TỔNG HỢP PAMAM LAI HÓA PEG MANG THUỐC 5‑FLUOROURACIL VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH CHỐNG UNG THƯ IN VIVO TRÊN CHUỘT

Từ đó tạo tiền đề nghiên cứu sâu hơn nhằm tạo ra loại thuốc có thể đáp ứng đến các bộphận mong muốn trong cơ thể với liều lượng thích hợp và theo đúng thời gian mongmuốn, đảm bảo được 3

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

LỜI CẢM ƠN



Sau gần một năm nghiên cứu và làm việc với sự cố gắng và nỗ lực của bản thân

cộng với sự giúp đỡ của tất cả mọi người, luận văn thạc sĩ đã được hoàn thành Tôi xin chân thành biết ơn sâu sắc đến:

PGS.TS Nguyễn Cửu Khoa, Viện Trưởng Viện Công Nghệ Hoá Học -Viện Khoa Học và Công nghệ Việt Nam, Người đã dành bao tâm huyết và hết lòng tận tụy

truyền đạt cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và những kinh nghiệm trong nghiêncứu khoa học

Quý thầy cô của Viện Công Nghệ Hóa Học tại TP HCM, trường Đại học Cần

Thơ đã tận tình giảng dạy trong suốt thời gian tôi theo học

Ts Hoàng Thị Kim Dung, Kỹ sư Lý Tú Uyên, Kỹ sư Nguyễn Hoàng công

tác tại Phòng Hóa hữu cơ polymer - Viện Công Nghệ Hóa học - Viện Khoa Học vàCông Nghệ Việt Nam , đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhấttrong thời gian tôi thực hiện đề tài

Cuối cùng tôi xin cám ơn đến gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã động viên,

ủng hộ, giúp đỡ cho tôi về vật chất lẫn tinh thần để tôi an tâm học tập, nghiên cứu vàhoàn thành luận văn này

Xin chân thành cám ơn!

Cần Thơ tháng 10 năm 2011

Mai Bích Thoa

EPR Enhanced Permeability and Rentention Effect

1H NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Bảng 1 Tính chất vật lý của hóa chất 40

Bảng 2 Độ dịch chuyển hóa học 1H NMR của MPEG p - nitrophenyl carbonate 51

Bảng 3 Độ dịch chuyển hóa học của 1H NMR của PAMAM G3.0-MPEG 54

Bảng 4 Khảo sát nhả thuốc in vitro trong môi trường nước 60

Bảng 5 Trung bình phần trăm giảm thể tích

khối u ở các lô thí nghiệm theo thời gian 63

Sơ đồ 1 Quy trình tổng hợp MPEG 5000 – p- nitrophenylchloroformate 44

Sơ đồ 2 Quy trình tổng hợp PAMAM G3.0-MPEG 5000 46

Sơ đồ 3 Quy trình nang hóa 5-fluorouracil vào cấu trúc PAMAM G3.0-MPEG: 48

Hình 1 Mô hình polymer dẫn thuốc của Ringsdorf 10

Hình 2 Cấu trúc Dendrimer 18

Hình 3 Sự thay đổi hình dạng và độ chặt theo

thế hệ của dendrimer PAMAM core ammonia 20

Hình 4 Phản ứng tạo các thế hệ lẻ của PAMAM 21

Hình 5 Phản ứng tạo các thế hệ chẵn của PAMAM 21

Hình 6 Cấu trúc của PAMAM: A.Core ethylenediamine; B Core ammonia 22

Hình 7 Một số hình thức vận chuyển thuốc của PAMAM 23

Hình 8 Độ độc của dendrimer theo nhóm chức bề mặt 25

Hình 9 Những thuận lợi của sự PEG hóa protein 26

Hình 10 Sự kết hợp của PEG - PAMAM với adriamycin, methotrexate 27

Hình 11 Mô hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-fluorouracil 29

Hình 12 Định hướng thụ động dựa theo cơ chế EPR 31

Hình 13 Quá trình nhập bào của chất mang - thuốc vào tế bào 33

Hình 14 Sơ đồ phản ứng tổng hợp MPEG p – nitrophenyl carbonate 36

Hình 15 Phản ứng của MPEG tác dụng với NPC 37

Hình 16 Sơ đồ phản ứng tạo thành các sản phẩm phụ 37

Hình 17 Sơ đồ phản ứng tổng hợp MPEG – PAMAM 38

Hình 18 Máy cô quay chân không 41

Hình 19 Tủ hút chân không 42

Hình 20 Máy đo phổ IR 42

Hình 21 Sản phẩm MPEG – p-nitrophenylchloroformate 50

Hình 22 Phổ 1H NMR của MPEG p - nitrophenyl carbonate 51

Hình 24 Công thức PAMAM G3.0-MPEG 53Hình 25 Phổ 1H NMR của PAMAM G3.0–MPEG 53Hình 26 Sản phẩm PAMAM G3.0 - MPEG-5-FU 55Hình 27 Phổ IR của 5-FU (A), PAMAM G3.0-MPEG (B), PAMAM G3.0-MPEG-5-

FU (C) 56Hình 28 Phổ 1H NMR của PAMAM G3.0-MPEG (A) và

PAMAM G3.0–MPEG-5-FU (B) 57Hình 29 Ảnh TEM của 5-FU nang hóa trong PAMAM G3.0-MPEG 58Hình 30 Phần trăm lượng thuốc phóng thích theo thời gian 61Hình 31 Kết quả phân tích khối u bằng phương pháp Flow cytometry với kháng thể

kháng HLA 62Hình 32 Chuột mang khối u tế bào ung thư người MCF7 63Hình 33 Biểu đồ so sánh phần trăm giảm thể tích khối u ở các lô thí nghiệm 64Hình 34 Chuột mang khối u vào ngày 0 (a) và sau 15 ngày điều trị bằng thuốc (b) 64

Phụ lục 1 Phổ 1H NMR của MPEG p – nitrophenyl carbonate (dung môi CDCl3) PL 1

Phụ lục 2 Phổ 1H NMR của PAMAM G3.0 - MPEG (dung môi CDCl3) PL 2Phụ lục 3 Phổ IR của 5-fluorouracil PL 2Phụ lục 4 Phổ IR của PAMAM G3.0 - MPEG PL 3Phụ lục 5 Phổ IR của PAMAM G3.0-MPEG-5-FU PL 3Phụ lục 6 Phổ 1H NMR của PAMAM G3.0-MPEG-5-FU (dung môi D2O) PL 4Phụ lục 7 Phổ 1H NMR của 5-fluorouracil (dung môi D2O) PL 4Phụ lục 8 Ảnh TEM của PAMAM G3.0-MPEG-5-FU PL 5Phụ lục 9 Ảnh TEM của PAMAM G3.0-MPEG-5-FU PL 5Phụ lục 10 Phổ 1H NMR của PAMAM G3.0-MPEG sau khi nhả thuốc 5-FU

hoàn toàn (dung môi D2O) PL 6Phụ lục 11 Xây dựng phương trình đường chuẩn độ hấp thu A265,5

theo nồng độ 5-fluorouracil C5-FU PL 6

Phụ lục 12 Kết quả thử nghiệm hiệu quả in vivo của 5-fluorouracil nang hóa

trong PAMAM G3.0-MPEG trên chuột mang khối u vú người PL 7

MỞ ĐẦU

Ung thư là căn bệnh nguy hiểm nó đã cướp đi bao nhiêu sinh mạng con người Theothống kê hiện nay, ung thư là nguyên nhân của 1/3 số ca tử vong trên thế giới và lànguyên nhân thứ hai gây tử vong sau bệnh tim mạch Việc điều trị ung thư cũng còngặp nhiều khó khăn như hiệu quả điều trị thấp, sự kháng thuốc của tế bào ung thư vàtính không đặc hiệu đối với tế bào ung của thuốc…

Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật con người đã không ngừng nghiên cứu

và tìm ra những vật liệu mới nhằm đáp ứng nhu cầu cấp thiết của cuộc sống Với tinhthần này, công nghệ nano ra đời đã tạo ra những vật liệu mới với kích thước từ vàinanometer tới vài trăm nanometer có thể được sử dụng như chất mang để vận chuyểndược chất cho việc điều trị bệnh PAMAM là một loại nano polymer có cấu trúc đặcbiệt thích hợp cho việc mang thuốc, bên cạnh đó khi được lai hóa với PEG thì tínhtương hợp sinh học của polymer này được tăng lên Đây là vật liệu mới có tiềm năngứng dụng trong y dược và công nghệ sinh học, đặc biệt làm chất mang thuốc để điềutrị những căn bệnh mãn tính như bệnh ung thư

Trên cơ sở đó chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Tổng hợp PAMAM lai hóa

PEG mang thuốc 5-fluorouracil và khảo sát hoạt tính chống ung thư in vivo trên

chuột” nhằm đánh giá sơ bộ về khả năng mang thuốc của polymer này và hoạt tính

chống ung thư trên cơ thể sống của 5-fluorouracil khi được mang trên PAMAM-PEG

Từ đó tạo tiền đề nghiên cứu sâu hơn nhằm tạo ra loại thuốc có thể đáp ứng đến các bộphận mong muốn trong cơ thể với liều lượng thích hợp và theo đúng thời gian mongmuốn, đảm bảo được 3 yếu tố tạo nên tính an toàn và hiệu quả của điều trị: đúng nơi,đúng lúc và đúng liều

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 MỘT SỐ THÔNG TIN VỀ THUỐC 5-FLUOROURACIL3, 51

5-Fluorouracil (5-FU) thuộc loại thuốc chống chuyển hóa, là một trong nhữngthuốc chống ung thư quan trọng nhất được sử dụng rộng rãi trong suốt 4 thập kỷ qua

1.1.1 Dược lý và cơ chế tác dụng

Fluorouracil là thuốc chống chuyển hóa pyrimidin có fluor Khi fluorouracilchuyển hóa theo con đường đồng hóa, thuốc phong bế phản ứng methyl hóa axitdeoxyuridylic thành axit thymidilic Do đó fluorouracil cản trở sự tổng hợp axitdeoxyribonucleic (ADN) và ức chế sự tạo thành axit ribonucleic (ARN) Vì ADNvà

ARN cần thiết cho sự phân chia và phát triển tế bào, mà fluorouracil lại gây ra thiếuthymin, nên làm cho sự phát triển mất cân bằng và tế bào bị chết Hiệu quả thiếu hụt

ADNvà ARN càng rõ nét ở các tế bào phát triển nhanh và tốc độ fluorouracil thâmnhập vào tế bào càng nhanh

Fluorouracil thường dùng tiêm tĩnh mạch và có nửa đời chuyển hóa ngắn Mặc

dù thuốc vẫn có hoạt tính khi uống, nhưng sinh khả dụng không ổn định Sau khi tiêmtĩnh mạch, thuốc phân bố vào các khối u, niêm mạc tiêu hóa, tủy xương, gan và các môkhác trong khắp cơ thể Mặc dù ít tan trong mỡ nhưng fluorouracil dễ dàng thấm quahàng rào máu - não và phân bố vào dịch não tủy, và các mô não

Tiêm tĩnh mạch, nửa đời thải trừ trung bình khỏi huyết tương khoảng 16 phút(từ 8 đến 20 phút và phụ thuộc vào liều dùng) Không còn thấy thuốc ở dạng nguyênvẹn trong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch được 3 giờ 7-20% thuốc thải trừ ở dạngkhông biến đổi qua nước tiểu sau 6 giờ, trong số này tới hơn 90% thải trừ ngay giờđầu Phần còn lại chuyển hóa phân giải ở gan tạo ra các chất giáng hóa (carbon

dioxide, urea, alpha - fluoro - beta - alanine) không có hoạt tính Các chất này cũng bàixuất qua nước tiểu sau 3-4 giờ.

Khi dùng tại chỗ, khoảng 6% lượng thuốc được hấp thu nhưng không đủ gâytác dụng toàn thân

Thuốc có tác dụng mạnh đến các tế bào đang tăng sinh nhanh Sự đáp ứng điềutrị bắt đầu là ban đỏ, tạo mụn nước, trợt da, loét nông, hoại tử và cuối cùng tái tạo lạibiểu mô

1.1.2 Chỉ định

Fluorouracil có hiệu quả làm thuyên giảm các bệnh carcinom đại tràng, trựctràng, vú và dạ dày Thuốc có hiệu quả kém hơn trong điều trị carcinom buồng trứng,

cổ tử cung, bàng quang, gan và tụy

Dùng ngoài da: Ðiều trị tổn thương da nông ác tính và tiền ác tính; dày sừngtuổi già; dày sừng quang hóa; u sừng gai; bệnh Bowen; carcinom nông tế bào đáy.Carcinom tế bào đáy và tế bào vảy xuyên sâu thường không đáp ứng với liệu phápfluorouracil Thuốc chỉ được dùng tạm thời khi không có phương pháp điều trị nàokhác

1.1.3 Chống chỉ định

Phụ nữ mang thai và cho con bú, người bệnh suy dinh dưỡng; suy tủy; nhiễmkhuẩn nặng; người bệnh có tiền sử quá mẫn cảm với thuốc

1.1.4 Liều lượng và cách dùng

Tiêm hoặc truyền tĩnh mạch cho người lớn

Fluorouracil có thể tiêm tĩnh mạch hoặc truyền tĩnh mạch Liều dùng thườngdựa vào thể trọng người bệnh Nếu béo phì, hoặc tăng trọng do phù cổ trướng hoặc cácdạng giữ nước khác thì tính theo trọng lượng lý tưởng Liều dưới đây có thể giảm đi1/3 hoặc 1/2 nếu thể trạng người bệnh dinh dưỡng kém, sau phẫu thuật lớn (trong vòng

30 ngày), suy tủy xương (thiếu máu, giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu), suy gan, suy thận

Truyền tĩnh mạch

15 mg/kg/ngày, không quá 1 g cho 1 lần truyền Thuốc được hòa trong 500 mLdextrose 5% hoặc 500 mL NaCl 0,9%, truyền tốc độ 40 giọt/phút trong 4 giờ hoặc

truyền trong 30-60 phút hoặc truyền liên tục trong 24 giờ Liều hàng ngày này đượctruyền liên tiếp cho đến khi độc tính xuất hiện hoặc cho đến khi được 12-15 g Ðây làmột đợt điều trị Một số người bệnh dùng tới 30 g với liều tối đa 1 g/ngày Liều hàngngày không bao giờ được quá 1 g Giữa 2 đợt điều trị nên nghỉ 4-6 tuần.

Tiêm tĩnh mạch

12 mg/kg/ngày, liền 3 ngày Nếu không xuất hiện ngộ độc thuốc có thể dùng 6mg/kg/ngày vào ngày thứ 5, thứ 7 và thứ 9 Nếu xuất hiện nhiễm độc thì ngừng chođến khi các dấu hiệu ngộ độc rút mới dùng liều tiếp theo

Liều duy trì: 5-15 mg/kg, 1 tuần 1 lần tiêm tĩnh mạch

Gần đây, người ta thường dùng liều 15 mg/kg tiêm tĩnh mạch, mỗi tuần một lần trongsuốt cả đợt điều trị, như vậy không cần dùng liều khởi đầu nữa

Truyền vào động mạch vùng

Việc truyền thuốc liên tục vào động mạch nuôi dưỡng khối u cho kết quả tốt hơn khidùng đường toàn thân qua truyền tĩnh mạch, đồng thời giảm được độc tính Liềuthường dùng 5-7,5 mg/kg/ngày

Phối hợp với tia xạ

Sự phối hợp này có hiệu quả tốt trong một vài loại tổn thương di căn ở phổi và

có tác dụng giảm đau cho những trường hợp tái phát không thể mổ được Dùng theoliều thông thường

Liều duy trì là 15 mg/kg, mỗi tuần một lần Trong điều trị tạm thời, để đạt tácdụng điều trị nhanh hơn, dùng liều 15 mg/kg/ngày, trong 6 ngày liền Sau đó dùng liềuduy trì 15 mg/kg/lần/tuần Liều mỗi ngày không quá 1 g Nên uống thuốc sau bữa ăn,với nước

Có thể trộn dung dịch thuốc với nước quả hoặc nước uống khác ngay trước khiuống để che vị khó chịu Không được pha uống làm nhiều lần.

1.2 BỆNH UNG THƯ 50, 53

Ung thư là một nhóm các bệnh liên quan đến việc phân chia tế bào một cáchkhông kiểm soát và những tế bào đó có khả năng xâm lấn những mô khác bằng cáchphát triển trực tiếp vào mô lân cận hoặc di chuyển đến các cơ quan xa hơn (di căn).Các nhà khoa học cho rằng lối sống hiện đại, mức độ ô nhiễm do các ngành côngnghiệp chính là nhân tố gây nên căn bệnh này Theo thống kê hiện nay, ung thư lànguyên nhân của 1/3 số ca tử vong trên thế giới và là nguyên nhân thứ hai gây tử vongsau bệnh tim mạch

1.2.1 Nguyên nhân ung thư

Phân chia tế bào (tăng sinh) là quá trình sinh lý xảy ra trong những điều kiệnnhất định ở hầu hết các mô trong cơ thể sinh vật đa bào Bình thường sự cân bằng giữatốc độ của quá trình tăng sinh và quá trình chết của tế bào được điều hòa một cách chặtchẽ để đảm bảo cho tính toàn vẹn của cơ quan và mô Khi các tế bào xảy ra những độtbiến trong DNA, chúng có thể phá vỡ cơ chế điều khiển này và dẫn đến ung thư

Có nhiều nguyên nhân gây đột biến như các yếu tố bên ngoài (hóa chất, bức xạ, virusmang gene gây ung thư, thuốc trị ung thư) hay các yếu tố bên trong (yếu tố di truyền,hormone, khả năng miễn nhiễm của từng cá thể)

Sự tăng sinh không kiểm soát và thường là nhanh chóng của tế bào sẽ tạo thànhcác khối u lành tính hay khối u ác tính (ung thư) Những khối u lành tính không lantràn đến những nơi khác trong cơ thể hay xâm lấn vào các mô khác, và chúng hiếm khi

đe dọa đến tính mạng trừ khi chúng chèn ép đến các cấu trúc sống còn Các khối u áctính có thể xâm lấn vào các cơ quan khác, lan đến những nơi xa hơn (di căn) và trở nên

đe dọa đến tính mạng

1.2.2 Các loại ung thư

Ung thư có thể được phân loại dựa theo tính chất giải phẫu bệnh hoặc theo cơ

quan bị tổn thương Các tế bào ung thư trong một khối u (bao gồm cả tế bào đã di căn) đều xuất phát từ một tế bào duy nhất phân chia mà thành Do đó một bệnh ung

thư có thể được phân loại theo loại tế bào khởi phát và theo vị trí của tế bào đó Tuynhiên, trong nhiều trường hợp, người ta không xác định được khối u nguyên phát.Các loại ung thư:

 Ung thư biểu mô (carcinoma) có nguồn gốc từ tế bào biểu mô (ví dụ như ở ốngtiêu hóa hay các tuyến tiêu hóa)

 Bệnh lý huyết học ác tính (hematological malignancy), như bệnh bạch cầu(leukemia) và u lympho bào (lymphoma), xuất phát từ máu và tủy xương

 Ung thư mô liên kết (sarcoma) là nhóm ung thư xuất phát từ mô liên kết, xươnghay cơ

 U hắc tố do rối loạn của tế bào sắc tố

 U quái bắt nguồn từ các tế bào mầm

1.2.3 Điều trị ung thư

Ung thư có thể được điều trị bằng phẫu thuật, hóa trị liệu, xạ trị liệu, miễn dịchtrị liệu hay các phương pháp khác Việc chọn lựa phương pháp điều trị phụ thuộc vào

vị trí và mức độ (grade) của khối u, giai đoạn của bệnh, cũng như tổng trạng của bệnhnhân Một số điều trị ung thư thực nghiệm cũng đang được phát triển

Hóa trị liệu là điều trị ung thư bằng thuốc chống ung thư có khả năng tiêu diệt tế bàoung thư Hóa trị liệu được sử dụng trong các trường hợp sau:

 Không thể phẫu thuật hay xạ trị như bệnh bạch cầu (leukemia) và u lympho bào(lymphoma)

 Ung thư đã di căn nhiều nơi, không thể cắt bỏ triệt để hoặc không thể cắt bỏkhối u được nữa Tia xạ cũng chỉ có thể dùng ở những nơi lớn, tập trung

 Điều trị bổ sung với phẫu thuật giải tỏa u hoặc phòng ngừa sau khi cắt bỏ hoàntoàn khối u

Thuốc chống ung thư can thiệp vào phân bào theo các cách khác nhau, ví dụ như sựsao chép DNA hay quá trình phân chia các nhiễm sắc thể mới được tạo thành Hầu hếtcác dạng hóa trị đều nhắm vào các tế bào phân chia nhanh chóng và không đặc hiệucho tế bào ung thư Vì vậy, hóa trị có khả năng làm tổn thương các mô lành, đặc biệt làcác mô có tần suất thay thế nhanh chóng (ví dụ như niêm mạc ruột) Những tế bào nàythường tự sửa chữa sau khi hóa trị

1.2.4 Những khó khăn trong hóa trị liệu điều trị ung thư1, 25, 36, 46

Độc tính của các thuốc trị ung thư 1

Tác dụng của các thuốc chữa ung thư không đặc hiệu Các thuốc chữa ung thư

có tác dụng độc, ngăn cản sự phân bào của các tế bào ung thư, nhưng đồng thời cũnggây độc với cả tế bào lành Hơn nữa, hầu hết thuốc trị ung thư có hệ số trị liệu thấp

(khoảng cách giữa liều điều trị và liều gây độc tính nhỏ), chúng có thể gây ảnh hưởng

cho tế bào ngay ở liều điều trị, đó là điều làm giới hạn trị liệu

Các mô tăng sinh nhanh như tủy xương, tế bào sinh sản, niêm mạc, da, nang tóc, vàđặc biệt là bào thai,… là các nơi thường biểu thị độc tính cấp của thuốc trị ung thư

Do độc tính cao nên việc sử dụng hóa trị liệu chữa ung thư là hạn chế Các biểu hiệnđộc thường gặp là:

 Rối loạn tiêu hóa, buồn nôn và nôn, viêm loét niêm mạc, táo bón, tiêu chảy

 Rối loạn chức năng gan, tổn thương ống thận

 Rụng tóc, ban đỏ, viêm loét da

 Với tủy xương, hầu hết các thuốc chữa ung thư đều làm suy yếu chức năng củatủy xương, hạn chế sự tạo ra hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu, gây ra thiếu máu;

do đó dễ bị xuất huyết và dễ bị nhiễm khuẩn Cần kiểm tra máu thường xuyên

để điều chỉnh liều dùng hoặc ngừng thuốc

 Với hệ nội tiết, thuốc có ảnh hưởng xấu đến buồng trứng và tinh hoàn, dẫn đến

vô sinh

 Với trẻ em, thuốc làm chậm sự tăng trưởng và phát triển

 Ung thư thứ phát: do dùng thuốc lại phát sinh ra các ung thư mới, xảy ra saunhiều tháng hoặc nhiều năm

 Gây tổn thương mạch máu và đau khi truyền thuốc đường tĩnh mạch, có thể bịngay khi tiêm hoặc sau khi điều trị một thời gian

 Sút cân, người yếu, không còn khả năng làm việc

 Đã thấy thuốc gây quái thai trên động vật thí nghiệm Vì vậy những người đãdùng thuốc chữa ung thư thì không nên có con nữa

Những tác dụng phụ này gây sự sợ hãi và lo lắng thường xuyên, thậm chí gây rối loạn

về tính cách, hành vi của bệnh nhân

Sự kháng thuốc của tế bào ung thư 46

Các tế bào ung thư có thể kháng lại các thuốc chữa ung thư cũng như các vi khuẩnkháng lại các thuốc hóa trị liệu kháng khuẩn

Cơ chế tế bào ung thư kháng thuốc gồm:

 Làm giảm sự thâm nhập của thuốc vào các tổ chức ung thư

 Làm giảm sự tích lũy của thuốc, thải trừ thuốc ra khỏi tế bào ung thư bằng các

“bơm” P - glycoprotein trên màng tế bào

 Làm giảm hoạt tính của thuốc bằng cách chuyển hóa các phân tử thuốc

 Làm biến đổi protein mục tiêu và các yếu tố cần để thuốc tác động lên tế bàoung thư

 Tăng cường sửa chữa DNA sai hỏng do tác động của thuốc

 Tăng tổng hợp protein để vẫn đảm bảo cho việc phân chia tế bào mặc dù bịthuốc tác động

Sự kháng thuốc có thể đặc hiệu cho một loại thuốc nhất định, nhưng cũng như sựkháng kháng sinh, các tế bào ung thư cũng có hiện tượng kháng thuốc chéo

Hiệu quả điều trị thấp 1, 25, 36

Do phần lớn thuốc trị ung thư ít tan trong nước nên khả năng hấp thu thuốc vào

cơ thể qua đường uống kém Lượng thuốc đi vào tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tínhthấp Tiêm truyền là một phương pháp tốt hơn, bảo đảm được lượng thuốc xâm nhậpvào tuần hoàn chung Tuy nhiên, tiêm truyền trong thời gian dài gây đau và tổn thươngmạch máu cho bệnh nhân

Khi thuốc vào được tuần hoàn chung thì chỉ một phần nhỏ lượng thuốc đếnđược đích tác dụng, phần còn lại phân bố vào các cơ quan khác hoặc bị chuyển hóa tạigan hay bị thải trừ ở thận dẫn đến nồng độ thuốc tại cơ quan đích rất thấp, không pháthuy được tác dụng

Ví dụ: đối với 5-FU, khi tiêm tĩnh mạch, nửa đời thải trừ trung bình khỏi huyếttương khoảng 16 phút (từ 8 đến 20 phút) Không còn thấy thuốc ở dạng nguyên vẹntrong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch được 3 giờ 7-20% thuốc thải trừ ở dạngkhông biến đổi qua nước tiểu sau 6 giờ, trong số này tới hơn 90% thải trừ ngay giờđầu Phần còn lại chuyển hóa phân giải ở gan tạo ra các chất giáng hóa (carbon

dioxide, urea, alpha - fluoro - beta - alanine) không có hoạt tính Các chất này cũng bàixuất qua nước tiểu sau 3-4 giờ.

Trong lượng thuốc 5-FU xâm nhập được vào các tế bào ung thư thì cũng chỉ cókhoảng 20% đi theo con đường đồng hóa và phát huy tác dụng Khoảng trên 80% bị dịhóa bởi dihydropyrimidine dehydrogenase (DPD) trở thành dạng bất hoạt tính vànhanh chóng bị đào thải

Do vậy để đạt được nồng độ thuốc có tác dụng tại đích, nếu theo cách thôngthường, chúng ta phải đưa vào cơ thể một lượng thuốc nhiều hơn Nhưng việc tăng liềulượng bị giới hạn bởi liều độc cũng như các tác dụng phụ và nhiều điều bất lợi khác

Do đó, để tăng tốc độ sinh hóa và giảm sự đề kháng thuốc thì khoảng cách giữa cácliều dùng thuốc bắt buộc phải rút ngắn Điều này càng gây ra sự bất tiện cho bệnh nhântrong quá trình điều trị ung thư và tăng chi phí điều trị

1.2.5 Chất mang polymer - liệu pháp mới điều trị ung thư

Một trong những ý tưởng để giải quyết những vấn đề này là đưa thuốc trực tiếpvào vị trí phát huy tác dụng (cơ quan, tế bào, hoặc các thành phần của tế bào), tạo ramột loại thuốc có tính chọn lọc cao vào một cơ quan nào đó trong cơ thể Thuốc sẽphát huy tác dụng khi được hấp thu qua màng tế bào Có nhiều con đường để thuốchấp thu qua màng tế bào như khuếch tán trực tiếp qua lớp phospholipid kép, khuếchtán qua các protein kênh, nhập bào nhờ protein vận chuyển hay chất mang hay sự ẩmbào

Chất mang thuốc là một liệu pháp mới trong điều trị ung thư Các chất mang(carrier) có tác dụng như một giá đỡ cho thuốc, giúp thuốc tránh khỏi sự đào thải bởicác cơ chế bảo vệ của cơ thể (chuyển hóa ở gan, thải trừ qua thận, phân huỷ bởi cácenzyme, tấn công của bạch cầu và hệ thống miễn dịch ) Các chất mang còn giúpphân tử thuốc đến được đích tác dụng mong muốn Chất mang thuốc có tác dụng nhưmột tiền dược (prodrug) giúp giảm độc tính của thuốc, thu hẹp phạm vi phân bố củathuốc trong cơ thể nên làm giảm tác dụng phụ của thuốc và giảm lượng thuốc nhưngvẫn đảm bảo hiệu quả điều trị Liệu pháp điều trị bệnh có ứng dụng polymer đã đượcRingsdorf nghiên cứu từ năm 1978 bởi những tính chất ưu việt của nó Khung sườnpolymer có tác dụng như một hệ thống dẫn thuốc Trên đó có bộ phận để liên kết vớiphân tử thuốc, bộ phận làm tăng khả năng hòa tan những loại thuốc có tính ái dầu, nhờ

đó thuốc sẽ đi vào hệ tuần hoàn máu thuận lợi hơn, tăng sinh khả dụng của thuốc, tăngthời gian bán thải của thuốc.

Hình 1 Mô hình polymer dẫn thuốc của Ringsdorf 36

Polymer được sử dụng làm hệ thống dẫn thuốc phải thỏa mãn các yêu cầu sau:

 Có tính tương hợp sinh học, không độc đối với cơ thể

 Giảm các tác dụng phụ có hại nhưng vẫn duy trì được đặc tính của thuốc

 Giảm lượng thuốc cần dùng nhưng vẫn đảm bảo hiệu quả điều trị

 Giảm độ thanh thải, tăng thời gian tuần hoàn thuốc trong cơ thể

 Kiểm soát được lượng thuốc sử dụng, tăng khoảng thời gian giữa các lần dùngthuốc, tạo cho bệnh nhân sự thoải mái khi điều trị

1.2.6 Một số polymer thường dùng làm chất mang vận chuyển và phân phối thuốc 5-fluorouracil 4, 5, 9, 10, 15, 16, 18, 19, 24, 26, 28, 29, 31, 32, 35, 48, 49

Chuỗi hạt Alginate 4

Polysacharide như alginate là một copolymer tự nhiên, được hình thành từ axitglucuronic và axit manuronic Alginate được sử dụng rộng rãi trong các ngành thựcphẩm, mỹ phẩm, dược và y sinh nhờ vào đặc tính hình thành dạng gel khi có sự hiệndiện của các cation đa hóa trị Một ví dụ điển hình là hệ gel trên nền nước của sodiumalginate cùng với cation hoá trị II (Ca2+) được dùng làm chất vận chuyển thuốc trong

Khi lượng 5-FU được mang tăng lên thì kích thước của hạt alginate cũng tăng lên cókhi lên đến 1-2 mm, hiệu suất bao bọc thuốc có thể đạt tới 10% Khảo sát cho thấy sựnhả thuốc hoàn tất sau 7 h.

mục đích này, một blockpolymer của PEG 35 kDa với ε-caprolactone được tổng hợp ở

nhiệt độ 185C không dùng xúc tác trong môi trường chân không đã được đề nghị để

tổng hợp poly caprolactone)-blockpoly (ethylene glycol)-block-poly

(ε-caprolactone) (PCL-PEG-PCL) Nghiên cứu này dẫn đến một kết luận sử dụngcopolymer (PCL-PEG-PCL) để kéo dài thời gian nhả thuốc 5-FU trong hệ dẫn thuốc:thuốc chống ung thư được nhả ra nhanh trong 10h đầu tiên, theo sau đó là pha nhảthuốc chậm, cuối cùng đạt đến giá trị tới hạn sau 24 h

Poly(D,L-lactide-ran-ε-caprolactone)-poly(ethyleneglycol)-poly(D,L

-lactide-ran-ε-caprolactone) triblock copolymer cũng được đề nghị sử dụng làm chất dẫn thuốc

5-FU Polymer này được tổng hợp bằng phản ứng polymer hóa mở vòng D,L-lactide và

ε-caprolactone với sự hiện diện cũa PEG, phản ứng sử dụng Zn L-lactate làm chất khơimào Hiệu suất mang 5-FU khoảng 90% Khảo sát đặc tính về nhiệt độ nóng chảy và

độ nhớt, cho thấy polymer này có khả năng làm hệ vận chuyển thuốc ở dạng tiêm

Chitosan 9, 10, 18, 28, 48

Chitosan, thu được bằng cách khử acetyl trong chitin, là polymer ưa nước đượcdùng làm hệ vận chuyển thuốc nhờ vào khả năng tương thích sinh học, phân huỷ sinhhọc và tính chất kết dính màng nhầy Do không tan ở môi trường pH cơ thể người, nênkhó khăn lớn của polymer này là sự ngưng tụ làm giới hạn sử dụng chúng trong việc

vận chuyển đường tĩnh mạch Tuy nhiên, chitosan có những ưu điểm nhất định, cácdẫn xuất của chitosan đã được tổng hợp để dùng trong các ứng dụng sinh học, ví dụnhư glycol chitosan đã nhận được sự quan tâm lớn của các nhà khoa học nhờ vàokhoảng độ tan rộng Quy trình tổng hợp hạt chitosan chứa 5-FU cần phải lựa chọn kỹlưỡng để có thể đạt được độ bao bọc và khả năng nhả thuốc tốt Ví dụ, công thức củachitosan dưới dạng hạt cầu nhiều lớp đồng tâm kích thước micro (270-370 µm ) khảnăng mang thuốc 5-FU kém (≈3%) và sự nhả thuốc nhanh (≈80% chỉ sau 80 phút).Dubey và Parikh đã tổng hợp hạt chitosan chứa 5-FU dựa trên phương pháp biến tínhhóa học cho phép tạo các hạt cầu với kích thước vào khoảng 12 µm và lượng 5-FU tối

đa có thể đưa vào đạt tới ≈50%

Các hạt chitosan đã được thử nghiệm in vivo với khả năng ức chế khối u đầy

hứa hẹn Ví dụ, hạt nano chitosan - polyaspartic chứa 5-FU có kích thước ≈200 nm,khả năng mang thuốc đạt ≈40%, nhả thuốc trong 6 ngày và hiệu quả ức chế khối u đạtđược cao hơn rất nhiều so với sử dụng thuốc chống ung thư một mình

Các dẫn xuất tan trong nước của chitosan, như N-(2-carboxybenzyl) chitosan,

có nhiều tiềm năng trong việc sử dụng làm các loại hydrogel nhạy pH dùng cho hệchất mang 5-FU chuyên dụng cho ruột kết Các nghiên cứu về sự nhả thuốc 5-FU chothấy sự nhả mạnh ban đầu ≈ 25% ở cả 2 giá trị pH (7.4 và 1.0) trong vòng 15 phút đầutiên Khoảng 20 phút sau, hydrogel đóng vai trò làm màng khuếch tán và thuốc đượcnhả ra chủ yếu dựa vào cơ chế khuếch tán qua màng Như dự đoán, lượng 5-FU đượcnhả ra trong môi trường axit (pH 1.0) là tương đối thấp Chỉ khoảng 40% lượng thuốcmang được nhả ra sau 12 h, kết quả có được này là nhờ vào tốc độ trương nở tương đốichậm của hydrogel ở pH 1.0 Tại giá trị pH 7.4, tốc độ nhả 5-FU tăng đáng kể cùngvới sự trương nở của mạng lưới hydrogel, một lượng thuốc mang xấp xỉ 90% được nhả

ra sau 10 h

Hạt cầu kích thước micro của axit polylactic mang 5-FU được bao phủ bằngchitosan được tổng hợp cho việc điều trị các khối u não Có thể mô tả quá trình tổnghợp một cách ngắn gọn như sau: một hệ nhũ tương của 5-FU và axit polylactic hòa tantrong hỗn hợp dung môi acetone-dichloromethane, hỗn này được đổ vào dung dịchchitosan để quá trình hình thành các hạt cầu kích thước micro (10-25 µm) tự xảy ra.Khả năng mang thuốc tối đa có thể đạt được ≈ 65% và đặc tính nhả thuốc của hệ thể

hiện theo mô hình 2 pha: trạng thái nhả thuốc nhanh ban đầu (≈25%), theo sau là trạngthái nhả thuốc chậm ổn định trong suốt 30 ngày.

Guar gum 26

Guar gum, là chất mang có tiềm năng trong việc mang thuốc chuyên trị bệnh

đường ruột kết, là dẫn xuất của polysaccharide từ hạt của Cyamopsis tetragonolobus (thuộc họ Leguminosae) Trong phân tử bao gồm liên kết (1→6) giữa các mạch thẳng

(1→4)-β-D-mannopyranosyl với α-D-galactopyranosyl Trong các công thức tạo

thuốc, guar gum được sử dụng như một chất mang, tá dược, chống lắng, làm dày hoặcchất ổn định

Một công thức làm thuốc viên rất có triển vọng để chuyên dùng mang thuốc

5-FU đến ruột kết đã được phát triển bởi Krishiah và cộng sự Các viên thuốc nén chứa80% guar gum có khả năng mang thuốc 5-FU cho các vùng trong ruột kết, do chúngchỉ nhả khoảng ≈ 2.4% lượng thuốc trong môi trường sinh lý của dạ dày và ruột non.Hơn thế nữa, công thức thuốc này không hề có sự thay đổi về vẻ ngoài vật lý, lượngthuốc mang, hoặc cấu trúc hòa tan khi lưu trữ ở điều kiện nhiệt độ 40C (độ ẩm trongphòng 75%) trong 6 tháng

Gelatin 32

Gelatin, một polymer ưa nước, có nhiều ưu điểm như không độc, tương thíchsinh học và có đặc tính nhả thuốc ổn định Mặc dù nghiên cứu khả năng ứng dụng củahạt gelatin trong điều trị ung thư đang còn hạn chế, một số nghiên cứu gần đây chứngminh được tiềm năng của chất mang này trong việc mang thuốc chống ung thư nhờvào khả năng nhả thuốc, phân phối thuốc sinh học và các tính chất tái sinh tế bào Sauđây là phương pháp tạo các hạt cầu micro mang 5-FU trên nền gelatin Quá trình tổnghợp bao gồm đưa dung dịch thuốc (5-FU trong nước, pH 7.4) vào dung dịch gelatintrước khi phân tán trong polymethylmethacrylate (PMMA) bằng khuấy cơ Một trongnhững yếu tố gây ảnh hưởng đến tốc độ nhả thuốc đó là kích thước của hạt cầu Bằngcách điều chỉnh tốc độ trộn, nồng độ của PMMA và gelatin trong suốt quá trình tổnghợp, ta thu được hạt cầu micro với các kích thước hạt khác nhau (1-15 µm) Liều nhảthuốc 5-FU gần ổn định (near zero order) (≈8 ngày) có thể đạt được bằng cách sử dụngcác hạt cầu micro có cùng khoảng kích thước

Poly(alkylcyanoacrylates) 16, 24

Poly (alkylcyanoacrylate) (PACA) là một dạng nano polymer rất hiệu quả cho

việc mang thuốc điều trị một số loại ung thư Báo cáo đầu tiên về tổng hợp hạt nano

PACA bằng phương pháp polymer hóa anion được công bố vào năm 1979 Sau đó,một số nghiên cứu báo cáo liên quan đến ảnh hưởng của đặc tính hóa lý và các thành

tố trong công thức đến sự hình thành và độ ổn định của các hạt nano PACA Một trongnhững ưu điểm quan trọng của hạt nano PACA là khả năng kết hợp chặt chẽ với cácloại thuốc ưa nước, tạo hệ nhả thuốc bền vững Ngoài ra, hạt nano PACA cũng có một

số ưu điểm khác như độ ổn định, khả năng phân hủy sinh học và khả năng chuyểnthuốc đến mục tiêu chính xác Phương pháp tổng quát để tổng hợp hạt nano PACAbao gồm việc đưa monomer alkylcyanoacrylate vào dung dịch có tính axit chứa chất

ổn định Thuốc được gắn vào hạt nano bằng phương pháp gắn kết đưa thuốc vào trướchoặc trong quá trình polymer hóa, hoặc bằng phương pháp hấp thụ, trong phương phápnày thuốc được hấp thụ vào các hạt nano trong quá trình hình thành Arias và cộng sựnghiên cứu sâu về khả năng mang 5-FU của PACA (≈100nm) bằng cách xác định độ

hấp thụ quang Ảnh hưởng của nồng độ thuốc lên khả năng hấp thụ bề mặt của 5-FU

và hiệu suất vận chuyển thuốc trên bề mặt hút bám, hiệu suất vận chuyển thuốc tăngcũng như tính ưa dầu của polymer tăng khi chiều dài mạch alkyl của polymer sẽ giảmdần đi

Xem xét hiệu quả in vivo của hệ mang thuốc 5-FU này, Kreuter và Hartmanntìm ra rằng việc đưa thuốc 5-FU lên các hạt nano poly (butylcyanoacrylate) tăng cườnghiệu quả của thuốc chống lại ung bứu cơ (S-180) Hệ polymer này được quan sát là cóhiệu quả tăng cường độ mạnh của 5-FU lên các tế bào ung thư Cũng đã được pháthiện trên bệnh nhân bị ung thư bứu bề mặt ngoài của tế bào cơ bản, kết quả rất đángkhích lệ ≈ 97% bệnh nhân có kết quả chứng nhận đã mất hoàn toàn khối u theo thờigian, cách điều trị bằng hệ mang thuốc này không gây các thay đổi lớn nào trong cả sốlượng của T lymphocytes và trong phytohaemagglutintin bao gồm cả trong Tlymphocytes tổng hợp bởi ADN

Poly(glutaraldehyde) 31

Ứng dụng của hạt nano poly(glutaraldehyde) (PGL) làm chất mang 5-FU đượcnghiên cứu bởi Mukherji và cộng sự Các hạt nano mang 5-FU này được tổng hợp

bằng cách ngưng tụ aldol của monomer glutaraldehyde trong môi trường kiềm Thuốcchứa trong các hạt nano (1 mg 5-FU/7 mg PGL) được nhả ra từ từ và khu trú nhiều ởgan, phổi và ruột (≈65% lượng thuốc được gắn kết ban đầu)

Poly(α-malic acid)35

Poly(malic acid) là một dạng lactide polyester tan trong nước, phân hủy sinhhọc và không gây ảnh hưởng đến gen, có nhóm thế axit carboxylic dễ dàng biến tính

để sử dụng như một polymer phân huỷ sinh học dùng cho chất mang thuốc Ohya và

cộng sự đã tổng hợp poly(α-malic acid)-5-FU-saccgaride liên hợp bằng cách gắn 5-FU

và một số loại đường saccharide (galactosamine, glucosamine, N-acetyl-D

-glucosamine, manose và mannosamine) lên poly(α-malic acid) Polymer liên hợp thu

được có hiệu quả chống lại P-388 Leukemia trên chuột và không có biểu hiện độc tố

trong liều sử dụng (200-800 mg/kg) Poly(α-malic acid)-5FU-glactosamine liên hợp có

hiệu quả chống lại sự phát triển của tế bào hepatoma tốt hơn so với các loại polymerliên hợp khác nhờ khả năng tương tác của galactose với các thụ thể trên tế bào gan

Polyacrylamide5

Hạt polyacrylamide mang 5-FU (2-3.5 µm) nối vớiN,N-methylenebisacrylamide (NNMBA) hoặc ethylene glycol dimethacrylate(EGDMA) được tổng hợp trong môi trường nước - methanol bằng kỹ thuật polymerhóa phân tán Cả hiệu suất mang thuốc và cách nhả thuốc đều phụ thuộc vào bản chấtcủa tác nhân tạo nối, lượng tác nhân tạo nối được dùng và phần trăm lượng thuốc tảilên Hiệu suất bao bọc thuốc cao (≈80%) đạt được khi hạt polymer được tạo nối bằngNNMBA ưa nước Điều này có được nhờ thuốc ưa nước ít tương tác với chất tạo nối

ưa dầu Tuy nhiên, thời gian nhả thuốc kéo dài hơn (lên đến 12 h) được quan sát thấykhi EGDMA được sử dụng, đó là do các hạt thu được có khả năng trương nở giảm

Các tác giả trên cũng đã tổng hợp hạt cầu micro core-shell, copolymerpoly(acrylamide methylmathacrylate) mang 5-FU (≈ 30 µm) nối mạng bằng NNMBA,bằng phản ứng polymer hóa nhũ tương gốc tự do với monomer tương ứng Thửnghiệm tăng cường nhả thuốc in vitro (≈ 24 h) cho thấy rằng kích thước hạt và cơ chếnhả thuốc phụ thuộc vào thành phần của copolymer, phần trăm tác nhân nối mạch sửdụng và lượng thuốc 5-FU mang trên hạt cầu micro

Phân tích cơ chế nhả 5-FU được tiến hành bởi chính tác giả đã đưa ra giảthuyết, do tương tác giữa thuốc chống ung thư và hạt cầu micro core-shell, sự nhảthuốc từ mạng polymer xảy ra nhờ sự phân tán Fickian Tốc độ nhả thuốc thườngnhanh hơn trong cấu trúc có chứa lượng 5-FU cao hơn Tuy nhiên, tốc độ nhả thuốcchậm hơn được xác định trong cấu trúc có khả năng bao bọc 5-FU thấp hơn Điều thứ

2 xảy ra có thể là do các vùng không gian trống có sẵn trong cấu trúc polymer mà cácphân tử 5-FU nhỏ hơn có thể phân tán qua

Dendrimer49

Vào năm 1984, Donald A Tomalia, giám đốc Trung tâm Công Nghệ Sinh HọcNano trường Đại học Michigan và các cộng sự, đã tổng hợp thành công một loạipolymer mới - dendrimer Dendrimer là một polymer có cấu trúc cầu đa nhánh vớikích thước và khối lượng phân tử xác định, khác hẳn các polymer mạch thẳng và mạchnhánh thông thường, rất phù hợp ứng dụng làm chất mang trong lĩnh vực y sinh học.Với mục đích này Zhuo và các cộng sự đã tổng hợp dendrimer với core1,4,7,10-tetraazacyclododecane mang thuốc 5-FU Kết quả nghiên cứu cho thấy độctính của thuốc giảm xuống và sự nhả thuốc chậm

1.3 DENDRIMER - NANOCARRIER CHO ĐIỀU TRỊ BỆNH UNG THƯ

1.3.1 Giới thiệu về dendrimer

Dendrimer bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp “dendron”, có nghĩa là nhánh cây bởi vìcác phân tử được tổng hợp bằng cách thêm liên tiếp các đơn vị nhánh tỏa ra ngoài từcore (nhân) Dendrimer được Donald A Tomalia và cộng sự tổng hợp lần đầu tiên vàonhững năm 1980

Cùng thời gian đó, nhóm nghiên cứu của NewKome cũng tình cờ báo cáo vềviệc tổng hợp ra những phân tử có cấu trúc tương tự, được gọi là “arborols”, theo tiếng

La Tinh cũng có nghĩa là nhánh cây Ngoài ra chúng còn được biết đến với tên khác là

“cascade molecule” có nghĩa là polymer nhiều tầng và ngày nay người ta sử dụng têngọi thông dụng là dendrimer

Cấu trúc phân tử 45

Phân tử dendrimer được cấu tạo bởi ba phần:

Phân tử ở tâm gọi là core (nhân): Phân tử core có thể ưa nước hay kỵ nước Các nhánh bên trong (interior branch) được lặp đi lặp lại có nhiệm vụ liên kếtcác nhóm bên ngoài với tâm, giữa các nhánh có nhiều khoảng không gian trống bêntrong

Các nhóm bên ngoài (surface groups) thường là các nhóm anion, cation, nhómtrung tính, các nhóm ưa nước hay kỵ nước

Khả năng hòa tan của dendrimer

Tính tan của dendrimer do các thành phần cấu trúc quyết định Dendrimer vớicore và các nhóm bên ngoài là các nhóm ưa nước thì có khả năng tan được trong nước,trong khi các dendrimer với core và các nhóm bên ngoài là các nhóm kỵ nước, ưa dầu

thì chúng không có khả năng tan trong nước mà tan được trong các dung môi có tínhdầu Độ dài của core liên quan đến hình dạng và tính ái dầu của dendrimer Nếu sốnhóm CH2 trong phân tử core càng nhiều sẽ làm tăng tính ái dầu Dựa trên cơ sở đó,bằng cách lựa chọn thành phần cấu trúc thích hợp ta có thể tổng hợp được dendrimervới khả năng hòa tan như mong muốn.

Tính đa hóa trị

Tính đa hóa trị của dendrimer xuất phát từ một số lượng lớn các nhóm chức trên

bề mặt Số nhóm chức càng nhiều, hóa trị càng tăng Mặt khác, các nhóm chức củadendrimer có độ phản ứng cao, nên có khả năng biến tính bề mặt dễ dàng để tạo ra cácdẫn xuất có tính chất khác nhau

Đối với các dẫn xuất glycodendrimer - dendrimer với bề mặt là các nhómđường - thì tính đa hóa trị rất quan trọng Sự đa tương tác giữa các phân tử đường vớicác protein thụ cảm sinh học trên bề mặt tế bào làm tăng hiệu quả nhận diện sinh học,định hướng đến các loại tế bào khác nhau trong cơ thể

Tính mang vác

Trong cấu trúc phân tử dendrimer có nhiều khoảng trống nên chúng được sửdụng như một chất mang Các chất chúng có thể mang là thuốc trị bệnh, các đoạnDNA, các enzyme, các hormone, các xúc tác kim loại

Đối với các dendrimer thế hệ thấp (G =0-3), phân tử dendrimer chưa có cấu trúchình cầu rõ rệt nên chưa thể hiện tốt vai trò mang vác Từ thế hệ thứ tư trở đi (G ≥4)thì dạng hình cầu càng rõ rệt, độ chặt càng tăng, các khoảng trống bên trong dendrimerbắt đầu thể hiện tốt hơn vai trò mang vác Tuy nhiên, đến các thế hệ cao hơn (G9 vàG10) thì các nhóm bề mặt hầu như xếp khít nhau, dẫn đến sự xâm nhập của các phân

tử khác vào không gian bên trong bị hạn chế rất nhiều

Hình 3 Sự thay đổi hình dạng và độ chặt theo thế hệ của dendrimer

PAMAM core ammonia 41

1.3.2 Giới thiệu về dendrimer PAMAM42, 43

Dendrimer polyamidoamine (PAMAM) là một trong những dendrimer đầu tiênđược nhóm nghiên cứu của Donald A Tomalia tổng hợp vào những năm 1980

Core có thể là ammonia (NH3) hay ethylenediamine (EDA) Nếu core NH3 được sửdụng thì số nhánh phát triển từ tâm là 3, còn khi sử dụng core EDA thì số nhánh pháttriển từ tâm là 4

Đơn vị nhánh bên trong là N-(2-aminoethyl)acrylamide được tổng hợp thông qua hai

bước:

Bước 1: Phản ứng alkyl hóa hay phản ứng cộng hợp Michael của nhóm NH2 của EDAhoặc NH3 vào nối đôi C=C tiếp cách với nhóm C=O của methylacrylate theo cơ chế áinhân, tạo ra thế hệ G(-0.5)

Hình 4 Phản ứng tạo các thế hệ lẻ của PAMAM

Bước 2: Phản ứng amide hóa xảy ra giữa nhóm COOCH3 của G(-0.5) với nhóm NH2của phân tử EDA mới, hoàn thành một thế hệ dendrimer, tạo ra G0.

Hình 5 Phản ứng tạo các thế hệ chẵn của PAMAM

Quá trình được lặp đi lặp lại xây dựng nên dendrimer gồm các lớp vỏ bao xung quanhcore Cứ sau mỗi bước 1, ta thu được PAMAM thế hệ lẻ (G(-0.5), G0.5, G1.5, G2.5 )với các nhóm bề mặt –COOCH3, và cứ sau mỗi bước 2, ta thu được PAMAM thế hệchẵn (G0, G1, G2, G3 ) với các nhóm bề mặt –NH2

Hình 6 Cấu trúc của PAMAM: A.Core ethylenediamine; B Core ammonia

1.3.3 Tương tác dendrimer PAMAM - thuốc6, 13, 11, 17, 23, 33, 47

Chính nhờ kiểu cấu trúc phân nhánh mang nhiều nhóm chức này mà dendrimerPAMAM có thể tạo nhiều kiểu tương tác với các phân tử thuốc, cơ bản có thể chiathành 2 nhóm:

Thuốc tương tác với các thành phần core và nhánh bên trong của

dendrimer 13, 17, 23, 33

Hình thức tương tác này gọi là nang hóa Các tương tác có thể xảy ra:

Các nhánh dendrimer bao bọc các phân tử thuốc một cách trực tiếp

Các nhánh bên trong của dendrimer tương tác kỵ nước với các phân tử thuốc có tính áidầu

Các nhóm chức trên nhánh, như amine và amide có thể tạo liên kết hydrogen, tạo phứcvới các phân tử thuốc

Một số thuốc chống ung thư đã được nghiên cứu nang hóa bên trong cấu trúcdendrimer PAMAM và một số loại dendrimer khác gồm có thuốc chống ung thưcampothecin, 6-mercaptopurine, methotrexate, adriamycin, 5-fluorouracil, thuốc đặctrị lao rifampicin …

Thuốc tương tác với các nhóm bề mặt của dendrimer 6, 11, 47

Các tương tác có thể là: tương tác tĩnh điện và tương tác hóa trị

So với các polymer mạch thẳng, bề mặt dendrimer mang một số lượng lớn các nhómamine hay carboxyl có khả năng tương tác tĩnh điện Ví dụ một polymer sao thôngthường chỉ có khoảng 1,58  10-6 nhóm amine/ 33 , trong khi đó PAMAM G3.0 lại

có đến 1,24  10-4 nhóm amine/3 , gấp khoảng 100 lần Thông qua các tương tác3tĩnh điện này, PAMAM có thể cải thiện khả năng hòa tan của các thuốc ái dầu mangnhóm carboxyl có thể tương tác với nhóm amine của PAMAM như nhóm thuốc khángviêm không steroid (NSAIDs) ketoprofen, Ibuprofen, diflunisal, naproxen Trong dungdịch PAMAM G4.0 10 mg/mL, độ tan ở 37C của Ketoprofen tăng từ 0,88 lên 16,92mg/mL; naprofen tăng từ 0,02 lên 31,41 mg/mL, Ibuprofen tăng từ 0,10 từ 7,45mg/mL và diflunisal tăng từ 0,19 đến 4,94 mg/mL

Không những vậy, PAMAM với nhiều nhóm amine trên bề mặt có độ phản ứng cao cóthể hình thành liên kết cộng hóa trị với các phân tử thuốc có các nhóm chức thích hợp

ví dụ như thuốc trị thuyên tắc phổi enoxaparin liên kết cộng hóa trị với dendrimerG2.0 và G3.0.

Hình 7 Một số hình thức vận chuyển thuốc của PAMAM 8

(a) Nang hóa thuốc bên trong các không gian trống của PAMAM

(b) Nhiều phân tử PAMAM kết hợp tạo thành mạng lưới bao bọc thuốc

(c) Thuốc kết hợp với các nhóm bề mặt của PAMAM bằng liên kết cộng hóa trị(d) Hoặc bằng các tương tác không hóa trị

1.3.4 Tính tương hợp sinh học của dendrimer PAMAM12, 20, 22, 27, 37

Những phân tử dendrimer được dùng làm chất mang thuốc phải thỏa mãn các yêu cầu về tính tương hợp sinh học, gồm:

Không có độc tố

Không sinh miễn dịch

Có khả năng thấm qua màng sinh học, chẳng hạn như màng ruột, mô máu, màng

tế bào

Có thể ở lại lưu thông trong cơ thể để đáp ứng nhu cầu điều trị

Năm 2000, Malik và cộng sự đã phát hiện ra các dendrimer PAMAM cationic có nhóm bên ngoài là NH2 là nguyên nhân gây huyết giải và đầu độc tế bào Do bề mặt tếbào mang điện tích âm nên khi gặp những dendrimer mang điện tích dương này sẽ có

sự tương tác với nhau làm phá vỡ màng tế bào, dẫn đến sự tiêu hủy tế bào

Đối với dendrimer, những đặc tính sinh học như độc tố hay tính sinh miễn dịch chịu sựảnh hưởng lớn của kích thước và các nhóm chức bên ngoài Độc tính giảm dần đối với các nhóm chức bên ngoài theo thứ tự như sau:

NH3 > Guanidin+ >SO3-2 >PO3-2 >COO->PEG

Hình 8 Độ độc của dendrimer theo nhóm chức bề mặt 8

Do đó muốn giảm độc tính của dendrimer PAMAM, ta chỉ cần làm hạn chế điện tích dương trên bề mặt dendrimer PAMAM bằng cách gắn kết với phân tử khác không tích điện và có tính tương hợp sinh học cao

Trong kỹ thuật sinh học, polyethylene glycol (PEG) là một tác nhân thường được sử dụng để bảo vệ và giảm tính sinh miễn dịch của protein Khi gắn kết PEG vào protein làm tăng khả năng hòa tan trong nước, giảm độ thanh thải, giảm tính sinh miễn dịch vàgiảm độc tính Khi gắn kết PEG vào protein còn làm tăng kích thước phân tử nên còn làm giảm quá trình lọc ở thận

Hình 9 Những thuận lợi của sự PEG hóa protein 44

Chuỗi PEG khi lai hóa với PAMAM trước hết sẽ che chắn bề mặt cationic củaPAMAM, tránh khỏi sự tương tác với bề mặt anionic của màng tế bào, giảm khả năngđầu độc tế bào Thuận lợi thứ hai là khi PEG kết hợp với PAMAM sẽ giảm được độctính của PAMAM rất nhiều và không sinh kháng thể Thông thường khi có “vật lạ”xâm nhập vào cơ thể, cơ thể sẽ có các cơ chế để chống lại “vật lạ” này “Vật lạ” bị coi

là “ngoại lai” và sẽ bị đào thải theo cơ chế miễn dịch, chủ yếu thông qua tác dụng thựcbào hoặc bị phá vỡ trong huyết tương Nhưng khi PAMAM kết hợp với PEG, do sựkết hợp giữa nhóm ethylene oxide trên chuỗi PEG với các phân tử nước gây khó khăncho hệ thống miễn dịch trong sự nhận biết PAMAM - MPEG là vật lạ, bảo vệdendrimer chống lại cơ chế phá hủy của cơ thể

Năm 2003, D Bhadra và các đồng nghiệp đã tiến hành lai hóa MPEG 5000 vớiPAMAM core EDA thế hệ G4.0 Kết quả xác định độ độc trên chuột của nhóm nghiêncứu cho thấy PAMAM không lai hóa có hiện tượng gây độc máu và tế bào, số lượnghồng cầu giảm xuống 106 - 2  106/l và số lượng bạch cầu tăng lên đến 3  103 - 4 

103/l; còn PAMAM lai hóa MPEG có độc tính giảm đi, số lượng bạch cầu tăng chỉ từ

103-1,5  103/l Các nghiên cứu in vivo trên các loại dendrimer khác cũng cho thấy

PEG hóa làm giảm độc tính rất nhiều Trên các con chuột nghiên cứu, liều độc củamelamine dendrimer đối với gan chỉ là ≥10 mg/kg, trong khi đó liều độc củadendrimer lai hóa 50% PEG trên bề mặt lên đến 1 g/kg

1.3.5 Sự tăng cường hiệu quả mang và nhả thuốc của sự lại hóa PEG7,

14, 21, 25, 36, 38, 40

Như đã đề cập ở trên, mục đích đầu tiên của việc PEG hóa là giảm tính sinhmiễn dịch của chất mang PAMAM Ngoài ra, với tính chất đặc biệt của PEG là vừa cókhả năng tan tốt trong nước vừa có thể tan được trong dầu nên khi PEG kết hợp vớiPAMAM sẽ tăng khả năng hydrate hóa trên bề mặt, tạo thuận lợi cho việc dẫn cácthuốc kỵ nước trong cơ thể Một lợi ích khác nữa là khi lai hóa những chuỗi PEG cótrọng lượng phân tử lớn (550, 2000, 5000,…), các nhóm bên ngoài PAMAM trở nênđông đúc và chằng chịt hơn, những chuỗi PEG co lại nhốt các phân tử thuốc, làm tăngkhả mang thuốc lẫn kiểm soát quá trình giải phóng thuốc

Năm 2000, Chie Kojima, Kenji Kono, Kazuo Maruyama, and Toru Takagishi

đã tổng hợp PAMAM ở thế hệ 3.0 và 4.0 gắn kết với MPEG trọng lượng phân tử 550

và 2000 Sau đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng sản phẩm PAMAM-MPEG nang hóa vàkhảo sát sự nhả thuốc của hai loại thuốc trị ung thư có tính ái dầu là adriamycin(ADR), methotrexate (MTX) Kết quả là sản phẩm PAMAM 4.0 kết hợp với MPEG

2000 sẽ mang được 6,5% ADR và 26% MTX Thuốc MTX được nang hóa trongPAMAM-MPEG được phóng thích ra một cách từ từ trong dung dịch nước

Hình 10 Sự kết hợp của PEG - PAMAM với adriamycin, methotrexate

Không những vậy, một số nghiên cứu khác cũng chỉ ra rằng việc lai hóa PEGcòn kéo dài thời gian lưu của dendrimer trong tuần hoàn máu Dendrimer không laihóa nhanh chóng bị thải trừ khỏi máu và tập trung ở các cơ quan như gan hay thận chỉsau vài phút hay vài giờ Theo nghiên cứu của Kukowska - Latallo, PAMAM G5.0đánh dấu tritium được cơ thể nhanh chóng đào thải qua đường thận chỉ trong 24 giờsau khi tiêm Trong một nghiên cứu khác, PAMAM được đánh dấu với đồng vị 125I vàtiêm thử nghiệm vào chuột Wistar, sau 1 giờ chỉ còn khoảng 1% lượng PAMAM lưulại trong máu và hơn 60% lượng PAMAM đã tập trung tại gan.

Nhưng khi lai hóa với PEG, thời gian lưu trong tuần hoàn chung được tăng lênđến 24 giờ, dendrimer chủ yếu được phân bố trong máu hơn là ở các cơ quan khác,nhờ đó kéo dài thời gian bán thải và giảm độ thanh thải của thuốc

Cũng trong nghiên cứu của nhóm Bhadra năm 2003, thuốc chống ung thư5-fluorouracil được lần lượt nang hóa trong chất mang PAMAM G4 không lai hóa và

lai hóa 25% bề mặt với PEG 5000 Kết quả khảo sát in vitro cho thấy so với PAMAM

không lai hóa, PAMAM lai hóa có khả năng mang lượng thuốc gấp đến 12 lần và tốc

độ nhả thuốc giảm đi 6 lần, thời gian phóng thích thuốc hoàn toàn kéo dài đến 6 ngày

Nhóm nghiên cứu tiếp tục tiến hành so sánh in vivo trên chuột và kết quả cũng tương

tự Khi không PEG hóa, nồng độ cực đại của thuốc trong huyết tương cao, thời gianđạt nồng độ cực đại nhanh (Cmax =21-23 g/mL, tmax =3 giờ) và kết quả là thời gian lưucủa thuốc trong tuần hoàn thấp (6-7 giờ) Còn khi PEG hóa, nồng độ Cmax giảm đi chỉcòn khoảng 1/3, thời gian đạt được chậm hơn tmax =7 giờ, mang lại hiệu quả kéo dàithời gian thuốc tồn tại trong huyết tương, lên đến 12 giờ

Hình 11 Mô hình PAMAM-MPEG mang thuốc 5-fluorouracil

Năm 2008, Shuhua Bai and Fakhrul Ashan tiếp tục tổng hợp PAMAM - MPEGvới MPEG trọng lượng phân tử 2000 và PAMAM ở thế hệ G3.0 Sau khi tổng hợpthành công PAMAM - MPEG, nhóm nghiên cứu đã tiến hành nang hóa PAMAM -MPEG với thuốc chống đông máu Heparin (LMWH) Nhờ nang hóa trong cấu trúcPAMAM-MPEG mà độ hấp thu qua đường hô hấp và sinh khả dụng của LMWH tăng60,6% so với LMWH tiêm dưới da bình thường Thời gian bán thải của thuốc đượcnang hóa là 11,9 giờ, tăng gấp 2,4 lần so với LMWH trong saline thông thường Đángchú ý là hiệu quả phóng thích thuốc từ từ của MPEG - PAMAM cho phép giãn khoảngcách giữa hai lần tiêm lên gấp đôi, 48 giờ, mà vẫn bảo đảm hiệu quả như LMWH

thông thường tiêm cách quãng 24 giờ trong việc giảm kích thước huyết khối in vivo

trên chuột

Hiệu quả mang và nhả thuốc của sự lai hóa PEG cũng được khẳng định trongkết quả của một số nghiên cứu khác của Arunvel Kailasan, Quan Yuan, Hu Yang vàChie Kojima…

Tuy nhiên, theo một nghiên cứu của nhóm G.Pan trên PAMAM G3.0 năm

2005, hiệu quả của sự lai hóa PEG lại rất ít hoặc hầu như không chịu ảnh hưởng củamức độ lai hóa Từ kết quả này, nhóm nghiên cứu đã đưa ra giả thuyết là các phân tửthuốc sẽ được nang hóa chủ yếu trong cấu trúc của dendrimer hơn là bị nhốt trong cácchuỗi PEG Năm 2004, một nghiên cứu khác cũng được H Yang và các đồng nghiệptiến hành nhằm khảo sát ảnh hưởng của yếu tố khối lượng của chuỗi PEG lai hóa trên

bề mặt PAMAM G3.0 cũng được chọn và lai hóa với các PEG 750, 2000 và 5000, đạtđược mức độ lai hóa lần lượt là 28, 25 và 23/32 nhóm amine bề mặt Các PAMAM -PEG hóa này được sử dụng để hòa tan pyrene Kết quả cho thấy PAMAM lai hóa PEG

2000 có khả năng hòa tan pyrene tốt nhất, hơn cả PAMAM lai hóa PEG 5000 Để giảithích điều này, nhóm nghiên cứu cho rằng các chuỗi PEG quá dài có thể bị vướng vàonhau, dẫn đến hiệu quả hòa tan của sự lai hóa giảm

1.3.6 Sự định hướng của chất mang PAMAM - MPEG đến tế bào ung thư30, 39, 46, 51

Định hướng thụ động (Passive targeting) 30, 46

Sự định hướng thụ động xuất phát từ hiện tượng tăng tính thấm và tăng hiệuquả lưu giữ (Enhanced Permeability and Retention Effect - EPR) đặc trưng ở các môung thư Tại hầu hết các mô khoẻ mạnh, kích thước các khe hở lớp nội mô thành mạchmáu thường nhỏ hơn 2 nm Các khe hở này quá nhỏ so với kích thước của hầu hết cácchất mang nano Còn tại mô ung thư, do sự phát triển của tế bào ung thư đòi hỏi sựtăng sinh mạch máu, các vi mạch máu mới được hình thành tại các mô ung thư và cókích thước lên đến từ 100 đến 800 nm Do đó các phức hợp chất mang - thuốc tồn tạitrong tuần hoàn máu có thể vượt qua dễ dàng và đi vào mô ung thư Hơn nữa, sau khixâm nhập vào, các phức hợp này sẽ tập trung ở dịch gian bào bao quanh các tế bào ungthư Sự phân bố này có được là kết quả của 2 yếu tố: không gian và áp suất thẩm thấulớn hơn tại các khe kẽ giữa các tế bào ung thư so với mô bình thường Đặc điểm hìnhthái của các tế bào ung thư tạo ra khoảng không gian giữa các tế bào rộng hơn so vớicác mô bình thường Các phức hợp chất mang - thuốc sau khi đã đi vào các khe hở tếbào này sẽ bị kẹt giữ lại khi các tế bào ung thư phát triển Thêm vào đó, do không có