luận án đã sửa báo cáo tốt nghiệp đại học, chuyên nhành công nghệ sinh học

Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây bệnh ở hầu hết gia cầm như gà, vịt, chim… đặc biệt là ở người với tốc độ lây lan nhanh chóng. Nguyên nhân gây bệnh là do virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, virut này tồn tại dưới dạng phân type dựa trên quan hệ kháng nguyên H (Hemagglutinin) và N (Neuraminidae).Virus A thích nghi hầu như với mọi loại vật chủ và hệ gen của chúng luôn biến đổi, định kỳ do vậy rất dễ lây nhiễm và trở thành đại dịch. Trong số những chủng virus cúm A thì virus cúm AH5N1 có độc lực rất mạnh chúng gây nguy hiểm cho cả người và động vật. Dịch cúm bùng phát nhanh, chúng gây ra hậu quả rất nghiêm trọng làm ảnh hưởng tới tính mạng con người cũng như gây thiệt hại cho người chăn nuôi và xa hơn là gây thiệt hại tới nền kinh tế quốc dân. Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao HPAI (High Pathogenic Avian Influenza) được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A các bệnh truyền nhiễm cấp tính và cực kỳ nguy hiểm. Cúm AH5N1 được phát hiện ở nước ta vào khoảng tháng 122003. Từ cuối năm 2003 trở lại đây bệnh cúm gia cầm đã, đang và dự đoán trong nhiều năm nữa sẽ là mối nguy hiểm cho sự phát triển của nền chăn nuôi nước ta và đặc biệt hơn là cho cả cộng đồng. Đã có hàng triệu gia cầm bị tiêu hủy và hàng chục người tử vong cho dịch cúm. Do đó việc phòng chống dịch cúm gia cầm là một trong những chương trình phòng chống dịch bệnh cấp quốc gia. Các biện pháp phòng chống dịch bệnh được áp dụng ngay từ đầu như tiêu hủy đàn gia cầm, cấm lưu thông, tiêu thụ sản phẩm, kiểm soát giết mổ đã phần nào hạn chế được dịch bệnh. Tuy nhiên rất tốn kếm và hiệu quả thì chưa được như mong muốn khi mà điều kiện nước ta còn rất nhiều hộ gia đình chăn nuôi nhỏ lẻ, điều kiện vệ sinh, chăm sóc và phòng bệnh chưa tốt. Ngoài các biện pháp về an toàn sinh học trong chăn nuôi đã kể trên thì việc sử dụng vacxin tiêm phòng để tạo đáp ứng miễn dịch chủ động chống lại bệnh cúm là một biện pháp tích cực trong việc phòng và chống bệnh. Mặc dù vậy do đặc tính của dịch cúm AH5N1 là lây lan rất nhanh và gây chết cho động vật trong thời gian ngắn nên việc đưa vacxin kháng virus cúm vào cơ thể động vật cần phải có thời gian để vacxin kết hợp với kháng nguyên của cơ thể tạo nên kháng thể mới có tác dụng do vậy vẫn có thể gây thiệt hại cho người chăn nuôi.Việc nghiên cứu và sản xuất ra kháng thể để khi đưa vào cơ thể động vật có tác dụng nhanh kháng virus cúm AH5N1 là đề tài cần nghiên cứu

ĐẶT VẤN ĐỀ

Chăn nuôi gia cầm là nghề truyền thống của nước ta và là nguồn thu nhập chínhđối với phần lớn các hộ gia đình ở nông thôn cũng như các trang trại chăn nuôilớn Phát triển ngành chăn nuôi nói chung và chăn nuôi gia cầm nói riêng trởthành ngành sản xuất hàng hóa, từng bước đáp ứng nhu cầu thực phẩm cho tiêudùng trong nước và xuất khẩu là một quan điểm phát triển ngành chăn nuôi đếnnăm 2020 đã được Chính Phủ phê duyệt Chăn nuôi gia cầm trở thành một nghềkhông thể thiếu trong cơ cấu sản xuất nông nghiệp Quốc gia

Theo số liệu thống kê tại thời điểm 1/10/2009 của tổng cục thống kê thì tổng

số đàn gia cầm của Việt Nam có khoảng 280,18 triệu con Cùng với sự phát triểncủa các ngành nghề khác thì chăn nuôi cũng đang phát triển nhanh cả về sốlượng cũng như chất lượng Bên cạnh đó thì chăn nuôi cũng phải đối mặt vớinhiều rủi ro như lãi suất thấp, giá cả bấp bênh, tổng chi phí đầu vào và chi phíđầu ra có biên độ hẹp…, cùng với đó là dịch bệnh và nguy cơ xảy ra đại dịch làrất cao trong đó có nguy cơ xảy ra dịch cúm A/H5N1 do người chăn nuôi khôngtuân thủ chặt chẽ điều kiện chăn nuôi cũng như quy trình kiểm dịch

Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính gây bệnh ở hầu hết gia cầmnhư gà, vịt, chim… đặc biệt là ở người với tốc độ lây lan nhanh chóng Nguyên

nhân gây bệnh là do virus cúm type A thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra, virut

này tồn tại dưới dạng phân type dựa trên quan hệ kháng nguyên H

(Hemagglutinin) và N (Neuraminidae).Virus A thích nghi hầu như với mọi loại

vật chủ và hệ gen của chúng luôn biến đổi, định kỳ do vậy rất dễ lây nhiễm vàtrở thành đại dịch Trong số những chủng virus cúm A thì virus cúm A/H5N1 có

độc lực rất mạnh chúng gây nguy hiểm cho cả người và động vật Dịch cúmbùng phát nhanh, chúng gây ra hậu quả rất nghiêm trọng làm ảnh hưởng tới tínhmạng con người cũng như gây thiệt hại cho người chăn nuôi và xa hơn là gâythiệt hại tới nền kinh tế quốc dân.

Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao HPAI (High Pathogenic Avian Influenza)

được tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A các bệnh truyền nhiễm cấptính và cực kỳ nguy hiểm Cúm A/H5N1 được phát hiện ở nước ta vào khoảngtháng 12/2003 Từ cuối năm 2003 trở lại đây bệnh cúm gia cầm đã, đang và dựđoán trong nhiều năm nữa sẽ là mối nguy hiểm cho sự phát triển của nền chănnuôi nước ta và đặc biệt hơn là cho cả cộng đồng Đã có hàng triệu gia cầm bịtiêu hủy và hàng chục người tử vong cho dịch cúm Do đó việc phòng chốngdịch cúm gia cầm là một trong những chương trình phòng chống dịch bệnh cấpquốc gia Các biện pháp phòng chống dịch bệnh được áp dụng ngay từ đầu nhưtiêu hủy đàn gia cầm, cấm lưu thông, tiêu thụ sản phẩm, kiểm soát giết mổ đãphần nào hạn chế được dịch bệnh Tuy nhiên rất tốn kếm và hiệu quả thì chưađược như mong muốn khi mà điều kiện nước ta còn rất nhiều hộ gia đình chănnuôi nhỏ lẻ, điều kiện vệ sinh, chăm sóc và phòng bệnh chưa tốt Ngoài các biệnpháp về an toàn sinh học trong chăn nuôi đã kể trên thì việc sử dụng vacxin tiêmphòng để tạo đáp ứng miễn dịch chủ động chống lại bệnh cúm là một biện pháptích cực trong việc phòng và chống bệnh

Mặc dù vậy do đặc tính của dịch cúm A/H5N1 là lây lan rất nhanh và gâychết cho động vật trong thời gian ngắn nên việc đưa vacxin kháng virus cúm vào

cơ thể động vật cần phải có thời gian để vacxin kết hợp với kháng nguyên của cơthể tạo nên kháng thể mới có tác dụng do vậy vẫn có thể gây thiệt hại cho người

chăn nuôi.Việc nghiên cứu và sản xuất ra kháng thể để khi đưa vào cơ thể độngvật có tác dụng nhanh kháng virus cúm A/H5N1 là đề tài cần nghiên cứu.

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu, sản xuất kháng thể

kháng virus cúm A/H5N1chủng NIBGR – 14 phục vụ trong phòng trị bệnh “.

Với mong muốn góp phần làm giảm thiệt hại cho người chăn nuôi và đặc biệthơn là sản xuất được kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 phục vụ trong phòng

và trị bệnh

Đề tài có những mục tiêu cụ thể sau:

- Nghiên cứu quy trình sản xuất kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 qua

- Sản xuất được kháng thể phục vụ trong phòng trị bệnh

Đề tài được nghiên cứu tại Cơ sở Hóa sinh Dược Thú y, Trường đại học NôngNghiệp Hà Nội

PHẦN I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm.

1.1.1 Khái niệm về bệnh cúm gia cầm:

Bệnh cúm ở gia cầm (Avian Influenza) còn gọi là bệnh cúm gà hay cúm loài

chim Là một bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm type A thuộc họ

Orthomyxoviridae.

Virus cúm gia cầm gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, gà tây, chim cút, đàđiểu, các loài chim cảnh và chim hoang dã Và nguy hiểm hơn bệnh có thể lâysang người và một số loài thú khác

Trước đây bệnh này còn được gọi là bệnh dịch tả gà (fowl plague) nhưng từhội nghị quốc tế lần thứ nhất về bệnh cúm gia cầm tại Beltsville - Mỹ năm 1981

đã thay thế tên này bằng tên bệnh cúm gia cầm độc lực cao (HPAI - Highty

Pathogenic Avian Inluenza) để chỉ các virus cúm type A có độc lực mạnh, gây

lây lan nhanh, tỷ lệ tử vong cao [2]

1.1.2 Lịch sử bệnh cúm gia cầm:

Năm 412 trước công nguyên, Hippocrates đã mô tả về bệnh cúm Năm 1680một vụ đại dịch cúm đã được mô tả kỹ và từ đó đến nay đã xảy ra 31 vụ đại dịch.Trong hơn 100 năm qua đã xảy ra 4 vụ đại dịch cúm vào các năm 1889, 1918,

1957, 1968

Bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao (HPAI) được phát hiện lần đầu tiên ởItalia vào năm 1878 và được đặt tên là bệnh dịch hạch gà, bệnh gây tỷ lệ tử vongrất cao ở đàn gia cầm.

Đến năm 1901, virus bệnh nguyên được Centanny Samnozzi xác định làmột tác nhân virus qua lọc Nhưng phải đến năm 1955 mới xác định đượcvirus đó chính là virus cúm type A (H7N1 và H7N7) gây chết nhiều gà, gàtây và các loài khác

Qua nhiều năm nghiên cứu các nhà khoa học đã phát hiện ra rằng bệnh dịchnghiêm trọng nhất xảy ra với gà là những chủng gây bệnh cao thuộc phân typeH5 và H7 như ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983 - 1984 là H5N2.Cuối thập kỷ 60, phân type H1N1 đã phát hiện ở lợn và có liên quan đếnnhững ổ dịch ở gà tây với biểu hiện đặc trưng là những triệu chứng ở đường hôhấp và giảm năng suất [2]

Vào giữa thế kỷ 20, bệnh đã xuất hiện ở hầu hết các nước Châu Âu, Nga,Bắc Phi, Trung Đông Châu Á, Nam và Bắc Mỹ Virus cúm gia cầm subtype H5

đã được tìm thấy ở Canada vào năm 1966 và vùng Wisconsin thuộc nước Mỹnăm 1968 Từ năm 1977, nhiều subtype thuộc virus cúm A như H5 và H7 đãđược phân lập và mô tả Trong năm 1972, virus cúm gia cầm đã được phát hiện

từ vịt chạy đồng qua chương trình giám sát virus bệnh Newcastle và theo dõichim hải âu ở Australia Đầu năm 1996, bệnh cúm gia cầm được thông báo ởtrên ngỗng Năm 1997, dịch xảy ra ở Hồng Kông, được xác định là do virusH5N1 gây ra và đã phải tiêu huỷ khoảng 1,5 triệu con gà [26]

1.2 Tình hình dịch cúm A/H5N1.

1.2.1 Tình hình dịch cúm gia cầm A/H5N1 trên thế giới:

Cúm A/H5N1 là một virus có độc lực cao, và gây bệnh trên người trong các

vụ dịch cúm gà những năm 1996 - 2008, đặc biệt ác liệt là do virus cúm A/H5N1thể độc lực cao (HPAI, highly pathogenic avian influenza) gây ra kể từ năm

2003 cho đến nay và phát sinh nhiều nhóm, phân nhóm (clade) có độc lực rấtcao Chủng virus cúm A/H5N1 được phát hiện lần đầu tiên gây bệnh dịch trên gàtại Scotland vào năm 1959 Từ đó cho đến nay, H5 và N1 đã có thay đổi lớn xét

về cấu trúc thành phần gen và kháng nguyên miễn dịch Sau gần 40 năm khôngphát hiện, cúm A/H5N1 xuất hiện tại Quảng Đông (1996), và Hồng Kông (1997)với biến đổi sâu sắc, không những gây chết gia cầm mà còn thích ứng và gâychết người bệnh Có thể coi dòng virus cúm A/H5N1 từ 1996 đến nay là cúm A/H5N1 hiện đại mới xuất hiện Đặc biệt, từ 2003 đến nay, virus H5N1 gây ra dịchcúm trên gia cầm tại Hồng Kông, Trung Quốc và lây lan sang hàng chục quốcgia trên thế giới ở châu Á, châu Âu và châu Phi Cúm A/H5N1 giai đoạn 2003đến nay, cơ bản về cấu trúc vẫn như trước đó, nhưng xét về độc lực (tính gâybệnh), loài vật chủ nhiễm bệnh, tính kháng nguyên - miễn dịch và mức độ truyềnlây có nhiều nét đặc trưng hơn và khác với nhiều biến chủng H5N1 trước đây

Từ cuối 2005, cúm A/H5N1, chủ yếu là các chủng virus thuộc phân dòngThanh Hải (nguồn gốc vùng Bắc Trung Quốc) bắt đầu lan sang một số nướcvùng Trung Á, trong đó có Nga, rồi tràn ngập Đông Âu và xâm nhập vào cácnước vùng Tiểu Á, bao gồm Thổ Nhĩ Kỳ, các nước Bắc- Trung Phi, đặc biệt AiCập và Nigeria là các nước chịu thiệt hại nhiều nhất Nhằm ngăn chặn dịch bệnhlây lan, trong hơn mười năm qua, trên thế giới đã có hàng trăm triệu gia cầm đã

bị tiêu hủy, gây thiệt hại nặng nề cho ngành chăn nuôi và kinh tế Đặc biệt, số

người nhiễm và tử vong do virus cúm A/H5N1 mỗi năm một cao hơn, theo thống

kê số người bị nhiễm cúm gia cầm H5N1 báo cáo với Tổ chức Y tế thế giới(WHO), từ năm 2003 đến tháng 6/2008, đã có tới 385 trường hợp mắc cúmA/H5N1, trong đó, 243 trường hợp đã tử vong chiếm tới 63,11% Việt Nam vàIndonesia là các 2 quốc gia có số người nhiễm và tử vong cao nhất do virus cúmA/H5N1 trên thế giới Trong số 16 nước có người chết do cúm gia cầm,Indonesia và Việt Nam được WHO xác định là quốc gia “điểm nóng” có thể cúmA/H5N1 có được các điều kiện thuận lợi để tiến hóa thích nghi lây nhiễm và trởthành virus của người [24]

1.2.2 Tình hình dịch cúm A/H5N1 tại Việt Nam:

Dịch cúm gia cầm A/H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng

12/2003 ở các tỉnh phía Bắc, sau đó đã nhanh chóng lan tới hầu hết các tỉnh,thành trong cả nước chỉ trong một thời gian ngắn Đây là lần đầu tiên dịch cúmgia cầm A/H5N1 xảy ra tại Việt Nam, có tới hàng chục triệu gia cầm bị tiêu hủy,gây thiệt hại nặng nền tới nền kinh tế quốc dân Tính đến nay (tháng 10/2008),dịch cúm gia cầm liên tục tái bùng phát hàng năm tại nhiều địa phương trong cảnước, có thể phân chia thành các đợt dịch lớn như sau:

- Đợt dịch thứ nhất từ tháng 12/2003 và 30/3/2004: dịch cúm xảy ra ở các

tỉnh Hà Tây, Long An và Tiền Giang Dịch bệnh lây lan rất nhanh, chỉ trongvòng hai tháng đã xuất hiện ở 57/64 tỉnh thành trong cả nước Tổng số gà vàthủy cầm mắc bệnh, chết và tiêu hủy hơn 43,9 triệu con, chiếm 17% tổng đàn giacầm Trong đó, gà chiếm 30,4 triệu con, thủy cầm 13,5 triệu con Ngoài ra, có ítnhất 14,8 triệu chim cút và các loài khác bị chết hoặc tiêu hủy Đặc biệt, có 3người được xác định nhiễm virus cúm A/H5N1 và cả 3 đã tử vong trong đợt dịchnày [11]

- Đợt dịch thứ 2 từ tháng 4 đến tháng 11/2004: dịch bệnh tái phát tại 17

tỉnh, thời gian cao điểm nhất là trong tháng 7, sau đó giảm dần đến tháng11/2004 chỉ còn một điểm phát dịch Tổng số gia cầm tiêu hủy được thống kêtrong vụ dịch này là 84.078 con Trong đó, có gần 56.000 gà; 8.132 vịt; và19.950 con chim cút Và đã có tới 27 người mắc bệnh virus cúm A/H5N1, trong

đó có 9 ca tử vong [11]

- Đợt 3 từ tháng 12/2004 cho đến tháng 12/2005: dịch cúm gà xảy ra trên

36 tỉnh/thành trong cả nước Số gia cầm bị tiêu hủy được Cục Thú y thống kê là1,846 triệu con (gồm 470.000 gà, 825.000 thủy cầm và 551.000 chim cút) Vàonhững tháng cuối năm 2005, dịch cúm gà xảy ra trong tháng 10/2005 lan nhanhtrong gần 40 tỉnh/thành và giảm dần trong tháng 12/2005 [21]

- Năm 2006, do áp dụng chương trình tiêm chủng rộng rãi cho đàn giacầm trong cả nước, cùng với các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, dịchcúm A/H5N1 không xảy ra ở Việt Nam Mặc dù vậy, đến 06/12/2006 dịch cúmgia cầm A/H5N1 đã tái bùng phát ở Cà Mau, sau đó lan sang các tỉnh Bạc Liêu,Hậu Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ [11]

- Năm 2007, dịch bệnh tái phát tại Hải Dương vào ngày 17/2/2007 vàđược khống chế sau một tháng Tuy nhiên, đến ngày 01/5/2007 dịch bệnh tiếptục tái phát tại Nghệ An, sau đó lan sang nhiều tỉnh/thành trong cả nước Theobáo cáo của Cục Thú y (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn) đến ngày10/6/2007 dịch đã xảy ra trên 16 tỉnh/thành và chỉ được khống chế hoàn toàn vàotháng 8/2007

- Những tháng đầu năm 2012, theo báo cáo của Cục Thú y dịch cúm giacầm đã xuất hiện ở một số tỉnh/thành như: Kom Tum, Thanh Hóa, Hà Tĩnh, HàNội, Quảng Nam và đến nay cơ bản đã khống chế được dịch [11].

- Theo thống kê của Cục Thú y, từ ngày 26/12/2003 đến ngày 31/3/2010nước ta đã có 59 người chết/117 trường hợp nhiễm bệnh

1.2.3 Những kết quả nghiên cứu đã đạt được về bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 1.2.3.1 Sự lưu hành virus cúm gia cầm ở Việt Nam[5].

Virus cúm gia cầm H5N1 gây bệnh cho gia cầm ở Việt Nam có nguồn gốc

từ Trung Quốc thuộc gennotyp Z

Virus cúm H5N1 có tính kháng nguyên rất đa dạng từ khi xuất hiện tại ViệtNam và đã xuất hiện một số chủng có tính kháng nguyên hoàn toàn khác và đượcphân vào nhóm kháng nguyên HA Clade 2 hoặc Genotyp G

Virus H5N1 có thể tồn tại lâu hơn trong môi trường so với các loại viruscúm khác Điều quan trọng là trong điều kiện môi trường bình thường (nước

trường có chất hữu cơ virus có thể tồn tại lâu hơn Đối với virus trong cơ thể giacầm bệnh được chôn dưới đất chúng chỉ giữ được tính gây nhiễm không quá 5ngày

Để làm nâng cao tính nhạy cảm của phương pháp chẩn đoán nên chẩn đoánvirus cúm bằng phương pháp RT-PCR, trong đó xác định virus type A trước(thông qua xác định gen M) sau đó mới xét nghiệm các đặc tính subtype khác

Đã phát hiện cầy hương tại rừng Cúc Phương bị chết do virus H5N1 Điềunày cho thấy cần phải có các biện pháp an toàn sinh học cho các vườn quốc gia

và nhất là các sở thú

Đã chế tạo thành công kháng nguyên HA H5N1 dùng trong giám sát huyếtthanh cúm gia cầm Mặt khác cũng đã chế tạo thành công kháng huyết thanhkháng H5N1 dùng trong nghiên cứu và chẩn đoán bệnh

Đã khảo sát chất sát trùng Alpha Terpineol từ tinh dầu tràm có khả năng sátkhuẩn và làm giảm sự nhân lên của virus H5N1 trên môi trường tế bào

1.2.3.2 Kết quả nghiên cứu phát triển vacxin phòng bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam:

Đã nghiên cứu thành công:

- Quy trình sản xuất vacxin cúm A/H5N1

- Quy trình bảo quản và sử dụng vacxin cúm A/H5N1

- Quy trình tiếp truyền giống gốc và sản xuất giống cấp một

1.3 Dịch tễ học cúm gia cầm.

1.3.1 Phân loại:

Virus nói riêng cũng như virus cúm nói chung thường được phân loại chủyếu theo tính kháng nguyên Khi dùng phản ứng kết tủa trên thạch hoặc kết hợp

bổ thể người ta thấy có 3 nhóm virus khác nhau và đặt tên cho 3 nhóm là virus

A, B, và C Dùng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu người ta thấy virus type

A lại có nhiều loại khác nhau Trên cơ sở kết quả của phản ứng ức chế ngưng kếthồng cầu, khi phát hiện ra rằng kháng thể kháng ngưng kết hồng cầu là kháng thể

được tạo ra để chống lại protein HA nhưng không ức chế toàn bộ các virus type

A Từ đó virus type A được chia ra các type phụ (subtype) trên cơ sở có phảnứng HI đặc hiệu Cho đến năm 2004 tổng số subtype chia theo khả năng ngưngkết hồng cầu là 16 Cũng như vậy với protein NA, người ta phát hiện ra 9 loại

NA có tính kháng nguyên khác nhau và được đặt tên là từ N1 cho đến N9 Viruscúm type A là kết quả sự tổ hợp giữa 2 loại protein này Chính vì vậy chúng ta

có virus cúm đặt tên là HxNy Việc phân loại virus như trên do ủy ban định danhquốc tế tiến hành [6]

Có 2 kiểu phân loại virus cúm dòng Châu Á (theo quy định của WHO) đólà:

Phân loại theo kiểu gen: Virus cúm dòng Châu Á phải có 2 đoạn RNA chịutrách nhiệm tổng hợp protein HA và NA có nguồn gốc từ virus cúm H5N1 phânlập từ ngỗng ở Quảng Đông (Trung Quốc) vào năm 1996 Tùy theo nguồn gốccủa 6 đoạn gen còn lại mà người ta đặt tên cho kiểu gen của virus đó Tại ViệtNam cho đến nay chúng ta đã phát hiện có 3 kiểu gen, đó là Z, G, và V

Phân loại theo nhóm kháng nguyên: Do sự biến đổi di truyền liên tục nênprotein HA của virus cúm H5N1 dòng Châu Á có tính kháng nguyên thay đổi.Bằng phản ứng HI xác định hiệu giá kháng thể của các loại virus cúm H5N1dòng Châu Á thì các virus cúm có hiệu giá kháng thể chênh lệch nhau không quá1log được phân vào cùng một nhóm kháng nguyên Khi hiệu giá HI lệch 2log trởlên thì virus sẽ thuộc nhóm kháng nguyên khác Hiện nay đã có đến 9 nhómkháng nguyên khác nhau [6]

1.3.2 Tên gọi của virus cúm A/H5N1.

Tên của virus cúm được đặt theo quy ước quốc tế bắt đầu bằng type virus,

và subtype (nghĩa là theo tên gọi của protein HA và NA) Như vậy chúng ta viết:virus type A H5N1 Tên của từng chủng virus được viết bắt đầu từ tên type, tênloài động vật mà từ đó virus được phân lập, tên địa phương nơi phân lập được(tên nước, tên tỉnh, hoặc tên bang), sau đó ký hiệu riêng của phòng thí nghiệmnơi phân lập được, năm phân lập và để trong ngoặc tên chung của virus Ví dụ:A/DK/VNM/450/06[H5N1] Riêng với virus cúm phân lập từ người thì khôngcần để tên động vật nữa, ví dụ A/Việt Nam/1303/03[H5N1] [6]

1.3.3 Cấu trúc của virus cúm A/H5N1.

1.3.3.1 Cấu trúc chung [6]:

Vius cúm gà có tên khoa học là Avian Influenza virus, thuộc họ

Orthomyxoviridae, là họ virus đa hình thái, có vỏ ngoài, genome là RNA đơn

Hạt virus có dạng hình khối tròn hình trứng hoặc dạng khối kéo dài, đườngkính khoảng 80 - 120nm, nhiều khi virus có dạng hình sợi dài đến vài µm Phân

tử lượng của hạt virus khoảng 4,6 - 6,4 Dalton

Vỏ ngoài của virus là một màng lipid Trên màng này có hai loại protein làHemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA) Bên trong virus có hai thành phầngồm axit nhân loại RNA và protein RNA của virus cúm là sợi đơn gồm 7 hoặc 8đoạn riêng biệt, các sợi RNA này được bao bọc bởi các protein chủ yếu là NP(Nucleoprotein) và protein M (Mactrix) tạo ra Nucleocapsid

một sợi RNA hoàn chỉnh mà phân chia thành 7 - 8 phân đoạn có cấu trúc riêngbiệt, mà mỗi một phân đoạn là một gen chịu trách nhiệm cho mỗi một loạiprotein của virus

Hình 1 Các dạng hình thái khác nhau dưới kính hiển vi điện tử (A), mô

hình cấu tạo hạt virus (B), cấu trúc của phức hợp ribonucleoprotein RNP (C)

của virus cúm A.

1.3.4 Sự biến đổi gen di truyền của virus cúm A/H5N1

Virus cúm liên tục biến đổi về gen di truyền tạo ra virus mới Cơ chế của sự biếnđổi đó là:

Thay đổi do đột biến điểm: Việc phân chia virus H5N1 dòng Châu Á theonhóm kháng nguyên như nói ở trên chính là kết quả của đột biến điểm của đoạngen HA Khi virus nhân lên trong tế bào ký chủ sẽ có sự sai lệch trong sao chépdẫn đến thay đổi một hoặc nhiều nucleotid, dẫn đến thay đổi cấu trúc của mã ditruyền và protein HA Sự thay đổi này làm tính kháng nguyên thay đổi theo.Việc thay đổi không chỉ xảy ra ở gen HA mà còn ở các gen khác Do vậy hàngnăm nhóm chuyên gia về cúm của WHO thường phải xem xét và chọn ra loạivirus mới để sản xuất vaccine thay thế cho chủng virus năm trước [6]

Thay đổi do tổ hợp: Khi 2 virus cúm type A cùng nhiễm vào trong một tếbào, chúng đều tổng hợp ra hàng ngàn phân tử protein và đoạn RNA của chínhmình Để hình thành một hạt virus cần tổ hợp 8 đoạn RNA và các loại protein.Lúc này không phải đoạn RNA của virus nào thì theo nhau làm thành một hạtvirus giống với virus thế hệ trước, mà chúng tự sắp xếp miễn sao có đủ 8 đoạnRNA bất kể của virus nào Kết quả là virus khi hình thành có thể có tất cả 8 đoạnRNA đều là của một trong hai loại virus bố mẹ hoặc có một số đoạn RNA củavirus này và số còn lại của virus kia Do sự biến đổi liên tục nên virus cúm luônluôn được coi là mới

1.3.5 Sự nhân lên của virus cúm A/H5N1 trong tế bào vật chủ.

Quá trình nhân lên của virus cúm chia ra nhiều giai đoạn, gồm có giai đoạnbám dính, xâm nhập, tổng hợp protein và RNA (pha sớm và pha muộn), lắp ráp

và giải phóng virus (hình 2) Sự bám dính của virus cúm vào tế bào ký chủ bắtđầu bằng sự bám dính không đặc hiệu do các loại đường có trên protein HAquyết định Tại đây vai trò của mối liên kết α 2 - 3 hay α 2 - 6 quyết định mức độbám dính Sau đó các men proteaza có trong ký chủ sẽ cắt đôi protein HA tạiđiểm cắt và giúp cho protein này bám vào thụ thể của tế bào ký chủ Sau khi cómối liên kết HA - thụ thể thì men neuraminidase (NA) của virus sẽ cắt các axitsialic của tế bào (taminflu có tác dụng ức chế NA tức là ức chế quá trình này).Khi virus bám vào thụ thể, tạo ra thông tin cho quá trình ẩm bào bắt đầu Mảng

tế bào tại nơi có virus bám vào sẽ lõm vào trong tạo thành một túi nhỏ, miệng túikhép lại và virus được nằm trong một quả cầu nhỏ gọi là endosome Màng củaendosome như vậy chính là màng tế bào được lộn ngược vào trong Người ta gọiquá trình này là quá trình ẩm bào Trong nguyên sinh chất màng endosome này

sẽ sát nhập với màng của lysosome Môi trường bên trong lysosome sẽ toan hóa

giúp cho màng lipid của virus sát nhập với màng của lysosome Mặt khác,

của virus sẽ toan hóa Nếu ta coi virus như một cái túi thì miệng túi sẽ gắnvới màng lysosome, sau đó chiếc túi này được mở ra và lộn ngược ra giảiphóng nucleocapsid của virus vào trong nguyên sinh chất

Hình 2: Cơ chế xâm nhiễm và nhân lên của virus cúm A trong tế bào chủ 1.3.6 Đặc tính nuôi cấy virus cúm A/H5N1.

Phần lớn các chủng virus có thể phát triển ổn định ở trứng gà có phôi hoặc

ở các loại tế bào mầm Đây chính là đặc điểm quan trọng để nhân giống virus trongphòng thí nghiệm để nghiên cứu, bảo tồn cũng như để sản xuất vacxin Đối với cácchủng virus cúm cũng có những đặc tính như vậy Tuy nhiên, virus cúm type A chỉphát triển ở trong môi trường tế bào không có huyết thanh chứa trypsin Một số hệthống tế bào kể cả dòng tế bào MDCK cần được nuôi cấy ở trong môi trường không

có huyết thanh có chứa trypsin để tách các protein HA của virus giúp cho việc hìnhthành các khuẩn lạc Một số loại môi trường tế bào như tế bào gan HepG2 củangười, tế bào thận phôi lợn (ESK) và tế bào thận gà (CK) cũng đã được chứng minh

là có nhiều hứa hẹn và nhạy cảm hơn đối với virus cúm gia cầm [19]

1.3.7 Độc lực và sức kháng của virus.

1.3.7.1 Độc lực của virus:

Để đánh giá độc lực của virus cúm người ta sử dụng phương pháp gây bệnhcho gà 3 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2ml nước trứng đã được gâynhiễm virus với tỉ lệ pha loãng 1/10, sau đó đánh giá mức độ bệnh của gà để chođiểm (chỉ số IVPI), điểm tối đa là 3 và đó là virus có độc lực cao nhất Theo quyđịnh của ủy ban Châu Âu [30] thì những virus có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên làthuộc nhóm virus có độc lực cao Căn cứ vào chỉ số IVPI các nhà khoa học đãthống nhất chia virus cúm làm 3 loại:

- Loại virus có độc lực cao: Nếu sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà mà làmchết 75 - 100% gà thực nghiệm, virus gây cúm gà phải làm chết 20% số gà mẫncảm thực nghiệm và phát triển tốt trên môi trường tế bào xơ phôi gà và tế bàothận trong điều kiện môi trường nuôi cấy không có trypsin

- Loại virus có độc lực trung bình: Là những chủng virus gây dịch cúm gàvới triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết không quá 15% số gà bị nhiễmbệnh tự nhiên và không quá 20 % số gà mẫn cảm thực nghiệm

- Loại virus có độc lực thấp: Là những virus phát triển tốt trong cơ thể gà,

có thể gây ra dịch cúm nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt và không tạo

bệnh trong tự nhiên của virus cúm A Loại này có thể trao đổi gen với các chủngvirus có độc lực cao đồng nhiễm trên cùng một tế bào, và trở thành loại virusHPAI nguy hiểm

- Loại có độc lực cao (HPAI): Là loại virus cúm A có khả năng gây tổnthương nhiều cơ quan nội tạng trong cơ thể bị nhiễm, trên gia cầm chúng thườnggây chết 100% số gia cầm bị nhiễm trong vòng 48 h sau nhiễm HPAI lây lannhanh hơn LPAI và gây chết cao hơn với các loài họ nhà chim Từ 1959 đến

2001 trên toàn thế giới đã có 19 chủng cúm A của loài lông vũ được phân lập cóđộc lực cao thuộc loại HPAI, trong đó, một số đã lây nhiễm và thích ứng gâybệnh trên người [24]

1.3.7.2 Sức đề kháng của virus:

Virus cúm type A tương đối nhạy cảm với các chất hóa học như fomalin,axit pha loãng, ete, sodium desoxycholat, hydroxylamon, [2]

Những chất sát trùng thông thường như: NaOH 2%, Formol 3%, Crezin

đặc, đều diệt được virus cúm gia cầm Người ta có thể dùng các chất này đểtổng tẩy uế chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và các thiết bị chăn nuôi khi cơ sở bị

đe dọa [4]

Virus không bền với nhiệt độ [32]:

- Virus có thể sống trong chuồng gà tới 35 ngày, trong phân gia cầmbệnh tới 3 tháng.

Điều kiện ngoại cảnh có ảnh hưởng rõ rệt đến sức đề kháng của virus cúmH5N1 Virus thường sống lâu hơn trong không khí ở độ ẩm tương đối thấp, trongphân ở điều kiện nhiệt độ thấp và độ ẩm cao [4]

Vịt nuôi cũng bị nhiễm virus cúm nhưng ít phát bệnh do vịt có sức đề khángvới virus bệnh, kể cả những chủng có độc lực cao gây bệnh nặng cho gà tây Tuynhiên năm 1961 ở Nam Phi đã phân lập được virus cúm type A H5N1 gây bệnhcho cả gà và vịt [1]

Phần lớn các loài gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A

Mới đây các nhà khoa học đã phát hiện virus cúm gia cầm có trong máumuỗi ở Thái Lan và hiện nay có thêm một loài động vật có vú nữa là chó bịnhiễm Trước đó các nhà khoa học đã phát hiện được virus cúm gia cầm trên hổ(Thái Lan), mèo (Hà Lan), cầy vằn (Việt Nam), lợn, tôm sú (Anh) [26]

1.3.9 Sự lây truyền.

Khi gia cầm bị nhiễm, virus được nhân lên trong đường hô hấp và đường tiêuhoá Sự truyền lây bệnh được thực hiện theo hai phương thức là trực tiếp và giántiếp:

Lây truyền trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnhthông qua các hạt khí dung được bài tiết từ đường hô hấp hoặc qua phân, thức ăn

và nước uống có chứa mầm bệnh

Đối với các virus gây bệnh cúm truyền nhiễm cao ở gia cầm thì sự lây chủyếu qua phân, đường miệng

Đối với gia cầm nuôi nguồn dịch thường là từ:

Các gia cầm nuôi khác nhau trong cùng một trang trại hoặc trang trại khácliền kề như vịt lây sang gà hoặc từ gà tây lây sang gà, gà nhật lây sang gà lôi Từ

gia cầm nhập khẩu, từ chim di trú (đặc biệt là thủy cầm di trú)

Hình 3 Mối quan hệ lây nhiễm và thích ứng các loài vật chủ của virus cúm A.

1.4 Triệu chứng và bệnh tích.

1.4.1 Triệu chứng:

Thời gian ủ bệnh từ 2 giờ đến 3 ngày kể từ khi nhiễm virus đến khi xuấthiện những triệu chứng đầu tiên (tùy theo lượng virus, đường lây nhiễm vàloài cảm nhiễm)

Biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm rất khác nhau do các yếu tố sau: chủngvirus, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tính, liều gây nhiễm, môi trường (độ bụi, thừaamoniac, ), chế độ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ trước khinhiễm virus và sự cộng nhiễm cùng với virus cúm gia cầm của các vi khuẩn,virus khác như E.coli, các Mycoplasma, Newcastle

Triệu chứng bệnh ở gà [12]:

- Gà từ 3 tuần đến hai tháng tuổi bệnh biểu hiện chủ yếu là ho hen đột ngột

và nhanh chóng lan ra cả đàn Gà bị sốt rất cao, nước mắt, nước miệng chảy dàndụa, nhiều gà phải há mồm thở dốc, có con vảy mỏ khạc đờm, đờm nhầy đặc đôikhi lẫn máu Gà bị tụt mào, mào tích thâm tím hoặc xuất huyết nhưng ít phù nề.Xuất huyết ở dưới da chân, kẽ ngón chân ở những gà sắp chết Gà kém ăn nhưnguống nhiều nước, ỉa chảy phân loãng xanh trắng Gà hay nằm, run rẩy, đi khôngvững, đầu cổ co giật Bệnh thường kéo dài 1 - 10 ngày và kết thúc với tỷ lệ chếtrất cao 70 - 100%

- Ở gà từ 3 - 10 tháng tuổi, đặc biệt là gà sắp đẻ và đang đẻ bệnh diễn biếnrất nhanh, luôn ở thể cấp tính và quá cấp tính với các triệu chứng sau: trong đàn

gà khỏe bỗng dưng thấy một số con sốt cao, mào và tích bị thâm tím, phù nề vàxuất huyết Sau đó khó thở, rướn cổ để hít khí hoặc để khạc đờm, đờm dãithường đặc quánh và lẫn máu Tình trạng đàn gà không bình thường, có con chạytán loạn, xoay vòng một lúc rồi chết Một số con tự nhiên dãy chết mà không có

triệu chứng gì Các biểu hiện lâm sàng ở mỗi cá thể gà trong cùng một đàn cũngrất khác nhau

Triệu chứng bệnh ở vịt và ngan [12]:

Bệnh thường tập trung ở lứa tuổi 2 - 11 tháng tuổi với các biểu hiện:

- Về hô hấp: Ngan, vịt bị cúm lúc đầu chảy nước mũi, nước mắt, mắt bịviêm giác mạc và có dử mắt Sau đó sốt cao, khó thở

- Về tiêu hóa: Ngan, vịt kém ăn hoặc bỏ ăn, tiêu chảy mạnh phân loãngtrắng hoặc loãng xanh, niêm mạc hậu môn bị phù nề và xuất huyết nặng

- Về sinh sản: Chỉ 1 - 2 ngày sau khi xảy ra bệnh năng suất trứng giảm rõrệt thậm chí ngừng đẻ

- Về thần kinh: Ngan, vịt yếu chân, bại chân, đi không vững, đầu cổ lắc lư.Triệu chứng bệnh ở người: Đối với con người cúm gia cầm gây ra các triệuchứng tương tự như của các loại cúm khác, đó là: sốt, ho, đau họng, đau nhức cơbắp, viêm kết mạc Ở những trường hợp nghiêm trọng có thể gây suy giảm hôhấp và viêm phổi, có thể dẫn đến tử vong Mức độ nghiêm trọng của bệnh phụthuộc phần lớn vào thể trạng sức khỏe, khả năng miễn dịch, tiền sử tiếp xúc viruscủa người bị nhiễm [22]

1.4.2 Bệnh tích:

Các biến đổi bệnh lý ở gà [8]:

- Bệnh tích bên ngoài: Mào tích sưng phù, tím tái, xuất huyết ở chân vùng

da không lông, nghẹo cổ, phù thũng phần đầu mặt, xung quanh hốc mắt và cácxoang

- Bệnh tích bên trong:

+ Bệnh tích vùng hầu họng: Khí quản xung huyết, xuất huyết và có nhiềudịch nhầy Viêm xoang, viêm khí quản từ dạng tiết dịch có sợi huyết đến dạngdịch nhầy có mủ hoặc bã đậu

+ Bệnh tích trên khoang ngực và khoang bụng: Hầu hết các cơ quan nộitạng đều xuất huyết, viêm phúc mạc từ mức độ viêm thanh dịch đến có sợi huyết

Vỡ trứng non Xuất huyết trên cơ tim Thành túi khí dày lên và đục, có nhiềufibrin bám dính Phổi viêm, xung huyết, xuất huyết Gan có những điểm hoại tửmàu vàng hoặc xám Tụy có những vùng xuất huyết thành vệt đỏ sậm và hoại tửmàu vàng Manh tràng và ruột viêm từ mức độ thanh dịch đến sợi huyết Láchsưng to, xuất huyết và có thể có điểm hoại tử vàng và xám Van hồi manh tràngxuất huyết Buồng trứng teo, xuất huyết Dịch hoàn xuất huyết Thận có thể cóxuất huyết, hoại tử vàng và xám

1.5 Chẩn đoán bệnh cúm gia cầm

1.5.1 Dựa vào đặc điểm dịch tễ:

Bệnh cúm gia cầm có tính lây lan rất nhanh và mạnh

Loài vật mắc bệnh: Gà, ngan, vịt, chim hoang, chim nuôi Vịt là loài mangmầm bệnh nhưng lại có ít biểu hiện triệu chứng lâm sàng, đây chính là nguồngieo rắc mầm bệnh ra môi trường

Lứa tuổi mắc bệnh: Mọi lứa tuổi, mẫn cảm nhất là đang trong giai đoạn bắtđầu sinh sản và trong giai đoạn sinh sản

Tùy thuộc vào các yếu tố như môi trường, độc lực, số lượng virus, tuổi,giống, giới tính, mật độ nuôi, khí hậu các ổ dịch có thời gian ủ bệnh ngắn từ 1 - 3ngày và có thể tới 21 ngày tùy theo độc lực.

Các ổ dịch thường xảy ra nhanh ở những lần đầu với tỷ lệ chết cao 90 100% với triệu chứng lâm sàng rõ rệt

-Phương thức lây truyền: Gia cầm mắc bệnh bài thải virus qua nước bọt,dịch nước mũi và phân Những gia cầm cảm nhiễm khác sẽ nhiễm virus cúm khichúng tiếp xúc với những chất bài thải trên của gia cầm mắc bệnh

Chim hoang được coi là nguồn truyền lây bệnh Chim và gia cầm mẫn cảm

có thể bị nhiễm bệnh khi tiếp xúc trực tiếp với chim mắc bệnh hoặc gián tiếp quacác bề mặt nhiễm bẩn

Ngoài chim và gia cầm ra, một số loài khác cũng có thể mắc bệnh như:người, lợn, ngựa, [21]

1.5.2 Dựa vào triệu chứng, bệnh tích [3]:

Nếu trong đàn gia cầm hoặc trại chăn nuôi gia cầm có những biểu hiện sauđây phải nghĩ ngay đến bệnh cúm gia cầm

- Giảm 20% tỷ lệ tiêu thụ thức ăn, nước uống trong một ngày so với bìnhthường.Tỷ lệ đẻ, tỷ lệ ấp nở giảm hẳn so với bình thường

Đàn gà có những biểu hiện triệu chứng, bệnh tích như: sốt cao, chảy nướcmắt, nước dãi, ủ rũ, đứng tụm một góc chuồng, lông xù, phù đầu và mặt, màotích sưng to và tím bầm, thở khó, hay vẩy mỏ, phân loãng màu sữa hoặc trắngxanh, đi lại loạng choạng, run rẩy, nghẹo đầu Xuất huyết dưới da thành mảng đỏ

tươi, khí quản xuất huyết, phổi xuất huyết Túi khí dầy và đục, xuất huyết ở hầuhết các cơ quan tiêu hóa, xoang bụng tích nước hoặc viêm dính.

1.5.3 Các phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm.

Chẩn đoán xét nghiệm cúm gia cầm được thực hiện bằng cách: phát hiệntrực tiếp các protein hay gen cấu trúc virus cúm trong bệnh phẩm hoặc chẩn đoángián tiếp bằng phát hiện kháng thể kháng virus cúm

Phát hiện kháng nguyên: Mẫu bệnh phẩm để phát hiện kháng nguyên có thểlấy bằng tăm bông ngoáy khí quản, lỗ huyệt, phân hoặc cơ quan phủ tạng Đốivới phủ tạng có thể lấy khí quản, phổi, lách, lỗ huyệt và não [18]

Để phân lập virus ta dùng bệnh phẩm tiêm lên trứng gà có phôi 9 - 11 ngàytuổi hoặc lây nhiễm trên môi trường tế bào MDCK (Madin - Darby CanineKidney Cells - môi trường tế bào dòng thận chó) Trên trứng gà có phôi ta dùngbệnh phẩm tiêm vào xoang niệu mô với liều 0,2 ml/trứng Virus cúm gia cầmđộc lực cao chủng H5N1 thường gây chết trứng trong thời gian 24 - 40 giờ Saukhi trứng chết thu hoạch nước xoang niệu mô và giám định Để giám định virustrước tiên phải thực hiện phản ứng HA Do ngoài virus cúm, virus Newcastlecũng gây ngưng kết hồng cầu, nên sau phản ứng HA cần tiếp tục thực hiện phảnứng HI với kháng huyết thanh chuẩn để giám định chính xác type H của virus.Hoặc bằng phương pháp RT - PCR (Reverse Transcriptase Polymerase ChainReaction) để xác định cả type H và type N

Phát hiện kháng thể: Phản ứng huyết thanh học dùng để phát hiện kháng thểđặc hiệu với virus cúm gia cầm sau 7 ngày nhiễm bệnh Có nhiều kỹ thuật dùng

để giám sát chẩn đoán huyết thanh học như: ELISA, HI, phản ứng miễn dịchhuỳnh quang, kỹ thuật khuếch tán trên thạch [18]

Kỹ thuật ELISA: (Enzym Linked Immunosorbent Assay): Phương pháp này

có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh ELISA có thể phát hiện với ribonucleotidecủa virus cúm nghĩa là chỉ có thể phát hiện được type A mà không thể xác địnhđược kháng thể với subtype của virus cúm Phát hiện kháng thể 1 tuần sau khinhiễm

Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI): Phương pháp này đặc hiệu và

có thể sử dụng để xác định được subtype của virus

Hiện nay việc sử dụng vacxin là cách để giảm thiệt hại tốt nhất do bệnhcúm gia cầm gây ra đối với ngành chăn nuôi Song việc này có thể dẫn đến sựtiến hóa của các chủng virus đang lưu hành thành các chủng mới Do đó việc sửdụng vacxin phải kết hợp chặt chẽ giám sát sau khi tiêm phòng, giám sát lưuhành virus ở các đàn đã được tiêm để có biện pháp xử lý kịp thời

1.7 Miễn dịch chống virus cúm [14].

1.7.1 Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu.

Cũng giống như đối với các mầm bệnh khác, đáp ứng miễn dịch không đặchiệu là hàng rào phòng ngự đầu tiên ngăn cản sự xâm nhập của virus vào cơ thể

Đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (miễn dịch bẩm sinh) gồm phản ứngviêm, sự thực bào bị nhiễm virus, sốt, và sự sản sinh interferon có tác dụng hạnchế sự lây lan của virus tới các tế bào chưa bị nhiễm virus.

* Các tế bào thực bào và bổ thể:

Một khi virus đã xâm nhập vào cơ thể các tế bào thực bào gồm các tế bàotrung tính, các tế bào monocyte và các tế bào đại thực bào sẽ được hoạt hóa vàthực hiện các chức năng của chúng Bổ thể cũng có tác dụng thúc đẩy quá trìnhthực bào các hạt virus

* Các cytokin (các interferon): Có 3 loại interferon: alpha (α), beta (β) vàgamma (γ) Interferon α và β (còn gọi là các interferon type 1) là các cytokinđược các tế bào bị nhiễm virus tiết ra Chúng kết gắn với các thụ cảm quan đặchiệu có trên các tế bào liền kề và bảo vệ các tế bào đó chống lại sự xâm nhiễmcủa virus Ngoài những tác dụng diệt virus trực tiếp đó, interferon α và β cũngthúc đẩy sự thể hiện các phân tử MHC loại I và loại II trên bề mặt các tế bào bịnhiễm virus và chính bằng cách này mà thúc đẩy sự trình diện các kháng nguyênvirus tới các tế bào miễn dịch đặc hiệu Interferon γ (còn được gọi là interferonmiễn dịch) là một cytokin do tế bào CD4 TH - 1 tiết ra, chức năng của interferon

γ là thúc đẩy các đáp ứng miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào T Như vậynếu như interferon type 1 tạo cho tế bào một "trạng thái kháng virus", đặc trưngbằng sự ức chế đối với cả sự nhân lên của virus và cả sự tăng sinh của tế bào thìinterferon γ do các tế bào T đã được hoạt hóa sản sinh ra có khả năng cảm ứng

sự tổng hợp các phân tử MHC loại I và chính các phân tử này làm cho các tế bào

dễ dàng "được nhận biết" bởi các tế bào T gây độc tố với tế bào (Tc) Khi virusgây nhiễm tế bào bên cạnh đã được hoạt hóa, các protein kháng virus sẽ phát

hiện các vật liệu thông tin di truyền ngoại lai Các protein đó sẽ được hoạt hóa và

ức chế quá trình nhân lên của virus bằng cách phân hủy (bẻ gãy) ARN thông tin

và làm dừng quá trình tổng hợp protein Các protein này làm cho các tế bào bịngừng trệ và điều đó sẽ hạn chế sự nhân lên tiếp tục của virus và do đó hạn chế

sự lây lan của virus sang các tế bào khác Chính vào giai đoạn đình trệ này mà hệthống miễn dịch có thời gian để huy động đáp ứng miễn dịch qua tế bào T

Cơ chế tác động của các interferon:

Nâng cao hiệu quả của đáp ứng miễn dịch bằng cách thúc đẩy sự thể hiệncác phân tử MHC loai I trên bề mặt của các tế bào bị nhiễm virus Vì thế cácinterferon sẽ làm tăng cơ hội cho các tế bào T gây độc tế bào nhận biết và tiêudiệt các tế bào bị nhiễm

* Các tế bào diệt tự nhiên (Natural Killer Cells): Là một nhóm các tế bàolâm ba cầu T, có nguồn gốc từ tủy xương, có mặt trong máu và các mô bào Các

tế bào này có khả năng nhận biết và dung giải các tế bào bị nhiễm virus và một

số loại tế bào ung thư Khả năng này không đặc hiệu và không bị giới hạn bởiphân tử MHC nên chúng được gọi là các tế bào diệt tự nhiên Các tế bào nàykhông có các thụ cảm quan bề mặt đặc hiệu với kháng nguyên (TCR hoặc cácthụ cảm quan immunoglobulin) Về mặt kiểu hình, các tế bào tự nhiên không cócác chất đánh dấu (marker) bề mặt đặc trưng cho các tế bào T và các tế bào B vàchính vì thế các tế bào này là một dòng lâm ba cầu riêng biệt Thuận lợi chủ yếu

mà các tế bào diệt tự nhiên có hơn các lâm ba cầu đặc hiệu với kháng nguyên vềkhả năng miễn dịch chống virus là ở chỗ nó không có pha ẩn của quá trình tăngsinh dòng tế bào khi được hoạt hóa nên các tế bào này hoạt động ngay như là các

tế bào thực hiện, còn các lâm ba cầu B và T đặc hiệu với kháng nguyên mất thời

gian để tăng sinh rồi sau đó mới thực hiện chức năng Vì thế các tế bào diệt tựnhiên có thể có các hiệu quả sớm trong diễn biến nhiễm virus và có thể hạn chế

sự lây lan virus trong giai đoạn sớm Tế bào NK có thụ cảm quan đặc hiệu vớimảnh Fc của phân tử IgG nên có khả năng dung giải tế bào đích thông qua hiệntượng gây độc tế bào phụ thuộc kháng thể (Antibody Dependent CellularCytotoxicity, ADCC): Trước hết kháng thể đặc hiệu gắn lên tế bào bị nhiễmvirus, sau đó phức hợp này gắn lên tế bào NK thông qua thụ thể dành cho mảnh

Fc, do đó tế bào NK có điều kiện tiếp cận với tế bào đích và tiêu diệt tế bào đích

* Các yếu tố "diệt virus cúm" khác: Đó là các IgA, α-defensin (1-3), cácchất ức chế haemagglutinin, các acid béo không bão hòa và monoglycerid

1.7.2 Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu [33].

Cả hai nhánh của đáp ứng miễn dịch thu được là đáp ứng miễn dịch dịch thể

và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đều đóng vai trò là cơ chế thực hiệnđặc hiệu trong miễn dịch chống virus

Các đáp ứng miễn dịch thông qua tế bào T và tế bào B đặc hiệu với khángnguyên có thể được thực hiện bằng:

Miễn dịch qua trung gian tế bào B, kết quả là quá trình sản xuất kháng thểđặc hiệu Bào chế, chuẩn bị và trình diện kháng nguyên thông qua các phân tửMHC loại I và MHC loại II

Miễn dịch tế bào chống virus với khả năng nhận biết kháng nguyên đặchiệu của virus và kháng nguyên của các tế bào bị nhiễm virus, nhận biết phứchợp kháng nguyên - MHC và các tế bào đích/ tế bào bị nhiễm virus

Kháng thể: Nhìn chung các kháng thể đặc hiệu đóng vai trò then chốt trongđáp ứng phòng hộ chống lại nhiễm virus Kháng thể được sản xuất tại chỗ là rấtquan trọng trong bảo vệ các bề mặt niêm mạc và kháng thể lưu hành, chủ yếu làIgG có tác dụng bảo hộ toàn thân IgG có thể nhận biết các tế bào bị nhiễm vàhoạt hóa bổ thể IgG có thể giao thoa, làm ảnh hưởng tới sự trao đổi chất của tếbào bị nhiễm virus IgG có thể ngăn các virus bám vào các tế bào đích Khángthể hoạt động tích cực trong các pha ban đầu của quá trình nhiễm virus Khángthể có thể ngăn cản sự tái nhiễm của cùng một loại virus.

Loại kháng thể có hiệu quả nhất trong tác dụng diệt virus là kháng thể trunghòa Đây là loại kháng thể gắn với virus mà thường là vỏ ngoài của virus hoặc vỏprotein capsid bên trong và chúng phong bế sự gắn kết của virus vào màng tếbào và đi vào tế bào vật chủ

Trong quá trình nhiễm virus kháng thể phát huy tác dụng mạnh nhất vàogiai đoạn sớm trước khi virus xâm nhập được vào tế bào đích của nó Về mặt nàykháng thể tương đối không có hiệu quả trong các trường hợp nhiễm virus nào đólần đầu tiên, chủ yếu là do pha ẩn của quá trình sản xuất kháng thể Tuy nhiên,các kháng thể đã được hình thành từ trước, đặc biệt là các kháng thể trung hòa làdạng có hiệu quả của miễn dịch phòng hộ chống lại các virus

Có thể nói kháng thể là yếu tố phòng thủ đầu tiên chống lại các mầm bệnhngoại bào với ba cách chính như sau:

Trung hòa: Bằng cách kết gắn với mầm bệnh hoặc kết gắn với các chấtngoại lai, các kháng thể có thể ngăn cản sự tiếp xúc của mầm bệnh với tế bàođích của chúng Phức hợp kháng nguyên - kháng thể sau đó bị các tế bào đạithực bào "nuốt" và phân hủy Kháng thể sau khi gắn vào kháng nguyên làm cho

kháng nguyên này dễ dàng bị các tế bào thực bào gồm đại thực bào và các tế bàoLeucocyte nhân đa hình thái nhân điện là ngoại lai Các tế bào thực bào sẽ tiêuhóa kháng nguyên và phá hủy kháng nguyên.

Opsonin hóa: Sự kết gắn của kháng thể vào một mầm bệnh hay một chấtngoại lai có thể opsonin hóa chúng và tạo điều kiện thuận lợi cho các tế bào thựcbào nuốt và tiêu hủy mầm bệnh hoặc vật liệu ngoại lai Vùng Fc của kháng thểtương tác với các thụ cảm quan Fc trên tế bào thực bào và điều đó làm cho mầmbệnh càng dễ bị thực bào

Hoạt hóa bổ thể: Sự hoạt hóa từng nấc của bổ thể nhờ kháng thể có thể dẫnđến sự dung giải virus Thêm vào đó, một số thành phần giáng hóa của bổ thể (ví

dụ C3b) có tác dụng opsonin hóa các mầm bệnh và tạo điều kiện thuận lợi chocác tế bào thực bào "nuốt" chúng dễ dàng thông qua các thụ cảm quan bổ thể cótrên các tế bào đó

Các tế bào T gây độc tế bào (Cytotoxic T Cells): Các tế bào thực hiệnchính tham gia vào quá trình làm sạch các virus đã thâm nhập vào tế bào là các

tế bào lâm ba cầu T gây độc tế bào (Cytotoxic T Lymphocyte, CTL) CD8+ đặchiệu với virus Các tế bào này nhận biết các kháng nguyên nói chung và trongtrường hợp kháng nguyên virus chính là các kháng nguyên được tổng hợp bêntrong nhân tế bào hoặc trong cytosol Kháng nguyên được trình bày trên bề mặt

tế bào dưới dạng các peptid ngắn liên kết với các phân tử MHC loại I Tuy nhiênkhông phải tất cả các đáp ứng CTL đều có lợi cho vật chủ mà trong một sốtrường hợp tổn thương mô bào do CTL đặc hiệu đối với virus gây ra lớn hơn cáctổn thương do nhiễm virus gây nên

Cơ chế hoạt động của tế bào T gây độc tế bào: Vì virus không có bộ máytổng hợp và chuyển hóa riêng nên chúng phải khu trú trong tế bào và lợi dụng tếbào để tái tạo Do virus phát triển trong tế bào chất nên tránh được tác dụng củakháng thể, vì vậy virus chỉ bị tiêu diệt khi giết chết tế bào bị nhiễm virus Trongtrường hợp này tế bào TCD8 gây độc đóng vai trò quan trọng vì nó có thể giếtchết một cách có chọn lọc các tế bào bị nhiễm này Sự biệt hóa từ tiền Tc thành

tế bào Tc có thể gây độc trực tiếp cần có 2 tín hiệu:

Tín hiệu 1: Tế bào T nhận diện phức hợp kháng nguyên - MHC loại I trên tếbào trình diện kháng nguyên hoặc tế bào đích

Tín hiệu 2: cytokin do tế bào TCD4 tiết ra (IL-6, IL-2, IFN-γ) khi nó nhậndiện được kháng nguyên trên tế bào trình diện kháng nguyên

Để loại bỏ các tế bào bị nhiễm virus mà không làm hủy hoại tế bào lành, tếbào TCD8 chỉ giết chết một cách có chọn lựa những tế bào đích đã bộc lộ khángnguyên đặc hiệu mà thôi Tế bào TCD8 gây độc cũng sản sinh IFN-γ và cả TNF-

α để kìm hãm sự nhân lên của virus, làm tăng sự bộc lộ các phân tử MHC loại I

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu.

- Vacxin nhũ dầu cúm gia cầm đã vô hoạt, chủng NIBRG-14 do công

ty Thuốc Thú y TW kết hợp với Viện Công Nghệ Sinh Học sản xuất

2.2 Nội dung nghiên cứu.

- Sản xuất kháng thể kháng virus cúm A/H5N1

- Đánh giá một số chỉ tiêu chất lượng của kháng thể như vô trùng,thuần khiết, an toàn, độ dài miễn dịch, điều kiện bảo quản cũng nhưhiệu lực vacxin

2.3.2 Thiết bị và hóa chất.

-Thiết bị

Máy li tâm, máy ổn nhiệt, pipet, đầu côn, eppendoff, đĩa 96 giếng đáy chữ

V cho phản ứng HA và HI Đĩa 96 giếng phẳng Costar dùng cho phản ứngELISA

Tủ lạnh thường, tủ lạnh sâu, nồi hấp khử trùng, ống nghiệm, pank, dao, kéo,kim tiêm, gang tay, khẩu trang, que hematocrit, máng nhựa, giấy thấm, khănthấm đèn cồn, bông cồn, ,… và các thiết bị cần thiết khác

- Hoá chất:

Dung dịch PBS, nước cất khử ion, agar, Pinicillin, Streptomicin, Tween 20,chất tạo màu cho phản ứng ELISA, môi trường dinh dưỡng, nước thịt gan yếmkhí, thạch nấm …

Hồng cầu gà, cồn 900, cồn 700, Muối NaCl, môi trường thạch dinhdưỡng và các dung dịch cần thiết khác

Địa điểm nghiên cứu:

Cơ sở Hóa sinh Dược Thú y, Trường đại học Nông Nghiệp Hà Nội

2.4 Phương pháp nghiên cứu.

2.4.1 Phương pháp gây miễn dịch.

- Trước khi dùng vacxin gây miễn dịch cho gà và thỏ, kiểm tra vô trùngcủa vacxin trên 4 môi trường: thạch máu, nước thịt, nước thịt gan yếm khí vàthạch nấm Kiểm tra độ an toàn của vacxin bằng cách tiêm phôi

- Sau khi đã kiểm tra vô trùng và độ an toàn của vacxin, chúng tôi dùngvacxin vô hoạt nhũ dầu H5N1 (chủng NIBRG-14) do Việt Nam sản xuất; gâymiễn dịch cho ba giống gà là: Rhosde, Leghorn, Tam Hoàng.

Đường tiêm: dưới da, cơ lườn

Liều tiêm: tiêm 4 lần mỗi lần cách nhau 7 ngày Lần 1 và 2 tiêm 0.5ml chomột cá thể, lần 3 và 4 tiêm 1ml cho một cá thể

2.4.2 Phương pháp gây miễn dịch trên thỏ.

Chúng tôi tiến hành gây tối miễn dịch trên thỏ khoảng 2 tháng tuổi có khối lượngkhoảng từ 1,8kg đến 2,2kg Sau đó thỏ được mua về nuôi 10 ngày cho ổn địnhrồi tiến hành làm thí nghiệm

Thỏ được tiêm 6 lần, tiến hành tiêm dưới da với thời gian và liều lượng nhưsau:

Tiêm vacxin cúm A/H5N1 mũi đầu tiên với liều lượng là 0,5ml/con

Sau đó 3 ngày tiêm mũi thứ 2 với liều lượng là 1ml/1con

Ba ngày tiếp tiêm mũi thứ 3 với liều lượng là 2ml/con

Sau đó 5 ngày tiêm mũi thứ 4 với liều lượng là 3ml/1con

7 ngày sau tiêm mũi thứ 5 với liều lượng là 4ml/1con

Một tuần sau tiếp tục tiêm mũi thứ 6 với kháng nguyên là giống virus đã nhânlên ở trên với liều lượng là 5ml/1con Sau khi tiêm mũi cuối cùng chúng tôi tiếnhành lấy máu, định kỳ mỗi tuần một lần, mỗi lần lấy 3 mẫu, sau đó chắt huyếtthanh và kiểm tra hiệu giá kháng thể qua phản ứng HI