TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT TỪ HESPERETIN VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CHÚNG

TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT TỪ HESPERETIN VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNGGÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CHÚNG Hoàng Thị Kim Dung 1 , Nguyễn Cửu Khoa 1 , Nguyễn Ngọc Hạnh 1 Nguyễn Thụy Vy 2 , Hồ Huỳnh Thùy Dương 2

TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT TỪ HESPERETIN VÀ XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG

GÂY ĐỘC TẾ BÀO CỦA CHÚNG Hoàng Thị Kim Dung 1 , Nguyễn Cửu Khoa 1 , Nguyễn Ngọc Hạnh 1

Nguyễn Thụy Vy 2 , Hồ Huỳnh Thùy Dương 2

1 Viện Công nghệ Hóa học, Viện KH & CN Việt Nam

2 Phòng Sinh học phân tử, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Summary Synthesized and determined antiproliferative activity of some hesperetin derivatives.

We synthesized 4 hesperetin derivatives and determined their structure by using physical chemistry analyses (IR, LC-MS, 1H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC) The result when we tested antiproliferative activity of these products showed that the synthetic compounds (at 100µg/ml) exhibited antiproliferative activity similar to hesperetin (63-86% compare with 63-78%) on HeLa, MCF-7, NCI-H460 tumor cells, however, the IC50 values were higher

1 Đặt vấn đề:

Các nghiên cứu của một số nhà khoa học trên thế giới về tác động của flavonoids họ cam chanh lên các dòng tế bào ung thư ở người thấy rằng các hợp chất tổng hợp có khả năng

ức chế sự tăng sinh mạnh tương tự như các hợp chất trong tự nhiên (nhiều hợp chất có IC < 10µM) [1] Với trữ lượng vỏ quả họ cam chanh ở nước ta khá lớn, đủ điều kiện tạo nguồn dược liệu phong phú mà chưa được khai thác tốt cũng như chưa được nghiên cứu sâu hơn, đặc biệt trong phòng chống và chữa trị bệnh ung thư, chúng tôi tiến hành tổng hợp các dẫn xuất của hesperetin, nhận danh cấu trúc và xác định khả năng gây độc tế bào trên 3 dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7, ung thư phổi NCI-H460 theo phương pháp SRB

2 Nguyên liệu và phương pháp:

2.1 Nguyên liệu:

- Hesperetin được thủy phân từ hesperidin và được làm sạch tại Phòng Hữu cơ – Viện Công nghệ Hóa học [2]

- (CH3)2SO4, propyl bromide, KBr, KCl, oxone - Merck

- Acetone, K2CO3, CHCl3 và các hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2 Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất chalcone từ Hesperetin:

(CH 3 ) 2 SO 4

K 2 CO 3

acetone, t o s

CH3CH2CH2Br

K 2 CO 3

acetone, t o s

O

OCH2CH2CH3 OCH3 O

OH

H3CH2CH2CO

H2C

CH2CH3

OCH3

OCH3 OCH 3 O

OH

H3CO

O

OH OCH3 O

OH

(68%)

Hesperetin (1mmol) được ether hoá bằng dimethyl sulfat hoặc 1-bromopropane (4.5 mmol)với xúc tác K2CO3 (3g) trong acetone (50ml), hỗn hợp được đun hồi lưu và theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sản phẩm tạo thành được làm sạch bằng sắc ký cột và phân tích cấu trúc dựa trên các phổ IR, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR

2.3 Phương pháp tổng hợp các dẫn xuất halogen của Hesperetin: [3]

Oxone (KHSO5.KHSO4.K2SO4) (2.2mmol) được cho vào một hỗn hợp gồm hesperetin (1mmol), KCl (hay KBr) (2.2mmol) trong acetone (15ml) Phản ứng được khuấy liên tục và duy trì ở nhiệt độ 20oC, theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau phản ứng, hỗn hợp được qua lọc và bay hơi dung môi dưới áp suất kém Sản phẩm tạo thành được làm sạch bằng sắc ký cột và phân tích cấu trúc dựa trên các phổ IR, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR

2.3 Phương pháp thử hoạt tính gây độc tế bào: Phương pháp Sulforhodamine B (SRB) [4]

(thực hiện tại Phòng Sinh học Phân tử – Bộ môn Di truyền – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp.HCM)

3 Kết quả và thảo luận:

3.1 Nhận dạng cấu trúc:

3.1.1 Nhận dạng 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’-hydroxychalcone:

- Sản phẩm thu được có dạng tinh thể hình kim, màu đỏ, độ sạch > 99%

- Phổ IR (cm-1): 3057, 2989, 2922, 2948, 1618, 1549, 1544, 1261, 1217, 1151, 814, 610

- Khối phổ MS cho pick [M+H+] = 345 tương ứng với trọng lượng phân tử là 344

- Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm), 13C-NMR (DMSO, δ ppm) kết hợp với DEPT, HSQC, HMBC:

Vị trí C/H 1H-NMR δ ppm (số H; dạng

mũi; J=Hz)

13C-NMR δ ppm HMBC 1H→13C

OCH3 x 2 3,818 (3H, s)

3,830 (3H, s)

H → C3’

6’ 7,298 (1H, dd, J=2 và 8,5) 122,763 H6’ → C2’,2,4’

3.1.2 Nhận dạng 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy-6’-hydroxychalcone :

- Sản phẩm thu được có dạng tinh thể hình kim, màu cam, độ sạch > 97%

- Phổ IR (cm-1): 2961, 2939, 2937, 2873, 1623, 1507, 1431, 1260, 1216, 1188, 1138, 1016,

841, 806, 764, 610

- Khối phổ MS cho pick [M+H+] = 429 tương ứng với trọng lượng phân tử là 428

- Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm), 13C-NMR (DMSO, δ ppm) kết hợp với DEPT, HSQC, HMBC:

Vị trí C/H 1H-NMR δ ppm (số H; dạng

mũi; J=Hz)

13C-NMR δ ppm HMBC 1H→13C

CH3 x 3 0,972-1,004 (9H) 10,235-10,496 H → CCH2, OCH2

CH2 x 3 1,703-1,878 (6H) 21,807-22,070 H → CCH3, OCH2

OCH2 x 3 3,939-4,042 (6H) 69,397-70,292 H → CCH3, CH2, 3(7)

6’ 7,221 (1H, dd, J=2 và 8) 123,405 H6’ → C2,4’,5’

3.1.3 Nhận dạng 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone:

- Sản phẩm thu được có dạng bột, màu vàng nhạt, độ sạch > 96%

- Phổ IR (cm-1): 3529, 3360, 2944, 2902, 2846, 1630, 1516, 1443, 1346, 1264, 1181, 1128,

1096, 883, 796, 552

- Khối phổ MS cho pick [M+H+] = 370 tương ứng với trọng lượng phân tử là 369

- Phổ 1H-NMR δ (ppm): 3.782 (3H, s, -CH3), 2.865 (H3, dd, J=3Hz và J=17Hz), 3.310 (H3, dd, J=12Hz và J=17Hz), 5.603 (H2, dd, J=3Hz và J=12Hz), 6.882 (H6’, dd, J=2Hz và J=8Hz), 6.946 (H2’, d, J=2Hz), 6.966 (H5’, d, J=8Hz)

- Phổ 13C-NMR δ (ppm): 41.375 (C3), 55.654 (-CH3), 79.019 (C2), 100.202 (C8), 100.857 (C6), 102.110 (C10), 112.082 (C2’), 114.005 (C5’), 117.598 (C6’), 130.355 (C1’), 146.504 (C3’), 148.032 (C4’), 155.886 (C9), 156.576 (C5), 156.965 (C7), 196.530 (C4)

3.1.4 Nhận dạng 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone:

- Sản phẩm thu được có dạng bột, màu vàng nhạt, độ sạch khoảng 93%

- Phổ IR (cm-1): 3542, 3387, 2973, 2937, 2841, 1635, 1560, 1516, 1442, 1401, 1347, 1298,

1258, 1179, 1130, 1103, 1074, 1020, 965, 869, 829, 789, 725, 688, 628, 591, 551

- Khối phổ MS cho pick [M+H+] = 461 tương ứng với trọng lượng phân tử là 460

- Phổ 1H-NMR (DMSO, δ ppm), 13C-NMR (DMSO, δ ppm) kết hợp với DEPT, HSQC, HMBC:

Vị trí C/H 1H-NMR δ ppm (số H; dạng 13C-NMR δ ppm HMBC 1H→13C

mũi; J=Hz)

2 5,611 (1H, dd, J=3 và J=12) 78,953 H2 → C5’,6’,1’,4

3 2,888 (1H, dd, J=3 và J=17)

3,304 (1H, dd, J=12 và J=17)

41,190 H3 → C10,1’,4

H3 → C2,1’,4

5’ 6,964 (1H, d, J=8,5) 113,983 H5’ → C1’,4’,2,6’

6’ 6,883 (1H, dd, J=2 và 8,5) 117,546 H6’ → C2,5’,4’

3.2 Kết quả xác định hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp SRB:

3.2.1- Sàng lọc thô ở nồng độ 100µg/ml:

 Dòng tế bào: Ung thư cổ tử cung HeLa

1 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’-hydroxychalcone 73.75 74.34 57.60 68.56 ± 9.50

2 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy-6’-hydroxychalcone -9.87 -1.88 0.66 -3.7 ± 5.50

3

6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 53.16 38.34 42.74 44.75 ± 7.61

4

6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 87.20 84.89 87.05 86.38 ± 1.29

6 Chứng dương (CPT 0.01 µg/ml) 63.55 59.83 33.71 52.36 ± 16.26

 Dòng tế bào: Ung thư vú MCF-7

1 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’-hydroxychalcone 77.01 61.17 64.07 67.42 ± 8.43

2 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy-6’-hydroxychalcone 32.77 21.88 38.78 31.14 ± 8.56

3 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 63.70 65.19 62.61 63.83 ± 1.30

4 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 68.65 69.34 70.92 69.63 ± 1.17

6 Chứng dương (camptothecin0.01 µg/ml) 48.67 53.89 48.37 50.31 ± 3.11

 Dòng tế bào: Ung thư phổi NCI-H460

STT Mẫu Lần 1 Tỉ lệ (%) gây độc tế bàoLần 2 Lần 3 TB ± ĐLC

1 2’,3,4,4’-tetramethoxy-6’-hydroxychalcone 77.01 61.17 64.07 67.42 ± 8.43

2

3

6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 79.21 70.30 72.47 74.00 ± 4.65

4

6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 73.82 76.17 76.31 75.43 ± 1.40

6 Chứng dương (camptothecin

3.2.2- Xác định giá trị IC50 trên dòng tế bào MCF-7:

1 6,8-chloro-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 73.23 72.95 73.00 73.06 ± 0.15

2 6,8-dibromo-3’,5,7-trihydroxy-4’-methoxyflavanone 70.52 69.32 72.05 70.63 ± 1.37

TB, ĐLC: trung bình, độ lệch chuẩn

Kết luận: chúng tôi đã tồng hợp thành công các dẫn xuất của Hesperetin và kết quả thử nghiệm sàng lọc thô ở nồng độ 100(µg/ml) trên 3 dòng tế bào ung thư cổ tử cung HeLa, ung thư vú MCF-7 và ung thư phổi NCI-H460 cho thấy ngoại trừ 2’,3,4’-tripropoxy-4-methoxy-6’-hydroxychalcone có khả năng gây độc tế bào yếu thì các chất còn lại đều có khả năng gây độc

tế bào (63-86%) tương tự như Hesperetin (63-78%), khả năng gây độc chêch lệch ít giữa các dòng tế bào Tuy nhiên giá trị IC50 trên dòng MCF-7 của hai dẫn xuất halogen lại cao hơn hesperetin cho thấy khả năng gây độc của các hợp chất này vẫn còn thấp, cần có nhiều nghiên cứu tổng hợp thêm các hợp chất khác

Tài liệu tham khảo

1 Yanling Li, Hao Fang, Wenfang Xu, Recent advance in the research of flavonoids as

anticancer agents, Mini-Reviews in Medicinal Chemistry, 2007, 7, 663-678.

2 Hoàng Thị Kim Dung, Nguyễn Cửu Khoa, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Thị Thu

Hương, Hồ Việt Anh, So sánh hoạt tính chống oxy hóa của một số flavonoid (dạng

glucosid và dạng genin) chiết từ hoa hòe và vỏ quýt, Tạp chí Dược liệu, Tập 11, số 5,

trang 185-188 (2006)

3 Regioselective bromination of aromatics using KBr/oxone, Synth Comm., 2002, 32

(15), 2313-18

4 Hồ Huỳnh Thùy Dương, Báo cáo tổng kết đề tài Xây dựng và hoàn chỉnh các quy trình

dùng trong sàng lọc tính kháng phân bào của cây thuốc ở mức độ tế bào và phân tử,

Chương trình Nghiên cứu cơ bản, Sở Khoa học và Công nghệ Tp.HCM 2007