tổng hợp dẫn xuất của rutin, một hợp chất có hàm lượng cao trong cây hoa hòe ở Việt Nam

Xã hội hiện đại ngày nay cùng với yêu cầu về tuổi thọ phải ngày càng cao đã đặt ra cho các nhà khoa học nhiều bài toán mới nhằm tìm kiếm các chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các chất có nguồn gốc từ thiên nhiên do khả năng gây độc của chúng thấp, độ an toàn trong sử dụng cao để ứng dụng trong điều trị bệnh nhất là các loại bệnh nan y, và hiện nay họ flavonoid nhận được sự quan tâm của nhiều nhà khoa học trên thế giới do chúng luôn có mặt trong các loại thực phẩm hàng ngày của con người, các nghiên cứu cho thấy các chất thuộc họ này không gây độc cho cơ thể dù dùng ở liều cao và khi sử dụng kết hợp với các loại thuốc khác như thuốc trị ung thư thì giúp làm giảm tác dụng phụ của các loại thuốc này. Rất nhiều các hợp chất được chiết tách đã được nghiên cứu và thử nghiệm, hàng loạt các hợp chất tổng hợp và bán tổng hợp vẫn đang liên tục được tạo ra trên rất nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc, các chất hóa học có tác dụng mạnh hơn và ít độc hại hơn đối với cơ thể người bệnh. Trên cơ sở đó, chúng tôi đề ra hướng nghiên cứu cho đề tài là tiến hành tổng hợp dẫn xuất của rutin, một hợp chất có hàm lượng cao trong cây hoa hòe ở Việt Nam, từ đó thử nghiệm hoạt tính sinh học của chúng nhằm có được những nghiên cứu bước đầu cho việc tổng hợp các dẫn xuất khác sau này đồng thời hy vọng có thể tìm thêm được những hợp chất mới có khả năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnh vực, đặc biệt là trong y dược.

ĐẶT VẤN ĐỀ

Xã hội hiện đại ngày nay cùng với yêu cầu về tuổi thọ phải ngàycàng cao đã đặt ra cho các nhà khoa học nhiều bài toán mới nhằm tìmkiếm các chất có hoạt tính sinh học đặc biệt là các chất có nguồn gốc

từ thiên nhiên do khả năng gây độc của chúng thấp, độ an toàn trong

sử dụng cao để ứng dụng trong điều trị bệnh nhất là các loại bệnh nan

y, và hiện nay họ flavonoid nhận được sự quan tâm của nhiều nhàkhoa học trên thế giới do chúng luôn có mặt trong các loại thực phẩmhàng ngày của con người, các nghiên cứu cho thấy các chất thuộc họnày không gây độc cho cơ thể dù dùng ở liều cao và khi sử dụng kếthợp với các loại thuốc khác như thuốc trị ung thư thì giúp làm giảmtác dụng phụ của các loại thuốc này Rất nhiều các hợp chất đượcchiết tách đã được nghiên cứu và thử nghiệm, hàng loạt các hợpchất tổng hợp và bán tổng hợp vẫn đang liên tục được tạo ra trên rấtnhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nhằm tìm kiếm các loại thuốc,các chất hóa học có tác dụng mạnh hơn và ít độc hại hơn đối với cơthể người bệnh

Trên cơ sở đó, chúng tôi đề ra hướng nghiên cứu cho đề tài là tiếnhành tổng hợp dẫn xuất của rutin, một hợp chất có hàm lượng caotrong cây hoa hòe ở Việt Nam, từ đó thử nghiệm hoạt tính sinh họccủa chúng nhằm có được những nghiên cứu bước đầu cho việc tổnghợp các dẫn xuất khác sau này đồng thời hy vọng có thể tìm thêmđược những hợp chất mới có khả năng ứng dụng cao trong nhiều lĩnhvực, đặc biệt là trong y dược

1

CHƯƠNG I- TỔNG QUAN

Flavonoid là một nhóm bao gồm khoảng 4000 hợp chất tự nhiênhiện diện trong nhiều thành phần của cây cối cũng như trong các loạirau quả, nước uống như rượu vang đỏ, trà, cà phê, bia hay cả trongcác bài thuốc dân gian Người ta dự đoán con người tiêu thụ tổnglượng flavonoid trong thực phẩm vào khoảng vài trăm milligram mỗingày

1.1- CẤU TRÚC VÀ PHÂN LOẠI CÁC FLAVONOID

Flavonoid là những chất màu thực vật, có cấu trúc cơ bản là diphenylpropan nghĩa là 2 vòng benzen A và B nối nhau qua một dây

1,3-có 3 carbon ( C6-C3-C6) Cấu trúc là một vòng kín hoặc mở

Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí gốc aryl (vòng B) và cácmức độ oxy hóa của mạch 3 carbon, gồm có các nhóm: flavon,flavanon, flavonol, auron, neoflavonoid, rotenoid, dihydroflavonol,chalcon, dihydrochalcon, anthocyanidin, leucoanthocyanidin,isoflavon

O

O

OH

O OH

O

O

O H

Hình 1.1: Cấu trúc của một số dạng flavonoid

2

1.2- HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÁC FLAVONOID

1.2.1- Vai trò của flavonoid đối với cây cỏ

Các flavonoid đóng một vai trò quan trọng trong quá trình sinhtrưởng, phát triển và tự vệ của cây

1.2.2- Tính chất dược lý của flavonoid

Flavonoid có nhiều hoạt tính sinh học mà dù ở nồng độ cao cũngkhông gây độc cho cơ thể như khả năng kháng oxy hóa, kháng khối

u, kháng viêm, kháng dị ứng và là tác nhân bảo vệ gan Vì vậy,nghiên cứu về hoạt tính của các flavonoid luôn nhận được nhiều sựquan tâm của các nhà khoa học đặc biệt là nghiên cứu về khả năngkháng khối u của flavonoid

1.2.2.1- Khả năng kháng oxy hóa của flavonoid

Các flavonoid là các chất kháng oxy hóa tự nhiên Các flavonoid

có khả năng bắt các gốc gây oxy hóa như superoxide anion, các gốchydroxyl, peroxy

1.2.2.2- Tác nhân chống ung thư

Trong những năm gần đây đã có nhiều nghiên cứu ở mức độ invitro và in vivo cũng như các nghiên cứu về dịch tễ học đề cập đếnvai trò của flavonoid ở khẩu phần ăn hàng ngày trong việc ngăn ngừaung thư, một số sự kết hợp trong điều trị được đề cập đến đối vớithực phẩm giàu flavonoid như sử dụng đậu nành và ung thư vú thời

kỳ tiền mãn kinh, trà xanh và ung thư bao tử, hành và ung thư phổi…

Vì vậy, hiểu biết thêm về khả năng chống ung thư của các loại thựcphẩm này sẽ giúp bổ sung thói quen trong ăn uống của chúng ta Ngoài ra, bên cạnh các flavonoid tự nhiên thì các flavonoid tổnghợp là những ứng cử viên cho các loại thuốc chống ung thư trongtương lai, một số các hợp chất này đang ở trong giai đoạn thăm dò

3

lâm sàng như flavopiridol, 5,6-dimethylxanthenone-4-acetic acid,phenoxodiol hay silybin,…

Cơ chế kháng ung thư của flavonoid

- Flavonoids là tác nhân ngăn ngừa về mặt hóa học

- Flavonoid ức chế sự phát triển hoặc tăng sinh của tế bào ung thư

- Flavonoid là tác nhân chống lại sự xâm nhập, sự bám dính và sự

1.2.2.6- Các hoạt tính khác của flavonoid

Flavonoid có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, chống dị ứng,chống loét, và là tác nhân bảo vệ gan

1.3- XÁC ĐỊNH ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Cây hòe là một loại cây có vùng nguyên liệu khá lớn trong nước,lượng nụ hòe chủ yếu chỉ để làm phẩm màu, sắc uống hoặc cung cấpcho các công ty dược để chiết rutin Vì vậy, trên cơ sở các tính chấtdược lý của flavonoid và nguồn nguyên liệu có sẵn trong nước màchúng tôi chọn nguồn nguyên liệu ban đầu là hoa hòe để tiến hànhchiết tách và sau đó là bán tổng hợp các hợp chất có được, xác địnhcác tác dụng sinh học của chúng nhằm góp phần nghiên cứu thêm vềcác hợp chất này cũng như nâng cao khả năng sử dụng nguồn nguyênliệu thiên nhiên có sẵn trong nước

4

1.3.1- Hoa hòe và rutin

Cây hoa hòe mọc ở nhiều nước trên thế giới nhất là ở khu vựcchâu Á Ở nước ta hoa hòe được trồng nhiều ở các tỉnh phía Bắc như

Hà Nội, Sơn La, Thái Bình,… với một lượng khá dồi dào có thể đápứng nhu cầu lớn trong sản xuất các sản phẩm dược Trong cây hòechứa 6-35% rutin tùy thuộc vào từng phần của cây (nụ hòe 30 - 35%,

vỏ quả 0,5%, lá cây 4,4%)

Rutin là một loại vitamin P có tác dụng rất quý, giúp tăng cườngsức bền của mao mạch (thành mạch máu), làm giảm tính “dòn” vàtính thấm của mao mạch Khi thủy phân rutin sẽ cho quercetin,glucoz và rhamnoz Rutin còn có tác dụng rất tốt trong phác đồ điềutrị các bệnh viêm gan siêu vi B, C và giúp tăng cường sức đề khángcho những người có cơ địa gầy yếu, suy nhược cơ thể, lao sơ nhiễm Chúng tôi tiến hành chiết rutin trong nụ hoa hòe để làm nguyênliệu cho cả quá trình nghiên cứu sau này

1.3.2- Quercetin

Quercetin là một hợp chất phenol được tìm thấy trong nhiều loàicây thiên nhiên, trong nhiều sản phẩm thực phẩm, các loại thuốcnhuộm tự nhiên…

Trong những năm gần đây, quercetin được nghiên cứu rộng rãitrên thế giới do nó có hoạt tính mạnh so với các loại flavonoid khác.Tuy nhiên nguồn quercetin có sẵn trong thiên nhiên tương đối thấp,đòi hỏi quá trình trích chiết lâu dài và kém hiệu quả do đó người ta đã

sử dụng phương pháp thủy phân rutin, một loại flavonoid có hàmlượng cao trong một số loại cây để tạo ra quercetin Phương pháp nàyđặc biệt phù hợp với điều kiện của Việt Nam, là nơi trồng nhiều câyHòe, loại cây có hàm lượng rutin lên đến 30% Vì vậy, trong khuôn

5

khổ đề tài nghiên cứu này, chúng tôi chọn phương pháp thủy phânrutin thành quercetin để tạo ra nguyên liệu ban đầu cho các phản ứngtổng hợp tiếp theo.

 Một số tác dụng dược lý của quercetin

 Quercetin và một số dẫn xuất của nó có khả năng ứng dụng trongviệc ngăn ngừa và điều trị bệnh suy thoái xương

Đa số các nghiên cứu cho thấy không có bằng chứng nào chứng tỏquercetin là chất có thể gây những biến đổi về mặt sinh học

Quercetin có khả năng là nguyên liệu ban đầu trong các chươngtrình nghiên cứu phát triển về thuốc Ảnh hưởng tích cực củaquercetin lên các tế bào ung thư đã thúc đẩy nhiều nghiên cứu tổnghợp cũng như thử nghiệm các dẫn xuất của quercetin để nhằm tìmkiếm các tác nhân chống ung thư hiệu quả nhất và đã đạt được một sốkết quả khả quan Các kết quả tương tự có thể đạt được trong quátrình phát triển các tác nhân chống tích tụ các tiểu huyết cầu, khángvirus, kháng viêm…dựa trên nền tảng của quercetin

1.4- MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI

Mục tiêu của đề tài là tổng hợp các dẫn xuất của rutin và quercetin

và xác định các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn vàkhả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này để từ đó làm

cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm đưa vào sử dụngcác flavonoid và dẫn xuất của chúng cho các ngành y tế, thực phẩm

6

CHƯƠNG II NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP2.1- NGUYÊN LIỆU – HÓA CHẤT

Nụ hoa hòe khô và vỏ quýt được mua rồi đem sàng để loại tạp đấtcát, loại bỏ cành, lá… chỉ giữ lại nụ hoa và vỏ quýt đem sấy khô ởnhiệt độ 50- 60oC, độ ẩm 8% Sau đó đem nghiền thành bột mịn, bảoquản trong hũ thủy tinh kín đặt ở nơi mát, tránh ánh sáng và tránh hút

ẩm trở lại để dùng cho quá trình nghiên cứu tiếp theo

 Vật liệu sinh học và hóa chất

- Sử dụng ba dòng tế bào ung thư người là MCF-7 (ung thư vú),HeLa (ung thư cổ tử cung), NCI-H460 (ung thư phổi) trong sànglọc tính gây độc tế bào

- Các mẫu thử nghiệm gồm các flavonol và các dẫn xuất được tổnghợp theo phương pháp được mô tả trong đề tài

- Các hóa chất, môi trường, … đều đạt tiêu chuẩn phân tích

2.2- THIẾT BỊ

Các thiết bị máy móc được áp dụng bao gồm: điểm nóng chảy,phổ hấp thu tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), sắc ký lỏng ghépkhối phổ (LC-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) bao gồm cácloại phổ 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HSQC, HMBC

2.3- PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

2.3.1- Tách chiết rutin từ hoa hòe và thủy phân tạo quercetin

Chiết rutin từ nụ hoa hòe trong dung môi ethanol 80% bằngphương pháp đun hồi lưu, tiếp tục thủy phân rutin thành quercetintrong môi trường axit:

O

O OH HO

OH OH

2.3.2- Tổng hợp các dẫn xuất ester của quercetin:

O

OH HO

OH O

O

O O

O O C C C

O O

CH 2 CH 3

H 3 CH 2 C

H 3 CH 2 C

O O O

O O C C C

O O

O O C C

O S S

O O O

O O C C C

O O

O O O

OH O C C

O

O

O OH O O O

O

C C

C C

O

O

O N N

N N

O

O

O O

Q-4

O O O

O

CH 3

CH 3

OH OH

C S

O

O C C

O S S

O O O

O H N

CH 2 CH 2 CH 2 CH 3

CH 2 CH 2 CH 2 CH 3

H

O O O

O

CH 2 CH 3

CH 2 CH 3

ii iii

iv

v vi

Sơ đồ 2.2: Tổng hợp các dẫn xuất ester của quercetin

i) n-butyl isocyanat, pyridin, nhiệt độ phòng

ii) thiophene-2-carboxylic chlorid, pyridin, nhiệt độ phòngiii) Benzoyl chlorid, pyridin, nhiệt độ phòng

iv) 4-morpholine-carbonylchlorid, pyridin, nhiệt độ phòngv) Propionyl chlorid, pyridin, nhiệt độ phòng

vi) Anhydric acetic, pyridin, nhiệt độ phòng

2.3.3- Tổng hợp các dẫn xuất ether của quercetin:

O

OH HO

OH O

O

O O

O OH

HO

OH

O

O O

H 3 CO

OCH 3

iv v

H 3 C

Sơ đồ 2.3: Tổng hợp các dẫn xuất ether của quercetin

i) Dimethyl sulfat, K2CO3, aceton, đun hồi lưu

ii) Benzyl bromid, K2CO3, aceton, đun hồi lưu

iii) 1-brompropan, K2CO3, aceton, đun hồi lưu

iv) Dimethyl sulfat, K2CO3, aceton, đun hồi lưu

v) HCl 5%, đun hồi lưu

2.3.4- Phương pháp xác định khả năng kháng oxy hóa

2.3.4.1- Khảo sát khả năng bắt gốc tự do bằng thử nghiệm DPPH

Gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) là gốc tự do bền

do có hiệu ứng liên hợp trong toàn phân tử, cho màu tím trong etanol

và có độ hấp thu cực đại tại 517 nm

cơ chế dập tắt gốc tự do sẽ làm giảm màu của dung dịch DPPH Xácđịnh khả năng này bằng cách đo độ hấp thu của dung dịch khảo sát ởbước sóng có hấp thu cực đại tại 517 nm

2.3.4.2- Xác định sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipit

Xác định khả năng ức chế peroxy hóa lipit thông qua việc xácđịnh hàm lượng malonyl dialdehyt (MDA) theo phương pháp củaMakarova

Nguyên tắc: MDA là sản phẩm của quá trình peroxy hóa lipit

màng tế bào MDA có khả năng phản ứng với axit thiobarbituric(TBA) để tạo thành phức hợp trimethin (màu hồng) có đỉnh hấp thu

9

cực đại ở bước sóng 532 nm Phản ứng này thực hiện trong môitrường pH = 2-3, ở nhiệt độ 90-100oC trong vòng 15 phút Các chấtchống oxy hóa sẽ ức chế quá trình peroxy hóa lipit màng tế bào, ngănchặn sự tạo thành MDA Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ với hàmlượng MDA.

t 0

-2H2O

HN N O

N NH S O O

H MDA

2.3.5- Phương pháp xác định khả năng kháng nấm, kháng khuẩn

Các mẫu được thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm tại phòngSinh học thực nghiệm – Viện Hóa học các Hợp chất thiên nhiên –Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam bằng phương pháp củaVanden Bergher và Vlietlinck trên phiến 96 giếng theo hai bước:Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính,

Bước 2: tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn,

Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:

- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.

- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis, Staphylococcus aureus.

- Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum.

Mẫu thô có MIC ≤ 200 µg/ml; mẫu tinh có MIC ≤ 50 µg/ml là cóhoạt tính

2.3.6- Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp

SRB (thực hiện tại Phòng Thí nghiệm Sinh học phân tử- Bộ môn Di

truyền, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM)

Sử dụng phương pháp Sulforhodamine B (SRB) là một phươngpháp nhuộm màu đơn giản và nhạy để xác định độc tính tế bào của

10

một chất SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điệnđược với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộmliên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào.

Trong thử nghiệm, tế bào được cố định, rửa và nhuộm với SRB.Sau đó SRB liên kết với protein tế bào được hòa tan tạo dung dịchtrong suốt có màu hồng Mật độ quang đo được của dung dịch tươngquan với lượng protein tổng hay số lượng tế bào Sự thay đổi lượng

tế bào so với mẫu chứng phản ánh độc tính tế bào của chất

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1- CHIẾT RUTIN TỪ HOA HÒE

Cho 60,0 gam dược liệu (bột nụ hoa hòe) và 600 ml dung môiethanol 80% (5 lần) vào bình cầu 1000 ml, đun hồi lưu ở nhiệt độ sôicủa dung dịch và khuấy bằng máy khuấy trong 120 phút Lọc, sau đógộp các dịch chiết lại loại bớt dung môi dưới áp suất thấp Làm lạnh

để kết tinh rutin, lọc, rửa sạch bằng nước lạnh rồi đem phần rutin thuđược sấy khô ở 80oC thu được rutin thô Làm tinh rutin bằng cáchcho kết tinh lại 3 lần trong dung dịch ethanol 80%

Sau đó rutin thô được tinh chế lại nhiều lần bằng etanol Rutin thôchiếm 27% trong nụ hòe

- Sản phẩm thu được có dạng bột màu vàng nhạt ánh xanh, tnc(oC) =189-192oC, độ sạch > 97%

- Phổ UV-Vis (metanol): có hai mũi cực đại tại:  = 258nm và  =352nm

- Phổ IR (cm-1): 3429, 2937, 1655, 1599, 1504, 1294, 1129, 1062,

1012, 805, 596

11

3.2- THỦY PHÂN RUTIN THÀNH QUERCETIN

Lấy 15,0 g rutin tinh và 750 ml acid H2SO4 2% cho vào bình cầu

1000 ml, đun sôi hoàn lưu trên máy khuấy từ trong 90 phút Sau đóđem lọc và rửa với nước cho đến khi hết acid trên phễu lọc Buchner.Phần trên lọc thu được đem sấy ở 105oC đến khối lượng không đổi tathu được quercetin thô Kết tinh sản phẩm liên tục 3 lần trong ethanol

để thu được 10,6g quercetin tinh

và 8Hz)

- Phổ 13C-NMR (DMSO, δ ppm) kết hợp với DEPT: 93,36 (C8),98,19 (C6), 103,03 (C10), 115,09 (C2’), 115,61 (C5’), 121,98 (C6’),119,99 (C1’), 135,73 (C3), 145,06 (C3’), 146,82 (C4’), 147,70 (C2),156,15 (C9), 160,73 (C5), 163,88 (C7), 175,84 (C4)

3.3- TỔNG HỢP CÁC DẪN XUẤT CỦA QUERCETIN

- Quá trình acyl hóa (6 hợp chất): quercetin (1 mmol) được hòa tantrong pyridin (2 ml) sau đó nhỏ từ từ từng giọt tác nhân phản ứng vào(anhydric acetic, acyl chloride hoặc alkyl isocyanate, 7 mmol), hỗnhợp phản ứng được khuấy trong khoảng 16h sau đó đổ vào trong hỗnhợp nước đá lạnh, lọc rửa phần rắn thu được sau đó tiến hành làm

12

sạch bằng cách cho chạy qua sắc ký cột hoặc kết tinh nhiều lần trongcác dung môi đã được nghiên cứu thăm dò và chọn lựa

- Quá trình alkyl hóa (4 hợp chất): cho vào bình cầu hai cổ 0,302g (1mmol) quercetin cùng với 50 ml acetone khuấy đều khoảng 15 phút,sau đó cho thêm 4g K2CO3 khan và nhỏ từ từ 0,693g (6 mmol)dimethyl sulfate (hoặc các alkyl bromide khác) vào Hỗn hợp đượcđun hồi lưu và theo dõi phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng Sau khiphản ứng kết thúc, lọc bỏ potassium carbonate, dịch qua lọc được côquay loại dung môi Phần rắn còn lại sau đó được rửa với nước, sấykhô và làm sạch qua sắc ký cột

Riêng với rutin, tiến hành methoxy hóa tương tự như quercetinvới dimethyl sulfate, sau khi loại bỏ K2CO3 và cô loại dung môi thuđược phần rắn, tiếp tục đem phần rắn này thủy phân với dung dịchHCl 5% trong methanol để cắt gốc đường ở vị trí C-3, loại dung môi,phần rắn thu được rửa nhiều lần với nước cất và chạy qua sắc ký cộtthu được sản phẩm R-2

- 13C-NMR (δ ppm): 13,60 (CH3), 19,41 (CH2), 31,25 (CH2), 39,92(CH2), 101,05 (C8), 104,56 (C6), 107,42 (C10), 123,86 (C2’), 124,35

13