẩy nhau ra xa nên dễ tan vào dung dịch Mỗi một protein có một trị số pH nhất định mà

ở đó tổng số điện tích âm và điện tích dương trong phân tử bằng không Trị số pH đógọi là điểm đẳng điện Ở điểm đẳng điện, độ hòa tan của protein là thấp nhất, protein rất

dễ bị kết tủa Dựa vào tính chất này, người ta có thể tách từng phần các protein enzymetrong hỗn hợp

Ở các phương pháp tách từng phần này, người ta có thể sử dụng phương pháp kếttủa thuận nghịch bằng muối hoặc các dung môi hữu cơ, phương pháp sắc kí cột

Nói chung để đạt kết quả tốt, người ta thường phối hợp hai phương pháp với nhau

Tinh chếSấy

Sản phẩm cuối

của dung dịch muối này Điều đó nói lên tính kết tủa lựa chọn của (NH4)2SO4 cao hơncác muối khác Thường dùng hai dạng bột hoặc bão hòa:

- Khi dùng bột:

Người ta cho từng ít một vào dịch chiết enzyme Cách cho cũng ảnh hưởng lớn đếnlượng kết tủa ban đầu của enzyme Khi cho muối vào dịch chiết cần phải có máy khuấy

từ để đảm bảo sự hòa tan của muối

- Khi dùng dung dịch bão hòa:

Trong nhiều sách về phương pháp nghiên cứu người ta đưa ra bảng tính số lượngmuối cần thiết để pha các dung dịch có độ bão hòa khác nhau ở những nhiệt độ nhấtđịnh Khái niệm về số phần trăm của độ bão hòa hoàn toàn đã được đề cập đến Như ví

dụ trên đã nói, enzyme có thể bị kết tủa ở 50% (0,5) hoặc 70% (0,7) của độ bão hòahoàn toàn của (NH4)2SO4 Khi cho dung dịch (NH4)2 SO4 vào dịch chiết enzyme thìnồng độ (NH4)2 SO4 không tăng đột ngột Sau khi kết tủa xong người ta thường để lắngkhoảng 2h hoặc để qua đêm, mục đích là tạo kết tủa hoàn toàn (ở phương pháp dùngdung môi hữu cơ thì không cần để lâu) Kết tủa được lấy ra bằng cách ly tâm hoặc lọcqua phễu Buckner Khi hòa tan kết tủa lại người ta thường thêm ion Ca2+ làm bền (CaCl2

hoặc Ca(COOH)2)

Ở giai đoạn loại muối, người ta dùng phương pháp thẩm tích Thời gian thẩm tíchthường là 24 - 28h, nước thay càng nhiều càng nhanh càng tốt Có thể loại muối bằngcách lọc qua gel sephadex G25 là dẫn suất của dextran Ưu thế của phương pháp này làtiến hành với thời gian ngắn (khoảng 30 '), nên không làm mất hoạt độ enzyme Muối cótrọng lượng phân tử bé bị giữ lại, các enzyme có trọng lượng phân tử lớn xuống trước(xem phương pháp lọc gel)

Giai đoạn tiếp theo là làm đông khô thành bột trắng Chuyển trạng thái từ dịch nước

đá sang trạng thái khí mà không qua trạng thái lỏng

Để tiện lợi người ta đưa ra công thức cách tính lượng (NH4)2 SO4 cho vào dung dịch

đã có độ bão hòa cho trước (S1) để đạt đến một độ bão hòa cần thiết (S2)

Tùy theo trạng thái (NH4)2 SO4 cho thêm vào dung dịch chiết enzyme, mà có côngthức tính toán khác nhau

- Đối với (NH4)2 SO4 ở dạng dung dịch bão hòa Thể tích (tính theo ml) của dungdịch bão hòa cần cho vào 100ml dung dịch có độ bão hòa ban đầu S1 để đạt đến một độbão hòa S2 cần thiết được tính theo công thức sau: 100 (S2 - S1)

V (ml) = 1 - S2

2.3.2 Dùng dung môi hữu cơ:

Phương pháp này được tiến hành dựa trên cơ sở: độ hòa tan của protein phụ thuộcvào sự tương tác của các nhóm tích điện trong phân tử protein với các phân tử nước Sựtương tác đó (còn gọi là sự hydrate hóa) sẽ bị giảm xuống khi thêm vào dung dịchenzyme các dung môi hữu cơ Dung môi hữu cơ thường dùng là ethanol, isopropanol,acetone hoặc hỗn hợp các loại rượu.Ở phương pháp này cũng chú ý tiến hành ở nhiệt độthấp (từ 50C trở xuống) Dùng dung môi hữu cơ có thể tiến hành tách phân đoạn dưới

00C và có thể đến - 200C, như vậy nó có tác dụng tốt đến độ ổn định của proteinenzyme Khi đã có kết tủa, chú ý lấy nhanh kết tủa ra khỏi dung môi bằng cách dùngmáy li tâm Phương pháp này có lợi thế là không cần loại muối, nhưng có nhược điểm làhay có màu

2.3.3 Nhiệt độ

Để tách các protein khác nhau dựa trên kết tủa của chúng, người ta có thể sử dụngphương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng của nhiệt Một điều cần lưu ý là chỉ nêndùng đối với trường hợp các protein enzyme bền với nhiệt Dịch protein enzyme đượcgiữ ở 50 - 70C trong thời gian xác định, sau đó protein tạp đã bị biến tính được loại bỏbằng cách lọc hoặc ly tâm Như vậy, dịch chiết protein thô bền với nhiệt có thể được thunhận bằng cách cho kết tủa không thuận nghịch phần lớn các protein tạp

Để thu nhận chế phẩm protein theo phương pháp kết tủa thuận nghịch bằng các muốitrung tính, cần tiến hành ở nhiệt độ thấp, đối với dung môi hữu cơ cần tiến hành ở nhiệt

độ dưới 00C tránh biến tính đặc biệt là protein enzyme

2.3.4 Các kỹ thuật sắc kí cột:

Dịch chiết enzyme đã được loại bỏ phần lớn các protein tạp nhưng vẫn chưa đảmbảo độ đồng nhất cần thiết Do đó dịch chiết enzyme được tiếp tục làm sạch bằngphương pháp sắc kí cột Phương pháp sắc kí (chromatography) là do hai chữ "chroma"

là màu sắc và " grapho" là viết, nghĩa là "viết bằng màu" Thuở ban đầu, người ta đã sửdụng phương pháp sắc kí để tách các chất màu và chỉ sau này người ta mới áp dụng choviệc tách các chất không màu

2.3.4.1 Phương pháp dùng chất rây phân tử (lọc gel - gel filtration)

Cơ sở của phương pháp lọc gel là dựa vào sự khác nhau về kích nthước hình dạng

và phân tử lượng của enzyme có trong hỗn hợp để tách chúng ra

Để đảm bảo cho việc tách enzyme được tốt, chất rây phân tử phải là chất trơ, khôngphản ứng với protein enzyme Chất này cũng không hòa tan và tương đối bền với cácyếu tố về cơ học cũng như sinh học Ngoài ra chất được sử dụng cho mục đích lọc phân

tử phải là chất không có tính đàn hồi (không co) và phải là chất ưa nước (hydrophyl)

Gel sephadex là chất thoả mãn các yếu tố trên Sephadex là chế phẩm dextran do cácloài vi sinh vật khác nhau là Leuconostoc tạo ra khi chúng được nuôi cấy trên môitrường chứa saccharose Trọng lượng phân tử của dextran có thể đạt tới hàng triệu vàlớn hơn Phân tử dextran bao gồm các chuỗi do các gốc glucose tạo thành các liên kếtglucsid 1,6 Sephadex nhận từ dextran bằng cách xử lí hóa học (do tác dụng củaepichlohidrin) để tạo ra các lưới phân nhánh có liên kết ngang gọi là "sàng phân tử" vàchất này trở thành không tan trong nước Số liên kết ngang tạo ra càng nhiều, kích thướccủa lỗ sàng phân tử càng nhỏ.

Phương pháp lọc trên sephadex được tiến hành như sau: cho sephadex vào cột thủytinh dài và cân bằng bằng dung dịch đệm có pH nhất định Sau đó cho dung dịchenzyme lên cột Khi lọc và chiết bằng dung môi thích hợp, các phân tử có trọng lượngphân tử nhỏ (ở đây là các muối) sẽ khuyếch tán chậm chạp qua các lỗ nhỏ của các hạtSephadex bị trương phồng, còn chất có trọng lượng phân tử lớn hơn (ở trường hợp này

là protein enzyme ) không có khả năng đi vào mà lách nhanh qua các hạt sephadex và sẽrơi xuống trước, sẽ được chiết nhanh ra khỏi cột Vì vậy ta có thể tách được chất cótrọng lượng phân tử cao hơn ra khỏi chất có phân tử lượng nhỏ Hãng Sephadex(Pharmacia) của Thụy Điển đã tung ra thị trường các loại sephadex có kích thước khácnhau có kí hiệu từ G10 đến G200 Số kí hiệu nhằm chỉ ra mức độ nhận (hút) nước củachúng Ví dụ: G10 để chỉ khi trương phồng thì 1g gel khô nhận 1ml nước (1ml/g)

Các sephadex có kí hiệu khác nhau từ G10 đến G200 phục vụ trong việc lọc phân

tử cho phép các chất có trọng lượng phân tử khác nhau lọt vào ở các ngưỡng sau đây:

Các loại sephadex Trọng lượng phân tử

Sự chênh lệch nhiều vì phân tử lượng của các enzyme (12700 - 1.000.000) cho phépnghỉ rằng để tách và làm sạch enzyme, phương pháp lọc gel sephadex là phương pháp

có nhiều triển vọng Nơi có ít liên kết ngang tách chất có trọng lượng phân tử lớn vàngược lại Người ta còn sử dụng sephadex để loại muối thay cho quá trình thẩm tích.Cùng nhóm chất rây phân tử có nguồn gốc polysaccharid, là chế phẩm dextran nhưsephadex (pharmacia) còn có Molselect (Reanal) – là sản phẩm của Hungary được ứngdụng nhiều trong nghiên cứu Có thể dùng để làm cô đặc các chất có trọng lượng phân

tử lớn như protein, peptid, loại muối khỏi protein enzyme (dùng nhanh hơn so với thẩmtích), lọc gel tách theo trọng lượng phân tử (như protein huyết thanh) hoặc tách các sảnphẩm protein được hình thành dưới tác dụng của enzyme phân cắt (như g - G - globulin

có trọng lượng phân tử trong ngưỡng từ 100 đến 300.000 Có thể sử dụng ở vùng pH từ

2 – 11 Chất thứ ba là agarose loại sulphate Hay phổ biến là loại sepharose (pharmacia)Người ta thường dùng chất này để tách các phân tử có trọng lượng lớn hơn 106

Tóm lại bằng phương pháp lọc phân tử người ta có thể tách các chất có trọng lượngphân tử khác nhau có trong hỗn hợp (như polymer, polysaccharid, nucleic acid , protein)

ra Người ta có thể dùng kỹ thuật này để loại muối thay cho quá trình thẩm tích Và hơnthế nữa, trong quá trình tinh chế protein enzyme, chúng còn được sử dụng để cô đặcdung dịch protein enzyme Việc sắc kí, lọc phân tử protein hoặc chiết xuất proteinthường thu được dung dịch loãng, nếu không cô đặc dung dịch để cho phù hợp đối vớicác nghiên cứu tiếp theo thì không dùng được Molselect G - 25 rất thích hợp cho việc

cô đặc các dung dịch loãng của các chất có trọng lượng phân tử lớn như protein, peptid.Bằng cách trộn với dung dịch protein loãng, Moltelect sẽ nhận nước và chất có trọnglượng phân tử nhỏ, như vậy dung dịch protein được cô đặc mà không có sự thay đổi về

pH và lực ion của nó

2.3.4.2 Phương pháp sắc kí trao đổi ion

Phương pháp sắc kí trao đổi ion dựa vào sự khác nhau về điện tích tổng số của cácprotein enzyme Hay nói cách khác, phương pháp này được dựa trên cơ sở của phản ứngtrao đổi ion giữa protein được tan trong nước hoặc dung dịch đệm loãng và các tác nhântrao đổi ion Tác nhân (hay nguyên liệu) trao đổi ion có thể là chất nhựa có tích nhómsinh ion hoặc là chất ionit Đây là những chất giá trơ, không tan trong nước, có bản chất

là cellulose hoặc chất gel dextran có lưới phân nhánh (Sephadex, Molselect) hoặc làchất nhựa polystirol Chất giá thể này thường kết hợp với các nhóm ion hóa Các chấttrao đổi ion có chất giá là cellulose, sephadex, molselect thông thường được dùng đểtách protein enzyme, còn các chất trao đổi ion có chất giá là polystirol (ví dụ nhưDowex, Amberlite) chỉ dùng để tách các peptid có trọng lượng phân tử nhỏ hơn

* Các chất trao đổi ion có chất giá cellulose

Cationit CM - cellulose (carboxylmetyl - cellulose) - là một dẫn xuất este củacellulose Cellulose - O - CH2 – COOH Khi phân li cho ra COO- Đây là chất trao đổication Trên những cationit, thì các protein kiềm có thừa những nhóm amin và nhữngnhóm kiềm khác được hấp phụ Sự hấp phụ trên các cationit được tiến hành với nhữngdung dịch loãng ở pH 1,5 - 6,5 (Các protein kiềm có chứa các amino acid diamino -mono carboxylic như lys, Arg, His)

Anionit DEAE - cellulose (diethylamino - ethyl - cellulose) là dẫn xuất este củacellulose) C2H5 Cellulose - O - CH2 - CH2 – N C2H5 trong H2O nó được phân ly:

Cellulose - O - C2H4 - N - (C2H5)2 + H2O C2H5 Cellulose - O - C2H4 - N+ + OH - H C2H5.Đây là chất trao đổi anion

Các anionit được áp dụng để phân tích các protein acid có thừa những nhómcarboxyl tự do Sự hấp phụ protein trên những ionit như vậy được tiến hành với nhữngdung dịch đệm có lực ion thấp (0,005 - 0,1M) ở pH 7,5 - 8,5, (các protein acid có chứacác amino acid monoamin) Trong hỗn hợp chất ionit với dung dịch đệm có độ pHtương ứng, các chất ionit đã nói ở trên trở nên tích điện Vì vậy trên bề mặt lớp chất giá

sẽ hình thành một lớp điện tích có dấu phụ thuộc vào kiểu nhóm chức hóa học của nó.Nếu thêm protein - enzyme vào dung dịch đệm thì các phân tử enzyme mang điện tích

sẽ bị các nhóm tích điện trái dấu của chất trao đổi ion kéo lại Khi dùng một dung dịchđệm để phản hấp phụ có pH khác hoặc khi thêm một loại ion khác có lực ion lớn hơn thìphân tử protein enzyme sẽ bị đẩy ra khỏi chất trao đổi ion

Khi tiến hành phản hấp phụ, thường người ta thêm vào các ion Na+ và Cl- trongNaCl có nồng độ tăng dần theo bậc thang hay theo gradient Các phân tử proteinenzyme nào có điện tích tổng số nhỏ thì sẽ bị đẩy ra trước do lực liên kết với chất traođổi ion yếu Còn những protein enzyme nào có liên kết với ionit lớn hơn thì sẽ bị đẩy rabằng một lực ion của muối lớn hơn Như vậy, bằng cách này, chúng ta có thể tách đượctừng phần các loại protein enzyme Việc tách từng phần có lựa chọn tốt nhất là khi tăngdần nồng độ các ion thay thế Nhờ nồng độ ion của muối tăng dần (gradient) người ta cóthể rút ra từ cột các loại protein enzyme khác nhau Có thể thu nhận dịch chiết enzymeprotein sau khi qua cột bằng máy thu phân đoạn tự động Theo thứ tự từng phần dịchthu được, người ta tiến hành định lượng protein theo các phương pháp Lowry hay

phương pháp đo quang phổ và xác định hoạt độ của enzyme Ngoài việc dùng muốiNaCl cho các ion Na+ và Cl-, người ta có thể dùng các loại muối khác như KCl,

Na3PO4

Nếu chất giá là sephadex thì chúng ta có chất trao đổi ion sephadex Đó là các loạiDEAE - sephadex và CM - sephadex Ưu điểm của loại này là vừa tách được proteinenzyme về kích thước và về điện tích tổng số của các protein enzyme Trường hợp CM

- sephadex trên chất giá sephadex có gắn nhóm COO-- O - CH2 – COOH phân ly COO

-(mang điện tích âm) đây là chất trao đổi cation

2.3.4.3 Phương pháp dùng chất hấp phụ:

Nhiều protein và enzyme gắn một cách chọn lọc vào các chất hấp phụ nhất định nhưsilicagel, bentonite, g - aluminium hydroxid, hydroxyapatite và nhờ vậy, chúng có thểđược làm sạch với hiệu suất cao Phương pháp hấp phụ chọn lọc - hấp phụ trong thể tích(thêm chất hấp phụ trực tiếp vào dịch enzyme) hoặc trên cột (sắc kí hấp phụ) được dùngphổ biến trong việc tách và làm sạch enzyme Chất hấp phụ chủ yếu thường được dùng

là hydroxyapatite cho hiệu quả phân tách đặc biệt cao Hấp phụ chọn lọc enzyme có thểthực hiện bằng một trong hai cách: chất hấp phụ hoặc hấp phụ protein tạp hoặc hấp phụenzyme Quá trình hấp phụ thường được tiến hành ở 00C Bằng cách thay đổi độ pHhoặc lực ion của dung môi thích hợp, các enzyme được hấp phụ có thể được chiết khỏichất hấp phụ

2.3.4.4 Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học hay là phương

pháp sắc kí ái lực (affinity chromatography)

Cơ sở của phương pháp này là người ta gắn những phân tử gắn (ligand) vào chấtmang (chất giá) rắn bằng liên kết cộng hóa trị mà protein enzyme cần tách sẽ tương tácđặc hiệu với nó Những chất đó có thể là cơ chất (Substrate) hoặc chất ức chế (inhibitor)cạnh tranh Trong trường hợp hai chất kháng nguyên và kháng thể có ái lực liên kết đặchiệu với nhau, người ta thay thế vị trí chất gắn vào giá thể giữa kháng nguyên và khángthể để nghiên cứu từng loại giống như cơ chất, chất ức chế và enzyme đặc hiệu củachúng Hay nói cách khác dùng chất chỉ có khả năng liên kết đặc hiệu với một enzymehoặc protein ta nghiên cứu Chất mang thể rắn có thể là bất kỳ một loại nào phục vụ cholọc gel như sephadex, nhưng người ta hay sử dụng nhất là gel Sepharose Ở trên cột giáthể hay chất mang chứa cơ chất cố định ở pH và lực ion phù hợp, chỉ có protein enzymenào có khả năng chuyển hóa cơ chất mới gắn vào, các protein khác thì chảy xuống cột.Bằng cách thay đổi pH và lực ion phù hợp hoặc có thể bằng cách thêm chất ức chế cạnhtranh đã được hòa tan vào thì có thể tách được protein enzyme khỏi cột ở trạng thái sạch

2.4 Phương pháp tinh sạch enzyme

2.4.1 Phương pháp kết tinh

Trong nghiên cứu và trong sản xuất, người ta dùng dung dịch ammonium sulfate đểkết tinh enzyme, dung dịch ammonium sulfate để kết tinh enzyme đòi hỏi độ tinh sạchphải rất cao là rất khó, vì vậy phương pháp này ít được phổ biến

2.4.2 Phương pháp điện di

Phương pháp điện di chỉ được ứng dụng nhiều trong phòng thí nghiệm Người ta cũng

đã tiến hành áp dụng thử phương pháp này theo quy mô công nghiệp nhưng cho đến nayvẫn chưa được phát triển rộng rãi

2.4.3 Phương pháp sắc ký

* Phương pháp sắc ký lọc gel : Theo phương pháp này, các loại gel được nạp vào trong

cột dùng để tách enzyme Các loại gel được sử dụng rộng rãi trong phương pháp sắc kýcột là: polycryamide, ararose, vinyl polymer, dextran …Trong lọc gel, các phân tử đượctách ra dựa theo kích thước và hình dáng của chúng

* Sắc ký trao đổi ion : Phương pháp sắc ký trao đổi ion dựa trên sự tích điện của phân tử

protein Phương pháp trao đổi ion được sử dụng rộng rãi trong sản xuất enzyme theo quy

mô công nghiệp Tính chất tích điện của protein chịu ảnh hưởng rất nhiều bởi giá trị pH

Từ đó, người ta chọn chất trao đổi là anion hay cation

* Sắc ký kỵ nước : Phương pháp này dựa trên sự tương tác của vùng kỵ nước của phân tử

protein với nhóm kỵ nước trên chất nền, sự hấp thụ xảy ra ở nồng độ muối cao và quátrình phân đoạn với muối Phương pháp này đặc biệt thích hợp đối với những enzyme đãđược làm cô đặc trước đó bằng phương pháp kết tủa với muối ammonium sulfate

* Sắc ký đồng hóa trị : Liên kết đồng hóa trị được tạo thành giữa các protein ở trạng thái

tĩnh

* Sắc ký ái lực : Phương pháp này dựa trên khả năng giữ enzyme bằng những chất nền

không hòa tan, được nhồi vào trong các cột sắc ký

CHƯƠNG 3 : CÁC VẤN ĐỀ VỀ ENZYME CỐ ĐỊNH 3.1 Khái niệm

Enzyme cố định (immobilization enzyme) hay còn gọi là enzyme không tan là

những enzyme được gắn cố định vào 1 vùng, một khoảng nhất định, không bị hòa tantrong các điều kiện bình thường, vẫn giữ được hoạt động xúc tác Enzyme cố định cóđầy đủ tính chất của một enzyme và có ưu điểm là sử dụng được liên tục và lặp lạinhiều lần Các chất dùng để gắn hoặc giữ enzyme thường được gọi là chất mang haygiá thể Như vậy nếu gắn enzyme xúc tác theo một dãy phản ứng theo đúng trật tự (hệthống nhiều enzyme, multi enzyme) sẽ nhận được hệ thống enzyme không tan xúc táccho một dãy phản ứng chuyển hoá từ cơ chất đến sản phẩm cuối cùng Ngoài tạo racác enzyme cố định, người ta cũng tạo các tế bào, cơ quan tử của tế bào, tế bào vi sinhvật ở dạng không tan để sử dụng trong quá trình sinh học Trong tế bào sống, có nhiềuenzyme gắn với màng tế bào, hoặc cơ quan tử của nhiều tế bào (các enzyme gắn vớimàng hoặc các matrix của ty thể): một số enzyme xúc tác cho quá trình oxy hóa khử,ATPase , đó cũng là dạng enzyme cố định

Có ba phương pháp chính điều chế enzyme cố định :

- Phương pháp vật lý

- Phương pháp hóa học

- Phương pháp bao enzyme trong khuôn gel

3.2 Một số phương pháp chủ yếu chế tạo enzyme cố định

3.2.1 Phương pháp hấp phụ vật lý

Là phương pháp hấp phụ lên bề mặt chất mang Chất mang như cám, than hoạt tính,

bột thủy tinh Chất hấp phụ và enzyme được trộn lẫn với nhau trong một khoảng thờigian nhất định để sự hấp phụ xảy ra nhờ tương tác bề mặt như: liên kết ion, liên kết ưabéo (kị nước), liên kết hidro, lực Wandewalls

Phương pháp này được sử dụng rất sớm, từ năm 1916, người ta đã cho invertase(sacchrase, 3.1.2.26) của nấm men hấp phụ trên than mà vẫn giữ được hoạt tính thủyphân đường (sucrose)

Ưu điểm : Phương pháp này dễ thực hiện nhất và thường ít ảnh hưởng đến hoạt độ của

enzyme, phương pháp này tương đối đơn giản

Nhược điểm : Enzyme dễ hòa tan trở lại trong quá trình sử dụng lặp lại nhiều lần, độ liên

kết lỏng lẻo, mức độ giữ enzyme trên chất mang, phụ thuộc nhiều vào pH và lực ion nênkhi muốn tách enzyme khỏi chất mang có thể sử dụng dung dịch có lực ion lớn

 Các chất mang dùng để hấp phụ enzyme

 Các chất mang cố định enzyme rất đa dạng và phong phú chủng loại

 Yêu cầu của chất mang:

- Gắn kết mọi enym bền chắc, hiệu suất trên 50%, chất mang rẻ, dễ kiếm

- Trơ với mọi cơ chất của enzyme

- Tính chất đặc hiệu không đổi

 Chất mang hữu cơ: do phương pháp tổng hợp hóa học tạo ra và hầu hết cácpolymer hóa học, poly-styren, poly-acrylamid.

- Chất mang hữu cơ có nguồn gốc sinh học (dễ gắn cellulose và dẫn xuất)

- Những protid hình sợi: collagen, keratin

- Chitin và chitocan (vỏ tôm)

- Agar (thạch)

- Tinh bột

- Dextran (aligianat)

- BC (bacteria-cellulase)

 Chất mang vô cơ:

- Dẫn xuất silicat (sợi, sành, sứ, thủy tinh )

- Oxit kim loại: Mg Mn, Al

- C hoạt tính

- Kaolin

- Diatomic

- Chất mang vô cơ bền hơn các chất mang khác nhưng khó gắn hơn

Trong thực tế, để hạ giá thành, cũng có thể dùng các nguyên liệu thô hơn như đất sét,alumina, bentonite, than, mạt cưa, hoặc bột giấy Các nguyên liệu này đã xử lý đểloại các tạp chất có thể kìm hãm enzyme

3.2.2 Phương pháp đưa Enzyme vào khuôn gel

Enzyme dễ định vị trong gel, mạng lưới chất trùng hợp càng nhỏ enzyme sẽ được giữ

chặt hơn Đây là cách được dùng khá phổ biến

Từ năm 1963, Bernfeld và Wan đã mô tả phương pháp nhốt các enzyme (trypsin,papain, amylase và ribonuclease) trong gel polyacrylamide

Hình 3.1: Nhốt enzyme trong các lỗ gel

Ưu điểm: Không kết hợp trực tiếp enzyme vào giá thể hay chất mang, mà có thể hình

dung enzyme như là enzyme bị bẫy trong các mắt lưới của lưới, nên cấu trúc của enzymekhông bị biến đổi nhiều

Hạn chế:

- Các phân tử cơ chất lớn không thể đi qua màng được, đối với các enzyme khi sử

dụng cơ chất phân tử lớn không sử dụng phương pháp này

- Trong một số trường hợp, kích thước của các mắt lưới cũng khó điều chỉnh thậtđồng nhất, nên enzyme có thể thoát ra ngoài một phần

- Một số gốc tự do được tạo thành trong quá trình trùng hợp có thể kìm hãm enzyme

Vì vậy cần phải lựa chọn về điều kiện pH, nhiệt độ và các điều kiện khác của quá trìnhtrùng hợp sao cho ít ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme, kích thước của các mắt lưới

đủ bé để enzyme khó bị thoát ra ngoài khi sử dụng, nhưng cũng phải đủ lớn để để cơ chất

có thể khuếch tán vào đến enzyme và sản phẩm được tạo thành có thể khuếch tán ra khỏimắt lưới

Để chuẩn bị chế phẩm theo phương pháp này, có thể thực hiện các cách sau:

 Đưa enzyme vào gel bằng cách trùng hợp gel trong dung dịch có enzyme ở nồng

độ cao, việc trùng hợp nhờ tác dụng của các hóa chất (gel polyacrylamide,polymer tự nhiên), nhờ bức xạ (gel polyvinyl alcohol, pyrrolidone) hoặc nhờ ánhsáng (polyethylen glycol dimetacrylate)

 Đưa enzyme vào các sợi: cho hỗn hợp có chứa các thành phần để trùng hợp vàenzyme đi qua mắt lưới, sẽ tạo các sợi có gắn enzyme hoặc có thể cho dung dịchenzyme đi qua sợi rỗng, sợi có lỗ tạo điều kiện thuận lợi để gắn enzyme vào

Để thực hiện phương pháp này có hiệu quả, cần nắm vững các điều kiện trùng hợp để cóthể đạt được gel đúng như theo yêu cầu

Các chất dùng để tạo gel theo phương pháp này là các chất có cấu tạo mắt lưới nhưgelatin, alginate, agarose, polyacrylamide hoặc các prepolymer tổng hợp

Tùy mục đích sử dụng, có thể cắt gel (đã được trùng hợp có chứa enzyme) thành từng lớpmỏng, từng mẫu nhỏ hay từng hạt để làm tăng bề mặt tiếp xúc của enzyme trong gel với

cơ chất trong dung dịch

Ví dụ: một số chất sử dụng trong phương pháp này:

 Aginate để tạo chế phẩm calcium - algianate - Enzyme cố định

Alginate là acid polyuronic tách từ rong biển, bao gồm các đơn vị cấu tạo của cácacid D - mannuronic và L - guluronic kết hợp với nhau bằng liên kết α-1,4

Muối natri của alginate là chất hòa tan trong nước, do đó có thể trộn với enzyme trongdung dịch, sau đó thêm từng giọt trong dung dịch calcium chloride sẽ tạo thành gelcalcium alginat không tan có chứa enzyme Phương pháp này thường được dùng rộngrãi vì khá đơn giản và dễ tìm

 K-carrageenan, tạo gel K-carrageenan- Enzyme cố định

K-carrageenan là hỗn hợp polysaccharide tương tự agar-agar, tách từ tảo đỏ hòatan trong nước hoặc trong dung dịch muối, có khoảng 4-5% carragenin, làpolysaccharide có chứa galactose và galactose sulfate

Nguyên tắc: Thêm từ từ dung dịch chất tạo gel vào dung dịch muối k-carrageenan có

chứa enzyme sẽ nhẫn được chế phẩm enzyme kông tan, k- carrageenan là nguyên liệutốt để cố định tế bào vi sinh vật làm trong công việc sản xuất nhiều chất khác nhau

 Polyarylamide, tạo gel polyarylamide - Enzyme cố định

Tiến hành trùng hợp các monomer acrylamide và N, N’- methylenebisacrylamidetrong dung dịch có chứa enzyme, và một số yếu tố cần thiết cho quá trình trùng hợp(TEMED, potassium persulfate).

Trong một số trường hợp, các monomer cũng làm giảm hoạt độ enzyme

 Các tiền polymer tổng hợp để tạo các polymer tổng hợp – Enzyme cố định

Quá trình trùng hợp được thực hiện nhờ ánh sáng: chuẩn bị dung dịch cóprepolymer, enzyme và chất làm tăng độ nhạy thích hợp như benzoylethylether, chiếutia UV bước sóng dài trong vài phút, sẽ tạo thành liên kết chéo giữa các prepolymer,gel được hình thành nhốt enzyme trong các lỗ gel Phương pháp này đã được sử dụng

để cố định tế bào nấm men ethanol ở qui mô pilot

Các prepolyme được dùng có chứa các đoạn có tính chất ưa nước hay kị nước củachúng đơn giản hơn

3.2.3 Phương pháp liên kết ion giữa Enzyme và chất mang

Từ năm 1956, Mitz đã tiến hành gắn catalase vào DEAE cellulose qua liên kết ion

Do phương pháp khá đơn giản nên đã được sử dụng để tạo các chế phẩm không tan củanhiều E khác Các chất trao đổi ion khác như CM – cellulose và các dẫn xuất khác củacellulose

Độ bền liên kết của enzyme và chất mang phụ thuộc vào pH, loại dung dịch đệm vàlực ion Vì vậy nếu thay đổi các yếu tố này có thể thu lại enzyme, chất mang mà khônglàm thay đổi tính chất và cấu trúc của nó

3.2.4 Phương pháp gói Enzyme trong bao cực nhỏ

Phương pháp này lần đầu tiên đã được Chang công bố vào năm 1964, tác giả đã dùngcarbonic anhydrase vào trong các capsule Sau đó, năm 1971, Gregoriadis đã tạo đượccác liposome chứa amyloglucosidae Cả hai chế phẩm đã được sử dụng trong điều trị

Hình 3.2: Bọc enzyme trong các nang

Enzyme có thể được bọc bằng các loại màng khác nhau, tạo thành các dạng khácnhau Các chất thương dùng để bọc enzyme là polyamide hoặc nitrocellulose Có thểphân biệt các kiểu sau:

- Microcapsule : Màng dùng bọc enzyme là màng bán thấm (có các lỗ nhỏ để các

chất phân tử thấp đi qua nhưng E không đi qua được) tổng hợp

- Liposome : Màng lỏng, được tạo thành từ các phospholipid, các liposome được

dùng trong y tế hoặc mỹ phẩm

- Các sợi có các lỗ rỗng.

- Ngoài ra người ta cũng có thể điều chế các chế phẩm enzyme không tan ở dạngliposome Tiến hành như sau: hòa tan các amphipatidyl lipid, như phosphatidylcholine và cholesterol trong chloroform, tráng thành một bình quay, thêm dung dịchenzyme trong nước, làm sao có thể nhanh chóng phân tán đều enzyme, tạo thành cácliposome ở dạng màng lipid bọc các giọt nước Do đó trong một số enzyme được giữbên trong liposome, còn một số khác còn lại sẽ kết hợp vào màng liposome

Ưu điểm: Phương pháp này hầu như có thể xem như hầu như không làm ảnh hưởng đến

cấu trúc của phân tử enzyme, và có thể đồng thời bọc nhiều enzyme xúc tác như một dãyphản ứng trong cùng một túi (nhưng cần tránh các protease, vì chúng có thể phân giải cácenzyme) để thực hiện một quá trình trao đổi chất qua nhiều phản ứng liên tục như một hệthống sống

3.2.5 Phương pháp tạo các liên kết chéo giữa các phân tử Enzyme

Năm 1964, Quiocho và Richards đã mô tả phương pháp tạo liên kết chéo giữa các

carboxypeptidae A với glutaraldehyde

Phương pháp này hoàn toàn không dùng chất mang, mà thường dùng các chất cónhóm chức kép, có hai nhóm chức ở hai đầu hoàn toàn giống nhau, phản ứng với cácnhóm chức của phân tử enzyme khác nhau, tạo thành các liên kết chéo giữa chúng,

“khâu” các phân tử enzyme lại với nhau thành các phần tử có kích thước lớn hơn, khôngtan, có thể tách chúng khỏi dung dịch bằng cách li tâm hay lọc

Các chất thường dùng vào mục đích này là glutaraldehyde, và một số chất khác nhưdimethylsuberimidate … phản ứng với nhóm amine, hoặc một số chất phản ứng vớinhóm carboxyl (-COOH) nhóm thiol (-SH), trong đó glutaraldehyde được dùng phổ biếnnhất

Hình 3.3: Tạo liên kết chéo giữa các phân tử enzyme

Hạn chế của phương pháp này: trong quá trình tạo liên kết chéo giữa các phân tửenzyme, có thể phá hỏng cấu trúc của enzyme, làm giảm hoạt động của nó Vì vậy, cầnlựa chọn điều kiện phản ứng, chất tham gia tạo liên kết chéo sao cho hoạt độ của enzyme

bị giảm ít nhất Để tăng độ bền của chế phẩm, có thể sử dụng thêm protein không có xúctác như albumin huyết thanh bò Nói chung phương pháp tạo liên kết chéo ít được sửdụng vì không đáp ứng được yêu cầu của nhiều quá trình kỹ thuật trong sản xuất

3.2.6 Phương pháp gắn Enzyme vào chất mang rắn bằng liên kết cộng hóa trị

Vào những năm 1953, Grubhofer và Schleith đã tạo được các chế phẩm không tancủa một số enzyme như carboxypeptidase, diastase, pepsin, và ribonuclease bằng cách tạoliên kết cộng hóa trị giữa enzyme với polyaminostyrene đã được diazot hóa Có thể nói,thành công này đã mở đầu cho việc sử dụng enzyme trong thực tế.

Hình 3.4: Gắn enzyme vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị

Ưu điểm :

 Có thể tạo ra các chế phẩm có độ bền cao, có thể sử dụng trong nhiều quá trình sảnxuất quy mô lớn, trong hệ thống dòng chảy

Trong một số trường hợp, các monomer cũng làm giảm hoạt độ enzyme

 Do enzyme gắn trên bề mặt chất mang nên dễ tiếp xúc với cơ chất

- Bề mặt của chất mang phải tương thích với enzyme

- Phải có các nhóm có khả năng phản ứng với các nhóm chức của protein, nhưngkhông phản ứng với các nhóm chức của trung tâm hoạt động

- Có dung tích kết hợp cao.

- Chất mang phải có tính “trơ” đối với các thành phần phản ứng

- Chất mang phải bền chặt trong điều kiện quá trình phản ứng liên tục kéo dài

- Độ bền của chế phẩm còn tùy thuộc tính chất hóa lý của chất mang và phươngpháp gắn enzyme

 Các nguyên liệu thường dùng làm chất mang

- Chất mang vô cơ: thủy tinh, aluminum oxide, gồm (ceramic)

- Các polymer tổng hợp

- Các polymer của saccharide và dẫn xuất của chúng: agarose, dextran, chitin,cellulose; hay một số protein như collagen, gelatin, albumin Các chất này có bềmặt phân tử ưa nước, lại có nhiều nhóm hydroxyl, có thể tạo thành liên kết cộnghóa trị với enzyme

 Cầu nối giữa Enzyme và chất mang

- Do hạn chế của chất mang khi gắn trực tiếp với enzyme có thể làm ảnh hưởng xấuđến hoạt động của enzyme, một phần do chất mang có thể cản trở bề mặt khônggian tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất Vì vậy người ta thường dùng spacer có vaitrò như là cầu nối giữa enzyme và chất mang, làm cho enzyme có thể hoạt độngtrong phạm vi môi trường rộng hơn, dễ tiếp xúc với cơ chất hơn

- Khoảng cách giữa enzyme và chất mang cũng có vai trò quan trọng, khi có spacer,khoảng cách giữa v và chất mang là khoảng 1nm Phải chọn được spacer có chiềudài thích hợp, để vừa đảm bảo độ linh động của enzyme và cũng không quá dài

- Ngoài chiều dài, để thực hiện có kết quả phương pháp này còn cần lưu ý đến kiểuliên kết giữa enzyme và chất mang, trình tự kết hợp (spacer kết hợp với enzymetrước rồi mới kết hợp với chất mang hay ngược lại)

Phương pháp gắn enzyme vào chất mang bằng liên kết cộng hóa trị: trong nhiềutrường hợp thường tiến hành qua 2 giai đoạn chính:

- Xử lý, hoạt hóa chất mang trước khi gắn enzyme

- Gắn E vào chất mang đã được hoạt hóa

Một số phương pháp dùng để hoạt hóa chất mang như: dùng cyanogens bromide,diazot hóa, azide acid, các chất ngưng tụ…

3.2.6.1 Cyanogens bromide (BrCN) được sử dụng phổ biến để hoạt hóa các chất mang

Có nhiều nhóm hydroxyl như các polysaccharide, các hạt thủy tinh, gồm…sơ đồ phảnứng được trình bày trên hình

3.2.6.2 Phương pháp alkyl hóa các nhóm trên chất mang

Làm cho nó dễ dàng phản ứng với các nhóm amino, nhóm hydroxyl phenolic, nhómsulfhydryl của phân tử enzyme Các dẫn xuất halogen của acetyl cellulose, dẫn xuấttriazinyl của cellulose hay các chất trao đổi ion khác được dùng trong phương pháp này

3.2.6.3 Tạo cầu disulphide giữa Enzyme và chất mang

Đối với các enzyme có nhóm sulfydryl không có vai trò quan trọng đối với hoạt độngxúc tác của enzyme, có thể dùng chất mang có nhóm sulfydryl để tạo cầu disulphide vớienzyme Phản ứng này có tính thuận nghịch, có thể dễ dàng tách E khỏi chất mang (nếuhoạt động của nó bị giảm), để tái tạo chế phẩm, chỉ cần thêm chất khử vào

3.2.6.4 Dùng các hóa chất ngưng tụ

Ví dụ: Sử dụng carbodiimide làm yếu tố ngưng tụ để tạo thành liên kết peptid giữacác nhóm carboxyl hoặc nhóm amino của chất mang, với các nhóm amino và các nhómcarboxyl của enzyme Phương pháp này được sử dụng đối với chất mang cellulose

3.2.6.5 Tạo liên kết peptide bằng phương pháp azide acid

Phương pháp này dùng trong hóa tổng hợp peptid Ví dụ dùng chất mang là cellulose, phản ứng tiến hành như sau:

3.2.6.6 Phương pháp diazot hóa

Phương pháp này được sử dụng đối với các chất mang có các nhóm amino thơm,nhóm amin của nó được diazot hóa bằng acid nitrous, tạo thành dẫn xuất diazonium Dẫnxuất này phản ứng với enzyme tạo enzyme không tan Ví dụ dùng chất mang là 4-aminobenxyl cellulose, phản ứng tiến hành như hình.

3.2.6.7 Cố định Enzyme trên bột thủy tinh bằng liên kết cộng hóa trị

Chất mang bột thủy tinh có nhiều ưu điểm như chịu được các điều kiện khắc nghiệt,

có cấu trúc bền vững, vì vậy rất thuận tiện trong công nghiệp

Hạn chế chính của chất mang này là có tính “trơ” về hóa học Vì vậy để có thể sử dụngchúng một cách có hiệu quả, cần gắn thêm các nhóm phản ứng vào bề mặt của nó Có thểtrình bày tóm tắt quá trình gắn enzyme vào bề mặt bột thủy tinh không có lỗ

Chuẩn bị bột thủy tinh, hạt có đường kính khoảng 1mm, quá trình gắn E được thực hiệnqua 5 bước chính như sau :

- Hoạt hóa bề mặt thủy tinh bằng phản ứng với silane để đưa nhóm amin vào

- Phản ứng tiếp với p-nitrobenzoylchloride, nhóm nitro của vòng thơm sẽ đượcchuyển hóa bằng các phản ứng khác

- Khử nhóm nitro thành nhóm amino

- Cho tác dụng với acid nitrous, nhóm amino chuyển thành cation diazonium

- Nhóm diazonium sẽ kết hợp với gốc tyrosine trong phân tử enzyme

3.2.6.8 Cố định Enzyme vào polyamide bằng liên kết cộng hóa trị

Nylon là polyamide kỹ thuật quan trọng nhất, là polymer mạch dài được tạo thành dophản ứng ngưng tụ với lượng tương đương của acid adipic và hexanediamine.

n HOOC-(CH2)4-COOH + n H2N-(CH2)6-NH2

[-NH-CO-(CH2)4-CO-NH-(CH2)6-]n

Ưu điểm của nylon là bền dưới tác dụng của vi sinh vật, và cũng có tính ưa nước ởmức độ nhất định Vì vậy, có thể sử dụng nylon để bọc enzyme, nhưng khó tạo được liênkết cộng hóa trị giữa enzyme và nylon vì nó chỉ có hai nhóm ở hai đầu phân tử là có thểphản ứng với enzyme

Để tăng số nhóm có khả năng kết hợp với enzyme, cần thủy phân một số liên kết amidetrong polymer để tạo thành các nhóm amino và carboxyl tự do có thể kết hợp vớienzyme

3.2.6.9 Cố định Enzyme vào các nhóm amin sau khi thủy phân một phần

polyamide, quá trình này gồm có 4 bước:

- Xử lý polymer để làm tăng diện tích bề mặt và tăng khả năng tiếp xúc với nước

- Cắt đứt một số liên kết amide

- Hoạt hóa các nhóm amin hoặc nhóm caborxyl tự do

- Gắn enzyme vào polyamide đã được hoạt hóa

 Những điều cần lưu ý khi thực hiện việc cố định enzyme:

Khi lựa chọn phương pháp và thử nghiệm cố định enzyme cần lưu ý các điều sau đây:

E phải ổn đinh trong điều kiện xảy ra phản ứng: quan trọng nhất là hoạt lựcenzyme và độ bền của nó theo thời gian phản ứng, điều này quyết định hiệu suất phảnứng, hiệu suất tổng thu hồi và hiệu quả của toàn bộ quá trình (giá thành, giá trị khoa học

và thực tiễn, giá trị kinh tế - xã hội)

Nếu có thể được thì các hợp chất tham gia phản ứng tạo liên kết ngang (giữa chấtmang và enzyme) sẽ chủ yếu tương tác với những nhóm chức năng nằm ngoài trung tâmhoạt động của enzyme Nếu điều kiện này không thực hiện được hoàn toàn thì chất thamgia phản ứng tạo liên kết ngang phải có kích thước lớn không cho phép nó xâm nhập, ảnhhưởng đến trung tâm hoạt động của enzyme

Trung tâm hoạt động của enzyme phải luôn được bảo vệ bằng các phương phápkhác nhau Ví dụ như enzyme với trung tâm hoạt động có nhóm – SH thì cần xử lý sơ bộbằng glutation hay systein và chỉ tái hoạt hóa enzyme sau khi đã gắn nó vào chất mang.Hoặc có thể che chắn tâm hoạt động bằng cách bổ sung vào hỗn hợp phản ứng cơ chất đãđược bão hòa bởi enzyme (nồng độ cao nhất mà enzyme có thể thực hiện được phản ứngxúc tác)

Khi rửa thiết bị phản ứng để phụ hồi enzyme, không được làm ảnh hưởng xấu đếnhoạt tính của enzyme đã được gắn vào chất mang.

Khi lựa chọn chất mang cần phải để ý đến phản ứng enzyme sẽ diễn ra cụ thể, sao chokhông làm ảnh hưởng thậm chí hủy hoại chất mang và sản phẩm phản ứng không được

ức chế hoạt động của enzyme Ví dụ không thể gắn enzyme cellulose vào chính chấtmang là cellulose và các dẫn xuất của nó cũng không thể tiến hành phản ứng thủy phâncellulose trên chính chất mang này

Cần lưu ý đến độ bền của chất mang (bền cơ học, thủy lực học, bền nhiệt, bền gel)nhất là khi phản ứng trong các cột công suất lớn

3.3 Phân tích chế phẩm enzyme không tan

Khi cố định enzyme trên chất mang, cũng như trong quá trình bảo quản và sử dụng

chế phẩm, để biết có bao nhiêu, còn bao nhiêu enzyme trên chất mang, hoạt động của nóbiến đổi ra sao cần xác định:

Các ion Cu2+ bị protein khử đến Cu1+ trong môi trường kiềm, Cu1+ kết hợp với 2 phân

tử BCA tạo thành phức màu đỏ tía Phản ứng có độ nhạy cao hơn phản ứng biuret nhiềulần: độ nhạy của phản ứng biuret là 0.1- 0.8 mg trong phương pháp BCA có độ nhạy <10g, và cũng không quá nhạy đối với các detergent ở nồng độ cao

3.3.1.2 Cách thực hiện

Lấy một mẫu enzyme không tan có khối lượng xác định cho vào 1ml dung dịch thuốc

thử C và giữ ở 370C, lắc nhẹ, trước khi so màu cần loại bỏ phần không tan

3.3.2 Xác định hoạt độ của Enzyme không tan

Phương pháp quang học

Cách thực hiện:

Lấy một lượng xác định enzyme không tan, cho vào bình phản ứng cùng với dungdịch đệm, cơ chất, cofactor, giữ ở nhiệt độ xác định, hỗn hợp phải khuấy liên tục Để đovận tốc phản ứng, nếu chất mang enzyme đủ nặng, dễ lắng, có thể dừng ngay phản ứng,gạn lấy phần trong, đo độ hấp thụ quang học, sau khi đo phải cho dung dịch vào lại bìnhphản ứng để giữ cho thể tích hỗn hợp phản ứng không thay đổi Trường hợp chất mangkhông dễ lắng, có thể lọc hay ly tâm, nhưng phải làm thật nhanh, sau khi đo phải cho cảdịch trong và cặn trở lại bình phản ứng Như vậy sẽ nhận được giá trị ở các thời gian khácnhau Để tính toán tốt hơn cả là tính trên khối lượng khô, hoặc bề mặt tiếp xúc của chếphẩm

Để đo liên tục phản ứng enzyme có thể dùng thiết bị chuyên dụng: hỗn hợp phản ứngđược bơm liên tục vào bình phản ứng trong vòng tuần hoàn khép kín, dịch sau khi đi quacuvette để đo mật độ quang học

Hình 3.5: Bình phản ứng enzyme để đo vận tốc phản ứng enzyme không tan

3.4 Ưu và nhược điểm của Enzyme không tan

3.4.1 Ưu điểm

Enzyme không hoà tan có đầy đủ tính chất của một enzyme, tuy ở dạng không hoàtan mà vẫn giữ được hoạt động xúc tác, ưu điểm nổi bật của enzyme không hoà tan so vớikhi ở dạng hoà tan là:

- Có thể sử dụng lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định (60 – 70 lần), nênlàm giảm đáng kể giá thành chế phẩm enzyme, và có thể sử dụng liên tục trong các hệthống dòng chảy

- pH thích hợp của các enzyme này khác nhau, vẫn có thể tìm được điều kiện đểcác enzyme hoạt động tốt

- Không trộn lẫn với các phẩm vật khác của phản ứng và dễ dàng tách ra khỏi hỗnhợp phản ứng, do đó có thể ngừng phản ứng ở bất kì giai đoạn nào

- E không tan có độ bền đối với các yếu tố hóa lý (nhiệt độ, pH, áp suất…) caohơn khi ở dạng hoà tan Ví dụ: cố định protease làm tăng độ bền nhiệt gấp chục nghìnlần Sau khi được cố định không những độ bền với nhiệt của enzyme tăng lên màphạm vi nhiệt độ tối thích của enzyme cũng được mở rộng Nhiệt độ cao làm choenzyme bị biến tính, cấu trúc bậc ba của enzyme bị phá vỡ và enzyme bị mất hoạttính Khi enzyme được cố định nhờ nhiều liên kết gắn với chất mang quá trình biếntính sẽ bị ngăn cản, làm cho enzyme chịu được nhiệt độ cao

- Trong một số trường hợp đối với các enzyme thủy phân protein, ví dụ papain vàtrypsin, sự cố định làm ngăn cản một phần hoặc hoàn toàn hiện tượng tự phân Điềunày có ý nghĩa thực tế vì nó giúp làm tăng thời gian làm việc của enzyme

- Có thể thực hiện chuỗi phản ứng bằng cách gắn nhiều enzyme lên một chất mangnhằm giúp giảm chi phí, đẩy nhanh quá trình