Điều tra và xác định bệnh xoăn vàng lá cà chua tại một số tỉnh đồng bằng sông hồng năm 2012 2013

tên theo cây ký chủ tomato và triệu chứng chủ yếu dưới 2 dạng xoăn lá leaf curl và biến vàng yellow nên tên virus gây bệnh thường là “Tomato yellow leaf curl virus” và tên các isolate vi

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

VŨ HỮU TUỆ

ðIỀU TRA VÀ XÁC ðỊNH BỆNH XOĂN VÀNG LÁ

CÀ CHUA TẠI MỘT SỐ TỈNH ðỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

NĂM 2012 - 2013

LUẬN VĂN THẠC SĨ

HÀ NỘI - 2013

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO

TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

-*** -

VŨ HỮU TUỆ

ðIỀU TRA VÀ XÁC ðỊNH BỆNH XOĂN VÀNG LÁ

CÀ CHUA TẠI MỘT SỐ TỈNH ðỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

LỜI CAM ðOAN

Tôi xin cam ñoan rằng, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ một học vị nào

Tôi xin cam ñoan rằng, mọi sự giúp ñỡ cho việc thực hiện luận văn này

ñã ñược cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñược chỉ rõ nguồn gốc

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Tác giả

Vũ Hữu Tuệ

LỜI CẢM ƠN

ðể hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi nhận ñược rất nhiều sự quan tâm giúp ñỡ nhiệt tình của các thầy cô, bạn bè, người thân và các cơ quan ñơn vị

Trước tiên tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong khoa Nông học, cán bộ trung tâm bệnh cây nhiệt ñới và ban sau ñại học trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội ñã trực tiếp giảng dạy, trang bị những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian qua ðặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Hà Viết Cường người ñã tận tình hướng dẫn, giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong quá trình thực hiện ñề tài và hoàn thiện luận văn

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè, và người thân giúp ñỡ tôi tận tình trong thời gian thực hiện ñề tài

Hà Nội, ngày tháng năm 2013

Vũ Hữu Tuệ

MỤC LỤC

LỜI CAM ðOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC BẢNG v

DANH MỤC BIỂU ðỒ vii

DANH MỤC HÌNH ẢNH viii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ix

MỞ ðẦU 1

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU 3

1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước 3

1.1.1 Triệu chứng bệnh 3

1.1.2 Tác nhân gây bệnh là một phức hợp loài 3

1.1.3 Hình thái của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua 5

1.1.4 ðặc ñiểm bộ gen của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua 5

1.1.5 Lan truyền của begomovirus 7

1.1.6 Môi giới truyền bệnh virus TYLCV: bọ phấn (Bemisia tabaci) 8

1.1.7 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculatiion 9

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 12

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15

2.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 15

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu 15

2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 15

2.2 Vật liệu nghiên cứu 15

2.2.1 Thu thập mẫu, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới 15

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu 15

2.3 Nội dung nghiên cứu 16

2.4 Phương pháp nghiên cứu 16

2.4.1 Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng ruộng 16

2.4.2 Phương pháp thu thập, bảo quản mẫu bệnh virus hại cà chua 16

2.4.3 Lây nhiễm nhân tạo bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng bọ phấn 17

2.4.4 Lây nhiễm nhân tạo bằng agroiculation 17

2.4.5 Giám ñịnh virus bằng ELISA 18

2.4.6 Phương pháp giám ñịnh virus gây bệnh bằng phương pháp PCR 19

2.5 Phương pháp tính và xử lý số liệu 21

2.5.1 ðiều tra ngoài ñồng ruộng 21

2.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới 22

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 23

3.1 Kết quả ñiều tra bệnh do virus hại cà chua tại Hà Nội và một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hống năm 2012 - 2013 23

3.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh 23

3.1.2 Tình hình bệnh virus hại cà chua dựa vào loại hình triệu chứng tại một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng năm 2012 – 2013 25

3.1.3 Kết quả ñiều tra tình hình bệnh xoăn vàng lá cà chua và mật ñộ bọ phấn trên cà chua tại Hà Nội và một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng năm 2012 - 2013 27

3.2 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng phương pháp agroinoculation và truyền qua bọ phấn 42

3.2.1 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng phương pháp truyền qua bọ phấn 42

3.3.2 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng phương pháp agroinoculation 44

3.3 Kết quả kiểm tra các mẫu bệnh virus hại cà chua thu thập ngoài ñồng ruộng bằng kỹ thuật ELISA và PCR 45

3.3.1 Thu thập và bảo quản mẫu bệnh virus gây hại trên cà chua 45

3.3.2 Kết quả kiểm tra ELISA mẫu bệnh hại cà chua 47

3.3.3 Kết quả kiểm tra PCR xác ñịnh begomovirus gây hại cà chua 52

Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 66

TÀI LIỆU THAM KHẢO 68

DANH MỤC BẢNG

Bảng 3.1 Tình hình bệnh virus hại cà chua theo loại hình triệu chứng tại một

số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng vụ xuân hè 2013 26

Bảng 3.2 Diễn biến của bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Perfect 89 và Racha vụ xuân hè năm 2013 tại xã Cổ Bi - Gia Lâm – Hà Nội 28

Bảng 3.3 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Magic và VT 3 vụ xuân hè năm 2013 tại xã ða Tốn – Gia Lâm – Hà Nội 30

Bảng 3.4 Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấntrên giống cà chua Magic và DV 2962 vụ xuân hè năm 2013 tại Văn Lâm – Hưng Yên 33

Bảng 3.5 : Diễn biến của bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Grandeeva 3963 và Mec VL3500 năm 2012 – 2013 tại Hải Cường - Hải Hậu – Nam ðịnh 35

Bảng 3.6: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên giống cà chua VL988, L66 vụ ñông xuân năm 2012 – 2013 tại Bình Nghĩa- Bình Lục- Hà Nam 38

Bảng 3.7: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên giống cà chua BM199, VL642 năm 2012 – 2013 tại Quỳnh Vân – Quỳnh Phụ - Thái Bình 40

Bảng 3.8 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng phương pháp truyền qua bọ phấn 43

Bảng 3.9 Kết quả lây nhiễm bệnh nhân tạo bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng phương pháp agroinoculation 44

Bảng 3.10: Kết quả kiểm tra ELISA mẫu bệnh hại cà chua thu thập ngoài ñồng ruộng năm 2012 - 2013 49

Bảng 3.11 Các mồi chung và mồi ñặc hiệu phát hiện begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua 53

Bảng 3.12 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện begomovirus bằng cặp mồi ccung BegoAFor1/BegoARev1 trên các mẫu cà chua 54

Bảng 3.13 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato leaf curl Hainan virus bằng cặp mồi ñặc hiệu ToLCHnVFor1 và ToLCHnVRev2 trên các mẫu cà chua dương tính với begomovirus 57

Bảng 3.14 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato leaf curl Vietnam

(ToLCVV) bằng cặp mồi ñặc hiệu To-F4 và To-R4 trên các mẫu cà chua dương tính với begomovirus 59

Bảng 3.15 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện Tomato yellow leaf curl

Kanchanabury virus (TYLCKaV) bằng cặp mồi ñặc hiệu TYKa-A-F1 và TYKa-A-R1 trên các mẫu cà chua dương tính với begomovirus 61

Bảng 3.16 Kết quả kiểm tra PCR phát hiện mẫu begomovirus VNP93 bằng cặp mồi ñặc hiệu VNP93-A-F và VNP93-A-R trên các mẫu cà chua dương tính với begomovirus 64

DANH MỤC BIỂU ðỒ

Biểu ðồ 3.1 : Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Perfect 89 và Racha vụ xuân hè năm 2013 tại xã Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội 29

Biểu ñồ 3.2: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Magic và VT 3 vụ xuân hè năm 2013 tại xã ða Tốn – Gia Lâm – Hà Nội 31

Biểu ñồ 3.3: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấntrên giống cà

chua Magic và DV 2962 vụ xuân hè năm 2013 tại Văn Lâm – Hưng Yên 34

Biểu ñồ 3.4: Diễn biến của bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Grandeeva 3963 và Mec VL3500 năm 2012 – 2013 tại Hải Cường - Hải Hậu – Nam ðịnh 36

Biểu ñồ 3.5: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên giống cà chua VL988, L66 năm 2012 – 2013 tại Bình Nghĩa- Bình Lục- Hà Nam 39

Biểu ñồ 3.6: Diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên giống cà chua BM199, VL642 năm 2012 – 2013 tại Quỳnh Vân – Quỳnh Phụ - Thái Bình 41

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 3.1 Triệu chứng khảm vàng 25

Hình 3.2 Triệu chứng xoăn vàng lá 25

Hình 3.3 Triệu chứng khảm dương xỉ 25

Hình 3.4 Triệu chứng cuốn lá, cây lùn 25

Hình 3.5: ðiều tra và lẫy mẫu tại Thái Bình 46

Hình 3.6: ðiều tra và lẫy mẫu tại Hà Tây 46

Hình3 7: Cây cà chua có rìa mép lá cong và lá bị biến vàng 47

Hình 3.8: Kiểm tra ELISA phát hiện TYLCV, TYLCTHV và TSWV trên cà chua 48

Hình 3.9: Chiết DNA và thực hiện phản ứng PCR phát hiện begomovirus trên cà chua 55

Hình 3.10: Kiểm tra PCR phát hiện các begomovirus từ mẫu cà chua bằng cặp mồi chung BegoAfor1/BegoARev1 56

Hình 3.11: PCR phát hiện Tomato leaf curl Vietnam (ToLCVV) bằng cặp mồi ñặc hiệu To-F4 và To-R4 trên các mẫu cà chua dương tính với begomovirus 60

Hình 3.12: PCR phát hiện Tomato yellow leaf curl Kanchanabury virus (TYLCKaV) bằng cặp mồi ñặc hiệu TYKa-A-F1 và TYKa-A-R1 trên các mẫu cà chua dương tính với begomovirus 62

Hình 3.14: PCR phát hiện virus VNP93 bằng cặp mồi ñặc hiệu VNP93-A-F và VNP93-A-R trên các mẫu cà chua dương tính với begomovirus 65

Số cây phát bệnh

Số cây thí nghiệm Thời kỳ tiềm dục Phương pháp Enzyme linked immunosorbent assay Phương pháp polymerase chain reaction

MỞ ðẦU

Cây cà chua bị tấn công bởi rất nhiều loài virus Trong số bệnh virus hại cà chua ở vùng nhiệt ñới và cận nhiệt ñới, bệnh xoăn vàng lá ñược xem là một bệnh cực kỳ quan trọng Cây bệnh biểu hiện nhiều triệu chứng: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (ñặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm còi cọc với tỷ lệ ñậu quả rất thấp (Pico et al., 1996)

Nguyên nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua khá phức tạp Bệnh ñược xem là một bệnh phức, có nghĩa là một bệnh nhưng do nhiều virus thuộc chi

Begomovirus, họ Geminiviridae gây ra (Moriones & Navas-Castillo, 2000)

Có khoảng 60 begomovirus hại cà chua ñã ñược công bố trên thế giới (Stanley et al., 2005) Các begomovirus không truyền qua hạt giống nhưng

lan truyền trên ñồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền

vững tuần hoàn (Pico et al., 1996) Các begomovirus có hình thái phân tử dạng hình cầu kép (hình chuỳ) và có bộ gen DNA sợi vòng ñơn, kích thước khoảng 2,6 - 2,8 kb (Stanley et al., 2005)

Trong số bệnh virus hại cà chua ở Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá ñược xem là bệnh quan trọng nhất Hiện nay tỉ lệ nhiễm bệnh xoăn lá trên các ruộng trồng cà chua thường rất cao, có khi tới 100 %

Ở Việt Nam, ñã có ít nhất 5 loài begomovirus ñược xác ñịnh gây ra bệnh

xoăn vàng lá cà chua Loài thứ nhât là Tomato leaf curl Vietnam virus

(ToLCVV), ñược phân lập từ cây cà chua bị bệnh xoăn lá ở miền Bắc vào năm

2001 (Green et al., 2001) Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi (TYLCKaV), ñược phân lập ñầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi

(Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và ñược phát hiện thấy trên cây cà chua tại Việt Nam vào năm 2005 (mã số Genbank của mẫu Việt Nam là DQ169054, -55) Gần ñây hơn, từ một mẫu cà chua bị bệnh xoăn lá thu thập tại

Hà Nội, cùng với ToLCVV, một loài begomovirus thứ ba cũng ñã ñược phân

lập Các phân tích phân tử ñã cho thấy loài thứ ba này là một loài mới và

ñược ñặt tên là Tomato yellow leaf curl Vietnam virus (TYLCVNV) (Hà Viết

Cường ett al., 2008) Một khảo sát gần ñây nhất (Hà Viết Cường et al., 2011) ñã

xác ñịnh 2 loài begomovirus nữa trên cà chua ở miền Bắc là Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHV) và Tomato leaf curl Hanoi virus (ToLCHanV) trong

ñó ToLCHanV là loài mới

Việc nghiên cứu bệnh virus ñã cho thấy rằng số lượng begomovirus trên thế giới rất nhiều, Tuy nhiên những nghiên cứu ñể xác ñịnh số lượng begomovirus ở Việt Nam vẫn còn ít Hơn nữa, Việt Nam ñã ñược xác ñịnh là trung tâm ña dạng của begomovirus, do vậy việc xác ñịnh số lượng loài begomovirus là cực kỳ quan trọng ðể góp phần thực hiện yêu cầu cấp thiết ñó, dưới sự hướng dẫn của TS Hà Viết Cường, chúng tôi thực hiện ñề tài:

“ðiều tra và xác ñịnh bệnh xoăn vàng lá cà chua tại một số tỉnh ñồng bằng Sông Hồng năm 2012 - 2013”

Mục ñích

Xác ñịnh chính xác thành phần begomovirus tại một số tỉnh ñồng bằng Sông Hồng năm 2012 – 2013

Yêu cầu

- ðiều tra bệnh xoăn vàng lá tại một số tỉnh thuộc ðBSH

- Thu thập các mẫu bệnh ngoài ñồng ruộng thuộc ñịa bàn ñiều tra và một số tỉnh miền Bắc

- Xác ñịnh begomovirus gây bệnh bằng các kỹ thuật ELISA, PCR trên các mẫu thu thập và các mẫu sẵn có

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU

1.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước

Bệnh xoăn lá cà chua ựược ghi nhận ựầu tiên trên thế giới từ cuối những năm 40 tại Israel Các vụ dịch bệnh ựã xuất hiện rải rác vào những năm 60,trở thành nghiêm trọng vào ựầu những năm 70 khi thiệt hại năng suất có thể ựạt 100 % Vào cuối những năm 70, tất cả các vùng trồng cà chua tại Trung đông ựã bị nhiễm bệnh Bệnh ựã ựược báo cáo tại vùng đông Nam Á (Thái Lan và cả đài Loan), châu Phi và Châu Âu vào những năm 80 Bệnh lần ựầu tiên ựược công bố tại Châu Mỹ vào năm 1993 Hiện nay, bệnh xoăn vàng lá ựã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp thế giới (Czosnek

& Laterrot, 1997; Moriones & Navas-Castillo, 2000; Pico et al., 1996)

và nhỏ hẹp Cuống lá có thể xoắn vặn Cây lùn còi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, ựốt thân ngắn Cây nhiễm sớm thường không ra quả do hoa bị rụng (Pico et al., 1996) Tuy nhiên triệu chứng do các begomovirus khác nhau gây ra trên cà chua thường tương tự nhau và không thể phân biệt ựược

1.1.2 Tác nhân gây bệnh là một phức hợp loài

Trước những năm 90, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua ựã ựược xác ựịnh do các begomovirus (chi Begomovius, họ Geminiviridae) truyền qua

bọ phấn (Bemisia tabaci) gây ra Các begomovirus gây bệnh thường ựược ựặt

tên theo cây ký chủ (tomato) và triệu chứng (chủ yếu dưới 2 dạng xoăn lá (leaf curl) và biến vàng (yellow)) nên tên virus gây bệnh thường là “Tomato yellow leaf curl virus” và tên các isolate virus gây bệnh thường ñược kèm theo 1 từ chỉ ñịa phương nơi bệnh xuất hiện; ví dụ Tomato yellow leaf curl - Is (TYLCV-Is) phân lập từ Israel, Tomato yellow leaf curl - Sar (TYLCV-Sar) phân lập từ Sardinia -Ý, Tomato yellow leaf curl - Th (TYLCV-Th) phân lập từ Thái Lan (Czosnek & Laterrot, 1997; Moriones & Navas-Castillo, 2000) Do có ít lựa chọn trong việc ñặt tên, các tác giả cũng có xu hướng lấy chỉ triệu chứng xoăn lá “leaf curl” ñể ñặt tên virus; chẳng hạn Tomato leaf curl virusAu (ToLCV-Au) phân lập từ Úc (Stonor et al., 2003) Tomato leaf curl Guzarat virus (ToLCGV) (Chakraborty et al., 2003) mặc dù các virus này ñều tạo triệu chứng biến vàng trên cà chua

Từ những năm 90 trở lại ñây, sự tiến bộ của công nghệ sinh học ñã cho phép giải trình tự toàn bộ bộ gen virus một cách dễ dàng Các virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua ñầu tiên ñược giải mã toàn bộ bộ gen là TYLCV-Sar (Kheyr-Pour et al., 1991) và TYLCV-Is (Navot et al., 1991) Từ ñó ñến nay, số lượng bộ gen begomovirus gây bệnh trên cà chua nói riêng và trên các cây trồng và cây dại khác ñược giải mã toàn bộ ñã gia tăng nhanh chóng (389 vào năm 2005) (Fauquet & Stanley, 2005) Dựa vào các phân tích phân tử,

Ủy ban Phân loại Virus Quốc tế (International Committee on Taxonomy of Viruses -ICTV) ñã xác ñịnh ngưỡng phân biệt loài begomovirus là 89 % tương ñồng chuỗi nucleotide cho DNA-A (Fauquet & Stanley, 2003) Chỉ tiêu này ñã cho phép tách ñược nhiều begomovirus, vốn ñược xem là các isolate khác nhau của cùng một loài gây bệnh xoăn vàng lá cà chua, thành các loài phân biệt; ví dụ TYLCV-Sar trở thành loài Tomato yellow leaf curl Sardinia virus (TYLCSV), TYLCV-Ch trở thành loài Tomato yellow leaf curl China virus (TYLCCNV), TYLCV-Th trở thành loài Tomato yellow leaf curl Thailand virus (TYLCSV) và isolate TYLCV-Is phân lập từ Israel, do quyền

ưu tiên, ñược công nhận là loài Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) Tương tự, Tomato leaf curl virus - Taiwan (ToLCV-TW) trở thành loài Tomato leaf curl Taiwan virus (ToLCTWV), Tomato leaf curl virus - New Delhi (ToLCV-ND) trở thành loài Tomato leaf curl New Delhi virus (ToLCNDV), và isolate ToLCV-Au phân lập ñầu tiên từ Úc, do quyền

ưu tiên, ñược công nhận là Tomato leaf curl virus (ToLCV) (Fauquet et al., 2003; Stanley et al., 2005)

Như vậy, tác nhân gây bệnh xoăn vàng lá cà chua ñược xem là một phức hợp các loài khác nhau (Moriones & Navas-Castillo, 2000) Hậu quả là, dựa trên triệu chứng quan sát, bệnh không thể ñược gán cho một loài begomovirus

cụ thể trừ phi danh tính của virus ñã ñược xác ñịnh

1.1.3 Hình thái của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua

Các begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua nói riêng và begomovirrus nói chung thuộc chi Begomovirus (họ Geminivirus) Các geminivirus ñều có cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác ñều với số ñơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt = 1, nối với nhau ñể tạo ra phân tử hình cầu ña diện kép (gemini) Do nối với nhau nên 2 hình cầu này không hoàn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ có 55 tiểu phần protein (protein vỏ) ñược xắp xếp thành 11 ñơn vị hình thái, mỗi ñơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer) Kết quả là toàn bộ phân tử có 110 tiểu phần và 22 ñơn vị hình thái (Gafni,

2003; Zhang et al., 2001)

1.1.4 ðặc ñiểm bộ gen của begomovirus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua

Các begomovirus là các virus thực vật có bộ gien DNA vòng ñơn có kích thước khoảng 2.6 - 2.8 kb Chúng hoặc có bộ gien kép gồm 2 phân tử DNA sợi vòng ñơn gọi là DNA-A và DNA-B hoặc có bộ gien ñơn tương ñương DNA-A (Seal et al., 2006)

ðối với các virus có bộ gien ñơn thì DNA-A của chúng chứa 6 gien

ñược tổ chức theo 2 chiều ngược nhau Trên chiều kim ñồng hồ (chiều virus) có

2 gien là (i) V1 mã hóa vỏ protein có chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyên qua vector, vận chuyển bộ gien virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gien virus giữa các tế bào; và (ii) V2 mã hóa protein V2 có chức năng liên quan ñến vận chuyển virus giữa các tế bào Trên chiều ngược kim ñồng hồ (chiều sợi tương ñồng virus) có 4 gien là (i) C1 mã hóa protein tái sinh hay còn gọi là protein Rep có chức năng chính là cắt - nối bộ gien virus tại một vị trí ñặc biệt ở vùng nguồn gốc tái sinh và tương tác với protein ký chủ ñể tạo ñiều kiện thuận lợi cho tái sinh virus, (ii) C2 mã hóa

1 protein hoạt hóa phiên mã, (iii) C3 mã hóa 1 protein tăng cường tái sinh và (iv) C4 mã hóa protein C4 với chức năng liên quan ñén phổ ký chủ và phát triển triệu chứng (Seal et al., 2006)

Giữa 2 vùng gen mã hóa ngược chiều nhau ở trên là một vùng không mã hóa chứa nguồn gốc tái sinh (ori = origin of replication) gồm (i) các chuỗi lặp ñảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết của protein Rep (Fontes et al., 1994) và (ii) một cấu trúc thân - thòng lọng trong ñó chuỗi AATACTAT trên vùng thòng lọng là giống nhau ở tất cả các begomovirus và vị trí TA cuối cùng là nơi protein Rep cắt và nối bộ gien begomovirrus trong quá trình tái sinh (Laufs et al., 1995)

ðối với các begomovirus có bộ gien kép thì DNA-A có tổ chức bộ gienome và chức năng các gien tương tự như DNA-A của các begomovirus có

bộ gien ñơn (tên các gien ñược thêm ký tự A vào ñằng trước thành AV1, AV2, AC1, AC2, AC3 và AC4); còn DNA-B của chúng chỉ chứa 2 gien ñược sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau và mã hóa 2 protein là (i) protein con thoi có chức năng vận chuyển bộ gien virus vào và ra khỏi nhân tế bào và (ii) protein vận chuyển có chức năng vận chuyển bộ gien virus giữa các tế bào ký chủ (Gafni & Epel, 2002)

1.1.5 Lan truyền của begomovirus

Tất cả các begomovirus lan truyền ngoài tự nhiên nhờ bọ phấn (B tabaci) theo kiểu bền vững tuần hoàn Chưa có bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn (Czosnek et al., 2002)

Bọ phấn dùng vòi chọ vào mô mạch dẫn ựể hút dịch cây từ mạch phloem Virus ựược hút qua vòi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, ựạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt Nghiên cứu với TYLCV cho thấy thời gian chắch nạp và chắch truyền tối thiểu của bọ phấn là khoảng 15 - 20 phút Kể từ khi bắt ựầu chắch nạp, virus ựược phát hiện có mặt ở phần ựầu sau khoảng 10 phút, ở ruột giữa.sau khoảng 50 phút, ở xoang

cơ thể sau khoảng 90 phút và ở tuyến nước bọt sau khoảng 7 giờ Thời gian từ khi virus ựược phát hiện thấy ở tuyến nước bọt tới khi bọ phấn có thể truyền ựược bệnh là khoảng 1 giờ Như vậy thời kỳ ẩn của TYLCV trong cơ thể bọ phấn là khoảng 8 giờ (Czosnek et al., 2002)

Thắ nghiệm với TYLCV cũng cho thấy, số lượng virus ựược tắch lũy ựạt cực ựại (khoảng 600 triệu phân tử virus) nếu ựể bọ phấn chắch nạp trên cây bệnh 12 giờ Thời gian này ựối với TYLCSV là 24 giờ (Czosnek et al., 2002) Sau thời gian chắch nạp khoảng 1-2 ngày, virus có thể ựược duy trì trong cơ thể bọ phấn nhiều tuần (3 tuần ựối với TYLCSV) hoặc cả ựời như ựối với TYLCV (Czosnek et al., 2002)

Virus có thể truyền qua giao phối từ bọ phấn ựực sang bọ phấn cái và ngược lại đã có bằng chứng cho thấy TYLCV có thể truyền qua trứng mặc dù

tỷ lệ truyền bệnh của bọ phấn trưởng thành phát triển từ trứng mang virus là rất nhỏ Trái lại, thắ nghiệm với Tomato mottle virus (ToMoV) cho thấy bọ phấn không truyền virus này qua trứng (Czosnek et al., 2002; Ghanim et al., 1998) Một cá thể bọ phấn có thể truyền bệnh sau khi chắch nạp 24 giờ mặc dù

tỷ lệ truyền bệnh không cao; tỷ lệ truyền bệnh ựạt 100 % nếu sử dụng 5 - 15

bọ phấn Bọ phấn cái truyền virus hiệu quả hơn bọ phấn ựực và hiệu quả

truyền tốt nhất khi bọ phấn trưởng thành ở 1 -2 tuần tuổi và giảm dần theo thời gian sinh trưởng của bọ phấn Hiệu quả truyền virus giảm theo tuổi là do lượng virus ñược chích nạp giảm (Czosnek et al., 2002)

1.1.6 Môi giới truyền bệnh virus TYLCV: bọ phấn (Bemisia tabaci)

Bọ phấn Bemisia tabaci (Gennadius, 1989) thuộc họ rầy phấn

(Aleyrodidae), bộ Homoptera Khả năng truyền virus TYLCV ñã ñược nhiều nghiên cứu khẳng ñịnh, do ñó diễn biến của loài này trên ñồng ruộng có ảnh hưởng lớn tới cây trồng ñặc biệt là cây cà chua

Theo Gerling và cộng sự (1996) bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành

một vòng ñời khoảng 20 - 30 ngày ở ñiều kiện thích hợp, trung bình có khoảng 11 - 15 lứa/năm Bọ phấn thích hợp và phát triển mạnh ở ñiều kiện khô nóng Mưa nhiều làm giảm mật ñộ bọ phấn Bọ phấn không khỏe chỉ có thể dịch chuyển những khoảng ngắn ñể tìm những bộ phận non của cây Tuy nhiên nếu ñiều kiện thời tiết thay ñổi bất lợi chúng có thể di chuyển hàng triệu con với khoảng cách dài hơn Chúng thường chích hút và bay vào buổi sáng, buổi chiều mát ðể tránh ánh sáng mặt trời, chúng núp vào mặt dưới của lá ðiều này phù hợp với phân bố chủ yếu ở khí hậu nhiệt ñới và cận nhiệt ñới Diễn biến mật ñộ bọ phấn trong năm tùy theo ñiều kiện sinh thái từng vùng Murugan (2001) ñã ñặt bẫy dính bọ phấn theo dõi mật ñộ bọ phấn trên cánh ñồng bông ở Coimbatace (Ấn ðộ) cho thấy: từ tháng 9 ñến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt ñộ cao, cường ñộ ánh sáng lớn với ẩm ñộ trung bình tạo ñiều kiện cho bọ phấn sinh sôi nảy nở nhanh chóng nên mật ñộ bọ phấn cao, từ tháng 5 ñến tháng 8 mưa nhiều nên mật ñộ bọ phấn thấp, ñỉnh cao của mật ñộ bọ phấn khoảng tháng 11 ñến tháng 1 năm sau

Ở Tây Ban Nha, mật ñộ bọ phấn trên cánh ñồng cà chua có 2 ñỉnh cao: khoảng tháng 7 – 8 và tháng 1 và tháng 2 năm sau (Ramos, 2001)

Như vậy sự tăng hay giảm mật ñộ bọ phấn ở mỗi vùng phụ thuộc vào nhiệt ñộ, ẩm ñộ và cây trồng vùng ñó Theo dõi diễn biến mật ñọ bọ phấn trên

ựồng ruộng ựể tiến hành công tác dự tắnh dự báo, ựể có biện pháp phòng trừ thắch hợp

Phạm vi kắ chủ của bọ phấn Bemisia tabaci rất rộng, do ựó chúng có mặt

quanh năm trên ựồng ruộng đây cũng là nguyên nhân làm khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp nhiều khó khăn

Theo Cuodiet và cộng sự (1985) trên thế giới có tới 500 loài cây là kắ chủ của bọ phấn, trong ựó ở Florida có tới 50 loài như khoai lang, dưa chuột, dưa thơm, dưa hấu, bắ ngô, cà chua, cà tắm, ớt, xà lách, suplơ xanhẦBọ phấn thắch hợp trên cây trồng này hay cây trồng khác tùy thuộc vùng sinh thái Ở Florida bọ phấn thắch sinh sống trên khoai lang, dưa chuột, bắ ngồi hơn là trên suplơ xanh, cà rốt Ở đài Loan thì thứ tự ựó là cà tắm, cà chua, khoai lang, dưa chuột, ựậu xanh Một số cỏ dại như cây cà ựộc dược, cây lulu, cây bông bụt

Ầlà các kắ chủ phụ của bọ phấn giúp chúng sống sót trên ựồng ruộng khi không có cây trồng là kắ chủ chắnh tạo thành sự gối lứa trên ựồng ruộng

1.1.7 Phương pháp lây nhiễm nhân tạo bằng agroinoculatiion

1.1.7.1 Lịch sử và ứng dụng kỹ thuật agroinoculation

Agroinoculation là kỹ thuật lây nhiễm nhân tạo (inoculation) các virus

thực vật dùng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Kỹ thuật ựược phát triển

lần ựầu tiên bởi Grimsley et al vào năm 1986 và 1987, khi các tác giả ựã nối

bộ gen của 2 virus là CaMV (Cauliflower mosaic virus), một virus có bộ gen DNA sợi kép, mạch vòng và virus MSV (Maize streak virus), một geminivirus, vào một vector nhị nguyên chuyển gen thực vật Các tác giả ựã chứng minh rằng cây bị nhiễm vi khuẩn Agrobacterium mang các plasmid tái

tổ hợp này có biểu hiện triệu chứng tương tự như cây bị nhiễm tự nhiên với phân tử virus nguyên vẹn (virions) (Vaghchhipawala & Mysore, 2008)

Kể từ ựó, agroinculation ựã trở thành phương pháp lây nhiễm nhân tạo ựược lựa chọn cho nhiều mục ựắch khác nhau trong nghiên cứu bệnh virus thực vật như xác nhận bản chất ựơn thành phần hay ựa thành phần của virus,

xác ñịnh ñặc ñiểm sinh học của các virus mới, nghiên cứu tương tác giữa virus và cây ký chủ, ñánh giá tính kháng virus của cây ký chủ Phương pháp

ñã ñược áp dụng cho nhiều nhóm virus, thường không thể hoặc rất khó lây nhiễm bằng tiếp xúc cơ học, như caulimovirus và badnavirus (có bộ gen DNA sợi kép), geminivirus (bộ gen DNA sợi ñơn), luteovirus (có bộ gen RNA sợi ñơn) và cả viroid (một nhóm tác nhân ñặc biệt gây bệnh cây với bộ gen chỉ là các phân tử RNA sợi ñơn rất nhỏ, khoảng 300 nucleotide) (Boulton, 1995; Vaghchhipawala & Mysore, 2008)

1.7.1.2 Cơ chế lây nhiễm bằng agroinoculation

Sau khi cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus ñã ñược xây dựng xong

và ñược biến nạp vào vi khuẩn A tumerfaciens thì việc lây nhiễm nhân tạo giống như chuyển gen thực vật Tế bào vi khuẩn Agrobacterium sau khi ñược ñưa vào trong mô cây sẽ chuyển toàn bộ cấu trúc xâm nhiễm của virus nằm giữa bờ trái (LB) và bờ phải (RB) của plasmid và tổng hợp vào bộ gen của tế bào cây ký chủ Trong tế bào cây ký chủ, gen AC1 của virus sẽ ñược biểu hiện thành protein Rep chịu trách nhiệm cho việc sao chép bộ gen của virus Protein Rep sẽ cắt bộ gen của virus khỏi bộ gen của tế bào ký chủ và nối lại thành bộ gen virus hoàn chỉnh dạng mạnh vòng Các gen virus trên bộ gen virus hoàn chỉnh này sẽ ñược biểu hiện và thực hiện các chức năng sông của virus bao gồm tái bản, lắp ráp, cảm ứng gây bệnh và di chuyển hệ thống khắp

cây giống như nhiễm virus tự nhiên (Hình 1) (Ferreira et al., 2008; Nagata et al., 2004; Wu et al., 2008)

Inoue-Hiện nay agroinoculation ñã trở thành phương pháp lây nhiễm chuẩn trong nghiên cứu begomovirus Một khi dòng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm ñã sẵn có thì việc lây nhiễm trở nên ñơn giản và ñặc biệt thích hợp khi lây một lượng lớn cây

Hình 1.1 Sơ ñồ mô tả cơ chế lây nhiễm nhân tạo begomovirus bằng

agroinoculation (nguồn Hà Viết Cường)

Nhân tế bào

ký chủ

Rep (mRNA)

Rep (protein)

Vector nhị nguyên (pCAMBIA)

Bờ phải

Bờ trái

ðiểm cắt nối

Virus

Gen

Rep

Cấu trúc xâm nhiễm

Ti plasmid (pAB4404)

Cấu trúc xâm

2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Theo các tài liệu trên thế giới về phân bố của bệnh virus xoăn vàng lá thì khu vực đông nam châu Á là một trong các khu vực xuất hiện phổ biến loại virus này Việt Nam nằm trong khối các nước đông nam Á Ở nước ta, bệnh virus hại cà chua ựược phát hiện vào năm 1967 - 1968 Năm 1968, Nguyễn Thơ - đHNN Hà Nội và Bùi Văn Ích - Viện BVTV ựã xác ựịnh chỉ từ 3-4 con

bọ phấn tiếp xúc cây bệnh và lây lên cây khỏe ựã có khả năng truyền bệnh TYLCV tốt

Bệnh virus xoăn vàng lá cà chua ựược phát hiện và bắt ựầu nghiên cứu

ở Việt Nam vào những năm 60 cùng khoảng thời gian với nhiều nước trên thế giới Từ ựó ựến nay, loại virus này ựược nhiều nhà khoa học nghiên cứu, nhiều công trình ựã ựược công bố giúp chúng ta hiểu rõ hơn về loài virus này

và các biện pháp phòng trừ bệnh virus xoăn vàng lá

Năm 1970, Bùi Văn Ích và cộng sự bước ựầu nghiên cứu nguyên nhân gây bệnh và vector truyền bệnh virus xoăn vàng lá cà chua Tác giả nhận ựịnh

ựó là bệnh virus, triệu chứng chủ yếu là mép lá cong lên, lá ngọn vàng, bệnh

lan truyền qua bọ phấn (Bemisia spp), bọ phấn có phạm vi kắ chủ rất rộng Các

tác giả Nguyễn Hữu Thụy, Nguyễn Thơ (1969 - 1970), Hà Minh Trung (1972),

Vũ Triệu Mân và ctv (1974 - 1988) xác ựịnh là bệnh virus truyền bằng bọ phấn

và nhiều loài virus khác cũng gây hại Các kết quả nghiên cứu ựều ựi ựến kết luận chung là: bênh virus ựược truyền bằng bọ phấn

Phương thức truyền lan của bệnh ựược tác giả Nguyễn Thơ nghiên cứu vào năm 1967-1969 ở một số hợp tác xã trồng rau ngoại thành Hà Nội trên cà chua sớm và muộn Từ các kết quả ựiều tra năm 1967-1969, tác giả Nguyễn Thơ nhận thấy: mức ựộ phát sinh bệnh xoăn lá trên ựồng ruộng có quan hệ rất chặt với mật ựộ bọ phấn So sánh tỷ lệ bệnh xoăn lá cà chua ở vụ hè thu, vụ ựông và vụ xuân hè, tác giả cho biết tỷ lệ bệnh vụ hè thu và vụ xuân hè cao hơn vụ ựông Tác giả cũng cho biết nguyên nhân chủ yếu là do nhiệt ựộ hai vụ

này cao hơn thích hợp cho bọ phấn phát triển cũng như tăng khả năng truyền bệnh Theo Gerling và cộng sự (1996), bọ phấn thích hợp và phát triển mạnh

ở ñiều kiện khô nóng Tác giả ñã tiến hành thí nghiệm về hình thức lan truyền bệnh xoăn lá cà chua (1968), qua các thí nghiệm tác giả kết luận: bệnh xoăn lá

cà chua ở nước ta không truyền qua hạt giống và sát thương cơ học, bệnh chỉ

lan truyền duy nhất qua bọ phấn Bemisia spp với tỷ lệ phát bệnh rất cao Cụ

thể trên một cây cà chua ở giai ñoạn còn non có 2 con bọ phấn là có thể truyền ñược bệnh xoăn lá, với số lượng bọ phấn 5 con/cây tiếp xúc liên tục trong 6 giờ ñồng hồ thì bắt ñầu truyền ñược bệnh và tiếp xúc lâu hơn khả năng truyền bệnh lớn hơn Theo Vũ Triệu Mân và Nguyễn Thị Kim Oanh (1993), nhóm virus gây bệnh trên cây cà chua theo phương thức truyền bệnh

có thể chia làm 3 nhóm: nhóm truyền bằng tiếp xúc cơ học (ñiển hình là TMV, PVX, CMV…), nhóm truyền bệnh bằng côn trùng theo kiểu không bền vững (Non-persistant) ñiển hình là virus Y (PVY) hay A (PVA), nhóm truyền bằng côn trùng theo kiểu bền vững (persistant) là virus xoăn vàng lá cà chua (TYLCV)

Các kết quả nghiên cứu bệnh cà chua của Viện BVTV (1970) ñã khẳng ñịnh bệnh truyền bằng bọ phấn, cây thuốc lá và cây lulu là kí chủ của bệnh Trên ñồng ruộng có 2 ñỉnh cao về mật ñộ bọ phấn là tháng 3 ñến tháng 6 và tháng 9 ñến tháng 11 Khi trời mưa to, rét ñậm thì mật ñộ bọ phấn giảm

Bệnh virus xoăn vàng lá ở nước ta là phổ biến, tỷ lệ bênh cao hơn nhiều

so với bệnh khảm lá dương xỉ và khảm vàng lá Bệnh gây hại khá nặng trên ñồng ruộng: bệnh virus xoăn vàng lá gây thiệt hại ñến 80 - 90% năng suất Cây cà chua bị bệnh virus xoăn vàng lá sẽ làm cho hoa và nụ bị rụng nhiều, quả xốp, khô nước phẩm chất kém, năng suất thấp

Vì vậy phòng trừ bệnh virus xoăn vàng lá góp phần làm tăng năng suất, sản lượng cà chua Các kết quả nghiên cứu ở nước ta hiện nay, chủ yếu sử dụng phòng trừ bằng thuốc hóa học ñối với môi giới truyền bệnh

Các tác giả Bùi Văn Ích, Lê Trường, Nguyễn Thơ (1969) ñã sử dụng Bi

58 (thuốc trừ sâu lân hữu cơ) diệt bọ phấn theo cách phun ñịnh kì và tưới ñã

có hiệu quả Theo kết quả nghiên cứu của Lê Trường và cộng tác viên (1971) thì dùng thuốc sữa Wofatox 50% hoặc Bi 58 % pha nồng ñộ 10/00 mỗi tuần 1 lần từ trồng ñến khi cây ra 5 chùm hoa ñã hạn chế tác hại của bọ phấn và bệnh xoăn lá Tác giả Nguyễn Văn Viên (1994) cho biết sử dụng thuố Bi 58 50EC nồng ñộ 0.1% phun 4 lần, mỗi lần cách nhau 14 ngày kể từ sau khi trồng và dừng phun thuốc trước khi thu hoạch 1 tháng sẽ cho hiệu quả tốt, làm giảm số cây bệnh xoăn vàng trên ñồng ruộng Vũ Triệu Mân và cộng sự (1993) sử dụng biện pháp tổng hợp là phun thuốc - nhổ bỏ cây bệnh phòng trừ bọ phấn

và bệnh virus trên cà chua có hiệu quả cao nhất

Trần Khắc Thi (1999) cho biết có thể sử dụng Mornitor và Nuvacron ñể phòng trừ bọ phấn Nguyễn Văn Tuất và cộng sự (2003), Phạm Văn Biên (2003) lại cho rằng có thể sử dụng Trebon, Padan, Pegasus, Sherpa, Admire, Bassa cùng việc tỉa bỏ lá già ñể phòng trừ bọ phấn

Ở nước ta bọ phấn hại trên nhiều loại cây trồng và cây dại, chúng hại trên các họ: cà, bầu bí, ñậu, bìm bìm, bông…Chúng có thể phát triển quanh năm trên ñồng ruộng Do ñó, phòng trừ bọ phấn cũng như virus xoăn vàng lá gặp nhiều khó khăn Bên cạnh việc sử dụng biện pháp hóa học, các biện pháp phòng trừ khác ñược ñề xuất như: diệt cỏ dại là kí chủ phụ của bọ phấn, nhổ

bỏ cây bệnh, luân canh với cây trồng không phải kí chủ của bọ phấn, quy hoạch vùng trồng cà chua hợp lí

Bệnh virus xoăn lá cà chua hiện vẫn là bệnh hại nguy hiểm trên cây cà chua, ảnh hưởng ñến nghề trồng cà chua cũng như sản phẩm cà chua thương

phẩm của Việt Nam

Chương 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 ðối tượng, ñịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

2.1.1 ðối tượng nghiên cứu

* Bệnh xoăn vàng lá cà chua

2.1.2 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu

* ðịa ñiểm thực hiện ñề tài:

+ Trung tâm Bệnh cây nhiệt ñới - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội + Các vùng trồng cà chua ở Hà Nội và phụ cận

* Thời gian thực hiện ñề tài: từ tháng 6/2012 ñến tháng 7/2013

2.2 Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Thu thập mẫu, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới

- Mẫu lá cà chua nghi nhiễm bệnh ñược thu thập trên những cây có triệu chứng bị virus ñiển hình, trên ruộng sản xuất tại các ñiểm ñiều tra Ngắt

3 - 4 lá cho vào lọ nhựa có chứa các hạt silicagel ñã ñược làm khô Mô tả triệu chứng bệnh, ñánh dấu ký hiệu lọ ñựng mẫu

2.2.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu

* Thiết bị nghiên cứu:

Máy ñọc bản ELISA, máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ ñịnh ôn, cân ñiện tử, bể nhiệt

* Dụng cụ nghiên cứu:

- Pipet tự ñộng 1 ñầu côn : 10 - 20 µl, 100 µl, 200 µl, v.v

- Ống ñong, bình thuỷ tinh, phễu lọc, vải lọc, giấy thấm

* Mẫu bệnh virus gây hại cà chua thu thập ở Hà Nội và một số tỉnh khác thuộc phía Bắc Việt Nam

2.3 Nội dung nghiên cứu

1 Xác ñịnh diễn biến các loại hình triệu chứng bệnh virus trên một số giống cà chua trồng tại Hà Nội và vùng phụ cận năm 2012

2 Xác ñịnh, mô tả triệu chứng bệnh do Begomovirus gây ra

3 Thu thập mẫu bệnh virus gây hại cà chua tại các ñiểm ñiều tra

4 Giám ñịnh tác nhân gây bệnh do virus bằng phương pháp ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay), phương pháp PCR (polymerase chain reaction)

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp ñiều tra ngoài ñồng ruộng

Áp dụng phương pháp nghiên cứu, ñiều tra và phát hiện bệnh hại (QCVN 01 -38: 2010/ BNNPTNT)

Tiến hành ñiều tra bệnh hại ngoài ñồng chuyên canh rau màu thuộc ñịa ñiểm nghiên cứu

ðiều tra ñịnh kỳ 7 ngày/lần, trên mỗi giống ñiều tra theo phương pháp

5 ñiểm chéo góc, mỗi ñiểm ñiều tra 50 cây ñối với ruộng lớn (trên 360 m2) và toàn bộ số cây ñối với ruộng nhỏ (dưới 360 m2)

Theo dõi ñịnh kỳ, thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh Quan sát và mô tả ñặc ñiểm cây nhiễm bệnh

Theo dõi diễn biến bệnh virus hại cà chua theo loại hình triệu chứng, thu thập mẫu bệnh ñể kiểm tra bệnh do virus hại cà chua ngoài ñồng ruộng

* ðiều tra diễn biến mật ñộ bọ phấn: tiến hành ñiều tra theo 5 ñiểm chéo góc, mỗi ñiểm cố ñịnh 5 cây, ñiều tra ngẫu nhiên 20 lá/ñiểm dải ñều ở 3 tầng lá

* Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%) và mật ñộ bọ phấn (con/lá)

2.4.2 Phương pháp thu thập, bảo quản mẫu bệnh virus hại cà chua

* Phương pháp thu mẫu: mẫu ñựng riêng trong từng túi nilon có ghi các thông tin: tên mẫu, ñịa ñiểm thu mẫu, thời gian thu mẫu, triệu chứng bệnh

* Phương pháp bảo quản mẫu: có hai phương pháp bảo quản mẫu

+ Phương pháp 1: bảo quản mẫu khô

- Bước 1: làm khô mẫu bằng silicagen tự chỉ thị

- Bước 2: Mẫu ñược gói trong giấy mỏng nhằm cách hạt Silicagel và mẫu sau ñó ñể trong các lọ thuỷ tinh nhỏ

+ Phương pháp 2: bảo quản mẫu tươi

Mẫu thu về ñược ñể nguyên trong túi giữ lạnh ở tủ -20oC Không ñưa mẫu ra ngoài khi chưa sử dụng

2.4.3 Lây nhiễm nhân tạo bệnh xoăn vàng lá cà chua bằng bọ phấn

Bọ phấn ñược thả trên cây nguồn bệnh cho chúng chích hút một ñến hai ngày sau ñó chuyển sang cây khỏe ñược trồng trong nhà lưới dùng ñể lây nhiễm, mỗi loại gồm 10 cây, mỗi cây ñặt trong một hộp Mỗi hộp thả 10 con

bọ phấn Cho bọ phấn chích hút truyền virus trên cây thí nghiệm trong thời gian hai ngày sau ñó ñưa ra khỏi hộp và tiến hành phun thuốc Actara 25WG nồng ñộ 0,01% diệt trừ bọ phấn Các cây thí nghiệm ñều có cây ñối chứng Mỗi công thức dùng 10 cây và thả 10 bọ phấn/cây và có công thức ñối chứng Cây lây bọ phấn ñược giữ trong ñiều kiện cách ly Cây thí nghiệm ñược ñặt trong lồng lưới cách ly côn trùng và ñể lồng vào trong nhà lưới

Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục

2.4.4 Lây nhiễm nhân tạo bằng agroiculation

- Bước 1: Nuôi cây dòng vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm trong 200

ml môi trường LB lỏng chứa 3 loại kháng sinh (streptomicin 200 µg/ml, refampicin 34 µg/ml và kanamicin 100 µg/ml) trong tủ nuôi cấy có lắc (250 vòng/phút/28ºC/2ngày)

- Bước 2: Ly tâm dịch vi khuẩn (3000 g/ 5 phút)

- Bước 3: Hòa cặn vi khuẩn với 5 ml môi trường LB chứa 3 loại kháng

sinh trên

- Bước 4: Dùng kim tiêm tiêm dịch vi khuẩn vào chồi và 4 nách lá tiếp

theo, mỗi vị trí tiêm 10 µl

- Chỉ tiêu theo dõi:

+ Quan sát mô tả triệu chứng

+ Tỷ lệ nhiễm bệnh tính cho mỗi loại cây:

Số cây biểu hiện triệu chứng TLCNB (%) =

Số cây lây bệnh

+ Thời kì tiềm dục (TKTD): tính từ lúc lây nhiễm cho tới khi cây biểu hiện triệu chứng (ngày)

2.4.5 Giám ñịnh virus bằng ELISA

Sử dụng kít ELISA thương mại do viện DSMZ (ðức) cung cấp Kỹ thuật ELISA là TAS-ELISA (Triple Antibody Sandwich –ELISA) Qui trình ñược thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất như sau:

Bước 1: Cố ñịnh kháng thể ña dòng ñặc hiệu virus (IgG) vào bản Hòa IgG trong ñệm Carbonate 0,05M pH 9,6 với tỷ lệ 1:1000 (hướng dẫn của nhà sản xuất) Nhỏ vào bản ELISA với lượng 100 µl/giếng Sau ñó ñể bản ELISA vào hộp ẩm và ủ 2-4 giờ ở 37 o C Rửa bản 3x bằng ñệm PBST

Bước 2 Khóa bản ELISA bằng ñệm sữa tách béo 2 % hòa trong ñệm PBST Ủ 37 oC 30 phút Rửa bản 3x bằng ñệm PBST

Bước 3: Cố ñịnh dịch cây Nghiền mẫu cây ñệm (PBST-PVP) theo tỷ lệ

1 g lá/ 5 mL ñêm Nhỏ dich cây vào bản và ủ qua ñêm ở 4 oC Rửa bản 3x bằng ñệm PBST

Bước 5 Cố ñịnh kháng thể ñơn dòng ñặc hiệu virus Hòa kháng thể ñơn dòng trong ñệm PBST-PVP-Ovalbumin theo tỷ lệ 1:1000 (hướng dẫn của nhà

sản xuất) Nhỏ vào bản ELISA với lượng 100 µl/giếng Ủ bản ELISA ở 37ºC 2-4 giờ Rửa bản ELISA với đệm PBST 3 lần

Bước 6: Cố định kháng thể đặc hiệu kháng thể liên kết AP Hịa kháng thể liên kết AP trong đệm đặc PBST-PVP-Ovalbumin theo tỷ lệ 1:1000 (hươnga dẫn của nhà sản xuất) Ủ bản ELISA ở 37ºC 2-4 giờ Rửa bản ELISA với đệm PBST 3 lần

Bước 7: Cố định chất nền và đánh giá kết quả: Pha 0,5 mg NPP (p - nitrophenyl phosphate)/1ml đệm substrate Ngay lập tức, nhỏ dung dịch trên vào bản ELISA, nhỏ 100 µl/giếng ðưa bản ELISA vào hộp ẩm và để trong bĩng tối ở điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm với thời gian từ 60 - 90 phút Bước 8: ðọc kết quả: Các giếng cĩ màu vàng là các giếng cĩ phản ứng (+) tức là cây nhiễm bệnh Giếng khơng màu là cây khơng bị nhiễm bệnh ðọc kết quả tiếp bằng cách đưa vào máy đọc ELISA ở bước sĩng 405 nm Dừng phản ứng bằng NaOH 3M với lượng 50 µl/giếng

2.4.6 Phương pháp giám định virus gây bệnh bằng phương pháp PCR

Qua quá trình điều tra thu thập mẫu bệnh trên đồng ruộng, chúng tơi đã

sử dụng phương pháp PCR (Polymenraza Chain Reaction) để chẩn đốn virus gây bệnh xoăn vàng lá cà chua

Chiết tách DNA tổng số bằng CTAB

1 Các bước tiến hành

+ Bước 1:

- Cho 0,1 g mơ lá tươi hoặc 0,02 g mơ lá khơ vào tube 1,5 ml

- Cho 0,5 ml đệm CTAB + β-ME đã ủ ở 60oC trong 10 phút vào tube Dùng chày nhựa nghiền nhuyễn

- Ủ 10 phút ở 65oC sau đĩ để nguội ở nhiệt độ phịng

+ Bước 2:

- Cho 0,5 ml hỗn hợp (Chlorofom : isoamyl alcohol 24:1) vào tube lắc đều

- Sau đĩ ly tâm 12.000 vịng /phút trong 10 phút, hút dịch trên của tủa

sang một tube mới (0,35 ml)

Rửa cặn hai lần etol 70o (0,7 ml/lần), ñảo nhẹ, ñổ hết etol Sau ñó, spin

và dùng pipet hút hết etol thừa

+ Bước 7: ðể khô cạn trong không khí ít nhất 30 phút

+ Bước 8: Hoà cặn trong 0,1 ml nước cất 2 lần và giữ ở -20oC

đà Nẵng) BegoAFor1 TGYGARGGiCCiTGYAARGTYCARTC

2.5.1 điều tra ngoài ựồng ruộng

Số cây có triệu chứng nhiễm bệnh virus

Tỷ lệ bệnh (%) = ỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞỞ

Tổng số cây ựiều tra

* Mật ñộ bọ phấn:

Tổng số bọ phấn ñiều tra MðBP (con/lá) = ———————————

Số lá ñiều tra

2.5.2 Thí nghiệm trong nhà lưới

Số cây biểu hiện triệu chứng

Tỷ lệ cây phát bệnh (%) = ——————————————————

Tổng số cây lây nhiễm

Số cây phản ứng (+)

Tỷ lệ nhiễm bệnh (%) = ——————————————————

Tổng số cây kiểm tra

Số liệu thí nghiệm thu thập ñược xử lý trong Microsoft Office Excel và IRRISTAT

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Kết quả điều tra bệnh do virus hại cà chua tại Hà Nội và một số tỉnh thuộc đồng bằng Sơng Hống năm 2012 - 2013

3.1.1 Mơ tả triệu chứng bệnh

Chẩn đốn bệnh hại cây trồng là bước cơ bản đầu tiên trong nghiên cứu cũng như trong cơng tác bảo vệ thực vật Chẩn đốn bệnh cây nĩi chung và chẩn đốn bệnh virus hại cây trồng nĩi riêng cĩ nhiều phương pháp khác nhau, trong đĩ phương pháp đơn giản nhất cĩ thể tiến hành ngay trên đồng ruộng là phương pháp quan sát triệu chứng bệnh

Cây cà chua (Lycopersion esculentum Mill) bị nhiều lồi cơn trùng, bệnh

hại tấn cơng trên đồng ruộng Những triệu chứng do bệnh hại khĩ nhận biết hơn đặc biệt với các tác nhân gây bệnh cĩ triệu chứng khơng điển hình, dễ nhầm với bệnh khơng truyền nhiễm (bệnh do mơi trường khơng thuận lợi gây ra) Bệnh cĩ triệu chứng điển hình: xoăn ngọn lá, làm cho lá co quắp, cây thấp nhỏ, hoa phát triển kém, dễ bị rụng Nhiễm bệnh lúc cây cịn nhỏ cây sẽ bị xoăn

lá nhanh và khơng thể phát triển, khơng cĩ hoa quả, cây dẫn đến tàn lụi (Lê Lương Tề và cộng sự, 2005)

Trong điều tra ngồi đồng kết hợp với nhiều tài liệu tham khảo, chúng tơi đã phân nhĩm các dạng triệu chứng do virus gây hại cà chua ở các vùng điều tra năm 2012

Trên cây cà chua cĩ rất nhiều loại virus cùng phá hoại Một loại virus

cĩ thể cĩ nhiều triệu chứng tương đối giống nhau rất khĩ phân biệt Tuy nhiên, một số loại virus gây hại cà chua cĩ biểu hiện các tính chất tương đối đặc trưng

Qua các điểm điều tra, bệnh virus hại cà chua thể hiện thành các loại hình sau:

* Triệu chứng khảm vàng (hình 4.1)

Triệu chứng bệnh có thể xuất hiện trong suốt thời kỳ sinh trưởng phát triển của cây nhưng triệu chứng bệnh ñặc trưng từ giai ñoạn phân cành ñến thu hoạch quả Lá mới bị bệnh thường có vết khảm xanh vàng xen kẽ Lá bị bệnh thường vàng từ gốc lá, lá hơi cong xuống, bề mặt lá gồ ghề

Dạng triệu chứng quan sát rõ trên lá bánh tẻ, lá gần ngọn Quả trên cây bị bệnh thường nhỏ, bị khảm vàng loang lổ hoặc bị biến vàng ñôi khi

có vết ñốm Cây nhiễm bệnh chậm sinh trưởng phát triển hơn cây không nhiễm bệnh

* Triệu chứng xoăn vàng lá (hình 4.2)

Bệnh xoăn vàng lá xuất hiện từ giai ñoạn cây con ñến khi thu hoạch Lá cây bị bệnh thường cong lõm và bị biến vàng từ mép lá vào trong Triệu chứng ñiển hình thường quan sát thấy ở lá bánh tẻ, lá non gần ngọn Cây bị bệnh các lá ngọn nhỏ, mép lá cong lên và xoăn lại, lá có dạng hình thìa Lúc ñầu phần thịt lá vàng, gân lá xanh, sau ñó biến vàng toàn bộ lá Toàn bộ phần ngọn xoăn vàng, mọc thẳng ñứng, hơi giòn dễ gãy Bệnh xuất hiện càng sớm trên ñồng ruộng thì thiệt hại càng nghiêm trọng, làm cây cà chua chùn lại, hấp cây, phân nhiều nhánh, sau một thời gian cây sẽ chết, những cây còn sống thì thường không cho hoa, quả hoặc cho ít hoa quả và quả thường nhỏ, chất lượng kém

* Triệu chứng khảm lá dương xỉ (hình 4.3)

Triệu chứng này thường xuất hiện vào giai ñoạn phân cành Cây nhiễm bệnh thường còi cọc Cây nhiễm bệnh nặng làm lá trên bánh tẻ, lá gần ngọn bị biến dạng, mất thùy, chỉ còn gân lá dạng dương xỉ Cây bệnh thấp lùn hơn hẳn

so với cây không nhiễm bệnh Cây nhiễm bệnh sớm làm cây sinh trưởng phát riển chậm lại Cây bệnh thường có ít hoa, quả nhỏ, biến dạng cong queo

* Triệu chứng cuốn lá, cây thấp lùn (hình 4.4)

Triệu chứng bệnh thường xuất hiện từ giai ñoạn cây con cho ñến phân cành Lá bệnh cuốn dạng hình thìa hoặc cuộn tròn lại, gây biến dạng lá Trên

lá cây bệnh còn xuất hiện các vết ñốm chết hoại, màu ñen Cây bệnh thường thấp, sinh trưởng phát triển kém Cây nhiễm bệnh nặng thấp lùn hơn hẳn so với cây không nhiễm bệnh Cây nhiễm bệnh nặng thường rất hoa, hoa dễ rụng, quả ít và nhỏ

Hình 3.1 Triệu chứng khảm vàng Hình 3.2 Triệu chứng xoăn vàng lá

Hình 3.3 Triệu chứng khảm dương xỉ Hình 3.4 Triệu chứng cuốn lá, cây lùn

3.1.2 Tình hình bệnh virus hại cà chua dựa vào loại hình triệu chứng tại một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng năm 2012 – 2013

Với các triệu chứng ñược phân loại ở trên, chúng tôi tiến hành ñánh giá mức ñộ phổ biến của từng loại triệu chứng bệnh do virus gây ra với từng giai

ñoạn sinh trưởng phát triển của cây cà chua vụ xuân hè năm 2013 tại một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng Kết quả thu ñược tại bảng 3.1

Bảng 3.1 Tình hình bệnh virus hại cà chua theo loại hình triệu chứng tại một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng vụ xuân hè 2013

Tỷ lệ cây nhiễm theo loại hình triệu chứng (%) Giai ñoạn sinh

lá

Khảm lá dương xỉ

Kết quả ñiều tra diễn biến bệnh virus tại Hà Nội và một số tỉnh ñồng bằng Sông Hồng cho thấy bệnh virus hại cà chua vụ xuân hè năm 2013 phát triển mạnh, số cây biểu hiện triệu chứng bệnh lên ñến trên 70% Qua số liệu ở bảng 4.1 cho thấy có tất cả 04 dạng triệu chứng xuất hiện trên cây cà chua bị nhiễm virus tại các ñịa ñiểm ñiều tra bao gồm: xoăn vàng lá, khảm vàng, khảm lá dương xỉ và dạng triệu chứng hỗn hợp Trong số các dạng triệu chứng xuất hiện, chúng tôi nhận thấy dạng triệu chứng xoăn vàng lá chiếm tỉ

lệ cao nhất lên ñến 70,10% khi cây ở giai ñoạn thu hoạch quả Dạng triệu chứng này do các loài virus thuộc chi Begomovirus gây Chúng tôi ñã tiến hành lấy mẫu

ñể giám ñịnh chính xác loài virus gây ra triệu trứng này trên cà chua

Cũng trong kết quả từ bảng trên cho thấy tỷ lệ bệnh virus tăng nhanh vào giai ñoạn cây ñẻ nhánh và kéo dài ñến khi cây có lứa quả ñầu tiên

Các triệu chứng khảm vàng lá và khảm lá dương xỉ xuất hiện với tỷ lệ thấp Tỷ lệ cây bị nhiễm từ 2 triệu chứng trở lên (triệu chứng hỗn hợp) xuất hiện nhiều và ñạt cao nhất ở cuối vụ là 10,60%

3.1.3 Kết quả ñiều tra tình hình bệnh xoăn vàng lá cà chua và mật ñộ bọ phấn trên cà chua tại Hà Nội và một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng năm 2012 - 2013

Cây cà chua là loại rau ăn quả mang lại giá trị kinh tế cao Những năm gần ñây, người nông dân thuộc các tỉnh ñồng bằng Sông Hồng ñã và ñang chuyển ñổi cơ câu cây trồng từ trồng lúa sang trồng rau, trong ñó cà chua là loại rau ñược quan tâm nhiều nhất

Trong quá trình ñi ñiều tra bệnh trên ñồng ruộng, người dân cho biết bệnh xoăn vàng lá cà chua là bệnh nguy hiểm, tỷ lệ bệnh rất cao có thể ñạt 100% và gây thiệt hại kinh tế lớn nhât Người dân chưa có biện pháp phòng trừ chủ ñộng Theo chúng tôi khảo sát thì biện pháp chủ yếu ñược áp dụng là nhổ bỏ cây bị bệnh Tuy nhiên, biện pháp này không mang lại hiệu quả Chính vì vậy, ñể góp phần vào công tác nghiên cứu xác ñịnh quy luật phát sinh phát triển của bệnh, cũng như ñưa ra những khuyến cáo về biện pháp phòng trừ cho người nông dân, chúng tôi ñã tiến hành ñiều tra diễn biến bệnh xoăn vàng lá trên cánh ñồng cà chua vụ thu ñông và vụ xuân hè năm 2012 - 2013 tại Hà Nội và một số tỉnh thuộc ñồng bằng Sông Hồng

3.1.3.1 Diễn biến của bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Perfect 89 và Racha năm 2012- 2013 tại Gia Lâm – Hà Nội

Chúng tôi tiến hành ñiều tra mật ñộ bọ phấn B tabaci và bệnh xoăn

vàng lá trên hai giống cà chua Perfect 89 và Racha ðây là hai giống ñược trồng khá rộng rãi, cho năng suất cao, mẫu quả ñẹp và có khả năng kháng

nhiều loại sâu bệnh Trong quá trình ñiều tra các hộ nông dân cho biết bệnh xoăn vàng lá cà chua là bệnh gây hại nặng trong mỗi vụ cà chua, ñồng thời họ cũng biết giống Perfect 89 là giống cà chua bị nhiễm bệnh nặng hơn so với những giống cà chua khác trồng tại thôn Vàng – Cổ Bi Mặc khác, do bên cạnh ruộng cà chua giống Perfect 89 có một ruộng trồng dưa chuột, ñây là một loại cây ký chủ rất thích hợp cho bọ phấn phát triển, vì vậy ñã làm cho tỷ

lệ bệnh và mật ñộ bọ phấn trên giống Perfect 89 là khá cao Kết quả ñiều tra ñược thể hiện qua bảng sau 3.2 và biểu ñồ 3.1

Bảng 3.2 Diễn biến của bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống

cà chua Perfect 89 và Racha vụ xuân hè năm 2013 tại xã Cổ Bi - Gia Lâm

– Hà Nội Giống Perfect 89 Giống Racha STT Giai ñoạn

sinh trưởng TLB (%) MðBP (con/lá) TLB (%) MðBP (con/lá)

Biểu ðồ 3.1 : Diễn biến bệnh xoăn vàng lá và mật ñộ bọ phấn trên giống cà chua Perfect 89 và Racha vụ xuân hè năm 2013

tại xã Cổ Bi – Gia Lâm – Hà Nội

Qua bảng 3.2 và biểu ñồ 3.1 cho thấy cả hai giống Perfect 89 và Racha ñều nhiễm bệnh xoăn vàng lá, giống Perfect 89 có tỷ lệ bệnh cao hơn so với giống Racha Ở thời ñiểm quả xanh già, tỷ lệ bệnh trên giống Perfect 89 là 10,4% và giống Racha là 8,8%

Trên giống Perfect 89 nhiễm bệnh sớm hơn giống Racha Tỷ lệ bệnh vào giai ñoạn phân cành trên giống Perfect 89 là 0,8%, trên giống Racha bệnh xuất hiện sau ñó một tuần với tỷ lệ bệnh là 1,2% Tỷ lệ bệnh trên hai giống ñều tăng từ giai ñoạn phân cành, và tăng nhanh nhất từ ở giai ñoạn quả xanh Trên giống Perfect 89 là từ 8,0% ñến 9,6% (tăng 1,6%) và trên giống Racha là

từ 6,0% ñến 7,6% (tăng 1,6%)