Với cao trích toàn phần này, người ta thường tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học để có kết quả định tính trước khi dùng các kỹ thuật sắc ký để cô lập những hợp chất tinh khiết..
Trang 1CHƯƠNG 2:
CÁC PHƯƠNG PHÁP SÀNG LỌC HÓA THỰC VẬT
Sau khi chiết xuất mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi bằng cô quay chân không ở nhiệt độ dưới 50oC sẽ thu được cao trích Với cao trích toàn phần này, người ta thường tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học để có kết quả định tính trước khi dùng các kỹ thuật sắc ký để cô lập những hợp chất tinh khiết
Trong cây thường chứa những hợp chất tự nhiên như: steroid, alcaloid, flavonoid,
saponin, tanin, glycoside…Phương pháp phân tích sàng lọc cổ điển là phương pháp
Stas-Otto Nguyên tắc của phương pháp này là phân chia các hợp chất dựa vào độ hòa tan của
chúng trong các dung môi có độ phân cực khác nhau: đối với các cây thuốc, nước ta thường sử dụng phương pháp phân tích của trường Đại học Dược khoa Rumani vì tính đơn giản, rẻ tiền và nhanh chóng Tuy nhiên từ các kết quả phân tích sơ bộ này, người ta phải phối kiểm lại bằng các phương pháp phân tích khác để có kết luận chính xác hơn Đôi khi người ta cũng tìm hiểu một số đặc điểm cao trích trước cũng như độ hòa tan trong dung môi, sự phân chia trong hai hệ dung môi không hòa tan vào nhau, đặc tính acid-baz, điện tích…
Tiến trình phân tích sơ bộ hoá thực vật được trình bày tổng quát ở sơ đồ dưới đây
Trang 2FLAVONOID ACID BÉO ANTHRAGLYCOSID TINH DẦU
PHYTOSTEROL CAROTENOID ALCALOID SAPONIN ANTHOCYANIN ĐƯỜNG
ALCALOID ACID HỮU CƠ TANIN
FLAVONOID ANTHRAGLYCOSID STEROID
H/C URONIC TANIN ĐƯỜNG ALCALOID SAPONIN
NGUYÊN
LI ỆU
Bã nguyên liệu
Lớp kiềm
Chiết bằng
ether
Chiết bằng cồn
Bã nguyên liệu
Dịch chiết cồn
Bã nguyên liệu
Dịch acid
Mg/HCl đđ Vết trên giấy lọc +KOH 10%
Cặn có mùi thơm Liebermann + H2SO4 đđ
TT Mayer, Bouchardat
Dragendorff , Liebermann
KOH, HCl
TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
Na2CO3
Na Acetat + FeCl3 3%Mg/HCl đđ KOH 10%
Liebermann Cồn cao độ FeCl3
TT Fehling A, B
TT Mayer, Bouchardat
Tạo bọt
Dịch cồn
Lớp ether
Dịch ether
Dịch acid
KOH 10%
H2SO4 10%
H2SO4 10%
Dịch ether
Trang 3I.1 Xác định các chất tan trong dịch ether ethylic
Cân 5g bột nguyên liệu cho vào bình nón nút mài 250ml, lắc với 30 ml ether ethylic trong 5 phút Làm như vậy 3 lần cho tới khi dịch ether không còn màu Tập trung dịch lọc trong một bình lắng gạn, lắc với 60ml KOH (20ml x 3 lần) sẽ tách ra 2 lớp: lớp kiềm và lớp ether
a Phân tích dung dịch kiềm
Dung dịch kiềm được cho vào becher và được trung hòa bằng HCl 25% để trung tính, lọc Tủa trên phểu lọc hòa với 5ml cồn 90o, chia làm 3 ống nghiệm
- Ống 1: nhỏ vài giọt KOH 10% nếu có màu đỏ, sơ bộ nhận định có hợp chất ANTHRAGLYCOSID
- Ống 2: acid hóa với HCl đậm đặc, sau đó cho một ít bột Mg kim loại, nếu có màu
đỏ, sơ bộ nhận định có FLAVONOID
- Ống 3: nhỏ một giọt lên giấy lọc khô, hơ khô, nếu trên giấy lọc có vết mờ thì sơ bộ nhận định có ACID BÉO
b Phân tích dung dịch ether
Lớp dung dịch ether được rửa 3 lần với nước cất (20ml x 3 lần), sau đó lắc 3 lần với dung dịch H2SO4 2% (5ml x 3 lần)
Các dịch acid được góp lại để làm phản ứng định tính alcaloid với:
- Thuốc thử Mayer: Tủa vàng nhạt
- Thuốc thử Dragendorff: Tủa Cam
- Thuốc thử Bouchardat: Tủa nâu
Dịch ether chia làm 3 phần cho vào 3 chén sứ, bốc hơi đến cạn
- Chén 1: nếu có mùi thơm thì có TINH DẦU
- Chén 2: nhỏ vài giọt H2SO4 đđ, nếu có màu xanh thì có CAROTENOID
- Chén 3: Hóa cắn với 10 giọt anhydrid acetic cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ theo thành ống nghiệm Nếu chổ giáp giới có màu vàng lục hay lục
đỏ thì sơ bộ nhận định có hợp chất PHYTOSTEROL
I.2 Xác định các chất tan trong dịch cồn
Bã nguyên liệu sau khi chiết bằng ether đem chiết nóng với cồn 90o (30ml x 3 lần) trên bếp cách thủy, lọc Tập trung dịch lọc vào bình nón, chia làm 6 phần
Phần 1: Pha loãng dung dịch cồn với 4 thể tích nước cất, kiềm hóa bằng dung dịch
NH4OH đđ, lọc:
Trang 4a Tủa trên phểu hòa với 1 ml CHCl3, hứng vào ống nghiệm Sau đó cho vào 1ml anhydrid acetic và nhỏ từ từ vài giọt H2SO4 đđ Nếu dung dịch có màu xanh thì có nhân STEROID
b Dịch lọc được acid hóa bằng HCl, lọc Tủa trên phểu hòa với 3-4 ml cồn 90o chia làm 2 ống nghiệm
- Ống 1: Cho vài giọt KOH, nếu có màu đỏ thì có hợp chất ANTHRAGLYCODID
- Ống 2: cho vào ít bột Mg kim loại và vài giọt HCL nếu có màu đỏ thì có hợp chất FLAVONOID
Phần thứ 2: Pha loãng dịch cồn với một thể tích nước cất rồi chia làm 2 phần:
- Ống 1: Trung hòa với natri acetat, thêm vài giọt FeCl3 2%, nếu có màu xanh đen thì có TANIN
- Ống 2: cho vào vài tinh thể Na2CO3, nếu có sủi bọt thì có acid hữu cơ
Phần thứ 3: Dịch cồn được bóc hơi cách thủy trong chen sứ đến cạn, hòa cắn với
4-5 ml H2SO4 2%, lọc Chia dịch lọc ra làm 3 phần để làm phản ứng định tính alcaloid
- Ống 1: + thuốc thử Mayer
- Ống 2: + thuốc thử Dragendorff
- Ống 3: + thuốc thử Bouchardat
Phần thứ 4: Bốc hơi dịch cồn trong chén sứ cho đến cạn, hòa cắn với 3ml nước cất
đun nóng Lọc, cho thêm vào nước lọc 4-5 giọt thuốc thử Fehling A và 4-5 giọt thuốc thử Fehling B, đun cách thủy, nếu có tủa gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ
Phần thứ 5: Dịch cồn được pha loãng với một thể tích nước cất, chia làm 2 ống
nghiệm:
- Ống 1: acid hóa (màu đỏ)
- Ống 2: Kiềm hóa (màu lục)
Thì có ANTHOCYNANOSID
Phần thứ 6: Chia dịch cồn làm 2 phần, bóc hơi cách thủy trong chén sứ
- Chén 1: hòa với 5 ml nước cất, lắc mạnh nếu có bọt thì có SAPONIN
- Chén 2: hòa vào chén 0,5 ml CHCl3và 0,5 ml anhydric acetic, cho vào ống nghiệm, nhỏ từ từ H2SO4 đđ
+ Có vòng tím thì có SAPONIN TRITERPEN
+ Có vòng xanh lục thì có SAPONIN STEROID
Trang 5I.3 Xác dịnh các chất tan trong dịch acid
Bã nguyên liệu sau khi chiết với cồn 90o được chiết với H2SO4 2% (20ml x 3 lần) Lọc, chia nước lọc ra làm 5 phần:
- Phần 1: Lắc trong ống nghiệm, nếu có bọt bền thì có SAPONIN
- Phần 2: Kiềm hóa với NH4OH 10% , lắc với ether (5ml x 3 lần) Loại bỏ lớp nước, lớp ether lắc với H2SO4 2% Dịch acid được chia làm 3 phần để làm phản ứng tìm alcaloid (thuốc thử Mayer, Bouchardat, Dragendorff)
- Phần thứ 3: Cho tác dụng với thuốc thử Fehling, nếu có tủa đỏ gạch thì có ĐƯỜNG KHỬ
- Phần 4: trung tính hóa với natri acetat, sau đó thêm vài giọt FeCl3 10% , nếu có tủa xanh nâu thì có TANIN
- Phần 5: Pha dịch với 2 thể tích cồn 90o, nếu có tủa nhiều thì có hợp chất URONIC
Bảng 2: Tóm tắt sự hiện diện của các hợp chất tự nhiên có trong cao trích (trường
hợp thí dụ)
Cao trích bởi các dung môi Thuốc thử Phản ứng màu Hợp chất
thiên nhiên Ether
ethyl
Ethanol
90%
Acid 1%
+ - - Nhỏ lên giấy lọc Có vết ố màu Acid béo
- + - Mg/HCl dung dịch Có vòng màu đỏ Flavonoid
Hager, Dragendorff Có tủa màu Alcaloid
dịch
Không có bọt Saponin
Trang 6II TINH CHẾ BẰNG PHƯƠNG PHÁP VẬT LÝ VÀ HÓA HỌC
KỸ THUẬT KẾT TINH
Kết quả cuối cùng của quá trình chiết tách, phân lập và tinh chế là phải thu được hợp chất sạch, thông thường dưới dạng tinh thể ngoài trừ những chất lỏng và chất vô định hình không thể kết tinh được
Quá trình kết tinh bao gồm việc chọn dung môi, hoà tan nóng và lọc, gạn tinh thể ra khỏi dung dịch mẹ và làm khô tinh thể Trong các bước trên việc chọn dung môi thích hợp có tầm quan trọng quyết định kết quả của sự kết tinh
I.1 Chọn dung môi
Đối với các hợp chất đã biết, thường trong các tài liệu tham khảo đều có cho biết dung môi kết tinh và điểm chảy của nó
Đối với các chất chưa biết, phải chọn dung môi để kết tinh theo các qui tắc sau:
- Một dung môi tốt để kết tinh một hợp chất khi nó hòa tan được nhiều hợp chất đó
ở nhiệt độ sôi, và rất ít tan ở nhiệt độ thường Một dung môi để kết tinh tốt thì độ hòa tan ở nhiệt độ sôi thường phải cao gấp 5 lần ở nhiệt độ thường
Trang 7- Nếu không tìm được dung môi thích hợp thì phải phối hợp 2 dung môi Trong 2 dung môi đó, phải có một dung môi có khả năng hòa tan nhiều hợp chất kết tinh ở nhiệt độ sôi và dung môi kia thì không hoặc ít hòa tan Hai dung môi này phải hỗn hợp với nhau thành một dung dịch trong suốt và đồng nhất
- Thông thường một chất rắn dễ hòa tan trong dung môi có cấu trúc hình học tương
tự nó Thí dụ ester dể hòa tan trong cồn hoặc ethyl acetat Các hydrocarbon dễ hòa tan trong eter dầu hỏa, benzen, hexan
- Các chất có nhiều nhóm OH, các glycoside dễ tan trong các dung môi ưa nước như MeOH, EtOH và các hỗn hợp dung môi có nước
- Thường các hợp chất dễ tan trong nước sẽ khó tan trong các dung môi hữu cơ và ngược lại
- Dung môi dùng kết tinh không được tạo thành hợp chất mới với chất kết tinh
- Dung môi kết tinh tốt phải có nhiệt độ sôi tương đối cao Nhiệt độ sôi của nó càng cao thì sẽ có nhiều thời gian để hình thành tinh thể, tuy nhiên cũng không nên quá cao vì sẽ khó bay hơi trong khi kết tinh, đồng thời nhiệt độ cao có thể làm phân hủy chất kết tinh
- Trên thực tế để kết tinh các hợp chất tự nhiên, ta hay dùng MeOH hoặc hỗn hợp của MeOH với một dung môi khác Việc chọn dung môi kết hợp với MeOH tùy thuộc vào tính hoà tan của chất cần kết tinh
I.2 Cách xác định độ hoà tan của một chất đối với dung môi
Cân một lượng chính xác chất tan trong ống nghiệm, dùng ống hút có chia vạch 0,1 ml nhỏ dung môi muốn hòa tan chất kết tinh, nhỏ từ từ vào cho đến khi hợp chất tan hoàn toàn Sau mỗi lần cho dung môi vào, cần lắc mạnh ống nghiệm để hoà tan chất
Tỷ lệ giữa lượng chất rắn với thể tích dung môi đủ để hòa tan hoàn toàn là độ hòa tan của dung môi ấy với chất rắn ở nhiệt độ thường
Cách xác định độ hòa tan ở nhiệt độ sôi cũng tiến hành tương tự, và được thực hiện trong nồi đun cách thủy
Căn cứ vào độ hòa tan đã được xác định để tính lượng dung môi cần thiết cho
sự kết tinh
Thí dụ: hợp chất có độ hoà tan:
5mg trong 1ml dung môi B ở nhiệt độ thường
45 mg trong 1 ml ở nhiệt độ sôi
Dung môi này hoà tan chất ở nhiệt độ sôi gấp 9 lần ở nhiệt độ thường nên có thể dùng làm dung môi kết tinh
Trang 8Nếu có 500 mg chất thì lượng dung môi cần dùng là :
1mlx 500/45 ≈ 11 ml
Như vậy có thể dùng khoảng 12 ml dung môi để kết tinh 500 mg hợp chất trên Căn cứ vào độ tan ở nhiệt độ thường (5mg/ml), người ta có thể ước tính lượng hợp chất còn lại trong dung dịch sau khi kết tinh
I.3 Cách hòa tan nóng
Để kết tinh một lượng nhỏ chất rắn (10-20mg), nên sử dụng bình cầu nhỏ hoặc ống nghiệm nhỏ
- Trường hợp dùng một dung môi: Cho chất rắn vào bình, đổ một lượng dung
môi đã tính trước vào bình, đun cách thủy đến sôi đồng thời lắc đều Khi dung dịch trở nên trong suốt, lấy bình ra để nguội và cho vào tủ lạnh để yên kết tinh
- Trường hợp dùng hỗn hợp 2 dung môi : thí dụ A là dung môi tan, B là dung môi
không tan hoặc ít tan Trong bình cầu có chứa bột chất kết tinh, cho một lượng nhỏ dung môi A đun sôi các thủy Tiếp tục cho từng ít dung môi A cho đến khi chất rắn vừa tan hết sau đó dùng ống hút lấy dung môi B cho từng ít một vào bình cho đến khi dung dịch bắt đầu đục Bình vẫn đun sôi, lấy dung môi A cho vào bình cho đến khi dung dịch bắt đầu trong suốt trở lại Lấy bình ra, để nguội ở nhiệt độ thường,
sau đó cho vào tủ lạnh để yên kết tinh
I.4 Gạn lấy tinh thể và làm khô
Nếu lượng tinh thể ít thì không nên lọc vì sẽ hao hụt nhiều Nghiêng bình hút dung dịch mẹ ra một bình khác, dùng ống hút lấy dung môi rữa nhẹ nhàng tinh thể Sau
đó để khô tự nhiên 1-2 giờ, cho vào bình hút ẩm vài ngày trước khi đo điểm nóng chảy hoặc phân tích quang phổ
Bảng 25:Một số dung môi kết tinh thường dùng
MeOH-EtOAc Ethet-Aceton
Trang 9
Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng nhiều từ lâu Phương pháp được phát triển nhanh chóng từ những năm 1930-1940
Sắc ký là quá trình tách liên tục từng vi phân hỗn hợp các chất do sự phân bố không đồng đều của chúng giữa những pha tĩnh và pha động khi cho pha động đi xuyên qua pha tĩnh
Trong những năm 1930, một loạt các nhà hóa học được nhận giải thưởng Nobel về Hóa học các hợp chất thiên nhiên nhờ ứng dụng thành công phương pháp cô lập bằng sắc ký cột hấp phụ
- 1937, P KARRER (Thụy sĩ) về hóa học Carotenoid, đặc biệt là vitamin A và vitamin B
- 1938, R KURN (Đức) hóa học Carotenoid và Vitamin
- 1939, L.RIZICKA (Thụy sĩ) hóa học Polymetylen và Terpenoid
Trang 10- 1940, MARTIN và SYNGE (Anh) bắt đầu nghiên cứu về sắc ký phân bố trên lớp silicagel và về sau phát triển sang sắc ký giấy Hai ông được giải thưởng Nobel năm 1952 về sắc ký phân bố
- 1948, TISLIUS (Thụy điển) được giải thưởng Nobel về kỹ thuật điện di và sắc ký hấp phụ
Phương pháp sắc ký ra đời đã cung cấp cho hóa học một công cụ tách chiết hiệu quả
và nhanh chóng, mở ra một giai đoạn phát triển rực rỡ của ngành hóa học, đặc biệt là hóa học các hợp chất thiên nhiên
Một đặc điểm của phương pháp sắc ký là tính đa dạng, cho phép ta ứng dụng nó ở bất
cứ mọi hoàn cảnh, mọi điều kiện… Trong hoàn cảnh chưa được trang bị những máy chuyên dùng hiện đại như máy sắc ký khí, máy sắc ký lỏng cao áp… chúng ta vẫn có thể thực hiện việc phân tích sắc ký bằng áp dụng kỹ thuật sắc ký lớp mỏng, sắc ký giấy hay sắc ký cột hấp phụ cổ điển với những dụng cụ phương tiện đơn giản mà bất
cứ ở một cơ sở nghiên cứu nào cũng có thể sắm được
Ngay cả ở những nước tiên tiến, bên cạnh những máy hiện đại, sắc ký lớp mỏng, sắc
ký cột vẫn là công cụ đắc lực trong công tác nghiên cứu hằng ngày
Có nhiều phương pháp để phân loại sắc ký:
- Nếu dựa theo trạng thái liên hợp của pha động thì có sắc ký lỏng và sắc ký khí
- Nếu dựa theo cơ chế của quá trình tách:
+ Sắc ký hấp phụ
+ Sắc ký phân bố
+ Sắc ký gel
+ Sắc ký trao đổi ion
III.1 Sắc ký hấp phụ
Hấp phụ là sự tích tụ một hợp chất ở trạng thái khí hoặc lỏng lên bề mặt một chất rắn Hay nói cách khác là sự tích tụ ở ranh giới giữa 2 pha: khí-rắn, lỏng-rắn
Trong sắc ký hấp phụ lỏng, pha tĩnh là chất rắn mịn và xốp, pha động là chất lỏng Dựa trên tính hấp phụ khác nhau của các cấu tử trong hỗn hợp cần tách đối với chất hấp phụ (pha tĩnh), người ta dùng dung môi thích hợp (pha động) qua pha tĩnh để giải hấp, ta sẽ tách riêng được từng phần các cấu tử trong hỗn hợp
Các yếu tố quan trọng trong sắc ký hấp phụ là lựa chọn chất hấp phụ và dung môi
Chất hấp phụ cần phải thỏa mãn các tính chất sau:
Trang 11- Không tương tác với cấu tử cần phân tách: không tạo phản ứng phụ như oxyd hóa, polymer hóa…
- Phải có tính chọn lọc, tức là ái lực hấp phụ đối với các cấu tử cần tách trong hỗn hợp phải khác nhau
- Độ mịn của hạt phải thích hợp: hạt càng bé, cân bằng hấp phụ được thiết lập càng nhanh, nhưng nếu quá nhỏ quá sẽ ảnh hưởng đến tốc độ dòng chảy của pha động
- Chất hấp phụ phải ổn định và được tiêu chuẩn hóa để kết quả trùng lập
Dựa trên kinh nghiệm, chất hấp phụ hay dùng được sắp xếp theo thứ tự hoạt tính giảm dần như sau:
Than hoạt tính Silicagel Đất tẩy trắng Magie silicat Nhôm oxyd (axit) Nhôm oxyd (baz) Crom (III) oxyd Kẽm sulfur Nhôm oxyd (trung tính) Nhôm hydroxyd
Calci hydroxyd Calci carbonat Calci sulfat Tal C Đường, tinh bột Inulin
Bột Celluloz Trong thực tế, người ta hay dùng rộng rãi oxyd nhôm và silicagel để tách hỗn hợp phân cực hoặc không phân cực
Đối với dung môi phải thỏa mãn các điều kiện sau:
- Hòa tan tương đối tốt tất cả các cấu tử trong hỗn hợp cần phân tích
Trang 12- Bị hấp phụ ít nhất đối với pha tĩnh
- Không phản ứng hóa học đối với các chất cần phân tích cũng như chất hấp phụ
- Phải tinh khiết
Đối với chất phân tích (chất bị hấp phụ), cấu trúc hóa học có ảnh hưởng trực tiếp lên
độ hấp phụ của chúng
Các hợp chất hydrocarbon bão hòa có độ hấp phụ rất kém, nếu thêm một nối đôi hay một nhóm chức thì ái lực hấp phụ của chúng sẽ tăng lên
Trong thực nghiệm, người ta đã xây dựng được một dãy các nhóm chức có độ hấp phụ giảm dần như sau:
- Đối với hydrocarbon nhân thơm:
-COOH > -CONH2 > -OH > -NHCOCH3 > -NH3 > -OCOCH3 > -(CH3)2 > -OCH3 > -H > -Cl
- Đối với hydrocarbon mạch thẳng:
-COOH > -OH > -NH2 > C=O > -OR > -CH3
III.2 Sắc ký phân bố
Sắc ký phân bố dựa trên sự phân chia một chất giữa 2 chất lỏng không trộn lẫn vào nhau (hoặc giữa chất lỏng và chất khí) khi cho chất lỏng thứ 2 (pha động) di chuyển qua chất lỏng thứ nhất (pha tĩnh)
Thông thường pha tĩnh được hấp thụ trên bề mặt của một chất rắn gọi là chất mang hoặc liên kết hóa học với chất mang
Các phương pháp sắc ký dựa trên nguyên tắc phân bố:
- Sắc ký cột
- Sắc ký giấy
- Sắc ký khí
Bảng 3: Phân loại các kỹ thuật sắc ký
Loại pha tĩnh Loại pha
động Dụng cụ pha tĩnh Loại sắc ký
Sắc ký hấp phụ (sự cạnh tranh giữa
chất hấp phụ rắn và pha động ) LỏngKhí CộtCột
Lớp phẳng
Sắc ký khí Sắc ký cột Sắc ký lớp mỏng
