Xác định hệ phân loại sinh thái học, các hoạt tính sinh học của bọ đậu đen và tổng hợp thuốc sinh học an toàn để tiêu diệt chúng

BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHCN TỈNH BÌNH DƯƠNG 2008-2009 “Xác định hệ phân loại sinh thái học, các hoạt tính sinh học của bọ đậu đen và tổng hợp thuốc sinh học an toàn để tiêu diệt chúng”

BÁO CÁO TỔNG KẾT

ĐỀ TÀI KHCN TỈNH BÌNH DƯƠNG 2008-2009

“Xác định hệ phân loại sinh thái học, các hoạt tính sinh học của bọ đậu đen và tổng hợp thuốc sinh học an toàn để tiêu diệt chúng”

Chủ nhiệm đề tài

PGS.TS.Hồ Sơn Lâm

Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng

Cán bộ tham gia nghiên cứu

Th.S.Nguyễn Thị Thu Thảo và Phòng Tổng hợp Hữu cơ

TSKH.Hoàng Ngọc Anh và Phòng các chất có HTSH

PGS.TS Trần Thị Thiên An và Nhóm nghiên cứu

PGS.TS Mai Phương Mai và bộ môn dược lý lâm sàng

Viện KHVLUD Viện KHVLUD Trường Đại học NL Khoa dược-ĐH Y Dược

II.TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

TRONG & NGOÀI NƯỚC III MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

V NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

VI KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI VII KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ

thực hiện các nội dung sau : Giao sở y tế nghiên cứu, khảo nghiệm thuốc, sử dụng và chủ trì phối hợp với sở nông nghiệp-Phát triển nông thôn, UBND các huyện Phú giáo, Bến cát, dầu tiếng Tân Uyên có kế hoạch hướng dẫn, phun thuốc diệt trừ bọ dậu đen…’’ Kể từ đó đến nay, chưa thấy có những đề án hoặc công trình nghiên cứu nhằm thực hiện chỉ thị của

II TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

TRONG & NGOÀI NƯỚC

Trong nước:

Cho đến nay, chưa có một công trình nào

nghiên cứu về mặt côn trùng học của loại bọ này cũng như chưa có một loại thuốc phun nào được sản xuất cho mục đích ngăn ngừa, hạn chế, xua đổi hay tiêu diệt chúng Các loại thuốc trừ sâu hiện có bán trên thị trường, một mặt có thể tiêu diệt bọ khi đã phát sinh, nhưng mặt

khác, gây độc hại cho người.

Bọ đậu đen của Việt nam: (Theo các thông tin ban đầu - chưa kiểm chứng) thuộc họ

Tenebrionidae, có tên khoa học là

Một số công trình nghiên cứu về loài

bọ tương tự như bọ đậu đen ở Bình dương cũng được nghiên cứu và cho rằng bọ đậu đen là một loại côn trùng có cánh, thuộc họ

Tenebrionidae, có tên khoa học là Mezomorphus villiger Tuy nhiên chưa thấy

có công trình nào nghiên cứu cụ thể về giống bọ này Các biểu hiện về đời sống và thời gian xuất hiện giống như ở Bình dương cũng chưa thấy đề cập đến.

-Chu kỳ sống:

+ Trứng nở sau 2-10 ngày.

+ Thời gian sống: 61-280 ngày.

White Grub (Holotrichia serata F.)

-Dòng: Coleoptera -Họ: Melonthidae

III MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU :

- Xác định nguồn gốc, đời sống, khả năng sinh

sản và các hoạt tính sinh học của bọ đậu đen, làm cơ sở dữ liệu cho các nghiên cứu tiếp

theo

- Nghiên cứu tạo ra những chủng loại thuốc có nguồn gốc sinh học, không độc với người, có thể tiêu diệt bọ đậu đen với giá thành thấp, sử dụng đơn giản và tiện lợi trên qui mô đại trà.

IV PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU:

1 Nghiên cứu về côn trùng học, trong đó nghiên cứu về giống, loài, thói quen sinh sống và sinh sản

+ Điều tra nơi cư trú và khảo sát phổ thức ăn của bọ đậu đen.

+ Nghiên cứu đặc điểm hình thái, tập tính sinh sống, thời gian phát triển các pha cơ thể và vòng đời của bọ đậu đen.

+ Nghiên cứu khả năng sinh sản và phát triển của bọ đậu đen trong điều kiện phòng thí nghiệm

2 Nghiên cứu những hoạt tính sinh học của bọ đậu đen :

+ Xác định mức độ nguy hiểm đối với người và tìm ra hoạt chất hạn chế, loại trừ sự nguy hiểm nói trên

+ Những đặc tính về feromon, từ đó tìm phương hướng cho việc tổng hợp những chất giúp cho xua đổi, hạn chế sinh sản hoặc tiêu diệt.

+ Các hợp chất này vừa phải đảm bảo chất lượng thuốc theo yêu cầu.

+ Qui trình công nghệ và nguyên liệu phù hợp, dễ sản xuất.

+ Giá thành thấp nhất để phổ biến rộng rãi cho người dân trong vùng có BỌ, có thể tự mình xử lý khi bọ xuất hiện.

V NỘI DUNG NGHIÊN CỨU :

1: Nghiên cứu về mặt côn trùng học của bọ đậu đen

a/Phân loại côn trùng:

b/Nghiên cứu sinh học, vòng đời

c/Khảo sát thực địa và Nghiên cứu môi trường

sống của bọ trên địa bàn Bình dương:

2: Nghiên cứu các hoạt tính sinh học có trong bọ đậu đen

a/ Khảo sát các chất hữu cơ trong bọ đậu đen b/ Khảo sát các chất dễ bay hơi trong bọ đậu đen c/Cô lập và xác định các hoạt chất, thử nghiệm

b/ Nghiên cứu các tác hại của thuốc với sức khoẻ:

c/ Thử nghiệm trên hiện trường.

VI KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI

Chuyên đề 2 / Phân loại côn trùng

1 Kết quả định danh bọ đậu đen theo chuyên gia nước ngòai:

* Địa chỉ định danh: Julio Ferrer, Emtomology, Naturhistorika Riksmuseet, Sweden

E-mail: "julio ferrer" julio_ferrer@hotmail.com.

* Kết quả: Có 4 lòai Bọ đậu đen thuộc họ Tenebrionidae bộ Coleoptera

1, Mesomorphus siamicus Kaszab, 1963

2, Mesomorphus vitalisi Chatanay, 1917

3, Gonocephalum ardoini Kaszab, 1962

4, Pseudoblaps javana Wiedemann,1819

Chuyên đề 2 / Phân loại côn trùng

2 Kết quả giám định bọ đậu đen tại Trường ĐH Nông lâm Tp HCM:

•Kết quả giám định Bọ đậu đen ở

huyện Dầu Tiếng (100 mẫu): ghi nhận có 3 lòai

1, Lòai Mesomorphus siamicus Kaszab, 1963 : 92 mẫu.

2, Lòai Gonocephalum ardoini Kaszab, 1962 : 5 mẫu

3, Lòai Pseudoblaps javana Wiedemann, 1819 : 3 mẫu

•Kết quả giám định Bọ đậu đen ở

huyện Phú giáo (100 mẫu): ghi nhận có 4 lòai

1, Lòai Mesomorphus siamicus Kaszab, 1963 : 91 mẫu.

2, Lòai Gonocephalum ardoini Kaszab, 1962 : 2 mẫu

3, Lòai Mesomorphus vitalisi Chatanay, 1917 : 6 mẫu

4, Lòai Pseudoblaps javana Wiedemann, 1819 : 1 mẫu

•Kết quả giám định Bọ đậu đen ở

huyện Bến Cát (100 mẫu): ghi nhận có 3 lòai

1, Lòai Mesomorphus siamicus Kaszab, 1963 : 90 mẫu.

2, Lòai Gonocephalum ardoini Kaszab, 1962 : 3 mẫu

3, Lòai Mesomorphus vitalisi Chatanay, 1917 : 7 mẫu

•Kết quả giám định Bọ đậu đen ở

huyện Tân Uyên (100 mẫu): ghi nhận có 4 lòai

1, Lòai Mesomorphus siamicus Kaszab, 1963 : 94 mẫu.

2, Lòai Gonocephalum ardoini Kaszab, 1962 : 1 mẫu

3, Lòai Mesomorphus vitalisi Chatanay, 1917 : 3 mẫu

4, Lòai Pseudoblaps javana Wiedemann, 1819 : 2 mẫu

Chuyên đề 2 / Phân loại côn trùng

Mesomorphus siamicus Kaszab là lòai có tỉ lệ

hiện diện của mẫu cao nhất 91,75% (367/400 mẫu) và chúng được ghi nhận là lòai Bọ đậu đen chính đang cư trú trong các hộ nhà dân hiện nay ở các địa phương điều tra Ba lòai Bọ đậu đen còn lại là Gonocephalum ardoini,

Mesomorphus vitalisi và Pseudoblaps javana

thì chỉ bắt gặp hiện diện rải rác trong số mẫu

đã giám định và là những lòai cùng hiện diện

với Mesomorphus siamicus trong các vườn

cao su đã thu mẫu.

Chuyên đề 2 / Phân loại côn trùng

Chuyên đề 3: Nghiên cứu sinh học, vòng đời: Đặc điểm

sinh học của bọ đậu đen Mesomorphus siamicus

(Tenebrionidae - Coleoptera) ở tỉnh Bình Dương

Các pha cơ thể Kích thước Hình dạng và màu

sắc cơ thể

-Trứng -Sâu non mới nở -Sâu non đẫy sức -Nhộng

-Trưởng thành

0,5-0,8 x 0,3-0,5mm 2-3 x 0,4- 0,5 mm 20-25 x 1-2 mm 7-9 mm x 3-5 mm 6-8 (♀), 5-7 mm (♂)

Hình bầu dục tròn, màu trắng-vàng nhạt

Hình sợi dây thép, màu trắng xám

Hình sợi dây thép, màu nâu vàng đỏ

Dạng nhộng trần, màu vàng nhạt

Hình bầu dục, màu nâu

đỏ lúc mới vũ hóa và màu xám đen lúc đẻ trứng.

Hình 8 Trứng Bọ đậu đen Hình 9 Sâu non Bọ đậu đen tuổi nhỏ

Hình 10 Sâu non bọ đậu đen tuổi lớn.

- Bọ đậu đen non và trưởng thành đều sợ ánh sáng trực xạ, thích sống trong điều kiện tối và ăn các lọai thức ăn khô có nguồn gốc hữu cơ Lá

cao su tươi vò nát và bánh mì khô được ghi nhận là thức ăn thích hợp cho bọ đậu đen trưởng thành ăn và đẻ trứng

- Trong điều kiện thí nghiệm thời gian phát triển vòng đời của bọ đậu đen thay đổi rất lớn từ 82 đến hơn 259 ngày Bọ đậu đen trưởng thành sau

NGHIÊN CỨU CÁC CHẤT DỄ BAY HƠI TRONG

BỌ ĐẬU ĐEN, CÔ LẬP VÀ XÁC ĐỊNH CHÚNG.

Tên gọi, công thức Phần trăm

(%) 6-Tridecene, (Z) C13H26

Limonene C10H16 1-undecene C11H22

0.395 1.591

98.15

Các chất dễ bay hơi:

7.3 5.4 7.1

36.9 27.3 35.8

Thành phần cao chiết:

Kích ứng da K=1,2

Kích ứng da K=3,33

Kích ứng da K=0

Kích ứng da nhẹ

Kích ứng da vừa phải

Không gây kích ứng da

Kết quả khảo sát tính kích ứng da của các cao

Kết quả xác định kích thước của giá thể:

Cấu trúc tinh thể trước khi

phản ứng

Cấu trúc tinh thể sau khi

phản ứng

xanh hoặc tím là có saponin.

2.Phản ứng Hirshsoln: Chất thử đun nóng với trichloaxetic, dung dịch có màu từ vàng chuyển sang đỏ là có Saponin.

3.Phản ứng Rosenthaler: Chất thử hoà trong dung dịch vanilin 1% trong Ethanol, thêm một giọt HCl đậm đặc, nếu màu chuyển từ lục đến tím

là có Saponin.

Để định tính ta phải chiết alcaloid và loại những chất kèm theo gây trở ngại cho các phản ứng Sau đó làm phản ứng tạo tủa để xác định xem

có alcaloid hay không Muốn xác định xem đó là alcaloid gì thì phải làm phản ứng tạo màu đặc hiệu, ngày nay thường kết hợp với phương pháp sắc ký, nhất là sắc ký lớp mỏng có

alcaloid tinh khiết làm chất chuẩn so sánh

CHIẾT TÁCH CÁC CHẤT CÓ HOẠT TINH SH

Một số alcaloid tiêu biểu dùng cho sản phẩm:

Những alcaloid là dẫn xuất của nhân purin ( = imidazol + pyrimidin)

Ví dụ:

Cafein [C5H2(CH3)3N4O2] trong Y, Z Theophylin [C5H2(CH3)2N4O2] trong Y, Z Theobromin [C5H2(CH3)2N4O2] trong Y, Z

Những alcaloid là dẫn xuất của nhân pyridin hoặc piperiđin.

Ví dụ.

Nicotin (C10H14N2) trong Z Arecolin (C8H13NO2) trong K

Arecaidin (C7H11NO2) trong K Những alcaloid là dẫn xuất của nhân isoquinolin Cấu trúc Jatrorrhizin trong hạt X

Nấm da: Trichophyton mentagrophytes,Mycrosporum gyseum.

Nấm men: Candida albicans ATCC10231

Vi khuẩn: Staphylococcus aureus ATCC 29212, MRSA(Methicilline resistant Staphylococcus Aureus)ATCC 44330, E.coli, Pseudomonas

STT Nhóm chất %

1 2 3 4

Các hợp chất tecpen:

Citronellal:

Các hợp chất có nhóm

OH khác:

Các thành phần không xác định được

15,97 0

75,37 8,66

Các nhóm chính trong sản phẩm

M-6 (Poly-6

DD Saponyl DDAlcaloid Polymer và nhũ tương Namo Hương dẫn

dụ Phụ gia tự nhiên

40 40 10

1000 ppm

1 9

40 40 10

1000 ppm

1 9

35 35 20

3000 ppm

1 9

60 phút; tỷ lệ chết ngay từ 30-70% (theo đánh giá của nhân dân), mất phương hướng, tê liệt và chết lâm sàng sau đó đạt 90-100%; có khả năng dẫn dụ bọ đến để diệt, không độc với người, có khả năng khử mùi bọ, làm cho mật độ bọ vào lại giảm đến 70% sau đợt diệt năm trước; giá thành thấp, dễ sử dụng.

cho chuột sử dụng với điều kiện thể tích x ml cho

10 gam chuột đối với đường uống hoặc phun ướt chuột đối với đường phun xịt.

Tiến hành: chuột sau khi được nuôi ổn định 2 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu, được cho

sử dụng thuốc thử nghiệm ở liều và phương pháp khảo sát, theo dõi tỉ lệ tử vong của chuột trong 72 giờ và theo dõi chuột trong vòng 14 ngày Giải phẫu đại thể được thực hiện ở các chuột chết, chuột hấp hối và chuột còn sống khi kết thúc thử nghiệm.

Đường phun xịt :1,5 ml/1 chuột không cạo lông và có cạo lông không gây tử vong

M5: (Japo-5) Đường cho uống: D100 là 22mg/ Kg và D0 là 8mg/Kg cho 10 chuột (1 chết sau 30 giờ và 1 chết sau 8 ngày)

Đường phun xịt: 1,5 ml/1 chuột không cạo lông và có cạo lông không gây tử vong cho chuột

M6: (Poly-6) Đường cho uống: D100 là 12,5 mg/ Kg và D0 là 7,8 mg/Kg cho 10 chuột

Đường phun xịt: 1,5 ml/1 chuột không cạo lông và có cạo

lô với khoảng liều giữa LD0 và LD100, cho chuột

sử dụng thuốc thử nghiệm với các liều nghiên cứu, theo dõi tỉ lệ tử vong của chuột trong 24 giờ Kết quả đạt được: tính liều LD50 của thuốc khảo sát trên chuột nhắt trắng bằng phương pháp

Karber – Behrens

n = 48/5 = 9.6 LD50=Df-Eab=0,19-(0,48/9,6)=0.14mg/

kg

n = 56/6 = 9.3

Kết quả đạt được: Kết quả độc tính bán trường diễn của thuốc diệt côn trùng ở liều khảo sát theo đường uống trên chuột nhắt trắng sau 60 ngày khảo sát

THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA THUỐC

KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

(BÁN MÃN TÍNH)

Biểu hiện trên chuột dùng uống M04:

Ở liều thấp, chuột uống M04 giảm hoạt động tự nhiên, thất điều nhanh, sau đó nằm im ngủ và hồi phục

Ở liều cao, chuột uống M04 giảm hoạt động tự nhiên, thở nhanh, thất điều, thở ngắt quãng, sau đó nằm im ngủ và tử vong với dấu hiệu toàn thân tím tái, đặc biệt ở đuôi Chuột xuất hiện tử vong sau khi uống khoảng 15 phút (liều cao 0,18 mg/kg và 0,2 mg/kg), trong khoảng 2 –> 4 giờ và trong vòng 6 giờ

Giải phẫu chuột tử vong quan sát đại thể: tất cả chuột có gan thận bình thường, dạ dày vẫn còn chất thử, tim có xuất hiện các điểm xung huyết nhỏ

Chuột không chết được theo dõi tiếp trong 14 ngày và giải phẫu quan sát đại thể không quan sát thấy các tổn thương ở gan, thận, tim, phổi, không phát hiện được các biểu hiện bất thường trên các

THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA THUỐC

KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

(BÁN MÃN TÍNH)

Biểu hiện trên chuột dùng uống M05:

Ở liều thấp, chuột uống M05 giảm hoạt động tự nhiên, thất điều nhanh, sau đó nằm im ngủ và hồi phục

Ở liều cao, chuột uống M05 giảm hoạt động tự nhiên, thở nhanh, thất điều, thở ngắt quãng, sau đó nằm im ngủ và tử vong với dấu hiệu toàn thân tím tái, đặc biệt ở đuôi Một vài chuột có biểu hiện bị co giật trước khi tử vong Chuột xuất hiện tử vong sau khi uống khoảng 15 phút (liều cao 0,19 mg/kg), trong khoảng 2 – >4 giờ và có chuột tử vong 18 giờ sau khi uống chất thử M05

Giải phẫu chuột tử vong quan sát đại thể: tất cả chuột có gan thận bình thường, dạ dày vẫn còn chất thử, tim có xuất hiện các điểm xung huyết nhỏ

Chuột không chết được theo dõi tiếp trong 14 ngày và giải phẫu quan sát đại thể không quan sát thấy các tổn thương ở gan, thận, tim, phổi, không phát hiện được các biểu hiện bất thường trên các

THỬ NGHIỆM ĐỘC TÍNH CỦA THUỐC

KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN

(BÁN MÃN TÍNH) Biểu hiện của chuột dùng đường uống M06:

Mô tả chuột tử vong: Ở liều thấp, chuột uống M06 giảm hoạt

động tự nhiên, thất điều nhanh, sau đó nằm im ngủ và hồi phục

Ở liều cao, chuột uống M06 giảm hoạt động tự nhiên, thở nhanh, thất điều, thở ngắt quãng, sau đó nằm im ngủ và tử vong với dấu hiệu đuôi tím tái trước khi tử vong Chuột xuất hiện tử vong sau khi uống khoảng 90 phút (liều cao 0,18 mg/kg và 0,2 mg/kg), trong khoảng 2 –> 4 giờ và trong vòng 8 giờ

Giải phẫu chuột tử vong quan sát đại thể: tất cả chuột có gan thận bình thường, dạ dày vẫn còn chất thử, tim có xuất hiện các điểm xung huyết nhỏ, miệng mũi có bọt chất thử, đôi khi đi phân có bọt chất thử

Chuột không chết được theo dõi tiếp trong 14 ngày và giải phẫu quan sát đại thể không quan sát thấy các tổn thương ở gan, thận,

VII KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ

- Đã hoàn thành đề tài theo hợp đồng.

- Đã vượt nhiều chỉ tiêu ban đầu và hoàn thành phụ lục hợp đồng là sản xuất thêm cho tỉnh 1500 lít thuốc với giá của đề tài 60.000

đồng /lít.

- Đã hoàn thành các thủ tục tài chính đúng qui định

- Đề nghị cho nghiệm thu và tiến hành thủ tục chuyển giao công nghệ cho Tỉnh hay doanh nghiệp do tỉnh chỉ định.