Nghiên cứu điều kiện thích hợp cho lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn biển HP411

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật biển sinh kháng sinh, xác định thành phần môi trường lên men, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men trong phòng thí nghiệm là cơ sở bước đầu cho

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, trước tiên em xin bày tỏ lòng biết

ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Phương Nhuệ, Th.S Phạm Thanh Huyền , Viện Công

nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã tận tình hướng

dẫn, giúp đỡ, truyền đạt những kiến thức, tài liệu quý không chỉ trong quá trình học

tập, nghiên cứu mà trong cả cuộc sống trong gần một năm nay Tôi xin cảm ơn các

cán bộ Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học đã khuyến khích và tạo

điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu.

Em cũng xin cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Công nghệ sinh học,

cùng các thầy cô trong Hội đồng bảo vệ, Viện Đại học Mở Hà Nội có những nhận

xét quý báu cho khóa luận này, và đã tạo mọi điều kiện cho em được học tập, làm

việc trong môi trường chuyên biệt, định hướng nghề nghiệp cho sinh viên trong

khoa nói chung và bản thân em nói riêng.

Cuối cùng tôi xin gửi tới gia đình và bạn bè, những người thân yêu nhất của

tôi đã luôn đồng hành, động viên, chia sẻ, góp ý và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi

MỤC LỤC

L I C M NỜ Ả Ơ i

M C L CỤ Ụ ii

DANH M C CH VI T T TỤ Ữ Ế Ắ iv

DANH M C CÁC B NGỤ Ả v

DANH M C CÁC HÌNH NH, Đ THỤ Ả Ồ Ị vi

M Đ U Ở Ầ 1

PH N I T NG QUAN TÀI LI U Ầ Ổ Ệ 3

1.1 CH T KHÁNG SINH Ấ 3

1.1.1 S l c v ch t kháng sinhơ ượ ề ấ 3

1.1.2 Ch t kháng sinh t vi sinh v t bi nấ ừ ậ ể 5

1.2 T NG QUAN V X KHU N VÀ S HÌNH THÀNH CH T KHÁNG Ổ Ề Ạ Ẩ Ự Ấ SINH T X KHU N Ừ Ạ Ẩ 10

1.2.1 Đ c đi m chung c a x khu nặ ể ủ ạ ẩ 10

1.2.2 Đ c đi m ặ ể sinh h c c a x khu nọ ủ ạ ẩ 10

1.2.3 S sinh tr ng c a x khu nự ưở ủ ạ ẩ 13

1.2.4 S hình thành ch t kháng sinh t x khu nự ấ ừ ạ ẩ 14

1.2.5 Các y u t nh h ng đ n quá trình sinh kháng sinh c a x khu nế ố ả ưở ế ủ ạ ẩ .17

1.2.6 Tình hình nghiên c u v ứ ề VSV bi n sinh kháng sinh trong và ngoài ể n cướ 19

PH N II.V T LI U VÀ PH Ầ Ậ Ệ ƯƠ NG PHÁP 22

2.1 V T LI U Ậ Ệ 22

2.1.1 Ch ng gi ng vi sinh v tủ ố ậ 22

2.1.2 Hóa ch tấ 22

2.1.3 Thi t b chínhế ị 23

2.1.4 Môi tr ngườ 23

2.2 PH ƯƠ NG PHÁP NGHIÊN C U Ứ 23

2.2.1.Ph ng pháp ươ b o qu n gi ngả ả ố 23

2.2.2 Nghiên c u đ c đi m sinh h c, phân lo i x khu nứ ặ ể ọ ạ ạ ẩ 24

2.2.3 Ph ng pháp nghiên c u các y u t nh h ng đ n quá trình lên ươ ứ ế ố ả ưở ế men 27

2.2.4 Xác đ nh đ ng thái c a quá trình lên menị ộ ủ 28

2.2.5 Ph ng pháp xác đ nh ho t tính kháng sinhươ ị ạ 28

2.2.6 Tách chi t ch t kháng sinhế ấ 29

PH N III K T QU VÀ TH O LU N Ầ Ế Ả Ả Ậ 30

3.1 Đ C ĐI M SINH H C VÀ PHÂN LO I CH NG X KHU N HP411 Ặ Ể Ọ Ạ Ủ Ạ Ẩ 30

3.1.1 Đ c đi m nuôi c y ch ng x khu n HP411ặ ể ấ ủ ạ ẩ 30

3.1.2 Đ c đi m hình thái c u t o và b m t chu i bào tặ ể ấ ạ ề ặ ỗ ử 32

3.1.3 Đ c đi m sinh lý, sinh hoáặ ể 32

3.1.4 K t qu phân lo i ch ng x khu nế ả ạ ủ ạ ẩ 38

3.2 CÁC Y U T NH H Ế Ố Ả ƯỞ NG Đ N QUÁ TRÌNH LÊN MEN SINH CH T Ế Ấ KHÁNG SINH T CH NG X KHU N HP411 Ừ Ủ Ạ Ẩ 41

3.2.1 L a ch n môi tr ng lên men thích h pự ọ ườ ợ 41

3.2.2 nh h ng c a hàm l ng các ngu n dinh d ng môi tr ng lên Ả ưở ủ ượ ồ ưỡ ườ men 42

3.2.3 nh h ng môi tr ng nhân gi ngẢ ưở ườ ố 42

3.2.4 nh h ng c a t l gi ng và th i gian nhân gi ngẢ ưở ủ ỷ ệ ố ờ ố 43

3.2.5 nh h ng pH ban đ u đ n quá trình lên menẢ ưở ầ ế 44

3.2.6 nh h ng c a đ thông khíẢ ưở ủ ộ 45

3.2.7 Đ ng thái c a quá trình lên men sinh t ng h p kháng sinh c a ộ ủ ổ ợ ủ HP411 46

3.3 NGHIÊN C U M T S ĐI U KI N TÁCH CHI T CH T KHÁNG Ứ Ộ Ố Ề Ệ Ế Ấ KHU N T D CH LÊN MEN CH NG HP411 Ẩ Ừ Ị Ủ 46

3.3.1 nh h ng c a nhi t đ và pH đ n ho t tính kháng khu n ch ng Ả ưở ủ ệ ộ ế ạ ẩ ủ HP411 46

3.3.2 L a ch n dung môi tách chi t ch t kháng khu n.ự ọ ế ấ ẩ 48

K T LU N VÀ KI N NGH Ế Ậ Ế Ị 50

TÀI LI U THAM KH O Ệ Ả 51

PH L CỤ Ụ

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

ĐKVVK Đường kính vòng vô khuẩn

TNTĐCNG Thí nghiệm trọng điểm công nghệ gene

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển 15

Bảng 3.1 Đặc điểm nuôi cấy của chủng xạ khuẩn HP411 trên các môi trường ISP31 Bảng 3.2 Đặc điểm của bề mặt bào tử và cuống sinh bào tử 32

Bảng 3.3 Khả năng sử dụng các nguồn đường khác nhau của chủng HP411 33

Bảng 3.4 Khả năng sử dụng các nguồn nitơ của chủng xạ khuẩn HP411 35

Bảng 3.5 Khả năng sinh trưởng của chủng HP411 ở các nhiệt độ khác nhau 36

Bảng 3.6 Khả năng sinh trưởng của chủng HP411 ở các giá trị pH khác nhau 37

Bảng 3.7 Khả năng sinh trưởng của chủng HP411 trên các nồng độ NaCl 37

Bảng 3.8 So sánh đặc điểm phân loại của chủng xạ khuẩn HP411 với chủng chuẩn Streptomyces variabilis ISP 5179 38

Bảng 3.9 Kết quả so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA của chủng HP411 với gen tương ứng của các chủng vi khuẩn được đăng ký trên GenBank 40

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của hàm lượng tinh bột, glucose và peptone tới hoạt tính kháng khuẩn của chủng HP411 42

Bảng 3.11 Khả năng sinh kháng sinh của HP411 trên môi trường lên men M1ASW khi sử dụng các môi trường nhân giống khác nhau 42

Bảng 3.12 Ảnh hưởng của tỉ lệ tiếp giống tới hoạt tính kháng khuẩn của HP411 43

Bảng 3.13 Ảnh hưởng của thời gian nhân giống đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng HP411 43

Bảng 3.14 Ảnh hưởng của giá trị pH ban đầu lên khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng HP411 44

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của độ thông khí lên khả năng sinh chất kháng khuẩn của chủng HP411 45

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng HP41 46

Bảng 3.17 Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính kháng khuẩn của chủng HP411 47

Bảng 3.18 Hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ dịch lên men chủng HP411 bằng các dung môi khác nhau 48

DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Cơ chế tác động của kháng sinh 4

Hình 1.2 Cấu trúc của Abyssomicin C, Daryamides và Trioxacacins 6

Hình 1.3 Cấu trúc của Proximicins và Mechercharmycin A 7

Hình 1.4 Cấu trúc của salinosporamide 7

Hình 1.5 Cấu trúc của Lajollamycin 8

Hình 1.6 Cấu trúc của Altemicidin và Isomarinone 8

Hình 1.7 Cấu trúc của Diazepinomicin và Chandrananimycin 9

Hình 1.8 Hình dạng cuống sinh bào tử và hình thái xạ khuẩn 13

Hình 3.1 Màu sắc của chủng HP411 nuôi cấy trên các môi trường ISP 30

Hình 3.2 Hình thái khuẩn lạc của chủng HP411 trên môi trường ISP2 31

Hình 3.3 Cuống sinh bào tử và chuỗi bào tử của chủng HP411 32

Hình 3.4 Khả năng sử dụng nguồn đường của chủng HP411 33

Hình 3.5 Khả năng sinh trưởng của chủng HP411 ở các nhiệt độ khác nhau 36

Hình 3.6 Sinh trưởng của chủng HP411 ở pH khác nhau 37

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm PCR trên gel agaroza 1% 39

Hình 3.8 Cây phát sinh chủng loại của chủng HP411 40

Hình 3.9 Khả năng sinh chất kháng khuẩn của HP411 trên các MT lên men 41

Hình 3.10 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh chất kháng khuẩn của chủng HP411 45

Hình 3.11 Đồ thị động thái quá trình lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn của chủng HP411 46

Hình 3.12 Sự tích lũy chất kháng khuẩn trong quá trình tích lên men của HP411 46

MỞ ĐẦU

Kháng sinh là loại thuốc thiết yếu dùng để phòng chống bệnh nhiễm trùng

cho con người Theo thống kê, Việt Nam thuộc vào những nước nhập khẩu thuốc

nhiều nhất trên thế giới, hàng năm khoảng 350-400 triệu USD Do vậy, định hướng

nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học tiên tiến, phù hợp với điều kiện kinh tế,

nhằm phát triển sản xuất kháng sinh ở Việt Nam là rất cần thiết

Chất kháng sinh có thể được thu nhận ở nhiều sinh vật khác nhau: động vật,

thực vật và vi sinh vật, trong đó chất kháng sinh có nguồn gốc từ vi sinh vật chiếm

hơn 98% các thuốc kháng sinh đang lưu hành hiện nay Theo thống kê thì trong

khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới có trên 80% là do

xạ khuẩn sản sinh ra (Berdy 2005; Goodfellow 1988) Ngày nay, do sự phổ biến của

hiện tượng đa kháng thuốc, việc tìm ra một nguồn kháng sinh mới có ý nghĩa vô

cùng quan trọng trong việc bảo vệ con người chống lại bệnh tật và nâng cao sức

khỏe của cộng đồng Để tìm ra kháng sinh mới, thì việc lựa chọn các chủng xạ

khuẩn sống trong điều kiện môi trường đặc biệt như: độ mặn cao, pH lớn, nhiệt độ

cao hoặc ở các môi trường có sự canh tranh cao là các ưu tiên hàng đầu Môi

trường biển là một trong những môi trường có thể đáp ứng đầy đủ các yếu tố đó

Việt Nam có một vùng biển đặc quyền kinh tế khoảng 1.000.000 km2 của vùng Biển

Đông, điều kiện khí hậu nhiệt đới gió mùa cũng tạo cho nước ta tính đa dạng về

cảnh quan tự nhiên và nguồn lợi thuỷ sinh vật Đây là nơi chứa đựng đầy hứa hẹn

các hợp chất kháng sinh mới trong tương lai

Việc lựa chọn các chủng vi sinh vật biển sinh kháng sinh, xác định thành phần môi

trường lên men, các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men trong phòng thí nghiệm

là cơ sở bước đầu cho việc lên men sản xuất thuốc kháng sinh sau này

Với những mục tiêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu điều kiện

thích hợp cho lên men sinh tổng hợp chất kháng khuẩn từ chủng xạ khuẩn biển

HP411” với các nội dung chính như sau:

1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại chủng xạ khuẩn HP411

2 Lựa chọn một số điều kiện thích hợp cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp

chất kháng khuẩn của chủng xạ khuẩn HP411

3 Sơ bộ nghiên cứu một số điều kiện tách chiết chất kháng sinh thô từ dịch lên

men chủng xạ khuẩn HP411

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 CHẤT KHÁNG SINH

1.1.1 Sơ lược về chất kháng sinh

Năm 1942, A.A Waksman người đoạt giải Nobel với công trình phát minh ra

streptomycin, lần đầu tiên đưa ra thuật ngữ “antibiotic” hay kháng sinh “Kháng

sinh là một chất do vi sinh vật sản sinh ra có khả năng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu

diệt các vi sinh vật khác” Ngày nay, thuật ngữ kháng sinh được hiểu theo nghĩa

rộng hơn: “Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác

dụng ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các vi sinh vật gây bệnh, đồng thời

không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật” [9, 19].

Cho đến nay, các nhà khoa học công bố đã phát minh được hơn 10.000 chất

kháng sinh tự nhiên, trong số này khoảng 100 chất thực vật do thực vật tạo ra, còn

khoảng hơn 7000 chất do các loài vi sinh vật tổng hợp, trong số này khoảng 100

chất đã được ứng dụng trong y học và một số lĩnh vực khác Mặt khác, từ những

kháng sinh đã biết các nhà nghiên cứu đã điều chế được hàng ngàn dẫn chất mới là

các kháng sinh bán tổng hợp và trong số này khoảng 50 chất cũng đã được đưa vào

sử dụng Đồng thời có 2 kháng sinh được sản xuất hoàn toàn bằng tổng hợp hóa học

đó là cloramphenicol và pyrrolnitrin [2]

Nồng độ thấp nhất của một chất kháng sinh có khả năng ức chế hoàn toàn sự

sinh trưởng của một hoặc một vài chủng vi sinh vật xác định, được gọi là nồng độ

ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration – MIC) chất kháng sinh có giá

trị nồng độ ức chế tối thiểu với vi sinh vật nào mà thấp thì hoạt tính kháng sinh cao

đối với vi sinh vật ấy [2, 9]

Các chất kháng sinh có phổ tác dụng khác nhau, ví dụ: Cloramphenicol và

tetraxyclin có tác dụng trên nhiều loài vi khuẩn gây bệnh nên được xếp vào loại có

phổ tác dụng rộng, một số kháng sinh khác chỉ có tác dụng trên một hoặc một số

loại vi khuẩn nên được xếp vào loại KS có phổ tác dụng hẹp Có chất kháng sinh

chỉ ức chế vi khuẩn Gram (+), có loại chỉ ức chế vi khuẩn Gram (-), có loại ức chế

cả nấm men, nấm mốc nên phổ kháng khuẩn của chúng rộng hẹp khác nhau Phổ

kháng khuẩn cũng được xem như là một chỉ tiêu để phân loạichất kháng sinh [9]

Độ lớn giá trị hoạt tính kháng sinh trong 1ml dung dịch (đơn vị/ml) hay 1mg

chế phẩm (đơn vị/mg) thường được thể hiện bằng đơn vị kháng sinh Đơn vị kháng

sinh là lượng kháng sinh tối thiểu hòa tan trong một thể tích môi trường xác định

(mcg/ml), có tác dụng ức chế hay tiêu diệt vi sinh vật kiểm định, trong thời gian xác

định [8] Đơn vị kháng sinh quốc tế là UI, ví dụ 1 UI penicillin = 0,6mcg, còn 1 UI

Streptomycin = 1,0mcg [9, 18]

Cơ chế tác động của chất kháng sinh phụ thuộc vào bản chất hóa học, nồng

độ chất kháng sinh, cấu trúc hiển vi của tế bào vi sinh vật và điều kiện biểu hiện

chúng Các chất kháng sinh tác dụng cơ bản đến tế bào thông qua việc ức chế các

phản ứng tổng hợp khác nhau của tế bào vi sinh vật gây bệnh Chúng liên kết vào

các vị trí chính xác hay các phân tử đích của tế bào vi sinh vật để tạo ra các phản

ứng làm thay đổi quá trình trao đổi chất [2, 9, 18] Có 6 mức tác dụng khác nhau đối

với tế bào vi khuẩn hoặc vi nấm: thành tế bào,màng sinh chất, quá trình sao chép,

phiên mã, dịch mã và trao đổi chất trung gian (Hình 1.1)

Ghi chú: PABA: paraminobenzoic acid; DHFA: dihydrofolic acid;THFA:

tetrahydrofolic acid

Hình 1.1 Cơ chế tác động của kháng sinh 1.1.2 Chất kháng sinh từ vi sinh vật biển

Hệ sinh thái biển có một số tính năng đặc biệt khiến nó khác biệt với các hệ

sinh thái thủy sinh khác, yếu tố đó chính là do sự hiện diện của các hợp chất hòa tan

trong nước biển,đặc biệt là natriclorua (NaCl) Môi trường biển là một hệ sinh thái

rộng lớn chưa được khám phá hết, thách thức các nhà khoa học tìm kiếm các loại

kháng sinh mới Đã có trên 1000 loại thuốc có nguồn gốc từ vi sinh vật trên cạn

nhưng tiềm năng này đã giảm đi từ gần 10 năm trở lại đây Các nhà dược học đã tìm

kiếm các loài vi sinh vật trên cạn có khả năng tạo ra thuốc nhưng kết quả thu được

rất khiêm tốn [11]

Trong những năm gần đây, một số loài vi sinh vật ưa mặn có khả năng sinh

tổng hợp các hợp chất thứ cấp đã được mô tả Một chủng vi khuẩn ưa mặn là

Bacillus licheniformis 603 được các nhà khoa học Nga tìm thấy ở vùng nước nóng ở

độ sâu 2100m, chủng này có thể sinh trưởng được ở nồng độ muối 15%, nhiệt độ

15-550C, pH 5,1-9,8 và sinh ra chất antiadhesin Gần đây, một chất kháng sinh mới

là 7-O-Malonyl Macrolactin thuộc nhóm macrolactin mới được phát hiện từ chủng

Bacillus subtilis có khả năng ức chế chủng Staphylococus aureus kháng methicillin,

cầu khuẩn đường ruột kháng vancomycin và một biến thể khuẩn lạc nhỏ của B.

Cepacia [23] Đây là những phát hiện có ý nghĩa góp phần ngăn chặn hiện tượng

kháng kháng sinh ở các chủng sinh vật gây bệnh

Tốc độ tìm kiếm các chất kháng sinh trong thời gian gần đây vẫn diễn ra

nhanh chóng, với hàng loạt các chất kháng sinh mới được tìm ra, nhất là các chất

kháng sinh có nguồn gốc từ các vi sinh vật biển

1.1.2.1 Nhóm chất kháng sinh polyketides

Polyketides là một họ các chất chuyển hóa bậc hai được hình thành bởi sự xúc

tác của enzyme polyketides synthases (PKSs) Khung Cacbon của polyketide được

khử và biến đổi bởi những khu vực khác nhau trong PKSs cùng với các enzyme

ketoreductase, dehydratase và enoylreductase Có 3 loại PKSs khác nhau đã được

biết cho đến ngày nay: PKSs loại I là những enzyme đa chức năng PKSs loại II là

phức hợp của nhiều enzyme, cùng tạo nên cấu trúc của chuỗi polyketide và PKSs

loại III [14]

Abyssomicin C (Riedlinger J, Reicke A; 2004) là kháng sinh có nguồn gốc từ

xạ khuẩn biển Verrucosispora sp Abyssomicin C có khả năng kháng lại các vi

khuẩn G+, bao gồm cả những vi khuẩn gây bệnh đã kháng vancomycin như

Staphylococus aureus [14, 22].

Daryamides (Asolkar et al., 2006) là polyketides gây độc cho tế bào được

phân lập từ dịch nuôi cấy của xạ khuẩn Streptomyces sp chủng CNQ-085 Chất này

có khả năng gây độc cho tế bào ung thư biểu mô ở người, dòng HCT-116 và có khả

năng kháng nấm Candida albicans [19, 22].

Trioxacarcin lần đầu tiên được phân lập vào năm 1981 từ Streptomyces

bottropensis DO-45 Chúng có khả năng chống lại các tế bào ung thư khác nhau, có

hoạt tính kháng vi khuẩn G- và G+ và kháng trùng sốt rét Trioxacarcin A có khả

năng tạo liên kết cộng hóa trị với đoạn DNA sợi kép d(AACCGGTT) [14]

Hình 1.2 Cấu trúc của Abyssomicin C, Daryamides và Trioxacacins

1.1.2.2 Nhóm kháng sinh non-ribosomal peptide

Proximicins là kháng sinh được tạo ra bởi xạ khuẩn Verrucosispora sp MG37

và Verrucosispora maris AB-18-032, chúng được phân lập từ các mẫu trầm tích

dưới độ sâu 250m ở Raune Fjord, Na-uy và ở biển Nhật Bản độ sâu 289m

Proximicins (A, B, C) có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào ung thư biểu

mô dạ dày và ung thư biểu mô gan [14]

Mechercharmycins được sản xuất bởi xạ khuẩn Thermoactinomyces sp

YM3-251; được phân lập từ bùn ở Macherchar nước cộng hòa Palau (Bắc Thái Bình

Dương) Mechercharmycin A có khả năng gây độc cho tế bào ung thư tuyến biểu

mô phổi dòng A549 và tế bào ung thư bạch cầu [14]

Hình 1.3 Cấu trúc của Proximicins và Mechercharmycin A

1.1.2.3 Nhóm kháng sinh phức hợp polyketide-nonribosomal peptide

Hình 1.4 Cấu trúc của salinosporamide

Salinosporamide A (NPI-0052) là kháng sinh mới có cấu trúc

β-lactone-γ-lactam (C15H20O4NCl) tách từ dịch lên men của xạ khuẩn biển Salinispora tropica

được phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở độ sâu 1m tại biển Chab Cay, Bahamas

NPI-0025 là chất ức chế proteasome 20S gây ra hiện tượng apoptosis trong tế bào u

tủy và kháng lại tế bào ung thư ruột kết NPI-0025 đã được thử nghiệm lâm sàng

bởi hãng dược phẩm Nereus Pharmaceuticals vào năm 2006 và có tiềm năng là một

chất kháng ung thư có giá trị trong tương lai [14, 22, 26]

Lajollamycin là kháng sinh được tạo thành từ chủng xạ khuẩn S Nodosus

NPS007994 phân lập từ các mẫu trầm tích biển ở Scripps Canyon, La Jolla,

California Lajollamycin có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng của tế bào u melanin

dòng B16-F10 ở chuột; ngoài ra chất này còn được Manam và cộng sự (2005) xác

đinh là có khả năng gây độc cho tế bào vi khuẩn [15]

Hình 1.5 Cấu trúc của Lajollamycin 1.1.2.4.Nhóm kháng sinh isoprenoid

Hình 1.6 Cấu trúc của Altemicidin và Isomarinone

Altemicidin là kháng sinh có bộ khung vòng đơn terpen-alkaloid, được hình

thành từ chủng xạ khuẩn biển S sioyaensis SA1758 được phân lập từ mẫu bùn ở

Gamo, Miyagi Prefecture, Nhật Bản Chất này có khả năng kìm hãm sự sinh trưởng

của tế bào ung thư bạch cầu Lympho L1210 và ung thư biểu mô dòng IMC [14]

Altemicidi

Altemicidin

Altemicidin

Altemicidin

Altemicidin

Altemicidin

Altemicidi

Marinones có cấu trúc một vòng rưỡi terpen Marinones và nhiều chất có

hoạt tính khác được tạo ra từ chủng xạ khuẩn CNH099 phân lập từ độ sâu 1m ở

Batiquitos Lagoon, Bắc San Diego, Califorlia Những chất này có khả năng gây độc

tế bào ung thư ruột kết ở người dòng HCT116 trong điều kiện invitro [14].

Glaciapyrroles (A, B, C) là kháng sinh được hình thành từ xạ khuẩn Streptomyces

sp chủng NPS008187 Nhóm kháng sinh này đã được Macherla (2005) tìm ra có

khả năng kháng khuẩn [19]

1.1.2.5 Các chất kháng sinh khác

Diazepinomicin (ECO-4601) được phát hiện vào năm 2004 bởi Charan và

cộng sự (Newyork, USA) ECO-4601 có nguồn gốc từ Micromonospora sp., có

hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm và kháng tế bào ung thư ECO-4601 có phổ

kháng rộng chống lại tế bào u vú, u thần kinh đệm và u tiền liệt tuyến Loại kháng

sinh này đã được thử nghiệm lâm sàng tại Canada vào năm 2006 [20, 22]

Chandrananimycins được hình thành từ xạ khuẩn Actinomadura sp chủng

M048 được phân lập từ vịnh Jiaozhou, Trung Quốc Chandrananimycins có khả

năng chống lại tế bào khối u ruột kết, u melanin, u phổi, u vú, u tuyến tiền liệt và u

tuyến thận; ngoài ra chất kháng sinh này còn có khả năng kháng khuẩn và nấm [14]

Helquinoline (C12H15O3N) là kháng sinh hình thành từ Janibacter limosus

Chất kháng sinh này có khả năng kháng Bacillus subtilis, Streptomyces

virdochromogenes Tu57 và Staphylococcus aureus [19, 22].

Hình1.7 Cấu trúc của

Diazepinomicin và Chandrananimycin

Diazepinomicin

1.2 TỔNG QUAN VỀ XẠ KHUẨN VÀ SỰ HÌNH THÀNH CHẤT KHÁNG

SINH TỪ XẠ KHUẨN

1.2.1 Đặc điểm chung của xạ khuẩn

Xạ khuẩn (Actinomycetales) là nhóm vi sinh vật đơn bào hay vi khuẩn thật,

phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước ao hồ, nước biển, một phần

trong bùn, lớp trầm tích và trong các chất hữu cơ khác Ví dụ như sự có mặt của xạ

khuẩn trong các trầm tích biển: loài Actinomyces Mortivalis, Actinomyces halophia,

Streptomycesantibioticus, Streptomyces sp Streptomyces nodosus,

Micromonospora sp… [19, 26] Một vài loài có thể gây bệnh cho động thực vật [4].

Phần lớn xạ khuẩn là các tế bào Gram (+), hoại sinh, có cấu tạo sợi phân

nhánh Xạ khuẩn được nghiên cứu một cách sâu sắc vì chúng có ý nghĩa quan trọng

trong tự nhiên: tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong

đất, trong nước, chúng có vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất của

tự nhiên Chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng khác nên đã

được dùng để sản xuất nhiều loại enzym như: protease, amilase, cellulase,

glucoizomerase, vitamin và các axit hữu cơ Nhưng đặc điểm quan trọng bậc nhất

của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh, trong đó 60-70% xạ khuẩn phân lập

được từ đất có khả năng này [6, 15] Trong số khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã

được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn Đây là kết quả của quá trình

đối kháng giữa các vi sinh vật và thúc đẩy quá trình tiến hóa của xạ khuẩn [4]

1.2.2.Đặc điểm sinh học của xạ khuẩn

a) Đặc điểm hình thái

Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của

chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm…)

Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, kích thước

thay đổi Mặt khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ

hay dạng màng dẻo, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu vào thạch với

nhiều màu sắc: đỏ, da cam, vàng, trắng, xanh tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng

môi trường [4, 6]

Tương tự nấm mốc, xạ khuẩn có hệ sợi rất phát triển, phân nhánh mạnh,

không có vách ngăn, đan chéo vào nhau trong hệ sợi sinh dưỡng dày đặc; nhưng lại

là cơ thể đơn bào, không có nhân thực và kích thước giống vi khuẩn [4, 32, 33]

Trên môi trường đặc, hệ sợi của xạ khuẩn phát triển thành 2 hướng tạo khuẩn ti cơ

chất và khuẩn ti khí sinh Khuẩn ti cơ chất phát triển cắm sâu vào trong môi trường

với chức năng chủ yếu là lấy nước và thức ăn, khuẩn ti cơ chất phát triển một thời

gian thì dài ra trong không khí tạo thành khuẩn ti khí sinh Khuẩn ti khí sinh phát

triển trên bề mặt thạch, có nhiệm vụ sinh sản, chúng thường mềm, xốp trông tựa

bông Người ta thường gọi khuẩn ti khí sinh là khuẩn ti thứ cấp để phân biệt với

khuẩn ti sơ cấp phát triển từ bào tử nảy mầm Khuẩn ti không mang bào tử gọi

chung là khuẩn ti dinh dưỡng

Khuẩn ti của xạ khuẩn thường mảnh hơn của nấm mốc, đường kính thay đổi

trong khoảng 0,2-1m đến 2-3m Đa số xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn

và không tự đứt đoạn Khuẩn ty cơ chất có thể tiết ra môi trường một số loại sắc tố:

có loại sắc tố tan trong nước, có loại chỉ tan trong dung môi hữu cơ Các sắc tố tạo

thành có thể hòa vào môi trường và nhuộm màu cho môi trường, nhưng trong đa số

trường hợp sắc tố có mối liên hệ chặt chẽ với nguyên sinh chất [4, 33]

b) Cấu tạo tế bào xạ khuẩn

Dưới kính hiển vi điện tử, cấu trúc tế bào xạ khuẩn có thể thấy rõ các thành

phần chính: thành tế bào, màng sinh chất, nguyên sinh chất, chất nhân, các thể ẩn

nhập Thành tế bào được cấu tạo dạng lưới, dày khoảng 10-20nm, có tác dụng duy

trì hình dạng khuẩn ty và bảo vệ tế bào Thành tế bào được cấu tạo từ các lớp

glucopeptid, gồm các gốc N-acetylglucozamin liên kết với acid N-acetylmuzamic

bằng liên kết 1,4-glucozit, gồm 3 lớp: lớp ngoài dày 60-120 Å, khi già có thể dày tới

150Å, lớp giữa rắn chắc dày 50Å và lớp trong dày 50Å Thành tế bào chứa nhiều

enzym tham gia vào quá trình trao đổi chất và quá trình vận chuyển vật chất qua

màng tế bào Trên thành tế bào xạ khuẩn còn có các lỗ cho phép các hợp chất có

phân tử lượng lớn như các chất kháng sinh, acid amin, enzym và nhiều hợp chất

khác đi qua một cách dễ dàng, đồng thời các hợp chất dinh dưỡng từ môi trường

bên ngoài cũng được thẩm thấu qua một cách có chọn lọc [4, 6] Căn cứ vào kết cấu

hóa học người ta chia thành tế bào xạ khuẩn thành 4 nhóm:

- Nhóm CW I: có chứa L, L-DAP (diaminopimelat) và glycin Gồm các chi

Streptomyces, Streptoverticillium, Sporichthya, Nocardioides.

- Nhóm CW II: có chứa mezo-DAP (meso- diaminopimelat) và glycin

Thuộc nhóm này có Micromonospora, Actinoplanes, Ampullariella.

- Nhóm CW III: có chứa mezo-DAP Gồm các chi Dermatophilus,

Geodermatophilus, Frankia, …

- Nhóm CW IV: có chứa mezo-DAP, arabionose và galactose Gồm các chi

Nocardia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus,… [6].

Dưới lớp màng tế bào là màng nguyên sinh chất có vai trò quan trọng trong

trao đổi chất của tế bào và quá trình hình thành bào tử của xạ khuẩn

Do chất nhân chưa có màng bao bọc nên một trong những điểm đáng chú ý ở

xạ khuẩn là chúng không ổn định về mặt di truyền và thường xuyên xảy ra sự sắp

xếp lại trong phân tử ADN Điều này tạo nên tính đa dạng về hình thái cũng như

tính kháng thuốc của xạ khuẩn do sự xuất hiện của dị vòng Hơn nữa, những biến dị

này còn ảnh hưởng tới hiệu suất sinh hóa của các chủng xạ khuẩn, chúng ảnh hưởng

tới sự hình thành chất kháng sinh Khi nuôi cấy trên môi trường rắn của cùng 1

chủng, người ta thu được những khuẩn lạc mà một trong số đó sinh ra một lượng

lớn kháng sinh, những khuẩn lạc khác lại không sinh ra hoặc chỉ sinh một lượng

nhỏ kháng sinh [2]

Bào tử của chúng có dạng hình cầu, hình bầu dục, hình que, hình trụ… Dưới

kính hiển vi quang học, hình dạng của bào tử có vẻ ổn định nhưng khi quan sát dưới

kính hiển vi điện tử thì hình dạng chúng không ổn định, thậm chí trong một chuỗi

bào tử hình thái bào tử cũng có thể khác nhau Ngược lại kết cấu bề mặt ngoài của

bào tử lại tương đối ổn định Hình dạng, kích thước của bào tử không giống nhau

tùy thuộc vào loài, từng cá thể trong loài, thậm chí trên cùng một cuống cũng khác

nhau Bề mặt bào tử có thể nhẵn, có gai, khối u, nếp nhăn [4, 7] Bào tử xạ khuẩn

được bao bọc bởi lớp màng polysaccharide giàu protein gồm có 3 lớp, giúp cho bào

tử tránh được những bất lợi của ngoại cảnh như : nhiệt độ, độ ẩm, pH… Hình dạng,

kích thước của chuỗi bào tử và cấu trúc màng có thể thay đổi khi nuôi cấy trên các

môi trường có nguồn nitơ khác nhau [13]

Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), “nhân” của xạ khuẩn cùng loại với nhân

của vi khuẩn nhưng khác với các vi sinh vật không có nhân thực khác là tỉ lệ G + C

cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25-40% [4]

Một trong những đặc điểm đáng chú ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững

về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN Điều này gây

ra một số hiện tượng kì lạ khác: tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng thuốc

do sự xuất hiện của các dị vòng [4, 6]

Hình 1.8 Hình dạng cuống sinh bào tử và hình thái xạ khuẩn

1.2.3 Sự sinh trưởng của xạ khuẩn

Xạ khuẩn thuộc loài dị dưỡng, chúng sử dụng nguồn cacbon là tinh bột, các

loại đường (glucose, maltose, saccarose ) và các hợp chất polysacaride Nguồn

nitơ vô cơ thường là: nitrate, muối amon , nitơ hữu cơ thường là: pepton, cao ngô,

cao nấm men Khả năng đồng hóa các chất này ở các chủng xạ khuẩn khác nhau là

khác nhau Phần lớn chúng là các vi sinh vật hiếu khí và ưa ấm Xạ khuẩn ưa nhiệt

thường ít gặp, phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường có pH trung tính và hơi

kiềm, ở môi trường pH thấp hoặc quá kiềm xạ khuẩn không phát triển hoặc phát

triển kém Các chủng xạ khuẩn phát triển được ở nồng độ muối 3-5%, còn ở nồng

độ cao hơn có thể bị ức chế hoặc bị tiêu diệt [4, 6, 21 ]

Trong môi trường dịch thể, quá trình sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn chia

làm 4 pha:

- Pha lag: sinh khối tăng không đáng kể

- Pha log: lượng sinh khối tăng theo hàm log, ở cuối pha này có sự tổng hợp

nên các sản phẩm bậc hai như chất kháng sinh

- Pha cân bằng: ở pha này sinh khối không tăng, hầu hết các chất dinh dưỡng

còn lại trong môi trường đều được sử dụng để tổng hợp chất kháng sinh

- Pha suy tàn: sinh khối giảm nhanh, lượng chất kháng sinh cũng giảm

Tế bào xạ khuẩn phân chia theo kiểu phân bào vô sắc - đó cũng là tính chất đặc

trưng của vi khuẩn Thời gian phân đôi của tế bào xạ khuẩn nuôi cấy trong môi

trường lỏng khoảng 90 phút (trong khi đó ở vi khuẩn khoảng 20-40 phút) Xạ khuẩn

sinh sản bằng cách tạo bào tử

1.2.4 Sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất bậc hai, thông thường được hình

thành ở cuối pha sinh trưởng, trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn, sinh tổng hợp chất

kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử, đó là điểm cần lưu ý trong

khi nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn

Trong số 8000 chất kháng sinh đã biết đến trên thế giới thì hơn 45% là do xạ

khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh ra, chỉ hơn 21% là của nấm [4, 10] Chi

Streptomyces là chi được nghiên cứu nhiều nhất trong nhóm xạ khuẩn, với 500 loài

đã được miêu tả, chi này có nhiều loài có khả năng sinh chất kháng sinh, một trong

những loại kháng sinh rất quan trọng là streptomycin do Streptomyces griseus sinh

ra Khả năng sinh kháng sinh là kết quả của quá trình đối kháng giữa các vi sinh vật

và thúc đẩy quá trình tiến hóa của xạ khuẩn [4]

Đối với sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn, người ta thường mô tả hai

pha: pha sinh trưởng (trophophase) - khuẩn ty sơ cấp phát triển nhanh; pha sinh

tổng hợp (idiophase) - sinh trưởng chậm đôi khi xuất hiện quá trình tự tan của

khuẩn ty và sinh tổng hợp chất kháng sinh mạnh [4, 15] Cũng có tác giả chia sự

phát triển của chúng thành 4 pha hoặc 6 pha theo các đặc điểm sinh hóa tế bào

Trong một số trường hợp quá trình sinh học này lại diễn ra mạnh mẽ trong pha sinh

trưởng như trường hợp của chủng xạ khuẩn Saccharothrix sp SA 103 phân lập từ

Sahara của Agieria sinh kháng sinh mutactymycin PR (một Anthracycline mới)

Quá trình cũng tương tự như ở chủng Saccharothrix sp SA 233 sinh

dithiolopyrolone và loài Streptomyces clauvuligenus sinh axit clavulanic.

Xạ khuẩn biển là nguồn cung cấp kháng sinh đầy hứa hẹn, dưới đây là bảng

tóm tắt giới thiệu các chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn biển

Bảng 1.1 Các chất kháng sinh từ xạ khuẩn biển

KORDI3238 Kháng tế bào ung thưDaryamides Streptomyces sp.CNQ-

085

Kháng nấm, kháng tếbào ung thưActinofuranones A

lucentensis CNR712

Arenamides Salinispora arenicola

CNT088 Kháng tế bào ung thư

Lajollamycin Streptomyces nodosus

Chloro-Xạ khuẩn chủngCNQ525

sp.NTK937 Kháng tế bào ung thưButenolides

Streptoverticillium luteoverticillatum

11014

Kháng tế bào ung thư

Diazepinomicin(ECO-4601) Micromonospora sp.

Kháng khuẩn, khángviêm, kháng ung thưFrigocyclinone Streptomyces griseus Kháng khuẩnHelquinoline Janibacter limosus Kháng khuẩnChất kháng sinh từ xạ khuẩn biển rất phong phú và đa dạng (Bảng 1.1),

nguyên nhân là một loại kháng sinh có thể do nhiều loài khác nhau tổng hợp ra,

cũng có khi một loài vi sinh vật tổng hợp ra nhiều loại kháng sinh khác nhau Ví dụ

có tới 27 chủng xạ khuẩn khác nhau có thể tổng hợp được kháng sinh

oxytetracyclin, hay Streptomyces rimosus cùng lúc có thể tổng hợp được

oxytetracyclin và rimicidin

1.2.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh kháng sinh của xạ khuẩn

Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh ở xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các

yếu tố như pH, nhiệt độ, thành phần môi trường lên men… Để xạ khuẩn phát triển

tốt và hình thành các sản phẩm tối ưu, cần đảm bảo trong môi trường lên men có

đầy đủ nguồn cacbon, nitơ, các nguyên tố vi lượng, và các thông số về điều kiện

nuôi cấy thích hợp [25]

a Ảnh hưởng của môi trường

Thành phần môi trường là yếu tố ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh kháng sinh

của xạ khuẩn Môi trường nghèo dinh dưỡng sẽ thúc đẩy vi sinh vật hình thành bào

tử nhiều hơn là sinh tổng hợp kháng sinh

Nguồn cacbon là nguyên liệu không thể thiếu đối với đời sống vi sinh vật, nó

ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chất kháng sinh do nguồn cacbon tham gia vào cấu tạo

tế bào và tham gia vào quá trình hình thành lên cấu trúc của sản phẩm Trong

nghiên cứu lên men sản xuất chất kháng sinh từ vi sinh vật, người ta nhận thấy

glucose là nguồn cacbon thích hợp cho sự phát triển của xạ khuẩn nhưng lại là yếu

tố cản trở sự sinh kháng sinh [8, 25] Các polysaccaride và oligosaccaride lại tốt hơn

cho sự sinh tổng hợp kháng sinh Như vậy, tùy thuộc vào yêu cầu sử dụng của từng

giai đoạn mà lựa chọn thành phần cacbon trong môi trường lên men cho phù hợp

Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn cần cả nguồn nitơ vô cơ và

hữu cơ Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả năng sinh chất kháng sinh không cao,

còn nguồn nitơ hữu cơ lại có ảnh hưởng khá tốt đến khả năng này, do nó cung cấp

các nguồn acid amin quan trọng, dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để tạo thành sản

phẩm Tùy vào từng chủng xạ khuẩn mà sử dụng nguồn nitơ vô cơ khác nhau như

các muối amoni, các muối nitrate: (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3… hay các nguồn nitơ

hữu cơ: cao ngô, cao nấm men, bột đậu tương… [4, 15, 31]

Nguồn photpho vô cơ là yếu tố điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp chất kháng

sinh từ xạ khuẩn Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn chất

kháng sinh không quá 10µg/ml [9] Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng

lượng acid nucleic trong khuẩn ty xạ khuẩn, làm kéo dài pha sinh trưởng và rút

ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng sinh

tổng hợp chất kháng sinh [8, 15]

Các chất khoáng cũng là yếu tố cần thiết cho quá trình sinh trưởng không chỉ

của vi sinh vật mà còn là yếu tố không thể thiếu của xạ khuẩn Cần bổ sung các

chất khoáng cần thiết cho chúng vào môi trường nuôi cấy Một lượng nhỏ các

nguyên tố vi lượng như Na, Fe, Bo, K, Cr, Cu, Mn,… cũng ảnh hưởng nhất định

đến sự hình thành chất kháng sinh từ xạ khuẩn Tỷ lệ các chất khoáng trong thành

phần môi trường cũng cần xác định bằng thực nghiệm [8]

b Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy

Điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, độ thông khí, hàm lượng oxy hòa tan

trong môi trường… cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh kháng sinh

của xạ khuẩn

Nhiệt độ: Phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt trong dải nhiệt độ từ 28-300C

Mỗi loại xạ khuẩn có một khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng

và sinh tổng hợp chất kháng sinh Có chủng sinh kháng sinh cao ở nhiệt độ 180C, có

chủng lại sinh kháng sinh ở 280C [9]

pH: pH thích hợp cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh

thường là trung tính Tuy nhiên, pH cho phép sinh trưởng thường lớn hơn so với pH

tối ưu cho sự tổng hợp chất kháng sinh [4, 9, 31]

Độ thông khí: là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh kháng sinh của

xạ khuẩn Nếu độ thông khí bị hạn chế sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và khả năng

tích lũy chất dinh dưỡng, làm thay đổi hình thái của khuẩn ty và giảm khả năng sinh

tổng hợp kháng sinh [4, 6]

Giống: sinh tổng hợp kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của bào

tử và tuổi giống, khả năng đồng đều về mặt di truyền Môi trường nhân giống và

lượng giống bổ sung cũng ảnh hưởng không nhỏ đến lượng kháng sinh được tổng

hợp ra.Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môi trường lên men để hiệu quả

nhất là từ 2-10%, tuổi giống thường là 24 giờ [16]

Công nghệ lên men: Trong sinh tổng hợp chất kháng sinh, phương pháp nuôi

cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định Có các hình thức lên men: lên men

bề mặt, lên men trên môi trường xốp, lên men chìm Herold và ctv (1956) đã phát

triển công nghệ lên men chất kháng sinh trong điều kiện không vô trùng còn gọi là “

lên men phòng ngừa” Chất kháng sinh lên men trên môi trường xốp làm thức ăn bổ

sung cho động vật nuôi [4]

1.2.6 Tình hình nghiên cứu về VSV biển sinh kháng sinh trong và ngoài nước

Hiện nay, vi sinh vật biển là đề tài quan trọng trong nhiều nghiên cứu mới về

vi sinh vật ở nhiều nước trên thế giới; đặc biệt là các đề tài tìm kiếm các chất có

hoạt tính sinh học từ vi sinh vật biển như các chất kháng khuẩn, kháng virus, kháng

tế bào ung thư, kháng nấm, chống đông hoặc là kháng trùng sốt rét… Những hợp

chất có hoạt tính này góp phần không nhỏ hạn chế hiện tượng kháng thuốc, trở

thành nguồn dược phẩm quan trọng để chữa bệnh trong tương lai, phát triển các sản

phẩm mới mang lại hiệu quả kinh tế cao

M Krishnaraj và N Mathivanan (Ấn Độ-2009) đã phân lập được 137 chủng

xạ khuẩn có hoạt tính kháng vi sinh vật từ 40 địa điểm khác nhau ở vịnh Bengal

Trong tất cả 137 chủng xạ khuẩn đều có khả năng kháng các vi khuẩn gây bệnh ở

người như Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp và 10

chủng có khả năng kháng nấm Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporum gây bệnh

ở thực vật [24]

Năm 2010, Rofiq Sunaryanto và Bambang Marwoto đã phân lập ở Anyer,

Banten (Indonesia) được 29 chủng vi khuẩn trong đó có một chủng A11 có đặc tính

kháng được các chủng vi khuẩn G- và G+ (E coli, Staphylococcus aureus, P.

aeruginosa, B subtilis) Bằng phương pháp giải trình tự gene 16S rRNA và so sánh

trình tự với dữ liệu của Genebank đã xác định được chủng A11 chính là xạ khuẩn

Streptomyces sp Bằng phương pháp sắc ký đã tách được một hợp chất kháng sinh

có khả năng kháng khuẩn với nồng độ ức chế tối thiểu thấp hơn nhiều so với chất

kháng sinh tetracyline (đối chứng) [27]

Năm 2011, Sumei Li, Xinpeng Tian, Siwen Niu, Wenjun Zhang và cộng sự đã

phân lập được một chủng xạ khuẩn (SCSIO-01299) ở biển Nam Trung Hoa (Biển

Đông-Việt Nam) ở độ sâu -3258m Bằng phương pháp quan sát hình thái học và

giải trình tự gene 16S-rRNA, chủng SCSIO-01299 được phân loại là

Pseudonocardia sp SCSIO-01299 Các nhà khoa học này đã tách được 4 hợp chất

có hoạt tính sinh học cao đó là deoxynyboquinone và pseudonocardians A, B, C

Deoxynyboquinone và pseudonocardians A và B có khả năng kháng khuẩn

(Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, B thuringensis) và kháng tế bào

ung thư phổi, ung thư vú và ung thư não Bằng phương pháp khối phổ đã phân tích

được deoxynyboquinone có công thức phân tử C15H12O4N2; pseudonocardian A

có thành phần C18H18O5N2; pseudonocardian B công thức là C19H20O5N2;

pseudonocardian C công thức là C21H24O8N2 [29]

Ở Việt Nam, việc nghiên cứu vi sinh vật biển có khả năng sinh các chất có

hoạt tính đối kháng còn hạn chế, hầu như chưa có công trình khoa học có quy mô

lớn nghiên cứu các vi sinh vật và tách chiết các chất kháng sinh từ vi sinh vật biển

Tác giả Lê Gia Hy và cộng sự làm việc tại Viện công nghệ sinh học đã phân

lập và nghiên cứu được đặc điểm của chủng vi khuẩn biển chủng HT0523 có nhiều

đặc điểm quý có thể khai thác trong nuôi trồng thủy sản Vi khuẩn biển chủng

HT0523 chính là vi khuẩn Gram dương, sinh bào tử có khả năng ức chế mạnh cả 2

chủng vi sinh vật Vibrio gây bệnh cho tôm là V parahaemolyticus và V furnisii.

Chủng HT0523 có sức sống cao, có khả năng thích ứng rất tốt với điều kiện môi

trường dao động nhiều, phát triển tốt ở nồng độ NaCl 1-3%, pH thích hợp từ 7-9,

nhiệt độ từ 25-370C Chủng này phát triển tốt trên nguồn cacbon lactose và nguồn

nitơ vô cơ là KNO3 đặc biệt là khi kết hợp với nguồn nitơ hữu cơ (pepton) thì mật

độ tế bào cao xấp xỉ hai lần [5]

Các nhà khoa học của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang

đã tách được chất Fucoidan từ một số loài rong ở vùng biển Nha Trang-Khánh Hòa

như Sargassum polysystum, S Oligosystum, S mcclurei, S swartzii, S.

denticarpum Bằng các phương pháp phân tích hóa học và phổ cho thấy những phân

đoạn Fucoidan tách được là Fucogalactam có chứa nhóm este sulfat, uronic acid và

các gốc đường Fucose, Galactose… các phân đoạn đều đem thử hoạt tính và kết quả

là tất cả các phân đoạn đều có hoạt tính chống ung thư Kết quả thực nghiệm chỉ ra

rằng sự có mặt của nhóm sulfat và uronic làm tăng hoạt tính của Fucoidan [1]

Hiện nay, môi trường biển suy thoái do việc khai thác không có qui hoạch,

chưa quan tâm đến hệ vi sinh vật biển, nhiều rạn san hô, thảm cỏ biển bị phá vỡ, do

đó gần đây có nhiều nghiên cứu tập trung vào vấn đề đa dạng sinh học biển, việc

nghiên cứu các chất có hoạt tính sinh học góp phần phát triển kinh tế còn rất hạn

chế Việc đánh giá được sự đa dạng của vi sinh vật biển, góp phần bảo vệ môi

trường và nguồn tài nguyên vi sinh vật biển, là cơ sở để lựa chọn được các chủng vi

sinh vật sinh các chất có hoạt tính kháng sinh, hiện nay đang ít được quan tâm

nghiên cứu ở Việt Nam Tuy vậy, biển Việt Nam vẫn là nguồn tài nguyên đầy hứa

hẹn cho việc nghiên cứu đa dạng vi sinh vật và tìm kiếm chất kháng sinh có hoạt

tính mới Từ đó có thể góp phần tạo ra thế hệ kháng sinh mới chữa các bệnh nan y

hiện nay, khắc phục tình trạng kháng thuốc đang rất phổ biến, và đóng góp vào sự

phát triển của ngành hóa dược nước nhà

PHẦN II.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 VẬT LIỆU

2.1.1 Chủng giống vi sinh vật

Chủng xạ khuẩn biển HP411 và các chủng vi sinh vật kiểm định gồm:

Bacillus subtilis ATCC 6633; Bacillus cereus ATCC 11778; Staphylococus

epidermidis ATCC 12228; Candida albicans ATCC 10231 nhận từ bộ sưu tập

giống của phòng Công nghệ Lên men, Viện Công nghệ Sinh học (Xem phụ lục 2)

2.1.2 Hóa chất

Các loại đường gồm: glucose; arabinose; raffinose; fructose; saccarose;

xylose; myo-inositol; mannitol; lactose; mannose; galactose; tinh bột, dextrose

(Merck)

Các nguồn nitơ: Histidinemonohy-drodorid monohydrate;

L-Phenylalanine; Leucine; L-Triptophan; L-Asparagine monohydrate; L-Arginine

monodo; L-Isoleucine; L-Valine; L-Methionine; L-Lysine; L-Threonine; L-Cystein;

2 Amino 2 hydroxy-methyl 1,3 prom (Merck)

Các hóa chất khác dùng trong nuôi cấy và lên men: CaCO3; K2HPO4.3H2O;

KH2PO4; FeSO4.7H2O; (NH4)2SO4; NH4Cl; NaCl; bột đậu tương; trypton; pepton;

cao ngô; casein thủy phân; yeast extract; meat extract; thạch agar và một số hóa chất

cần thiết khác

Các hóa chất dùng trong sinh học phân tử gồm: Tris-base, EDTA, acid

acetic, CTAB, NaCl, propanol, chloroform, phenol, Isoamin alcohol, etanol,

bromophenol blue, Ethidium bromide, glycerol, dNTP các loại, MgCl2, cặp mồi

9F/5141R, kít PureLinkTM - DNA Purification (Invitrogen), DNA Marker

(Fermentas), agarose…

Các dung môi dùng trong tách chiết CKS: methanol, ethuylacetate,

n-butanol, chloroform, 2-n-butanol,…

Olympus CHD -2

Tủ ấm Trung Quốc Tủ khử trùng khô Trung Quốc

Máy lắc Hàn Quốc Kính hiển vi quét

Viện 69, Bộ tưlệnh lăng Chủtịch HCMCân điện tử

Máy cô chân

2.1.4 Môi trường

Các môi trường được sử dụng trong phân lập và xác định đặc điểm sinh học

của xạ khuẩn, môi trường lên men kháng sinh (Xem phụ lục 1).

2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1.Phương pháp bảo quản giống

Các chủng xạ khuẩn sau phân lập được giữ trong môi trường ISP2 thạch

nghiêng, ở nhiệt độ 40C và cấy chuyển lại hàng tháng Giống sử dụng trong các

nghiên cứu được hoạt hóa bằng cách nuôi trên môi trường ISP2 thạch nghiêng,

nhiệt độ 370C trong 2-4 ngày Để bảo quản chúng giống lâu dài, giữ giống trong

glyxerin ở -200C hoặc -70đến -800C [9]

2.2.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại xạ khuẩn

Nghiên cứu định tên các chủng xạ khuẩn đã chọn theo đặc điểm phân loại

của Waskman, 1961; Krasilnikov, 1970; Gauze, 1983; Sổ tay phân loại vi sinh vật

của Bergey, 1989 và tham khảo các bản mô tả xạ khuẩn của Chương trình xạ khuẩn

quốc tế (ISP), 1966 và 1970 [13, 17, 30]

Để quan sát các đặc điểm hình thái như: hình dáng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn

ti khí sinh, khuẩn ti cơ chất, sắc tố tan, sự hình thành melanin, cuống sinh bào tử, bề

mặt bào tử các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường ISP1, ISP2,

ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28-300C Sau 7, 14 và 21 ngày lấy ra quan

sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan trên môi trường theo

phương pháp của Shirling và Gottlieb, 1966 và so sánh với bảng màu của Tresner

và Barkus (1963)

Đặc điểm sinh lý - sinh hóa của chủng được mô tả dựa vào khả năng đồng

hóa các nguồn cacbon, nitơ (axit amin), khả năng ức chế các vi sinh vật và sự sinh

trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau (về pH, nhiệt độ, nồng độ

muối NaCl)

2.2.2.1 Đặc điểm hình thái

a) Đặc điểm nuôi cấy

- Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ty khí sinh): màu sắc của khuẩn ty khí sinh được

so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus (1963): xanh da trời, sẫm, xám, xanh lá,

đỏ, tím, trắng, vàng

- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất: chia vào 5 nhóm vàng- nâu (gồm cả các

loại không tiết sắc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

- Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi

trường ISP2-5 Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ty khí sinh và

khuẩn ty cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím

- Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin,

nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp Quan

sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ

vàng nhạt sang nâu, đen

b) Đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử

Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP2 ở 370C Sau cứ 7, 14 và 21

ngày nuôi ở nhiệt độ 28-300C xạ khuẩn phát triển tốt lấy ra quan sát hình dạng chuỗi

bào tử trên lamen dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét

- Hình dạng chuỗi bào tử được ký hiệu: