Vi nhân giống hoa hướng dương (Helianthus annuus)

Ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy và môi trường đến khả năng hình thành mô sẹo sau 4 tuần cấy.. Ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy và môi trường đến khả năng hình thành mô sẹo sau 6 tuần cấy.. Các

Trang 1

VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC

VI NHÂN GIỐNG HOA HƯỚNG DƯOÍNG

LỚP:CNSH K33

Trang 3

DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO YỆ LUẬN VĂN

Cần Thơ, ngày tháng năm 2011

CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG

(ký tên")

Để hoàn thành tốt bài luận văn này ngoài sự cố gắng của bản thân tôi cònnhận được sự giúp đỡ, hướng dẫn, động viên của nhiều người và sau đây tôi xingởi lời cảm om chân thành nhất đến:

Cha mẹ và gia đình, nơi đã sinh thành, nuôi nấng, bảo vệ, động viên và hỗtrợ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện và hoàn thành bài luận văn này

Ban Giám Hiệu trường Đại Học cần Thơ, Ban Giám Đốc Viện NGhiênCÁN Bộ HƯỚNG DẪN

Trang 4

Cô Nguyễn Thị Pha đã hết long hướng dẫn, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ,đóng góp ý kiến và tạo điều kiện thuận lợi trong suốt quá trình tôi thực hiện vàhoàn thảnh luận văn tốt nghiệp.

Cô Nguyễn Thị Liên cố vấn học tập lớp Công Nghệ Sinh Học, khóa 33 trường Đại Học cần Thơ đã tận tình giúp đõ, truyền đạt kiến thức trong suốt quátrình làm việc trong phòng thí nghiệm

-Cô Tràn Thị Xuân Mai đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thựchiện tốt luận văn

Cuối cùng tôi xin gởi lời cảm ơn đến Thày Tràn Nguyên Tuấn đã độngviên, và cho tôi những lời khuyên tốt nhất trong những lúc khó khăn để tôi có thểtiếp tục và hoàn thành chương trình học Cảm ơn tất cả các bạn của tập thể lớpCông Nghệ Sinh Học, khóa 33 đã luôn bên cạnh tôi trong suốt quá trình học tập vàhoàn thảnh bài luận văn này

Xin kính chúc Thầy Cô vạn điều tốt đẹp, dồi dào sức khỏe và luôn thànhcông rong công việc, tiếp tục cống hiến cho sự nghiệp cao cả “ Trăm năm trồngngười”, góp phần phát triển nền giáo dục Việt Nam

Đe tài “ Vi nhân giống hoa Hướng Dương (Helianthus annuus) ” nhằm mục đích

khảo sát hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng như: BAP, IAA, NAA, 2,4 D lên quá trình phát triển của mô sẹo và sự tái sinh chồi từ sẹo của hoa Hướng Dương, qua đỏ góp phần xây dựng quy trình vỉ nhăn giống loài cây này.

Kết quả thỉ nghiệm cho thấy:

Trang 5

trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp.

Thí nghiệm 2: Mầu từ thân cho khả năng tạo sẹo tốt hơn mẫu lá Môi trường MS0,5 cho hiệu quả tạo sẹo tốt nhất sau 4 tuần, Môi trường MS2 cho hiệu quả tạo sẹo nhiều nhất sau 6 tuần.

Thí nghiệm 3: khả năng tạo sẹo của thân và lá cây mầm hoa Hướng dương phụ thuộc nhiều vào môi trường nuôi cấy, môi trường MS 0,5 cho hiệu quả tạo sẹo cao nhất sau 4 tuần, môi trường MS2 cho hiệu quả tạo sẹo cao nhất sau 6 tuần.

Thí nghiệm 4: Sau 8 tuần quan sát chồi vẫn chưa xuất hiện.

Thí nghiệm 5: Sẹo phát triển tắt nhất và chồ xuất hiện sớm nhất trên môi trường MS205IAA

MỤC LỤC

TrangPHẦN KÍ DUYỆT LỜI CẢM TẠ

Trang 6

3.1 Phương tiện nghiên cứu

3.1.1

3.1.2

4.2 Kết quả thí nghiệm 2: Khảo sát vị trí của cây mầm (đoạn thân, lá) và

3.1.3 nồng độ2,4D lên khả năng tạo sẹo của Hoa Hướng dương

4.3 Kết quả thí nghiệm 3: Khảo sát tuối cây mầm và nồng độ 2,4D lên khả

3.1.4 năngtạo sẹo của hoa Hướng dương

4.4 Kết quả thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của môi trường đến khả năng

3.1.5 tạo chồi từsẹo của hoa Hướng dương

4.5 Kết qảu thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng tạo sẹo và tái sinh chồi trực tiếp

3.1.6 củaHoa Dướng Dương từ phôi mầm

Trang 7

3.1.9 PHU LUC

• •

Trang 8

3.1.12 Bảng 7: Thành phần môi trường tạo sẹo và tái sinh chồi của Dướng

Dương.33 Bảng 8: Các chỉ tiêu theo dõi sự phát triển của cây mầm 8,11,14 ngày.

3.1.13 Bảng 8.1 Ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy và môi trường đến khả năng

hình thành mô sẹo sau 4 tuần cấy.

3.1.15 Bảng 8.3 Hiệu quả tương tác của hai vị trí mẫu cấy vói môi trường

nuôi cấy đến phần trăm mẫu tạo mô sẹo sau 6 tuần cấy.

3.1.17 Bảng 9.1 Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy thân và môi trường đến khả

năng hình thành mô sẹo sau 4 tuần cấy.

3.1.18 Bảng 9.2 Hiệu quả tương tác của tuổi mẫu cấy thân vối môi trường

nuôi cấy đến phần trăm mẫu tạo mô sẹo sau 4 tuần cấy.

3.1.21 Bảng 9.5 Ảnh hưởng của tuổi mẫu cấy lá và môi trường đến khả năng

3.1.23 Bảng 9.7 Hiệu quả tương tác của tuổi mẫu cấy lá với môi trường nuôi

cấy đến phần trăm mẫu tạo mô sẹo sau 6 tuần cấy.

Trang 9

3.1.26 DANH SÁCH HÌNH 3.1.27 Hình 1: Cây hướng dương sau 8,11,14 ngày cấy

3.1.28 Hình 2: mẫu sau 2 tuần cấy trên môi trường MS0,5

3.1.29 Hình 3: mẫu trên môi trường tạo sẹo MS0,5 sau 4 tuần cấy

3.1.30 Hình 4: mẫu lá trên môi trường tạo sẹo MS0,5 sau 6 tuần cấy

Trang 10

3.1.33 Hình 8: Sự hình thành và phát triển của mô sẹo thân trên môi

trường MS0,

3.1.34 Hình 9: Sự hình thành mô sẹo từ lá trên môi trường MS0,5

3.1.35 Hình 10: Mô sẹo sau 14 ngày cấy trên môi trường MS205IAA và

MS2Ỏ5NAA

3.1.36 Hình 11: Chồi hình thành trên môi trường MS205IAA

3.1.37 CÁC TỪ VIẾT TẮT

3.1.38 IAA : Indol acetic acid

3.1.39 NAA : 1- Napthalene acetic acid

3.1.40 BAP : 6 - Benzylaminopurine MS : Murashige & Skoog

Trang 11

3.1.41 CHƯƠNG 1: GIỚI THIỆU

3.1.44 Hoa hướng dương (Helianthus annuus) là loài cây quen thuộc mang

lại giá trị mỹ quan khi được trồng làm kiểng, có giá trị kinh tế khi được trồng đểlấy hạt, tinh dầu làm thực phẩm, làm thuốc chữa bệnh Hơn thế nữa tinh dầu cònđược sử dụng làm nhiên liệu sinh học- một trong những nguồn nhiên liệu đangđược nghiên cứu và phát triển mạnh mẽ nhằm thay thế nhiên liệu có giới hạn vàgóp phần bảo vệ môi trường

3.1.45 Hiện nay, diện tích hoa hướng dương trên thế giới chiếm 20 triệu ha

và sản xuất khoảng 30 triệu tấn hoa hướng dương Các nước trồng nhiều hướngdương: Nga (5.410.000 ha), Ukraine (3.690.000 ha), Ấn Độ (2,16 triệu ha),Argentina (1.890.000 ha) Mỹ (1.060.000 ha), Trung Quốc (1,05 triệu ha) (http://www.agricultureinformation.com/mag/ 7p=363)

3.1.46 Trong khi đó, ở Việt Nam có điều kiện khí hậu thuận lợi, ánh sángmặt trời chiếu quanh năm rất thuận lợi cho Hoa hướng dương phát triển nhưng diệntích trồng hướng dương ở nước ta còn rất ít, theo hướng công nghiệp chưa nhiều,hoa chủ yếu chỉ trồng làm cảnh cũng chính vì thế mà các tài liệu nghiên cứu về loàicây này trong nước còn rất hạn chế Đặc biệt là các nghiên cứu về vi nhân giống.Với những lợi ích mà hoa hướng dương mang lại đề tài “Vi nhân giống hoa hướng

dương (Helỉanthus annuus) ” được thực hiện nhằm khảo sát một số yếu tố ảnh

Trang 12

hưởng đến quá trình phát triển của mô sẹo và sự phát sinh chồi trong điều kiện invitro và bước đầu xây dựng quy trình vi nhân giống loài cây này Kết quả của đề tài

sẽ cung cấp một số kiến thức hữu ích về hoa hướng dương phục vụ cho các nghiêncứu tiếp theo cũng như trong công tác nhân giống loài cây này trên quy mô côngnghiệp

1.2 Muc tiêu của đề tài:

3.1.47 •

3.1.48 Mục tiêu chính của đề tài là khảo sát hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng như: BAP, IAA, NAA, 2,4 D lên quá trình phát triển của mô sẹo và sự tái sinh chồi từ sẹo của hoa hướng dương

Chuyên ngành Công Nghệ Sinh Học 12 Viện NC & PT Công Nghệ Sinh Học

Trang 13

2.1 Nguồn gốc, phân loại, đặc tính, công dụng của hoa hướng

dĩrơngựỉelùmthus annuus.)

2.1.1 Nguồn gốc:

3.1.50 Hướng dương là loài cây có từ châu Mỹ, bắt đầu từ đất nước Mexico,

và đã được con người nuôi trồng vào khoảng năm 1000 TCN Sau đó được mang về

châu Âu từ trước thế kỷ 16 Từ Heỉỉanthus để chỉ hoa hướng dương có nguồn gốc từ

tiếng Hy Lạp Hoa hướng dương thuộc lớp thực vật hai lá mầm

3.1.51 Từ hướng dương cũng được sử dụng để nói về tất cả các loài thực vật

thuộc chi Helianthus, rất nhiều trong số đó là thực vật sống lâu năm.

3.1.52 (http://vi.wikipedia.org/wiki/H%C6%B0%E1%BB%9Bng_d

%C6%B0%C63.1.53 %Alng#L.El.BB.8Bch_s.El.BB.AD)

2.1.2 Phân loại khoa học:

3.1.54 Tên khoa học: Helỉanthus annuus.

a Tên gọi: Hoa hướng dương còn có tên gọi khác là: hoa Mặt Trời, hướng

dương quỳ tử, thiên quỳ tử, quỳ tử, quỳ hoa tử Được gọi là Hoa hướng dương

vì những bông hoa đang ở giai đoạn nụ, chưa trưởng thành thì biểu lộ tập tính

Trang 14

chuyển từ đông sang tây, thời gian buổi đêm nó lại trở về hướng đông Sự vậnđộng thực hiện bằng những tế bào vận động trong thân, một đoạn mềm dẻocủa cuống ở vị trí thấp hơn nụ hoa Khi giai đoạn chồi kết thúc thì cuống hoa

bị cứng lại, và khi hoa nở thì nó không còn tính hướng dương nữa, cho dùnhiều bông hoa quay về hướng đông

3.1.55 (http://vi.wikipedia.org/wiki/H%C6%B0%E1%BB%9Bng_d

%C6%B0%C6%A1n

3.1.56 g#H.C3.ACnh_d.El.BA.Alng)

b Phân bố: Cây có nguồn gốc từ Mexico, hiện tại được trồng ở nhiều nơi trên

thế giới và một số tỉnh ở nước ta

c Mô tả:

- Hoa hướng dương thuộc lớp thực vật 2 lá mầm

- Hướng dương là loài cây thảo sống 1 năm

- Thân to thẳng có lông cứng, thường có đốm, cao l-3m

- Lá to, thường mọc so le, có cuống dài, phiến lá hình trứng đầu nhọn, phíadưới hình tim, mép có răng cưa, hai mặt đều có lông trắng

- Cụm hoa đầu lớn, đường kính 7-20cm, bao chung hình trứng; bông hoa nàytrên thực tế là một cụm hoa dạng đàu, bao gồm những bông hoa con (chiếchoa) tập họp cùng nhau Ở vòng ngoài, những bông hoa con gọi là chiếc hoatỏa tia Chúng có thể có màu vàng, nâu sẫm, da cam hoặc các màu khác.Những bông hoa con này không có khả năng sinh sản Các bông hoa con nốithành một vòng tròn ở bên trong các chiếc hoa toả tia được gọi là chiếc hoadạng đĩa Những bông hoa dạng đĩa khi trưởng thành phát triển thành nhữngcái mà người ta gọi là "hạt hướng dương

- Hạt: Thực sự là một loại quả (quả bế) của loài cây này

- Cây ra hoa vào mùa đông, mùa xuân, có quả vào tháng 1-2

2.1.4 Thành phần hóa học.

3.1.57 Theo hiện đại dưỡng sinh bảo kiện trung dược từ điển:

3.1.58 Hàm lượng dầu béo trong hạt hướng dương khoảng 50%, trong đó

Trang 15

3.1.59 Hàm lượng protein khoảng 20-26%, trong đó các acid amin thiết yếuisoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylamine, tryptophan, threonile, valine có

tỷ lệ phần hăm gần giống tỷ lệ lý tưởng do WHO kiến nghị, do đó có giá trị dinhdưỡng tương đối cao

3.1.60 Ngoài ra còn có các acid hữu cơ như citric acid, tartaric acid,chlorogenic acid, quinic acid, caffeic acid; beta caroten, nhiều loại vitamin vànguyên tố vi lượng Đặc biệt, vitamin E có hàm lượng rất cao trong hạt hướng dương(trong 15g có tới 31mg); Hàm lượng Ka-li (K) trong hạt hướng dương còn cao hơntrong chuối tiêu và quít

và mỡ thực vật tốt nhất cho sức khỏe, đặc biệt là đối với những người có nguy cơmắc bệnh tim mạch

3.1.64 Đặc biệt trong điều kiện kinh tế xã hội đang phát triển một cách mạnh

mẽ như hiện nay thì vấn đề cấp thiết đang được quan tâm hàng đầu là tìm ra nguồnnăng lượng mới thay thế những nguồn năng lượng đang dần cạn kiệt đồng thời giảm

Trang 16

sinh viên của Trường ĐH California (Mỹ) Hoa hướng dương được trồng không phải

để trang trí mà là phần chính yếu của một chiến lược kiểm soát sâu bệnh của trangtrại rau sạch Vì loài hoa này được trồng để làm nơi trú ngụ của bọ rùa và ong vò vẽ

ký sinh Đây chính là 2 loài côn trùng chuyên tiêu diệt côn trùng gây hại cho việctrồng trọt

3.1.66 Theo tin mới nhất từ Cơ quan Nghiên cứu và Phát triển Hàng không vũtrụ Nhật Bản (JAXA) Thì cây hướng dương sẽ được trồng để khử đất nhiễm phóng

xạ tại các nhà máy điện hạt nhân sau thảm họa động đất và sống thần năm 2011.Trước đây vào năm 1986 loài cây này cũng đã giúp Ukraina khử lượng phóng xạtrong đất trong thảm họa Chernobyl (http://vnexpress.neƯgl/khoa- hoc/2011/04/khu-dat-nhiem-phong-xa-bang-cay-hoa-huong-duong/)

b Tác dụng theo Đông Y và kinh nghiệm nhân gian:

3.1.67 Toàn bộ các bộ phận của cây hướng dương đều được dùng làm thuốc.Theo Đông y: Hạt hướng dương có vị ngọt, tính bình, không độc Tác dụng ninh tâm

an thần, chỉ lỵ, thấu chẩn Dùng chữa tinh thần uất ức, thần kinh suy nhược, chán ăn,đau đầu do suy nhược, đi lỵ ra máu, sởi không mọc được

3.1.68 Công dụng của các bộ phận khác (theo Trung dược đại từ điển):

- Lá có tác dụng tăng cường tiêu hóa và chữa cao huyết áp

Trang 17

- Lõi thân cành (còn gọi là hướng nhật quỳ ngạnh tâm, hướng nhật quỳ kinhtâm, hướng nhật quỳ nhương) có tác dụng chữa tiểu tiện xuất huyết, tiểudưỡng chấp, sỏi đường tiết niệu, tiểu tiện khó khăn.

- Rễ cây hướng dương có tác dụng chữa ngực, sườn và vùng thượng vị đaunhức, thông đại tiểu tiện, chữa đòn ngã chấn thương, mụn nhọt lở loét chảynước vàng

- Ngoài ra hoa hướng dương còn đem lại cho con người giá trị về mặt thẩm mỹkhi được trồng làm kiểng và không những thế nó còn có ý nghĩa về mặt tinhthần: Người dân Inca có sự sùng bái hoa hướng dương giống như hình ảnhthần Mặt Trời của họ Hoa hướng dương thể hiện niềm tin và hy vọng trongtình yêu, luôn hương về điều tươi sáng nhất

3.1.69 2.2 Một số phương pháp nhân giống:

2.2.1 Phương pháp nhân giống thông thường:

3.1.70 Hoa hướng dương được trồng chủ yếu bằng hạt

2.2.2 Phương pháp nhân giong in vitro:

a Khái niệm và mục đích của vi nhân giống:

3.1.71 Vi nhân giống là một trong những ứng dụng của kĩ thuật nuôi cấy mô

tế bào thực vật

3.1.72 Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô,

tế bào thực vật trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ; việc nuôi cấy mô đượcduy trì dưới các điều kiện được kiểm soát Kỹ thuật nuôi cấy mô mang tính thươngmại chủ yếu trên cơ sở vi nhân giống

3.1.73 Vi nhân giống là việc nhân đúng kiểu cây (true-to-type) của một kiểu

gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng kỹ thuật in vitro (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).

Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giúp giảm giá thành sảnphẩm

3.1.74 Các giai đoạn của vi nhân giống:

Trang 18

3.1.75 Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành bốngiai đoạn khác nhau:

• Giai đoạn đầu tiên: Chuẩn bị của cây mẹ

• Giai đoạn 1: Bắt đầu tiệt trùng

• Giai đoạn 2: Nhân chồi

• Giai đoạn 3a: Kéo dài

• Giai đoạn 3b: Tạo rễ và tiền thuần dưỡng

• Giai đoạn 4: Thuần dưỡng

3.1.76 Mỗi giai đoạn đều có một chức năng riêng Kết quả của việc vi nhângiống phụ thuộc vào cả bốn giai đoạn

3.1.77 ♦♦♦ Giai đoạn đầu tiên: Chuẩn bị cây mẹ

3.1.78 Giai đoạn này là giai đoạn điều kiện vệ sinh cây mẹ được cải thiện.Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn làm mẫu cấy có thể được cải thiện bởimột số kỹ thuật như tưới nhỏ giọt, ghép nhiều tầng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Ngoài

ra các thủ tục phát hiện để làm giảm hay loại trừ một số mầm bệnh về vi khuẩn, virus

là điều càn thiết (George, 1993) Chọn nguyên liệu ban đàu rất quan trọng, nó khôngchỉ quyết định thành công ban đầu mà cả các quá trình tiếp theo

3.1.79 ♦♦♦ Giai đoạn 1: Tiệt trùng mẫu cấy

3.1.80 Đây là một sự kết họp giữa một phương pháp tiệt trùng đầy đủ và một

tỉ lệ sống cao với mẫu cấy và không bị nhiễm Thông thường khó đạt thành công100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu Để nâng cao tỉ lệ tiệt trùng, cần chú ý đến nồng

độ hóa chất và thời gian khử trùng Nồng độ và thời gian khử trùng tùy theo loài vàkích thước của mẫu cấy

3.1.81 * Các hóa chất khử trùng bề mặt:

3.1.82 > Dung dich hypochloride

3.1.83 lon hypochloride có trong sodium hypochloride NaOCl hoặc calciumhypochloride Ca(OCl)2, nồng độ sử dụng là từ 5 - 10% để ngâm mẫu khoảng 20 phút(Nguyễn Bảo Toàn, 2004) Sodium hypochloride hòa tan trong nước ở dạng lỏng

Trang 19

Dung dịch này có trong các sản phẩm tẩy rửa như nước Javel, Clorox.

3.1.84 Tác dụng diệt khuẩn của dung dịch hypochloride là cả HOC1 và ion ocn.

Người ta cho rằng HOC1 hiệu quả hơn OC1 Dung dịch hypochoride nên được sửdụng ở pH 6-7

3.1.85 Nước Javel thương mại có chứa khoảng 5% NaOCl, có khả năng diệt vi sinhvật tốt và không hoặc có mức độ độc thấp đối với mẫu cấy Để tăng tính linh độngcủa hóa chất diệt khuẩn, người ta thường sử dụng thêm các chất làm giảm sức căng

bề mặt như Tween 20, Tween 80, Teepol hoặc có thể xử lý phối họp với cồn 70%(Vũ Vãn Vụ, 1999)

> Cồn

3.1.86 Có tác dụng diệt khuẩn đồng thời lấy đi các chất sáp từ mô mẫu cấy.cồn khử trùng thường được sử dụng là ethanol, nồng độ từ 70 - 95%

> lon kim loai năng

3.1.87 Chất khử trùng thông dụng nhất là HgCl2 Tuy nhiên việc sử dụng hóachất này phải hết sức cẩn thận vì độc cho thực vật lẫn động vật cũng như chất thảisau khi khử trùng có ảnh hưởng đến môi trường

> Chất khử nấm

3.1.88 Benomyl, Carbendazin, Fenbendazol, là các chất khử nấm của thuốcbảo vệ thực vật được sử dụng trong khử trùng bề mặt Nồng độ và liều lượng thayđổi theo từng loại mẫu thực vật Người ta cũng cho các chất này vào trong môitrường nuôi cấy

> Chất kháng sinh

3.1.89 Một số chất kháng sinh cũng được sử dụng cho khử trùng bề mặt đểloại trực tiếp các vi khuẩn trong mẫu cấy như streptomycin, penicillin, alcide, 3.1.90 Nồng độ hóa chất và thời gian khử trùng cực kỳ quan trọng Nếu nồng độ quácao và thời gian khử trùng khá dài mẫu có thể bị tổn thương và chết Còn nếu nồng

độ quá thấp và thời gian khử trùng quá ngắn thì không giết chết được vi sinh vật.Nồng độ thấp và thời gian khử trùng dài cũng có hiệu quả như nồng độ cao và thờigian khử trùng ngắn (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

3.1.91 ♦♦♦ Giai đoạn 2: Nhân chồi

Trang 20

3.1.92 Mục tiêu của giai đoạn này là tăng nhanh số lượng cá thể bằng sự sinhphôi soma, tăng số lượng chồi bên và tạo chồi bất định (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) sốlượng chồi nhân lên phụ thuộc vào số lần cấy chuyền và nồng độ kích thích tố sửdụng trong môi trường Một mẫu cấy có mang chồi đơn và sẽ phát triển thành mộtchồi hay một cụm chồi được tạo ra và chuyển sang giai đoạn 3 để cảm ứng ra rễ(Nguyễn Đức Lượng et al, 2002).

3.1.93 ♦♦♦ Giai đoạn 3: Kéo dài, tạo rễ và tiền thuần dưỡng.

3.1.94 Giai đoạn kéo dài: Trong nhiều trường hợp sự kéo dài là một yêu càucho sự tạo rễ đầy đủ Môi trường kéo dài thường không chứa cytokinin hoặc có íthơn lượng cytokinin được sử dụng trong giai đoạn 2 Có thể cần thiết thêm than hoạttính để trung hòa hiệu quả cytokinin còn lại trong giai đoạn 2 Tùy thuộc vào kiểucây, sự kéo dài có thể xảy ra trên các chồi đơn hoặc chồi cụm (Pierik, 1987)

3.1.95 Giai đoạn kích thích rễ và tiền thuần dưỡng: Auxin thường được sửdụng để kích thích tạo rễ Tạo rễ tốt nhất trên môi trường có hàm lượng khoáng thấp

Các rễ phát triển trong in vitro thì luôn không thích nghi với điều kiện nhà lưới và

các rễ quá dài sẽ gặp điều kiện khó khăn khi trồng Ngoài việc kích thích rễ, giaiđoạn này cũng thích hợp với tiền thuần dưỡng Các cách làm tăng khả năng thuầndưỡng là cung cấp cây con với carbonhydrate hoặc làm thấp ẩm độ tương đối trongbình chứa, sử dụng nấm rễ, sử dụng chất trơ

3.1.96 ♦♦♦ Giai đoạn 4: Sự thuần dưỡng

3.1.97 Mục đích của giai đoạn này là làm giảm tối thiểu sự chết cây con khi

chuyển từ in vitro sang nhà lưới hoặc điều kiện ngoài đồng Trong giai đoạn này các

yếu tố cần quan tâm là:

3.1.98 - Tình trạng cây con khi chuyển ra môi trường trồng

3.1.99 - Các yếu tố về môi trường như: nhiệt độ, ẩm độ và ánh sáng (Nguyễn

Bảo Toàn, 2004)

3.1.100 Đặc tính giải phẫu và sinh lý của cây con cấy mô cho thấy, chúng cầnthời gian hoàn thiện cấu trúc và chức năng sinh lý để thích nghi với môi trường tựnhiên Các kỹ thuật thuần dưỡng có mục đích làm cho cây cấy mô dần dần hoànthiện cấu trúc Các yếu tố môi trường cần đạt đến như làm thấp ẩm độ, tăng dần

Trang 21

cường độ ánh sáng Quá trình thuần dưỡng có thể bắt đầu ở giai đoạn cuối của cáccây cấy mô, còn trong bình nuôi cấy và giai đoạn sau khi chuyển cây con ra ngoàimôi trường tự nhiên (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).

b Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô:

3.1.101 Mồi trường nuôi cấy:

3.1.102 Thực vật cũng như tất cả các sinh vật khác, muốn sinh trưởng và pháttriển phải hấp thu các chất dinh dưỡng từ môi trường Nhu càu dinh dưỡng cho sinhtrưởng tối ưu của các loài không giống nhau, ngay giữa các bộ phận của cùng một cơthể cũng ít nhiều có sự khác nhau

3.1.103 Các thành phần trong môi trường nuôi cấy như: Nước, khoáng đalượng, khoáng vi lượng, đường, vitamin, chất điều hòa sinh trưởng, agar, giá trị pHđều ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy mô

3.1.104 Cho đến nay nhiều loại môi trường dinh dưỡng được tìm ra, trong số

đó môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) giàu và cân bằng về chất dinh dưỡngđược sử dụng rộng rãi trong nuôi cấy mô, thích hợp cho nhiều loài cây, phù họp chonhững nghiên cứu ban đàu (Nguyễn Văn Uyển et al, 1993)

Trang 22

3.1.110 Là thảnh phần cấu tạo của nhiều hợp chất hữu cơ chứa N nhưprotein, amoni acid, chlorophyll, Nitơ vô cơ thường được sử dụng trong môi trườngnuôi cấy mô ở hai dạng: N03 , NH4+ Lượng nitrat trong hàu hết tất cả các môitrường nhiều hơn amon và thường dùng ở nồng độ 25 mM với 2-20 mM amon.Nitrogen hữu cơ thường dùng là các amino acid và các polyamine Sự có mặt củanguồn nitơ vô cơ và hữu cơ ở hàm lượng thích hợp sẽ thúc đẩy mẫu sinh trưởngmạnh hơn và đảm bảo chống lại sự thiếu hụt nitơ (Vũ Văn Vụ, 1999)

3.1.111 • Phospho

3.1.112 Là thành phần cấu tạo của các thành phàn quan trọng trong câynhư acid nhân (DNA, RNA), màng tế bào (phospholipid), ATP, NADPH MÔ cấyhấp thu lân ở các hình thức khác nhau: H2P04”, HP042_, P04 Hai dạng phosphothường dùng nhất là NaH3P04.7H20 và KH2PO4 Nồng độ trong môi trường biếnthiên từ 0.15—4 mM, trung bình khoảng 1 mM

• Kali

3.1.113 Là thành phần xúc tác của nhiều enzyme Vai trò của K liên quannhiều đến quá trình tổng họp carbohyderate Mô hấp thu K ở dạng ion K+ Trong môi

3.1.1 Bảng 1: Các nguyên tố khoáng

3.1.2 Nguyên tố khoáng đa lượng 3.1.3 Nguyên tố khoáng vi lượng

3.1.4 Nitơ ( dạng amonium và nitrate) 3.1.5 Iod Ợ)

3.1.12 Canxi (Ca) 3.1.13 Molybdenum (Mo)

3.1.14 Lưu huỳnh (S) 3.1.15 Đồng (Cu)

Trang 23

trường nuôi cấy, thường dùng nhất là KNO3, KC1, KH2PO4 Nồng độ K+trong môitrường biến thiên từ 2-25mM, trung bình khoảng lOmM.

• Magie

3.1.114 Thành phần của chlorophyll Ngoài ra Mg còn là thành phần của nhiềuenzyme và cũng cần thiết cho quá trình biến dưỡng năng lượng trong sự tổng họpATP Cây hấp thu Mg ở dạng Mg2+ Mg được cung cấp dưới dạng MgS04.7H20 vớinồng độ trong môi trường khoảng từ 0.5-3mM

• Canxi

3.1.115 Là thành phần của vách tế bào, màng tế bào và hoạt tính của một sốcác enzyme Mô cấy hấp thu Ca ở dạng Ca2+ Ca được cung cấp dưới dạngCa(N03)2.4H20, CaCl2.2H20 với nồng độ trong môi trường khoảng từ l-3.5mM, trungbình là 2mM

• Natri

3.1.116 lon Na+ được cây hấp thu, tuy nhiên chức năng của Na đối với câytrồng thực sự chưa rõ Người ta cho rằng Na có chức năng ổn định thẩm thấu các câysống trong vùng mặn

• Clo

3.1.117 Có vai trò trong quang hợp chủ yếu ở hệ thống quang II trong quá trìnhquang phân li nước, Ngoài ra, ion cr còn điều hòa sự đóng mở khí khẩu Mô cấyhấp thu ở dạng cr.

3.1.118 ♦♦♦ Các nguyên tố khoáng vỉ lượng

3.1.119 Có rất ít các nguyên tố vi lượng được chứng minh là không thể thiếuđối với sự phát triển của mô và tế bào thực vật Tuy nhiên, để an toàn các nguyên tố

vi lượng cần thiết đối với cây trồng đều được cung cấp trong môi trường nuôi cấy

• lot

3.1.120 Không được công nhận như một nguyên tố dinh dưỡng cho thực vậtbậc cao mặc dù nó có thể cần thiết cho một số tảo và một lượng nhỏ thực vật bậccao Nếu cần, chỉ sử dụng một lượng nhỏ

• Bo

Trang 24

3.1.121 Cần thiết cho sự phát triển và chuyển hóa mô, gia tăng sự ổn định của

tế bào và sự sinh sản của cây Các chức năng sinh hóa của B vẫn chưa được hiểu rõ.Người ta thấy B có liên quan đến sự điều hòa hoạt động của enzyme phenolase, biếndưỡng acid phenolic và sự tổng họp lignin

• Mangan

3.1.122 Là nguyên tố vi lượng quan trọng trong môi trường nuôi cấy, là thànhphàn quan trọng trong quang phân ly nước và cũng là thành phần hoạt hóa cho nhiềuenzyme Cây hấp thụ Mn ở dạng ion Mn2+

3.1.123 •Kẽm

3.1.124 Liên quan đến các phản ứng tổng hợp Indol-3- acetic acid (IAA), cũng

là thành phàn hoạt hóa của một so enzyme Mô thực vật hấp thụ Zn ở dạng ion Zn2+

• Molybden

3.1.125 Mo là thành phàn cơ bản của enzyme khử nitrate và nitrogenase Mocần thiết cho quá trinh tổng hợp ascorbic acid Mô thực vật hấp thụ Mo ở dạng ionMo042-

• Đồng

3.1.126 Tham gia vào sự hoạt hóa của các enzyme cytocrome oxydase trong hôhấp, trong các chất vận chuyển điện tử như plastocyanin và cũng là thành phần củaascorbic acid oxydase Mô cây hấp thu Cu ở dạng Cu2+

Trang 25

giải phóng ra dần dần theo nhu cầu của mô thực vật.

3.1.129 • Nhôm và niken

3.1.130 Là nguyên tố vi lượng được cho vào môi trường nuôi cấy, tuy nhiênvai trò sinh lý của các nguyên tố này thì chưa thật sự được hiểu rõ Người ta thấy Ni

là thành phần của enzyme urease biến đổi ure sang ammonium

3.1.131 Nồng độ của khoáng đa lượng và vi lượng trong môi trường ra rễthường giảm xuống còn một nửa so với bình thường (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

3.1.132 ♦♦♦ Nguồn cacbonhydrat, Đường sucrose

3.1.133 Nguồn carbonhydrat thường dùng là đường sucrose, đây là nguồncacbon để tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ, giúp tế bào phân chia, tăngsinh khối trong môi trường nuôi cấy nhân tạo Đường càn thiết cho sự ra rễ ở nhiềuloài thực vật Hai loại đường monosaccharide và disaccharide đã được thí nghiệm.Đường sucrose thường được sử dụng trong khoảng 2-5% Khi sử dụng đườngsucrose trong môi trường nuôi cấy, nó được thủy phân hoàn toàn hoặc thủy phân mộtphàn thành monosaccharide: glucose và fructose Đường còn ảnh hưởng đến áp suấtthẩm thấu của môi trường (Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

3.1.134 Hàm lượng đường cao, mô nuôi cấy khó hút được nước Hàm lượngđường quá thấp là một trong những nguyên nhân gây ra hiện tượng mọng nước ởmẫu nuôi cấy, đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra vườn ươm(Vũ Văn Vụ, 1999)

3.1.135 ♦♦♦ Vitamin

3.1.136 CÓ vai trò xúc tác quá trình trao đổi chất diễn ra bên trong tế bào, kíchthích sinh trưởng rễ cây Vitamin thường sử dụng nhiều nhất là Nicotinic acid,Pyridoxin, Thiamine, Myo inositol

3.1.137 Việc xử lý phối hợp một số vitamin với các auxin, cytokinin và cácnguyên tố vi lượng thường đem lại kết quả mỹ mãn trong giâm cành và cấy mô (VũVăn Vụ, 1999)

3.1.138 ♦♦♦ Chất tạo gel

• Agar:

3.1.139 Là sản phẩm tự nhiên được trích từ tảo Là thành phần quyết định trạng

Trang 26

thái vật lý của môi trường Hàm lượng agar thường dùng cho nuôi cấy mô dao động

từ 0.6 - 10% theo khối lượng Nồng độ cao của agar làm môi trường trở nên cứng, sựkhuếch tán của các chất dinh dưỡng cũng như hấp thụ của mô gặp khó khăn Tuynhiên, môi trường lỏng sẽ gây ra hiện tượng mọng nước ở nuôi cấy mô (Vũ Văn Vụ,1999)

3.1.142 s Độ tinh khiết của Agar s Hàm lượng ẩm chứa trong Agar

3.1.143 s Sự sinh trưởng của mẫu cấy trong môi trường có agar theo từng loại

thương hiệu

3.1.144 ■S Nồng độ agar sử dụng sẽ ảnh hưởng đến:

3.1.145 Thế năng nước trong môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến:

3.1.146 ■S Độ cứng của môi trường s Sự sinh trưởng của mẫu cấy

3.1.147 •S Các vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước (hyperhydricity) 3.1.148 s Sự hoạt động của cytokinin trong môi trường có agar ( Nguyễn Bảo

Toàn, 2004)

3.1.149 * Công thức môi trường MS (Murashỉge và Skoog, 1962):

3.1.150 ❖ Thành phần muối khoáng cơ bản của môi trường MS:

Trang 27

3.1.161 *1* Chất điều hòa sinh trưởng thực vật

3.1.162 Điều quan trọng của vi nhân giống là nghiên cứu vai trò của các chấtđiều hòa sinh trưởng và sự cảm ứng kích thích thành chồi với số lượng lớn Chấtđiều hòa sinh trưởng thực vật là những hợp chất hữu cơ khác chất dinh dưỡng, vớimột hàm lượng nhỏ có thể kích thích, ức chế hoặc bổ sung một quá trình sinh lí nào

đó trong thực vật ( Nguyễn Minh Chơn, 2004)

3.1.163 Cây trao đổi thông tin giữa các tế bào chủ yếu là nhờ các hóa chất Khicây nhận một kích thích, một hóa chất kiểm soát đặc biệt (hormon) được tạo ra.Hormon có thể hoạt động tại chỗ, hay có thể được vận chuyển đến một tế bào điểm ởmột phàn khác của cây, ảnh hưởng quá trình sinh lí nơi đó Hormon hoạt động nhưngười đưa tin giữa các tế bào và có hiệu quả với nồng độ rất thấp Mỗi hormon chỉảnh hưởng đến một quá trình sinh lí riêng biệt

3.1.164 Các chất điều hòa sinh trưởng được dùng trong nuôi cấy mô là: auxin,cytokinin, abscisic, gibberellin, ethylene, poly amines

• Auxin

3.1.165 Auxin tự nhiên được tìm thấy ở thực vật là indole-3-acetic acid (IAA),

Trang 28

hiện diện nồng độ cao ở vùng phân sinh mô của thực vật Auxin tổng họp được dùngrộng rãi nhất là indole-3-butyric acid (IBA), alpha-napthaleneacetic acid (NAA), 2,4

—dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) Các auxin này thường sử dụng kết họp vớicytokinin Trong nuôi cấy mô, auxin có tác dụng sinh lý về nhiều mặt lên các quátrình sinh trưởng của tế bào, gây hiệu ứng giãn thành tế bào, làm tăng thể tích, khốilượng chất nguyên sinh, kích thích sự hình thành rễ, gây ra hiện tượng ưu thế ngọn,tính hướng của thực vật, kích thích sự sinh trưởng của quả và tạo quả không hạt(Pierik, 1987)

• Cytokinin

3.1.166 Trong nuôi cấy mô cytokinin đóng vai trò quan trọng trong sự phátsinh chồi và nhân chồi, giữ tuổi thọ cho mô cấy, kích thích sự phân chia tế bào, địnhhướng phân hóa tế bào Các cytokinin thường được sử dụng là zeatin (Z) được trích

từ hạt bắp nảy mầm, kinetin (KIN), benzynaldenine (BA), thidiazuron (TDZ), benzylaminopurin (BAP) (Pierik, 1987) Sử dụng hàm lượng cytokinin cao có thểgây ra một số vấn đề trong các cây được nhân giống như sự thừa nước, tạo thành bụirậm, biến dị vô tính, các vấn đề về rễ và chậm ra hoa (Debergh, 2003)

6-3.1.167 • Tương tác giữa auxin và cytokinin

3.1.168 Nhiều tác giả nghiên cứu cho thấy tỷ lệ auxin và cytokinin trong môitrường nuôi cấy ảnh hưởng đến sự thành lập chồi và rễ Một tỷ lệ cytokinin cao vàauxin thấp thích họp cho sự ra chồi Trong khi tỷ lệ cytokinin thấp và auxin cao thíchhợp cho sự ra rễ, mức độ trung gian giữa hai tỷ lệ thích hợp cho sự tạo mô sẹo(Debergh, 2003)

3.1.169 Gibberellin

3.1.170 Gibberellin mẫn cảm với nhiệt độ và thường không được sử dụng trongnuôi cấy mô Khi sử dụng Gibberellin thường được lọc vô trùng sau khi đã hấp khửtrùng môi trường Chức năng chính của nó trong cây là kích thích sự tăng trưởng kéodài ở mô phân sinh chồi Do đó, chúng được sử dụng để kích thích kéo dài cây lúalùn Trong các gibberellin thì gibberellin 3 ( GA3) thường được sử dụng trong nuôicấy mô Dù auxin và gibberellin đều kích thích sự tăng dài của thân nhưng ảnh

Trang 29

hưởng của chúng trên cây khá khác biệt Vì gibberellin được vận chuyển qua mô gỗ

và mô libe, trong khi auxin được di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác một chiều.Gibberellin có ảnh hưởng trên toàn bộ cây, auxin ảnh hưởng trên từng vùng của cây

3.1.171 Ảnh hưởn.2 của điều

kiên nuôi cấy ♦♦♦ Nhiệt độ

3.1.172 về mặt thực hành có thể tối ưu hóa nhiệt độ cho mỗi loài

và mỗi giai đoạn sinh trưởng, thường 24 ± 2°c Ban đêm nhiệt độ thường thấp hơn.Nhiệt độ trong các bình tam giác, lọ nuôi cấy thường cao hơn nhiệt độ phòng vài độ

do hiệu ứng nhà kính Nhiệt độ cũng như thời gian chiếu sáng ngày đêm phải khôngđổi trong suốt thời gian nuôi cấy (Vũ Văn Vụ, 1999)

❖ Ánh sáng

3.1.173 Thường sử dụng là đèn huỳnh quang đặt song song với

kệ Cường độ ánh sáng từ 1000 - 2500 lux được dùng phổ biến cho nuôi cấy nhiềuloại mô Theo Amnũrato (1986), ánh sáng tham gia vào sự phát sinh, phát triển tếbào soma Cường độ ánh sáng cao gây nên sự phát triển của mô sẹo, ánh sáng ởcường độ trung bình kích thích sự tạo chồi, ngoài ra với cường độ ánh sáng thấp chồi

sẽ gia tăng chiều cao và có màu xanh đậm (Vũ Văn Vụ, 1999)

c Những vẩn đề thường gặp trong nuôi cấy mô:

Trang 30

3.1.178 ♦♦♦ Sư tay nhiễm:

3.1.179 Sự tạp nhiễm là vấn đề rất được quan tâm và thường xảy ra trong ncm

tv, gây hậu quả nghiêm trọng đến hiệu suất nuôi cấy một số nguồn gây tạp nhiễmnhư từ mẫu cấy, thao tác trong lúc cấy, môi trường, dụng cụ thiết bị như tủ cấy,kẹp

3.1.180 Muốn giảm tỉ lệ tạp nhiễm cần thực hiện nhiêm túc các phương phápkhử trùng:

3.1.181 ♦♦♦ Vỉêc sản xuất các chất 2ÔV đôc từ mẫu cấy:

3.1.182 Mầu Cấy của vài loài thực vật có hiện tượng hóa nâu sau vài ngày nuôicấy, khi đó sự sinh trưởng của mẫu cấy sẽ chậm lại và mẫu cấy có thể bị chết Hiệntượng hóa nâu là do mẫu có chứa các hợp chất tannin và hydroxylphenon có nhiềutrong mô già hơn mô non Các phân tử phenon làm nâu mẫu là Eucomic acid vàtyramine

3.1.183 Vài phương pháp làm giảm sự hóa nâu:

• Than hoạt tính giúp ngăn cản quá trình hóa nau hay đen

• Polyvinylpyrolidone(PVP) 1 chất thuộc loại polyamide hấp thu phenon ngăn chặn sự hóa nâu

• Cho các chất khử quá trình oxh ngăn chặn quá trình oxh phenon như: ascorbicacid, citric acid Glutathione, mecaptoethanol

3.1.184 Ngoài ra: Để hạn chế ảnh hưởng phenon các nhà khóa học đưa ra một

số kĩ thuật khi thao tác trên mẫu:

• Sử dụng mẫu nuôi cấy nhỏ từ mô non

• Sây vết thương trên mẫu nhỏ nhất khi khử trùng, ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic acid, citric acid vài giờ trước khi cấy

3.1.185 (' trong-nuoi-cay-mo-thuc-

http://tailieu.vn/xem-tai-lieu/nhung-van-de-thuong-gap-3.1.186 vat.365038.htm11

2.2.3 Sự tạo mô sẹo và tái sinh của thực vật trong điều kiện in vừro

a Sự hình thành mô sẹo của thực vật:

> Định nghĩa mô sẹo

Trang 31

3.1.187 Mô sẹo là khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô hoặc cơquan đã phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt như vết thương, xử lí với các chất điềuhòa sinh trưởng thực vật , ( Nguyễn Đức Lượng, 2002) Xét về mặt cấu trúc thì môsẹo là một khối vô định của các tế bào nhu mô có vách mỏng, được sắp xếp lỏng lẻo( Nguyễn Bảo Toàn, 2004).

> Tầm quan trọng của mô sẹo

3.1.188 Nuôi Cấy mô sẹo là một khâu quan trọng ữong nuôi cấy tế bào, mô sẹo

là nguyên liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng như: phân hóa mô và tế bào,chọn dòng tế bào, protoplast, sản xuất các chất có hoạt tính sinh học, (Nguyễn ĐứcThành, 2002)

3.1.189 Việc nuôi cấy mô sẹo được ứng dụng trong nhiều trường họp:

- Nhân giống in vitro ở những loài thực vật mà phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng có ít hiệu quả hoặc không thực hiện

- Làm nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào đơn, thu nhận các chất có hoạt tính sinh học

- Nguyên liệu cho chọn dòng tế bào: đột biến, chọn dòng chịu mặn,

- Nghiên cứu quá trình hình thành cơ quan

3.1.190 ( Theo Nguyễn Bảo Toàn, 2004)

> Nguồn gốc của mô sẹo

3.1.191 Mô sẹo được phát sinh từ các tế bào sinh sôi của mô cha mẹ Trongquá trình nuôi cấy, mô sẹo được hình thành từ một mảnh nhỏ của mẫu cấy trên môitrường được cung cấp chất điều hòa sinh trưởng dưới điều kiện vô trùng Hormonthay đổi chuyển tế bào từ thụ động sang hoạt động Theo Vũ Văn Vụ ( 1999) mô sẹosau khi hình thành gồm 2 loại:

- Loại xốp: Chứa nhiều tế bào xốp với nhân nhỏ, tế bào chất loãng và không bào to

- Loại cứng: Các tế bào chắc, nhân to, tế bào chất đậm đặc và không bào nhỏ

> Sự tạo mô sẹo

3.1.192 Kĩ thuật tạo mô sẹo được tiến hành làn đàu tiên vào cuối những năm

Trang 32

20 đàu những năm 30 là một trong những phương pháp đầu tiên của lã thuật nuôi cấy

mô trong nhiều năm Đa số các mô và cơ quan của thực vật đều có khả năng tạo môsẹo dưới một tác động thích họp nào đó Khả năng tạo mô sẹo của mô và cơ quanphụ thuộc rất nhiều vào trạng thái sinh lí, sinh hóa và kiểu gen của thực vật làm mẫu.3.1.193 Trong tự nhiên vết thương có thể dẫn đến sự thành lập mô sẹo ở nơi bịcắt hoặc phần thân hay rễ bị tổn hại Sự thành lập mô sẹo được quan sát ở hầu hếtcác nhóm thực vật sống Sự hình thành mô sẹo ở vết thương là sự đáp ứng bảo vệcủa thực vật; sự phân chia tế bào được biệt hóa do các thay đổi trong sự cân bằng nộisinh sơ khởi hay sự xáo trộn trong quá trình tạo cơ quan Theo Nguyễn Bảo Toàn

(2004) sự hình thành mô sẹo trong ỉn vitro có thể chia làm 3 giai đoạn:

- Kích thích: hầu hết các loại thực vật, mô sẹo có thể được thiết lập tương đối

dễ dàng ở cây song tử diệp, cây đơn tử diệp, khỏa tử, dương xỉ, rêu Mô củanhiều cơ quan có thể có tiềm năng phân chia và sinh sôi trên môi trường nuôicấy thích hợp Tuy nhiên, một số mô thì chịu sự phân chia tế bào nhanh hơncác mô khác

- Phân chia tế bào: Sự phân chia tế bào hoạt động, các tế bào biến đổi sang tìnhtrạng mô phân sinh

- Chuyên hóa: Sự xuất hiện về chuyên hóa tế bào và sự biểu hiện của các conđường biến dưỡng thứ cấp

3.1.194 > Các yếu tố ảnh hưởng đến sự

tạo mô sẹo • Ảnh hưởng của loại cơ quan:

3.1.195 Mô sẹo có thể được tạo ra từ nhiều loại cơ quan khác nhau của cơ thểthực vật Tuy nhiên, với mỗi loại mô hay cơ quan thì việc sử dụng chất điều hòa sinhtrưởng với loại và nồng độ khác nhau tùy mức độ nhạy cảm của các tế bào trong môhay cơ quan đó: Có thể sử dụng các mô hay cơ quan của thực vật để tạo mô sẹo như:

Rễ, thân, lá, chồi hoa, túi phấn, phôi hợp tử chưa trưởng thành, tượng tầng libe gỗ,

3.1.196 • Ảnh hưởng của tuổi cơ quan:

3.1.197 Những mảnh cơ quan trưởng thành không có khả năng tạo mô sẹo.Ngược lại, cây còn non hay những mảnh còn rất non của cây trưởng thành có thể

Trang 33

hình thành mô sẹo trên môi trường có chất điều hòa sinh trưởng thực vật, đặc biệt làauxin.

• Ảnh hưởng của ánh sáng:

3.1.198 Theo Pierick (1997) trong suốt thời gian tạo mô sẹo tùy theo mẫu cấy

mà ánh sáng có thể cần hay không cần thiết Đa số trường họp, trong tối sự tạo sẹodiễn ra tốt hom ngoài ánh sáng, đặc biệt với mẫu cấy là lá

• Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật:

3.1.199 Auxin có vai trò quan trọng trong sự tạo mô sẹo, trong môi trường nuôicấy, auxin thường gây ra sự tạo bướu ở mô và cơ quan, kích thích sự phân chia tếbào ( tạo mô sẹo) kích thích sự tạo rễ bất định, gây ra sự phát sinh phôi từ tế bàosoma từ các huyền phù tế bào Khi nồng độ auxin thấp thì sự tạo rễ bất định chiếm

ưu thế, khi nồng độ auxin cao sẽ không có sự tạo rễ nhưng lại xảy ra sự tạo mô sẹo

Đa số mẫu thực vật thuộc nhóm song tử diệp không có khả năng tạo mô sẹo trongmôi trường chỉ có auxin mà càn phải có sự phối hợp của auxin và cytokinin

3.1.200 Mô sẹo khi hình thành nếu tiếp tục duy trì trong môi trường có auxinthì sự tăng sinh của mô sẹo sẽ nhanh, nhưng nếu chuyển sang một môi trường có đầy

đủ các thành phần dinh dưỡng không có sự hiện diện của auxin thì sự tăng sinh của

mô sẹo diễn ra rất chậm (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

3.1.201 Hình thái mô sẹo phụ thuộc rất nhiều vào loại cũng như nồng độ củacác chất điều hòa sinh trưởng thực vật hiện diện trên môi trường nuôi cấy TheoMehra và Jaidka (1985); Pal et al (1985); Shrikhande et al (1993) ghi nhận nếu giữnguyên nồng độ và loại auxin, nhưng thay đổi thành phàn và nồng độ cytokinintrong môi trường nuôi cấy thì hình thái mô sẹo thay đổi Hầu hết sự hiện diện củaBAP trong môi trường nuôi cấy kích thích sự tạo mô sẹo dạng nốt, chắc, màu nâu, cókhả năng sinh phôi; mô sẹo trên môi trường có kinetin có dạng bở và thường không

có khả năng sinh phôi (Shrikhande et al., 1993) Nồng độ auxin cao kích thích sự tạo

mô sẹo dạng bở nhưng khi giảm auxin thì mô sẹo có dạng nốt và chắc ( Nguyễn ĐứcLượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002)

> Sự chuyên hóa mô sẹo

Định dạng
Số trang	66
Dung lượng	799,28 KB