Xác định genotype và một số đặc điểm dịch tễ học phân tử của porcine circovirus type 2 (PCV2) ở đàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền bắc việt nam

Nghiên cứu trên các mẫu bệnh phẩm ñược thu thập từ những 1970 ñã chỉ ra sự có mặt của PCV2 lưu hành trên ñàn lợn ở một số nước.. Thực trạng chăn nuôi lợn ở nước ta hiện nay ñã tạo môi tr

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

= = = =


= = = =

NGUYỄN VĂN QUANG

XÁC ðỊNH GENOTYPE VÀ MỘT SỐ ðẶC ðIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở ðÀN LỢN NUÔI TẠI MỘT SỐ

TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI – 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

= = = =


= = = =

NGUYỄN VĂN QUANG

XÁC ðỊNH GENOTYPE VÀ MỘT SỐ ðẶC ðIỂM DỊCH TỄ HỌC PHÂN TỬ CỦA PORCINE CIRCOVIRUS TYPE 2 (PCV2) Ở ðÀN LỢN NUÔI TẠI MỘT SỐ

TỈNH MIỀN BẮC VIỆT NAM

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi, kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học

vị nào

Tôi xin cam ñoan mọi sự giúp ñỡ cho việc hoàn thành luận văn này ñã ñược cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2013

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Quang

ðặc biệt, tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Huỳnh Thị Mỹ Lệ - giảng viên Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, khoa Thú y, trường ðại học Nông Nghiệp Hà Nội ñã dành nhiều thời gian chỉ dẫn và giúp

ñỡ tận tình ñể tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp

Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp ñỡ tận tình của các thầy cô trong Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm ñã tạo mọi ñiều kiện thuận lợi ñể tôi hoàn thành công việc trong quá trình thực tập của mình

Tôi luôn biết ơn tới gia ñình, bạn bè, những người luôn ñộng viên, giúp ñỡ tôi trong suốt quá trình học tập tại trường cũng như trong quá trình thực hiện ñề tài này

Hà Nội, ngày 15 tháng 8 năm 2013

Tác giả luận văn

Nguyễn Văn Quang

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO v

DANH MỤC BẢNG BIỂU vi

DANH MỤC HÌNH vii

MỞ ðẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4

1.1 Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra 4

1.1.1 Một vài nét về PCV2 4

1.1.2 Bệnh do PCV2 gây ra 8

1.1.3 Triệu chứng và bệnh tích 11

1.1.4 Chẩn đốn 15

1.1.5 Phịng bệnh 17

1.1.6 ðiều trị 22

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngồi nước về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra 22

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước 22

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 23

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆUPHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 ðối tượng nghiên cứu 26

2.2 ðịa điểm 26

2.3 Nội dung nghiên cứu 26

2.4 Nguyên liệu 26

2.5 Phương pháp nghiên cứu 27

2.5.1 Phương pháp tính tốn dung lượng mẫu 27

2.5.2 Phương pháp thu thập mẫu huyết thanh, mẫu bệnh phẩm 27

2.5.3 Phương pháp nested PCR chẩn đốn PCV2 trong bệnh phẩm 27

2.5.4 Phương pháp giải trình tự gen 31

2.5.5 Xây dựng cây phả hệ 32

2.5.6 Phương pháp xử lý số liệu 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Tổng hợp kết quả thu thập mẫu dùng trong nghiên cứu 33

3.1.1 Kết quả thu thập mẫu 33

3.1.2 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn nghi mắc bệnh liên quan đến PCV2 34

3.2 Kết quả xác định genotype của PCV2 ở đàn lợn nuơi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 40

3.2.1 Kết quả xác định sự cĩ mặt của PCV2 trong mẫu nghiên cứu 40

3.2.2 Kết quả xác định sự cĩ mặt của PCV2 ở các đàn cĩ/khơng biểu hiện triệu chứng của PCVAD 44

3.2.3 Kết quả xác định genotype của các chủng PCV2 ở đàn lợn nuơi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam 45

3.3 Kết quả giải trình tự bộ gen của PCV2 46

3.4 Phân tích, so sánh trình tự các chủng giải trình tự được và các chủng lưu hành trên thế giới 47

3.4.1 ðặc điểm trình tự gen PCV2 lưu hành ở Việt Nam 47

3.4.2 Kết quả phân tích cây phả hệ chủng PCV2 lưu hành ở Việt Nam 50

3.4.3 Kết quả phân tích trình tự amino acid của capsid protein 53

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 55

4.1 Kết luận 55

4.2 ðề nghị 55

TÀI LIỆU THAM KHẢO 57

CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG BÁO CÁO

ADN : Axit Deoxyribose Nucleic

ELISA : Enzym Linked Immunosorbent Assay

ORF : Open Reading Frame

PBS : Phosphate – Buffered - Saline

PCR : Polymerase Chain Reaction

PCV : Porcine CircoVirus

PCV1 : Porcine CircoVirus type 1

PCV2 : Porcine CircoVirus type 2

PCVAD : Porcine CircoVirus Associated Disease

PDNS : Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome

PK15 : Pig Kidney 15

PMWS : Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome

PNP : Proliferating Necrotizing Pneumonia

PRDC : Porcine Respiratory Disease Complex

PRRS : Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome

TAE buffer : Tris-Acetate Etilendiamin Tetraaxetic Axit buffer

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 1.1 Bảng so sánh các khung đọc mở của PCV1 và PCV2 7

Bảng 1.2 Những nghiên cứu về PCV2 trên thế giới 23

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi của phản ứng nested PCR để xác định genotype và giải trình tự PCV2 29

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chẩn đốn và định type PCV231

Bảng 3.1 Tổng hợp tình hình thu thập mẫu xác định sự cĩ mặt của PCV2 33

Bảng 3.2 Kết quả nested PCR xác định sự cĩ mặt của PCV2 trong mẫu huyết thanh thu thập được từ các địa phương 41

Bảng 3.3 Kết quả nested PCR xác định sự cĩ mặt của PCV2 trong mẫu bệnh phẩm thu thập được từ các địa phương 41

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1: Cấu trúc PCV2 (Gillespie và cộng sự, 2009) 6

Hình 2.1 Sơ ñồ vị trí mồi phản ứng nested PCR 28

Hình 3.1 Lợn còi cọc, chậm lớn 36

Hình 3.2 Lợn gầy còm, lông dựng 36

Hình 3.3 Lợn bị viêm da 36

Hình 3.4 Lợn bị viêm da 37

Hình 3.5 Lợn bị tiêu chảy 37

Hình 3.6 Lợn có triệu chứng hô hấp 37

Hình 3.7 Lấy mẫu lợn thí nghiệm 37

Hình 3.8 Hạch bẹn nông sưng, xuất huyết 38

Hình 3.9 Hạch bẹn nông sưng, xuất huyết 38

HÌnh 3.10 Viêm dính màng phổi với thành lồng ngực 38

Hình 3.11 Hạch màng treo ruột bị sưng, xuất huyết 38

Hình 3.12 Lợn bị viêm khớp 39

Hình 3.13 Thận bị sưng, xuất huyết và có ñiểm hoại tử 39

Hình 3.14 Phổi bị viêm ở các mức ñộ khác nhau 39

Hình 3.15 Kết quả nested PCR trên mẫu ADN dương chuẩn và mẫu bệnh phẩm 40

Hình 3.16 Kết quả phân tích cây phả hệ của các PCV2 chủng lưu hành ở Việt Nam với các chủng tham chiếu 51

Hình 3.17 Kết quả phân tích con ñường phát tán của virus thuộc nhóm tái tổ hợp 52

Hình 3.18 Trình tự amino acid của các chủng PCV2 lưu hành tại Việt Nam 53

MỞ ðẦU

Chăn nuôi là một trong hai lĩnh vực kinh tế quan trọng trong nền kinh

tế nông nghiệp (chăn nuôi, trồng trọt) nước ta và là một mắt xích quan trọng trong sản xuất nông nghiệp bền vững, tạo việc làm, tăng thu nhập, xóa ñói giảm nghèo Vì thế, chăn nuôi luôn chiếm vị trí quan trọng và ñối tượng vật nuôi luôn ñược quan tâm phát triển ðể thúc ñẩy nhanh quá trình nhân giống vật nuôi trong những năm gần ñây việc ứng dụng tiến bộ khoa học ngày càng nhiều như: ứng dụng thụ tinh nhân tạo vào chăn nuôi trên quy mô rộng nhằm tăng năng suất chăn nuôi, tránh cận huyết, dịch bệnh qua giao phối tự nhiên ñặc biệt trong chăn nuôi lợn Khi ngành chăn nuôi phát triển ngày càng mạnh

mẽ theo xu hướng công nghiệp, người ta nhận thấy việc cai sữa quá sớm có thể làm cho lợn con không nhận ñủ kháng thể cần thiết từ mẹ, dẫn ñến rất dễ mắc bệnh

Porcine circovirus (PCV) ñược phát hiện ñầu năm 1974 trên tế bào PK15 và ñược xếp vào Porcine circovirus typ 1 không gây bệnh (PCV1) Năm 1997, Harm và cộng sự ñã tìm ra Porcine circovirus typ 2 (PCV2) trong những con lợn mắc hội chứng gầy còm sau cai sữa (postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS) và ñã xác ñịnh trình tự nucleotide của PCV1 và PCV2 giống nhau dưới 80% và trình tự amino - acid dưới 70%; ñặc tính kháng nguyên của hai loại virus này cũng có nhiều ñiểm khác nhau Nghiên cứu trên các mẫu bệnh phẩm ñược thu thập từ những 1970 ñã chỉ

ra sự có mặt của PCV2 lưu hành trên ñàn lợn ở một số nước Tuy nhiên, hội chứng bệnh do PCV2 gây ra mới ñược xác ñịnh vào những năm 90 của thế kỷ

XX PCV2 là tác nhân gây suy giảm hệ thống miễn dịch, cùng với các tác nhân gây bệnh khác gây nên hội chứng bệnh liên quan ñến PCV2 (Porcine circovirus type 2-associated disease, PCVAD) gồm Hội chứng gầy còm ở lợn

sau cai sữa (PMWS); Hội chứng viêm da và viêm thận (porcine dermatitis and nephropathy syndrome – PDNS); Hội chứng viêm ñường hô hấp (porcine respiratory diseases complex) và Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn (porcine reproductive disorders); gây tác ñộng lớn tới sức sản xuất của ñàn lợn Trong

số các bệnh do circovirus gây ra, PMWS ñược coi là nguyên nhân gây thiệt

hại kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn; danh từ Hội chứng 30kg

(The 30kg syndrome) cũng ñôi khi ñược dùng ñể chỉ bệnh này do lợn bệnh chỉ ñạt khối lượng khoảng 30kg trong khi lợn bình thường cùng lứa tuổi có thể ñạt 100kg

Thực trạng chăn nuôi lợn ở nước ta hiện nay ñã tạo môi trường hết sức thuận lợi cho việc thường xuyên tồn tại nhiều mầm bệnh PCV2 trong ñàn; cộng thêm sự xuất hiện của virus gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome virus - PRRSV) từ năm

2007 ñã làm cho tình hình dịch bệnh càng trở nên phức tạp Do vậy, nghiên cứu chỉ ra sự có mặt của PCV2 và PCVAD ở ñàn lợn là hết sức cấp thiết ñể từ

ñó có ñược những chiến lược phòng bệnh, vacxin phòng bệnh kịp thời Trong khi các nước trên thế giới, thậm chí các nước trong khu vực ñã và ñang ñi sâu nghiên cứu về PCV2 và bệnh PCVAD thì tại Việt Nam còn rất ít thông tin về PCV2 và PCVAD; vì vậy, ñặt vấn ñề nghiên cứu về PCV2 là hoàn toàn cần

thiết và cấp thiết trong thời ñiểm hiện nay Chúng tôi tiến hành ñề tài "Xác ñịnh genotype và một số ñặc ñiểm dịch tễ học phân tử của Porcine Circovirus type 2 (PCV2) ở ñàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam" nhằm nghiên cứu về genotype lưu hành và trình tự của PCV2, so sánh

hệ gen của PCV2 lưu hành tại Việt Nam với các chủng trên thế giới; giúp cung cấp thông tin phòng chống, hạn chế tối ña thiệt hại do bệnh PVCAD gây ra cho người chăn nuôi

* Ý nghĩa khoa học của ñề tài:

- ðây là nghiên cứu ñầu tiên về PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

- Kết quả nghiên cứu giúp làm sáng tỏ về tỷ lệ lưu hành PCV2 và một

số ñặc ñiểm dịch tễ học phân tử của PCV2 lưu hành ở ñàn lợn nuôi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

- Nguồn dữ liệu của ñề tài rất có ý nghĩa, là tiền ñề khoa học trong việc triển khai các nghiên cứu tiếp theo, ñặc biệt ñể sản xuất vacxin phòng PCVAD

* Ý nghĩa thực tiễn của ñề tài:

- Kết quả nghiên cứu giúp ñề xuất ñược biện pháp phòng PCVAD có hiệu quả, hạn chế dịch bệnh gây ra cho ñàn lợn nuôi tại Việt Nam

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Giới thiệu về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra

Porcine circovirus (PCV) thuộc họ Circoviridae, bao gồm Porcine

circovirus type 1 (PCV1) và Porcine circovirus type 2 (PCV2) Mức ñộ tương ñồng trình tự nucleotide giữa PCV1 và PCV2 là 68 – 76% (theo Hamel và cộng sự, 1998)

Trong những năm cuối thập niên 1990, một loại circovirus mới (Porcine Circovirus) gây bệnh ñã ñược phát hiện ở lợn Virus này khác với PCV thích ứng trên môi trường tế bào thận lợn (Pig Kidney) PK15 ñã biết trước ñó Người ta ñã ñề nghị gọi PCV ñã biết là PCV type 1 (PCV1) và virus mới phân lập ñược là PCV type 2 (PCV2) PCV1 ñược phân lập lần ñầu tiên tại ðức vào năm 1974, virus này ñược xem như không phải tác nhân gây bệnh (nonpathogenic) ở lợn Năm 1991 tại Canada, PCV2 ñược nhận diện là nguyên nhân gây hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa và sau ñó ñược ghi nhận ở nhiều nước trên thế giới Tuy nhiên, các kết quả nghiên cứu hồi cứu mẫu bệnh phẩm cho biết ñã phát hiện ñược kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh của lợn từ năm 1969 tại Bỉ, năm 1970 tại Anh, năm 1973 tại Ireland và năm 1983 tại Canada (trích theo Gillespie và cộng sự, 2009) và Tây Ban Nha (Rodríguez - Arrioja và cộng sự, 2003)

1.1.1 Một vài nét về PCV2

1.1.1.1 Phân loại

PCV2 thuộc giống Circovirus, họ Circoviridae Họ circoviridae gồm 3

giống, ñược xác ñịnh là nguyên nhân gây một số bệnh ở gia súc và gia cầm:

- Giống Anellovirus: gồm một số circovirus của người như Transfusion Transmitted Virus hay Torque teno virus (TTV) Virus này ñược phát hiện lần ñầu tiên vào năm 1997 tại Nhật Bản và thường phân lập ñược từ bệnh nhân

mắc bệnh gan; tuy nhiên chúng không ñược coi là nguyên nhân gây bệnh Một số nghiên cứu gần ñây cho thấy TTV cũng có thể gây bệnh cho một số loài vật nuôi khác như lợn, và có thể phân lập ñược từ huyết thanh của lợn mắc PMWS tại Tây Ban Nha (Francisco de Grau)

- Giống Gyrovirus: thành viên duy nhất của giống này là chicken anemia virus (CAV) gây bệnh thiếu máu truyền nhiễm gà (Chicken Infectiuos Anemia – CIA)

- Giống Circovirus: gồm các virus ñã phát hiện ñược từ ñộng vật như porcine circovirus type 1 và 2 (circovirus ở lợn), canary circovirus (circovirus ở chim hoàng yến), bovine circovirus (circovirus ở bò), goose circovirus (circovirus ở ngỗng), ostrich circovirus (circovirus ở ñà ñiểu), raven circovirus (circovirus ở quạ) và human circovirus (circovirus gây hội chứng mệt mỏi mạn tính ở người)

Các chủng PCV2 phân lập ñược trên thế giới có cùng nguồn gốc với mức ñộ tương ñồng về kiểu gen khoảng 93% (Larochelle và cộng sự, 2002) Hiện nay, dựa vào kết quả giải trình tự gen, có 3 genotype PCV2 ñược chính thức công nhận, ký hiệu từ PCV2a-2c (Segalés và cộng sự, 2008) Genotype PCV2a và PCV2b lại có thể ñược chia thành các cluster khác nhau (ví dụ PCV2a có 5 cluster 2A-2E; PCV2b có 3 cluster 1A-1C)

là ORF1, ORF2 và ORF3 (Hamel và cộng sự, 1998)

Hình 1.1: Cấu trúc PCV2 (Gillespie và cộng sự, 2009)

ORF1 mã hĩa cho các protein liên quan đến sự nhân lên của virus (viral replication protein – Rep), cĩ khối lượng phân tử 35,8 kDa Sự tương đồng amino acid của phân tử protein quy định bởi ORF1 giữa PCV1 và PCV2 khoảng là 85%

ORF2 mã hĩa cho các protein liên quan đến sự hình thành vỏ capsid của virus (capsid protein – Cap), cĩ khối lượng phân tử 27,8 kDa Sản phẩm ORF2 chứa các điểm quyết định kháng nguyên, kích thích sinh kháng thể chống lại virus, vì vậy người ta sử dụng kháng thể nguồn gốc ORF2 như một cơng cụ để chẩn đốn phân biệt PCV Sự tương đồng amino acid của phân tử protein do ORF2 mã hĩa giữa PCV1 và PCV2 là 66%

ORF3 mã hĩa protein cĩ khối lượng phân tử 11,9 kDa, được cho là cĩ liên quan đến hiện tượng apoptosis ở tế bào nhiễm virus; sự tương đồng amino acid của protein này giữa PCV1 và PCV2 là 62%

Theo Hamel và cộng sự (1998), trình tự 11 ORF của PCV2 gây hội chứng cịi cọc (PCV2) và chủng khơng gây bệnh (PCV1) như sau (bảng 1.1)

Vị trí nucleotide

Số

aa

Khối lượng protein (kDa)

Tương ñồng (%)

1.1.1.3 Tính chất nuôi cấy

Hiện nay những hiểu biết về ñặc tính sinh học của PCV2 như khả năng nhận biết, gắn và xâm nhập vào tế bào chưa nhiều Vì PCV2 chỉ mã hóa cho hai loại protein nên chúng ñược cho rằng phải dựa vào protein của tế bào vật chủ ñể nhân lên, nghĩa là chúng nhân lên tốt trong tế bào ñang phân chia Qua nghiên cứu của nhiều tác giả cho thấy môi trường tế bào thận lợn PK15 rất thích hợp ñể nuôi cấy PCV2, virus nhân lên trong nhân tế bào, nhưng không gây bệnh tích tế bào Tischer và cộng sự (1987) cho biết sự nhân lên của PCV2 sẽ tốt hơn nếu tế bào PK15 ñược xử lý với glucosamine

ðể khẳng ñịnh sự nhân lên của virus trong môi trường PK15 cần phải làm phản ứng miễn dịch huỳnh quang hoặc PCR do PCV2 thường không gây bệnh tích tế bào

ðể phân lập PCV2 trên môi trường tế bào PK15 thường mất rất nhiều công sức và thời gian do phải cấy chuyển nhiều lần, thường chỉ áp dụng trong nghiên cứu ñể sản xuất vacxin phòng bệnh

Virus không có khả năng gây ngưng kết hồng cầu

1.1.1.4 Sức ñề kháng

PCV2 rất bền ở nhiệt ñộ cao và chịu ñược trong ñiều kiện pH dao ñộng lớn Với nhiệt ñộ, PCV2 có khả năng sống ñược 72 giờ ở 800C, 30 phút ở nhiệt ñộ 70 - 750C và 1 giờ ở 560C; bị bất hoạt ở pH 3 và bởi chloroform Ở nhiệt ñộ phòng, khi bị tác ñộng trong 10 phút bởi một số chất sát trùng như chlorhexidine, formol, iodine và cồn thì hiệu giá của virus sẽ giảm Có thể phân lập ñược PCV2 trong bệnh phẩm của lợn bảo quản ở -700C

1.1.2 Bệnh do PCV2 gây ra

1.1.2.1 Loài vật mắc bệnh

Tất cả các giống lợn ñều mẫn cảm với bệnh, kể cả lợn nuôi và lợn hoang dã, nhưng các loài vật khác không mẫn cảm với PCV2 Khả năng mẫn cảm với bệnh thay ñổi tùy theo tính biệt, giống lợn, có liên quan ñến sự nhân

lên của PCV2 trong ñại thực bào phế nang Gần ñây, nghiên cứu Potter và cộng sự (2012) ñã khẳng ñịnh bản chất di truyền của từng giống lợn có ảnh hưởng ñến mức ñộ mẫn cảm với PCVAD Ví dụ, thường lợn ñực mẫn cảm với bệnh hơn so với lợn cái; lợn giống Landrace mẫn cảm hơn giống Duroc

và ðại Bạch

Chen và cộng sự (2007) cho biết chỉ xác ñịnh ñược kháng thể kháng PCV2 trong huyết thanh của lợn trong các loài ñược kiểm tra là lợn, gà, vịt,

dê và trâu, bò Bệnh không có khả năng lây sang người

1.1.2.2 Phương thức truyền lây

Mầm bệnh xâm nhập vào cơ thể chủ yếu qua ñường miệng - mũi Bệnh

có thể lây qua tiếp xúc, qua phân, qua ñường hô hấp và tinh dịch của lợn ñực giống Bằng kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) có thể xác ñịnh ñược mầm bệnh có trong dịch bài xuất và bài tiết của lợn mắc hoặc không mắc PMWS, trong huyết thanh lợn có triệu chứng lâm sàng cũng như lợn khỏe mạnh, không có triệu chứng (Segalés và cộng sự, 2005)

PCV2 cũng có thể truyền trực tiếp từ mẹ sang con qua nhau thai, là nguyên nhân khiến cho mầm bệnh tồn tại lâu trong ñàn, lợn con bị nhiễm virus ngay từ khi mới sinh Tuy nhiên, ñường truyền lây này ít gặp

Ngoài ra, PCV2 còn ñược tìm thấy trong sữa ñầu nhưng ñể khẳng ñịnh ñược ñây có phải là ñường truyền lây bệnh hay không thì cần phải tiếp tục nghiên cứu (trích theo Gillespie và cộng sự, 2009)

1.1.2.3 Cơ chế sinh bệnh

PCV2 tác ñộng ñến tế bào lympho và các tế bào có thẩm quyền miễn dịch như tế bào ñơn nhân, ñại thực bào và tế bào tua (dendritic cell) gây suy giảm miễn dịch, tạo ñiều kiện thuận lợi cho nhiều loại mầm bệnh khác xâm nhập và gây bệnh ðiểm ñặc trưng quan trọng nhất quan sát ñược khi lợn bị hội chứng PCVAD là số lượng bạch cầu giảm rất nhanh (leucopenia)

Bằng thực nghiệm người ta thấy rằng lợn bị nhiễm PCV2 không có khả

năng sản sinh interferon ở giai ñoạn ñầu của quá trình nhiễm trùng có thể là nguyên nhân làm giảm ñáp ứng miễn dịch với PCV2 và bị bệnh Ngoài ra, hiện tượng giảm sản sinh interferon nhưng tăng lượng IL-10 ở những lợn thực nghiệm bị nhiễm PCV2 cũng ñã ñược chứng minh

Cho ñến nay, ảnh hưởng của PCV2 ñến hệ miễn dịch của lợn vẫn còn nhiều tranh cãi và cần phải có các nghiên cứu ñể làm sáng tỏ Nghiên cứu cần tập trung làm rõ tác ñộng qua lại giữa giai ñoạn sau nhiễm trùng và trước khi biểu hiện triệu chứng lâm sàng ñể giải thích hiện tượng nhiễm trùng cấp tính hoặc/và mạn tính Opriessnig và cộng sự (2006) cho biết mặc dù hầu hết lợn trong ñàn có thể bị nhiễm PCV2 nhưng chỉ có khoảng 5 - 30% lợn mẫn cảm biểu hiện triệu chứng

Có bốn yếu tố ảnh hưởng ñến sự phát sinh PCVAD do nhiễm PCV2 là cấu trúc và ñộc lực virus, giống lợn, sự ñồng nhiễm, trạng thái miễn dịch của

cơ thể Việc sử dụng một số loại vacxin, trong ñó chất bổ trợ sẽ khiến cho tỷ

lệ lợn có triệu chứng PCVAD tăng lên Ở lợn cùng tiêm một loại vacxin nhưng có chất bổ trợ khác nhau (ñặc biệt bổ trợ dầu) sẽ làm cho thời gian nhiễm virus cũng như số lượng PCV2 trong huyết thanh và mô bào tăng lên,

tế bào lympho bị tổn thương nặng hơn so với những lợn ñược tiêm vacxin bổ trợ là keo phèn Một thí nghiệm khác cũng cho thấy khi lợn ñược tiêm vacxin

phòng bệnh do M hyopneumoniae hoặc A pleuropneumoniae, sau ñó gây

nhiễm PCV2 thì thời gian PCV2 có trong máu sẽ lâu hơn và các bệnh tích vi thể sẽ trầm trọng hơn so với những lợn không tiêm phòng vacxin

ðiểm ñặc biệt trong cơ chế sinh bệnh của PCV2 là hiện tượng ña nhiễm hoặc bội nhiễm với nhiều loại mầm bệnh khác Pallares và cộng sự (2002) thông báo kết quả khi nghiên cứu trên 484 mẫu bệnh phẩm từ các ca bệnh PMWS chỉ xác ñịnh 1,9% số mẫu ñơn nhiễm PCV2; 51,9% số mẫu nhiễm kép PRRSV;

35,5% nhiễm kép với M hyopneumoniae; 5,4% nhiễm kép với virus cúm lợn và

15% nhiễm kép với PPV (porcine parvovirus) Trong trường hợp bại huyết,

thường có sự hiện diện của Streptoccocus suis (14%) và Pasteurella multocida (7,6%)

Tại Úc, ựến năm 2010, mặc dù ựã chứng minh ựược sự nhiễm PCV2 ở ựàn lợn nhưng vẫn chưa chứng minh ựược sự hiện diện của PMWS Theo L.Grau-Roma và cộng sự (2010), giả thuyết ựược ựưa ra là do chưa có mầm bệnh kế phát cần thiết ựể PCV2 gây bệnh Tuy nhiên kết quả của O'Dea và cộng sự (2011) cho biết ựã chứng tỏ ựược sự có mặt của PCVAD ở ựàn lợn thịt nuôi tại miền Tây nước này, cùng với sự có mặt gây bệnh của vi khuẩn

Salmonella

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Lâm Thị Thu Hương tại hai tỉnh miền đông Nam Bộ cũng cho thấy lợn mắc PMWS thường cộng nhiễm một số vi

khuẩn như E coli (55%), Streptococcus (42,5%), Salmonella (32,5%),

P.multocida (22,5%) và Haemophilus parasuis (17,5%)

Từ năm 1988, trên thế giới ựã có nhiều nghiên cứu tập trung vào vai trò của PCV2 gây hội chứng còi cọc ở lợn sau cai sữa PMWS điều dễ dàng nhận thấy là nếu chỉ gây nhiễm PCV2 rất ắt khi lợn biểu hiện triệu chứng lâm sàng (Okuda và cộng sự, 2003) Trong hầu hết các trường hợp lợn có triệu chứng lâm sàng rõ khi ựược gây nhiễm ựồng thời với một số mầm bệnh truyền nhiễm hoặc không truyền nhiễm (Rovira và cộng sự, 2002) Do ựó, PCV2 ựược coi là ựiều kiện cần nhưng chưa ựủ ựể gây thành bệnh (Tomás và cộng sự, 2008) Với trường hợp PDNS, cần phải làm thắ nghiệm chứng minh giả thuyết cho rằng hàm lượng kháng thể PCV2 tăng cao sẽ là nguyên nhân gây bệnh

1.1.3 Triệu chứng và bệnh tắch

Thời gian nung bệnh khi gây bệnh thực nghiệm PCV2 cho lợn thường dao ựộng từ 2 - 4 tuần, virus có trong máu từ 7 - 14 ngày sau khi nhiễm Ngay sau khi xâm nhập vào cơ thể, PCV2 sẽ nhân lên ở hạch amidan và các hạch lympho ở vùng ựầu, tấn công tế bào lympho B; rồi từ ựó ựi ựến các cơ quan khác trong cơ thể như lách, mảng PayeỖr

Theo Segalés (2011), một số hội chứng ở lợn ñã ñược mô tả có liên quan ñến sự nhiễm PCV2; trong ñó, PMWS ñược mô tả nhiều nhất với tên gọi lúc ñầu là circovirosis, một số trường hợp khác là PDNS, hội chứng rối loạn

hô hấp, hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn, hội chứng viêm ruột ở lợn Hiện nay tên gọi phổ biến ñể mô tả các bệnh liên quan ñến PCV2 là “hội chứng liên quan ñến PCV2 (PCVAD)”

1.1.3.1 Hội chứng gầy còm ở lợn sau cai sữa (PMWS)

PMWS ñặc trưng bởi hiện tượng còi cọc, da nhợt nhạt, thở khó, ñôi khi

bị ỉa chảy (phân sẫm màu) và có chứng hoàng ñản Giai ñoạn ñầu bị bệnh các hạch lympho dưới da ñều bị sưng to

Tỷ lệ ốm thường dao ñộng từ 4 - 30% (ñôi khi lên ñến 50 - 60%), tỷ lệ chết khoảng từ 4 - 20% nhưng cũng có thể 50%

PMWS thường xảy ra ở lợn từ 7 - 16 tuần tuổi Do khi lợn mắc bệnh thường còi cọc và giảm hiệu quả kinh tế nên khoảng 70 - 80% lợn có triệu chứng PCVAD bị giết thịt

Bệnh tích ñặc trưng thường quan sát ñược là các hạch lympho bị sưng

to trong giai ñoạn ñầu của bệnh Bệnh tiến triển, hạch lympho trở lại kích thước bình thường và thậm chí bị teo nhỏ, tuyến ức bị teo Phổi có thể sưng

to, dai chắc như cao su, tương ứng với bệnh tích vi thể viêm kẽ phổi Nhiều trường hợp phế quản bị viêm tơ huyết

Một số lợn bị hoàng ñản trong giai ñoạn cuối của bệnh Gan bị sưng to hoặc teo nhỏ, nhạt màu, cứng, bề mặt có các hạt nhỏ

Thận có nốt hoại tử màu trắng (viêm kẽ thận không có mủ)

Bệnh tích vi thể cho thấy lợn mắc PMWS bị giảm tế bào lympho và thâm nhiễm tế bào khổng lồ ña nhân và tế bào mô (histiocyte) Phần vỏ tuyến

ức bị teo nhỏ Ngoài ra còn quan sát ñược các tiểu thể virus trong tế bào tua (dendritic cell) và tế bào mô

1.1.3.2 Hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS)

Hội chứng này ñược mô tả lần ñầu tiên vào năm 1993 tại Anh Tỷ lệ

nhiễm khoảng dưới 1% nhưng ñôi khi có thể cao hơn Tỷ lệ chết có thể lên ñến 100% ở ñàn lợn trên 3 tháng tuổi nhưng chỉ khoảng 50% với lợn nhỏ hơn PDNS xảy ra ở lợn con, lợn thịt và lợn trưởng thành (11 - 14 tuần tuổi) Lợn chết chỉ sau một vài ngày có biểu hiện triệu chứng lâm sàng Những con sống sót có thể tăng trọng trở lại sau 7 - 10 ngày

Bệnh xảy ra thường ghép với một số mầm bệnh khác như PRRSV,

Pasteurella multocida, Streptococcus suis type 1 và 2

Lợn mắc PDNS có biểu hiện mệt mỏi, ủ rũ, bỏ ăn, sốt (410C) hoặc không sốt, nằm một chỗ, lười vận ñộng và/hoặc ñi lại khó khăn, cứng nhắc Triệu chứng ñiển hình là trên da xuất hiện những ñám phát ban có màu ñỏ tía, không có hình dạng nhất ñịnh, bắt ñầu ở vùng chân sau và mông, có trường hợp nốt ban lại phân tán khắp cơ thể Bệnh tiến triển, hình thành ñám vẩy sẫm

ở những nơi có bệnh tích, sau ñó nhạt màu dần, ñôi khi ñể lại sẹo

Bệnh tích ñại thể là hiện tượng hoại tử và xuất huyết mô bào, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử mạch máu Hạch lympho, ñặc biệt là hạch vùng bụng có màu ñỏ, sưng to và có thể có chất lỏng chứa trong bụng

Khi lợn chết thể cấp tính, hai bên thận sưng to, trên bề mặt có nốt màu trắng, phù thũng bể thận, tương ứng với bệnh tích vi thể là viêm hoại tử có mủ tiểu cầu thận và viêm kẽ thận

Thường thì bệnh tích ở da và thận ñều xuất hiện khi lợn mắc PDNS, tuy nhiên có những trường hợp chỉ biểu hiện một trong hai bệnh tích trên

Hạch lympho thường bị sưng to, có màu ñỏ Lách bị nhồi huyết

1.1.3.3 Hội chứng rối loạn sinh sản liên quan ñến PVC2 ở lợn (PCV2 - Associated Reproductive Failure)

Hội chứng này ñược mô tả lần ñầu tiên tại Canada năm 1999, chủ yếu ảnh hưởng ñến lợn nái PVC2 có liên quan ñến hiện tượng sảy thai và thai chết

non, tuy nhiên trong thực tế hiếm gặp ðiều này có thể giải thích do tỷ lệ huyết thanh dương tính với PCV2 ở lợn trưởng thành cao và do ñó lợn sinh sản thường không mẫn cảm với bệnh Trong những trường hợp rối loạn sinh sản do PCV2, triệu chứng ñặc trưng là lợn sảy thai, chết yểu Mổ khám thai chết có hiện tượng gan xung huyết, tim sưng to, trên bề mặt có nhiều ñiểm hoại tử Bệnh tích vi thể rõ nhất là hiện tượng cơ tim bị viêm tơ huyết và/hoặc hoại tử

1.1.3.4 Hội chứng rối loạn hô hấp liên quan ñến PVC2 ở lợn (PCV2 - Associated Respiratory Disease)

Hội chứng này cũng ñóng vai trò gây bệnh ñường hô hấp phức hợp ở lợn Bệnh xảy ra ở lợn từ 8 - 26 tuần và thường cộng phát với một số nguyên nhân khác Triệu chứng bao gồm giảm khả năng tăng trọng, giảm chuyển hóa thức ăn, lợn mệt mỏi, sốt, ho và khó thở

Bệnh tích ñặc trưng gồm viêm kẽ phổi, phế quản viêm loét hoặc hoại tử nặng, phế nang viêm tơ huyết

1.1.3.5 Hội chứng viêm ruột liên quan ñến PVC2 ở lợn (PCV2 - Associated Enteritis)

Thường xảy ra ở lợn từ 8 - 16 tuần tuổi, gây chứng viêm hồi tràng mạn

tính có liên quan ñến Lawsonia intracellularis Lợn bị bệnh có triệu chứng

tiêu chảy, còi cọc, giảm tăng trọng và tăng tỷ lệ chết

Bệnh tích bao gồm viêm ruột dạng hạt, rõ nhất là ở các mảng Paye’r Hạch màng treo ruột bị sưng to, niêm mạc ruột tăng sinh dày lên

Ngoài ra, vai trò của PCV2 gây hội chứng thần kinh ở lợn (PCV2 - Associated Neuropathy) cần phải tiếp tục nghiên cứu làm rõ Năm 2001,

PCV2 ñược phát hiện có liên quan ñến hiện tượng lợn con sinh ra có triệu chứng run bẩm sinh và viêm màng não không có mủ Một số nghiên cứu gần ñây cho biết lợn bị nhiễm PCV2 có thể gây viêm mạch quản tiểu não và viêm xuất huyết màng não PCV2 còn liên quan ñến triệu chứng opisthotonus, chứng giật cầu mắt và co giật ở lợn từ 6 - 8 tuần tuổi (trích theo Gillespie và

cộng sự, 2009) Tuy nhiên theo một số tác giả khác PCV2 lại khơng cĩ liên quan gì đến hội chứng thần kinh ở lợn (trích theo Segalés, 2011)

1.1.3.6 Hiện tượng nhiễm PCV2 thể cận lâm sàng (PCV2 subclinical infection)

Dựa vào kết quả huyết thanh học cho thấy tỷ lệ nhiễm PCV2 là rất cao nhưng tỷ lệ lợn cĩ triệu chứng lâm sàng thấp hơn rất nhiều, điều đĩ cĩ nghĩa bệnh do PCV2 gây ra biểu hiện ở thể cận lâm sàng (Segalés, 2011) PCV2 cĩ thể nhiễm trong 1 - 2 hạch lympho nhưng lợn khơng cĩ triệu chứng điển hình Tuy nhiên, sự nhiễm PCV2 này sẽ làm giảm hiệu quả việc sử dụng vacxin; bên cạnh đĩ, mặc dù lợn khỏe mạnh nhưng vẫn cĩ hiện tượng hạch lympho bị sưng to, viêm hoại tử nên cĩ trường hợp phải hủy bỏ thân thịt khi giết mổ

1.1.4 Chẩn đốn

1.1.4.1 Chẩn đốn lâm sàng

ðể chẩn đốn PCVAD chủ yếu dựa vào lịch sử đàn và triệu chứng lâm sàng, đặc biệt tỷ lệ mắc và chết do PMWS Cần chẩn đốn phân biệt triệu chứng hơ hấp ở lợn mắc bệnh “Tai xanh” với hội chứng PMWS Trong trường hợp PDNS, cần chẩn đốn phân biệt với một số nguyên nhân gây viêm

da cũng như các bệnh gây xuất huyết ở thận; đặc biệt phải chẩn đốn phân biệt với bệnh dịch tả lợn cổ điển, dịch tả lợn Châu Phi Bên cạnh đĩ, cũng cần phân biệt hội chứng rối loạn sinh sản do PCV2 với các bệnh gây sảy thai và con chết yểu

Chẩn đốn Hội chứng gầy cịm ở lợn sau cai sữa (PMWS)

ðể chẩn đốn PMWS, cần dựa vào một số thơng tin sau:

- Lợn cịi cọc, chậm lớn, khĩ thở, hạch lympho vùng bẹn bị sưng to, đơi khi cĩ chứng vàng da

- Các tổ chức lympho cĩ bệnh tích đặc trưng từ nặng đến trung bình

- Trong tổ chức lympho và các mơ bào của lợn bệnh cĩ thể xác định được một số lượng PCV2 từ cao đến trung bình

Chẩn đốn Hội chứng viêm da và viêm thận (PDNS)

ðể chẩn đốn PDNS, cĩ thể dựa vào một số thơng tin sau:

- Da bị xuất huyết và hoại tử, bắt đầu ở vùng chân sau và mơng; thận bị sưng to, nhạt màu với các nốt xuất huyết ở vỏ thận

- Hoại tử mạch máu, viêm hoại tử cĩ mủ tiểu cầu thận

Chẩn đốn Hội chứng rối loạn sinh sản ở lợn

Cĩ thể dựa vào một số thơng tin sau để chẩn đốn:

- Sảy thai và thai chết non, đơi khi thấy tim của con non bị sưng to

- Cơ tim bị viêm tơ huyết và/hoặc hoại tử

- Trong cơ tim và tổ chức cĩ bệnh tích của con non chết vì bệnh cĩ thể xác định được một số lượng lớn PCV2

1.1.4.2 Chẩn đốn khẳng định

Do PCV2 phân bố rộng rãi trong quần thể lợn, cĩ thể tìm thấy ở lợn khỏe mạnh cũng như lợn bệnh nên việc chẩn đốn khẳng định là rất cần thiết Theo Gillespie và cộng sự (2009), để chẩn đốn PCVAD cĩ thể dựa vào triệu chứng lâm sàng và chứng minh sự cĩ mặt của kháng nguyên PCV2 trong 1

mơ lympho hoặc trong 1 mơ lympho và 1 khí quan của cơ thể như phổi, gan, thận, ruột hoặc trong 2 khí quan của cơ thể Nếu kháng nguyên chỉ được tìm thấy trong 1 khí quan, bệnh sẽ được xếp loại dựa vào khí quan đĩ Nếu chỉ phát hiện được ít kháng nguyên PCV2 nhưng biến đổi bệnh tích của khí quan rất trầm trọng thì được xếp vào dạng PCVAD nặng mạn tính (chronic sereve PCVAD) Trong một nghiên cứu về biến đổi của lợn mắc PCVAD ở các trang trại cho thấy 98,1% lợn cịi cọc; 77,2% lợn bị tiêu chảy; 75,1% lợn bị khĩ thở; 44,8% lợn bị sưng và thủy thũng hạch lympho; 39,6% lợn cĩ triệu chứng thần kinh; 37,1% lợn cĩ triệu chứng hồng đản; 90,4% lợn bỏ ăn và tỷ lệ chết 96,8%

ðể chẩn đốn PCVAD việc xác định kháng nguyên PCV2 được coi là

"gold standard" với phương pháp được sử dụng phổ biến hiện nay là kỹ thuật PCR, insituhybridization (ISH) hoặc hĩa mơ miễn dịch (immunohistochemistry-IHC)

Opriessnig và cộng sự (2007) cho biết kỹ thuật PCR được sử dụng gồm: 1) Multiplex PCR: cĩ thể xác định một số sản phẩm PCR được nhân lên; 2) Nested PCR: giúp tăng khả năng xác định một lượng nhỏ sản phẩm PCR được nhân lên; 3) Multiplex-nested PCR: dùng để phát hiện đồng thời PCV1/PCV2/PPV và PCV1/PCV2; 4) Quantitative real - time PCR: để xác định lượng PCV2 genomic copy trong huyết thanh hoặc mơ bào; 5) Reverse transcription PCR: để xác định PCV2 RNA cĩ mặt khi PCV2 nhân lên Theo Segalés (2011), sử dụng kỹ thuật "real time quantitative PCR" xác định số lượng kháng nguyên (và/hoặc nucleic acid) trong 1ml huyết thanh hoặc trong 500ng mơ bào của phơi cũng rất cĩ ý nghĩa, cĩ thể chẩn đốn được bệnh do PCV2 gây ra Tuy nhiên, phương pháp này mới chỉ được áp dụng giới hạn ở một số phịng thí nghiệm

Chẩn đốn huyết thanh học rất cĩ ý nghĩa trong việc xác định sự phơi nhiễm PCV2 trong quần thể lợn Tuy nhiên, vì nhiều lợn khỏe mạnh cĩ kháng thể dương tính nên nếu dùng để chẩn đốn PCVAD thì sẽ khơng phân biệt được đàn cĩ bệnh và đàn khơng cĩ bệnh Các phương pháp thường được sử dụng là ELISA (Enzyme – Linked Immunosorbent Assay), miễn dịch huỳnh quang gián tiếp, phản ứng IPMA (immunoperoxidase monolayer assay), phản ứng trung hịa virus Ngồi ra cĩ thể chẩn đốn PCVAD dựa vào biến đổi các bệnh lý vi thể, phân lập virus, hoặc sử dụng kính hiển vi điện tử phát hiện sự cĩ mặt của PVC2

1.1.5 Phịng bệnh

1.1.5.1 Vệ sinh phịng bệnh

PCVAD được coi là do nhiều nguyên nhân gây ra, trong đĩ cĩ vai trị của các yếu tố mơi trường; ngồi ra cịn phải kể đến vai trị của một số vi khuẩn và virus đồng nhiễm khác

Việc bổ sung vitamin E và Se vào thức ăn cĩ thể giúp trang trại phịng PMWS cĩ hiệu quả

Cách phòng ngừa hợp lý và hữu hiệu nhất ñược khuyến cáo ñể phòng bệnh do PCV2 gây ra là:

- Hạn chế sự thăm viếng chuồng trại nhằm giảm thiểu nguy cơ làm lây bệnh cho ñàn lợn; khi vào chuồng nái bắt buộc phải thay ủng và quần áo

- Thực hiện biện pháp chăn nuôi cùng vào - cùng ra Chăn nuôi với mật

ñộ hợp lý

- Có chương trình diệt trừ chuột, ruồi muỗi giúp hạn chế lây lan mầm bệnh;

- ðịnh kỳ phun tiêu ñộc khử trùng chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi bằng các loại thuốc sát trùng Phân, nước tiểu, chất thải trong chăn nuôi phải ñược thu gom xử lý bằng các phương pháp thích hợp Kiểm soát tốt các nguồn nguyên vật liệu khi ñưa vào trang trại

- Lợn mua về cần ñược kiểm dịch, phải tôn trọng quy tắc cách ly triệt ñể lợn mới mua về Trong thời gian cách ly ñảm bảo lợn không bị bệnh hoặc kết quả kiểm tra huyết thanh ñảm bảo mới ñược phép nhập ñàn

- Chăm sóc nuôi dưỡng tốt ñàn lợn nhằm nâng cao sức ñề kháng cho ñàn lợn, tránh stress, tạo môi trường thuận lợi ñể lợn sinh trưởng phát triển

Theo Gillespie và cộng sự (2009) việc sử dụng kháng sinh (ví dụ sử

dụng chlorotetracycline ñể ñiều trị bệnh do M hyopneumoniae gây ra) có thể

giúp phòng ñược bệnh do PCV2 gây ra rất hiệu quả Ngược lại, một số yếu tố khác như sự nhiễm PRRSV và PPV, quy mô ñàn cai sữa lớn, việc sử dụng vacxin phòng PRRS lại là nguy cơ làm cho PCVAD phát sinh; vì vậy việc giảm các yếu tố nguy cơ này sẽ giúp hạn chế bệnh

1.1.5.2 Phòng bệnh bằng vacxin

Bằng thực nghiệm người ta thấy rằng việc kích hoạt hệ miễn dịch của

cơ thể khi tiêm phòng vacxin PCV2 là một yếu tố rất quan trọng thúc ñẩy khiến cho PMWS xảy ra ở nhiều trang trại; tuy nhiên không thể không tiêm phòng vacxin cho ñàn lợn do nguy cơ từ việc không tiêm phòng sẽ lớn hơn rất nhiều so với thiệt hại do PMWS Vì vậy, cần xác ñịnh thời ñiểm lợn có nguy

cơ bị nhiễm circovirus ñể xây dựng lịch sử dụng vacxin thích hợp Vacxin sẽ giúp giảm tỷ lệ chết và cải thiện khả năng tăng trọng của ñàn lợn Khi tiêm vacxin cho lợn sẽ sản sinh kháng thể trung hòa, giúp giảm số lượng PCV2 trong cơ thể, từ ñó giảm ñược lượng virus bài thải ra ngoài môi trường và hạn chế ñược bệnh truyền ngang (Segalés và cộng sự, 2005)

Một nghiên cứu gần ñây nhất tại Pháp so sánh giữa hai lô lợn nái ñược tiêm và không tiêm vacxin Circovac thì tỷ lệ sảy thai giảm từ 7,3% xuống còn 3,6%; tỷ lệ thụ thai tăng gần 7% (90,5% so với 83,9 %) (The pigsite.com, 2012)

Việc tiêm vacxin sẽ giúp giảm khả năng nhiễm virus cũng như nguy cơ mắc chứng còi cọc sau cai sữa Kun Yang và cộng sự (2012) khi thử nghiệm vacxin vô hoạt PCV2 cho lợn con 28 ngày tuổi cho thấy tỷ lệ lợn có bệnh tích

ñã giảm rõ rệt so với lợn không tiêm vacxin

Hiện nay có vacxin vô hoạt phòng bệnh do PCV2 gây ra, dùng cho lợn nái và lợn hậu bị giúp giảm tỷ lệ mắc PMWS; lợn con bú sữa ñầu có kháng thể thụ ñộng giúp phòng bệnh Ngoài ra còn có nhiều nghiên cứu sản xuất vacxin tái tổ hợp, vacxin ADN giúp phòng bệnh do PCV2 gây ra Tuy nhiên

do ñây là phương pháp miễn dịch thụ ñộng, lợn con khi mới ñẻ bú sữa ñầu sẽ ñược nhận kháng thể từ sữa mẹ nên cần phải chăm sóc thật tốt lợn trong quá trình sinh ñẻ, cố ñịnh vú cho lợn con sau khi sinh, cho lợn con bú sữa ñầu càng sớm càng tốt

Thời gian bán hủy của kháng thể thụ ñộng ở lợn là 19 ngày và lượng kháng thể thụ ñộng này sẽ không còn ở các ñộ tuổi lợn khác nhau tùy thuộc vào lượng kháng thể thụ ñộng từ mẹ (từ 4 - 6 tuần tuổi nếu ít kháng thể thụ ñộng; từ 6 - 10 tuần nếu lượng kháng thể thụ ñộng ở mức trung bình và 8,5 - 13,5 tuần nếu nhiều kháng thể thụ ñộng) Lợn con theo mẹ (< 4 tuần tuổi) thường không có triệu chứng lâm sàng do ñược bảo hộ bởi kháng thể thụ ñộng (Gillespie và cộng sự, 2009) Bằng thực nghiệm người ta ñã chứng minh ñược khả năng bảo hộ phụ thuộc vào lượng kháng thể thụ ñộng Khi lượng kháng thể thụ ñộng cao thì mức bảo hộ tốt hơn khi mức kháng thể thấp, tuy

nhiên không hoàn toàn bảo vệ lợn chống lại bệnh do PCV2 gây ra; nhưng nếu hiệu giá kháng thể thụ ñộng thấp thì chắc chắn không bảo hộ ñược lợn (McKeown và cộng sự, 2005)

Tại Việt Nam, một số loại vacxin có thể sử dụng ñể phòng bệnh do circovirus gây ra như:

- Vacxin Circovac (Merial): tiêm cho lợn nái liều lượng 2ml/con/lần,

lịch trình như sau: Lợn hậu bị: tiêm 2 mũi, cách nhau 3 - 4 tuần, mũi thứ 2 chậm nhất 2 tuần trước khi phối; Lợn nái: tiêm 2 mũi cách nhau 3 - 4 tuần, mũi thứ 2 chậm nhất 2 tuần trước khi ñẻ Tiêm nhắc lại: ñối với các lứa tiếp theo, tiêm 1 mũi trước khi ñẻ 2 - 4 tuần

Chú ý chỉ sử dụng vacxin trong vòng 3 giờ sau khi pha

- Vacxin Porcilis PVC (Intervet): tiêm cho lợn con liều lượng 2ml/lần, lịch

trình như sau: lần thứ nhất tiêm vào lúc 3 tuần tuổi, tiêm nhắc lại sau 3 tuần Thử nghiệm trên 35.000 lợn của 21 trại, người ta ñã chứng minh ñược những ñàn sử dụng vacxin thì tỷ lệ chết ñã giảm ñược 77,5% so với những ñàn không tiêm

- Vacxin Circumvet PCV (Intervet): là vacxin ñược sản xuất theo công

nghệ “vector” (vacxin thể ORF2) tiên tiến nhất nên chứa ñược kháng nguyên bảo hộ cao, ñáp ứng miễn dịch tối ña

Vacxin dùng cho lợn con khỏe mạnh từ 3 tuần tuổi trở lên (tiêm bắp với liều lượng 2ml/con, tiêm nhắc lại sau 3 tuần), có tác dụng giảm tỷ lệ chết, phòng circovirus lưu hành trong máu và ngăn chặn bài xuất virus ra ngoài môi trường

- Vacxin Ingelvac Circoplex (Boehringer Ingelheim): là vacxin PCV2

ORF2 protein ñược gắn trên baculovirus vô hoạt

Vacxin dùng ñể tiêm bắp (liều lượng 1ml/con) cho lợn khỏe mạnh từ 3 tuần tuổi trở lên, giúp tăng cường mô lympho, hạn chế hiện tượng viêm và số lượng PCV2 trong mô bào ðộ dài miễn dịch kéo dài 4 tháng

Kết quả thử nghiệm tại Canada cho thấy khi lợn ñược tiêm vacxin tỷ lệ chết ñã giảm rõ rệt so với ñối chứng (P<0,003) (Opriessnig và cộng sự, 2007)

- Vacxin Suvaxyn ® PCV2 One Dose TMm (Fort Dodge Animal Health): là

vacxin vô hoạt kết hợp PCV1-2

Vacxin dùng ñể tiêm bắp (liều lượng 2 ml/con) cho lợn khỏe mạnh từ 4 tuần tuổi trở lên, giúp tăng cường mô lympho, không bị ảnh hưởng bởi PCV2

ðộ dài miễn dịch kéo dài 4 tháng

Kết quả thử nghiệm tại Mỹ cho thấy khi lợn ñược tiêm vacxin tỷ lệ chết

và chi phí ñiều trị ñã giảm rõ rệt so với ñối chứng (P<0,001) (Opriessnig và cộng sự, 2007)

- Pro-vac Circomaster Vac (Komipharm international): là vacxin tiểu

phần tái tổ hợp dùng phòng các bệnh do PCV2 gây ra, lịch sử dụng như sau: + Nái mang thai:

Mới tiêm vacxin Circo lần ñầu: tiêm bắp 2 lần, mỗi lần 2ml vào lúc 4 -

5 tuần và 2 - 3 tuần trước khi sinh Tiêm lứa kế tiếp trở ñi: tiêm bắp 1 lần 2ml vào lúc 2 - 3 tuần trước khi sinh

+ Lợn con:

Nếu sinh ra từ lợn mẹ ñã tiêm phòng: tiêm bắp 1 lần 2ml lúc 4 - 5 tuần tuổi Nếu lợn mẹ chưa tiêm phòng: tiêm bắp 2 lần, mỗi lần 1ml vào lúc 3-4 tuần và 5 - 6 tuần tuổi

- SuiShot ® Circo One (Choongang vaccine laboratory): tiêm bắp ở gốc

tai cho lợn con khỏe mạnh từ 2 – 3 tuần tuổi (liều lượng tiêm 2ml/con)

- Circo Pig Vac (Daesung Microbiological Lab): tiêm 1 liều duy nhất

(1ml/con) cho lợn con lúc 1 ngày tuổi ñến 3 tuần tuổi

Tại Việt Nam, Trần Thị Dân và cộng sự (2010) thử nghiệm vacxin thể ORF2 cho thấy lợn ñược chủng ngừa vacxin không thay ñổi các chỉ tiêu huyết học và ít bệnh tích liên quan ñến PCV2 so với lợn không tiêm Hiệu quả kinh

tế ñược cải thiện ở lô thí nghiệm (tiêm vacxin) so với lô ñối chứng (không tiêm vacxin) trong ñiều kiện trại nhiễm circovirus

1.1.6 ðiều trị

Bệnh do virus nên không có thuốc ñiều trị ñặc hiệu Tuy nhiên, theo Ferreira và cộng sự (2001) ñã thử nghiệm dùng kháng huyết thanh ñể ñiều trị nhưng hiệu quả rất khác nhau Một khi hội chứng phát sinh trên một nhóm lợn thì ñiều trị thường không có hiệu quả cao Lợn khoảng 15 - 40 kg ñiều trị với Chlotetracycline trộn vào thức ăn có thể giảm sự phát triển của hội chứng,

do có liên quan tới sự suy yếu của các vi khuẩn kế phát gây bệnh

1.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PCV2 và bệnh do PCV2 gây ra

1.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, PCV2 ñược phát hiện ở một số tỉnh thành phía Nam từ năm 2000 với tỷ lệ nhiễm 38,97% nhưng ñến 2006 tỷ lệ nhiễm ñã tăng ñến 96,47%, chứng tỏ PCV2 ñang lưu hành phổ biến trong chăn nuôi lợn (Nguyễn Thị Thu Hồng và cộng sự, 2006) và là một trong những nguyên nhân gây còi cọc lợn con cai sữa ở một số trại lợn tại thành phố Hồ Chí Minh (trích theo Nguyễn Thị Thu Hồng và cộng sự, 2010) Một số nghiên cứu của các tác giả như Lam Thu Huong và Duong Chi Mai (2006); Lê Tiến Dũng (2006) ñều cho thấy có sự lưu hành của PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại thành phố Hồ Chí Minh (trích theo Nguyễn Thị Thu Hồng và cộng sự, 2008)

Tại Viện Thú y, Nguyễn Viết Không và cộng sự tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nhiễm Porcine circovirus 2 (PCV2) ở lợn ñến ñáp ứng miễn dịch tiêm phòng vacxin dịch tả lợn và biện pháp khắc phục Kết quả bước ñầu cho thấy ñã xác ñịnh và phân lập ñược PCV2 ở ñàn lợn nuôi tại một số tỉnh như

Hà Nội, Bắc Giang, Hà Nam, Phú Thọ (tài liệu chưa công bố, 2012)

Tuy nhiên, các nghiên cứu thường tập trung vào xác ñịnh tỷ lệ lưu hành, phân lập và ñánh giá mức ñộ ảnh hưởng của PCV2 ñến ñáp ứng miễn dịch tại một số ñịa phương Vì vậy, việc xác ñịnh genotype và so sánh mức ñộ tương ñồng với các chủng PCV2 của khu vực cũng như trên thế giới, giúp ñề xuất biện pháp sử dụng vacxin có hiệu quả là một việc làm cần thiết

1.2.2 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Tính ñến năm 2010, các nước trên thế giới ñã có công trình nghiên cứu

về PCV2 bằng kỹ thuật huyết thanh học hoặc sinh học phân tử như sau (bảng 1.2) (Patterson và Opiessnig, 2010)

Bảng 1.2 Những nghiên cứu về PCV2 trên thế giới

PCV2 ựược ghi nhận ở rất nhiều nước trên thế giới và bệnh PMWS ựã ựươc chẩn ựoán ở cả 5 châu lục Hiện nay, các kết quả nghiên cứu ựã xác ựịnh ựược tỷ lệ lưu hành huyết thanh kháng PCV2, phân lập và xác ựịnh genotype cũng như ựánh giá ựược ựặc tắnh di truyền và dịch tễ học phân tử của PCV2 Căn cứ vào kết quả giải trình tự gen, người ta chia PCV2 thành 5 genotype, ký hiệu từ PCV2a-2e Tuy nhiên, theo Segalés và cộng sự (2008), chỉ có 3 genotype PCV2a, PCV2b và PCV2c ựược chắnh thức công nhận PCV2a và PCV2b là hai genotype lưu hành phổ biến nhất, ựã ựược ghi nhận ở nhiều nơi trên thế giới; PCV2c ựược phát hiện ở đan Mạch (Dupont và cộng

sự, 2008), và gần ựây PCV2d và PCV2e mới ựược thông báo có ở Trung Quốc (Wang và cộng sự, 2009; Guo và cộng sự, 2010)

Sự phân bố của PCV2 có sự khác nhau giữ các vùng ựịa lý:

- Châu Á: lần ựầu tiên một vụ dịch gần giống PMWS ựược mô tả tại đài Loan năm 1995; từ ựó ựến nay nhiều vụ dịch PMWS ựã ựược ghi nhận ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Philippine, đài Loan và Thái Lan (trắch theo Hinton, 2003) PCV2 và PCVAD ựã ựược xác ựịnh lưu hành trong ựàn: ở Nhật Bản năm 1997 (Takahagi và cộng sự, 2008), ở Hàn Quốc năm 1999 (An

và cộng sự, 2007), ở Thái Lan năm 1998 (Jantafong và cộng sự, 2011), Malaysia năm 2004 (Jaganathan và cộng sự, 2011)

Wang và cộng sự (2009) tiến hành giải trình tự 49 chủng phân lập từ một số tỉnh của Trung Quốc, và ựã xác ựịnh thuộc genotype PCV2a, PCV2b, PCV2d và PCV2e; trong khi ựó tại Hàn Quốc và Nhật Bản chỉ phát hiện ựược PCV2a và PCV2b (Chae và Choi, 2010; Takahagi và cộng sự, 2008), tại Thái Lan phát hiện ựược PCV2b và PCV2e (Jantafong và cộng sự, 2011)

- Châu Âu: hầu hết các nước xác ựịnh sự có mặt của PCV2b, là nguyên nhân gây thiệt hại kinh tế do PCVAD; ngoài ra, Allan và cộng sự (2007) còn phát hiện ựược PCV2a ở ựàn lợn nuôi tại Ireland

- Bắc Mỹ: lần ựầu tiên PCV2b ựược xác nhận ở Canada vào năm 2005

Các nghiên cứu sau này ñã cho thấy sự lưu hành của PCV2a và PCV2b trong khu vực (Olvera và cộng sự, 2007; Gagnon và cộng sự, 2007)

- Châu ðại Dương: hiện tại có một số công bố của Muhling và cộng sự (2006) về sự lưu hành PCV2 tại Úc; nghiên cứu của O'Dea và cộng sự (2011)

về PCVAD tại Úc; nghiên cứu của Neumann và cộng sự (2007) về PCV2 phân lập ñược tại New Zealand Tuy nhiên, các nghiên cứu ñều chưa chỉ ra genotype lưu hành trong khu vực

- Nam Mỹ: không có nhiều nghiên cứu về PCV2, ñã xác ñịnh genotype phổ biến là PCV2b (Chiarelli Neto và cộng sự, 2009); cần có các nghiên cứu tiếp theo ñể khẳng ñịnh sự có mặt của genotype PCV1/2a (Gagnon và cộng sự, 2010)

CHƯƠNG 2 NỘI DUNG - NGUYÊN LIỆU PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðối tượng nghiên cứu

PCV2 lưu hành ở đàn lợn nuơi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

2.2 ðịa điểm

Mẫu được lấy tại các trang trại, nơng hộ chăn nuơi lợn tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam gồm Hà Nội, Hịa Bình, Bắc Giang và Hải Dương

ðịnh genotype và giải trình tự được thực hiện tại Bộ mơn VSV-TN khoa Thú y, trường ðHNN Hà Nội và phịng thí nghiệm virus, ðH Thú y thuộc trường ðH Quốc gia Seoul

2.3 Nội dung nghiên cứu

- Xác định genotype của PCV2 lưu hành ở đàn lợn nuơi tại một số tỉnh miền Bắc Việt Nam

- Giải trình tự một số chủng PCV2 đại diện

- Xác định mối liên hệ (dựa trên trình tự gen) với các genotype lưu hành trong khu vực và trên thế giới

- Phân tích, so sánh trình tự nucleotide, amino acid giữa các chủng giải trình tự được và các chủng lưu hành trên thế giới

2.4 Nguyên liệu

- Mẫu nghiên cứu: huyết thanh và bệnh phẩm của lợn

- Các loại dụng cụ, sinh phẩm và hĩa chất dùng trong phản ứng PCR, giải trình tự gen

- Chủng PCV2a và PCV2b chuẩn do Phịng thí nghiệm virus học, Trường đại học Thú y, ðại học Quốc gia Seoul cung cấp, gồm PCV2b (cluster 1A): A4058 và PCV2a (cluster 2E): A5293

- Mẫu bệnh phẩm hồi cứu của lợn do phịng virus, Trung tâm chẩn đốn Thú y Trung ương, Cục Thú y cung cấp

- Kit i-StarMaster (iNtRON Biotechnology)

- Các trang thiết bị khác (tủ lạnh, nồi hấp, máy PCR, máy li tâm ) của phịng thí nghiệm được sử dụng phục vụ nghiên cứu

2.5 Phương pháp nghiên cứu

2.5.1 Phương pháp tính tốn dung lượng mẫu

Dựa vào thuật tốn thống kê (sử dụng phần mềm WinEpiscope 2.0)

2.5.2 Phương pháp thu thập mẫu huyết thanh, mẫu bệnh phẩm

Lợn được lấy mẫu ở mọi lứa tuổi, chưa được tiêm vacxin phịng bệnh

do PCV2 gây ra

- Huyết thanh: được lấy ngẫu nhiên từ lợn khỏe mạnh hoặc cĩ triệu chứng PCVAD (tiêu chảy, cĩ triệu chứng hơ hấp, cịi cọc…) Dùng xi lanh lấy máu tĩnh mạch tai hoặc vịnh tĩnh mạch cổ, để 1-2 giờ cho máu đơng tự nhiên (hoặc để 1 giờ ở 370C), sau đĩ để qua đêm ở 40C Tiến hành chắt huyết thanh vào ống eppendorf và bảo quản ở -200C cho đến khi kiểm tra

- Bệnh phẩm: gồm gan, hạch amidan, hạch lympho, thận, lách, phổi, ruột của lợn cĩ triệu chứng PCVAD (tiêu chảy, cĩ triệu chứng hơ hấp, cịi cọc…) Bệnh tích khi mổ khám thường quan sát được là hạch lympho sưng, xuất huyết; phổi viêm Mẫu thu được sẽ được tiến hành đồng nhất mẫu và bảo quản ở -200C cho đến khi kiểm tra

Ngồi ra chúng tơi cịn lấy mẫu bệnh phẩm (gan, lách, hạch lympho ) của lợn khỏe mạnh để làm đối chứng, đồng nhất và bảo quản mẫu ở -200C

2.5.3 Phương pháp nested PCR chẩn đốn PCV2 trong bệnh phẩm

Nghiên cứu này ứng dụng kỹ thuật nested PCR nhằm tăng độ nhạy và

độ đặc hiệu của phương pháp PCR để xác định sự cĩ mặt của PCV2

- Outer PCR (PCR vịng ngồi) được thực hiện bởi cặp mồi CV1 (mồi xuơi, forward) và CV2 (mồi ngược, reverse), cho sản phẩm 987bp Sản phẩm này sẽ được sử dụng trong giải trình tự gen

- Vị trí bắt mồi ñược thiết kế bắt cặp với vùng ổn ñịnh (conserved regions) ở ñầu ORF1 và ORF2

- Sản phẩm outer PCR sẽ ñược dùng như sợi khuôn trong phản ứng nested PCR Inner PCR ñược thực hiện với cặp mồi VF2 (mồi xuôi) và VR2 (mồi ngược) tổng hợp sản phẩm 359bp

Thiết kế nested PCR có thể tận dụng ñược sản phẩm outer PCR cho giải trình tự

Sơ ñồ vị trí mồi và sản phẩm nested PCR ñược minh họa ở hình 2.1

Hình 2.1 Sơ ñồ vị trí mồi phản ứng nested PCR

Hóa chất dùng tách chiết ADN tổng số gồm: (1) dung dịch ly giải mẫu

có chứa 27% sucrose, 15 mM trisodium citrate, 0,15 M NaCl, 1 mM ethylene diaminetetraacetic acid, 1% sodium dodecyl sulphate, 200 µg/ml proteinase

K; (2) phenol-chloroform-isoamyl alcohol (25:24:1); (3) isopropyl; (4) cồn 70%; (5) dung dịch ñệm TE (pH=8)

Sinh phẩm, hóa chất dùng cho phản ứng nested PCR: (1) hot start PCR kit (i-StarMaster, iNtRON Biotechnology, Korea); (2) cặp mồi ñặc hiệu dùng cho phát hiện và ñịnh type PCV2 do hãng BioNERR sản xuất ñược lựa chọn dựa theo các nghiên cứu ñã công bố trước ñây (bảng 2.1)

Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi của phản ứng nested PCR ñể xác ñịnh genotype

và giải trình tự PCV2

Primer Trình tự mồi (5 ’ - 3 ’ )

Kích thước sản phẩm (bp)

Vị trí nucleotide

Tài liệu tham khảo

CV2-reverse TCT TCC AAT CAC GCT TCT GC

987

530-549

CV4-reverse TGG GCG GTG GAC ATG ATG AG

1092

1525-1544

Fenaux

và cs, 2000

PCV2- VR2 CTC ACA GCA GTA GAC AGG T

359

403-421

Yang và

cs, 2003 PCV2a Inner-F GGG TAT AGA GAT TTT GTT GGT C 1460-1481

PCV2a Inner-R GCA CCT TCG GAT ATA CTG TC

125

1584-1603 PCV2b Inner-F CAC AGA GCG GGG GTT TGA GC 1462-1481

PCV2b Inner-R CCG TTA CCG CTG GAG AAG GA

Mẫu: nếu là huyết thanh cĩ thể trộn tối đa là 4 mẫu huyết thanh; nếu là bệnh phẩm tiến hành kiểm tra riêng với từng mẫu đã được đồng nhất

- Rửa mẫu bằng cồn 70%: 1ml Ly tâm, 12.000 vịng/15 phút, ở nhiệt

độ 40C Loại bỏ hết cồn ðể khơ ở nhiệt độ phịng 15 phút

(5) Cặn ADN được hịa tan trong 30 µl dung dịch đệm TE, để 5 phút, tiến hành trộn đều

Pha hỗn hợp trong 1 eppendorf mới: 17 µl i star Master mix solution + 1 µl mồi xuơi + 1 µl mồi ngược + 1 µl mẫu đã cho TE buffer

Trộn đều, tiến hành chạy PCR

2.5.3.2 Phương pháp nested PCR chẩn đốn và định genotype PCV2

Các bước thực hiện gồm: (1) tổng hợp sản phẩm PCR vịng ngồi sử dụng cặp mồi đặc hiệu CV1/CV2 chung cho các genotype; (2) xác định sự cĩ mặt của PCV2 với cặp mồi VF2/VR2 chung cho tất cả genotype; (3) định type bằng cặp mồi đặc hiệu genotype 2aF/2aR (PCV2a) và 2bF/2bR (PCV2b) Thành phần phản ứng PCR được phối trộn theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Chu trình nhiệt của phản ứng được trình bày ở bảng 2.2

Bảng 2.2 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR chẩn đốn và

định type PCV2

của phản ứng

Nhiệt độ ( 0 C)

Thời gian (giây)

Số vịng lặp

Sản phẩm PCR được phân tích bằng phương pháp điện di trong thạch agarose 1,5% cĩ bổ sung 0,5 µg/ml ethidium bromide

2.5.4 Phương pháp giải trình tự gen

Tồn bộ hệ gen của PCV2 được tiến hành giải trình tự theo mơ tả của Fenaux và cộng sự, 2000; Larkin và cộng sự, 2007