Các phương pháp nhân giống in vitro lan hồ điệp

Phần I: Mở ĐầuCuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo một gốc vườn nhỏ mang màu xanhcây lá thiên nhiên vào trong nhà của người dân ngày càng cao.Vốn nhiều họ, nhiềuchủng loại, màu sắ

Phần I: Mở Đầu

Cuộc sống ngày càng phát triển, nhu cầu tạo một gốc vườn nhỏ mang màu xanhcây lá thiên nhiên vào trong nhà của người dân ngày càng cao.Vốn nhiều họ, nhiềuchủng loại, màu sắc phong phú lại tốn ít diện tích nên việc chọn trồng và tạo một vườnlan nhỏ trong khuôn viên nhà là sự lựa chọn của nhiều cá nhân, nhiều hộ giađình.Trong số những loại phong lan được nuôi trồng ở nước ta hiện nay, bên cạnhnhững loài tương đối dễ trồng như Mokaro, Dendro, lan Vũ Nữ…thì vẫn có những loàilan thích hợp với một số khu vực địa lý nhất định, cụ thể là Địa Lan – loài hoa chỉ cóthể nuôi trồng trong điều kiện lí tưởng của Đà Lạt [4]

Không quá kén chọn và hạn chế nơi trồng như Địa Lan song Hồ Điệp cũng làmột trong những giống lan quý lại khó trồng Do đó, đòi hỏi người trồng phải có đôichút am hiểu về loài hoa này.Thích hợp với điều kiện trong nhà lại là một trong nhữnggiống lan được yêu thích không chỉ về màu sắc, kiểu dáng mà còn mang một nét đẹprất sang trọng, trang nhã Chính vì vậy, Hồ Điệp đã nhanh chống trở thành sản phẩmtrồng trọt được nhiều người ưa chuộng và mang lại hiệu quả kinh tế cao không chỉ ởViệt Nam mà còn ở nhiều nước trên thế giới như:Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản,Mỹ…Bên cạnh đó, hoa Hồ Điệp rất lâu tàn, độ bền bông cao, giàu sức quyến rũ nên

nó đã được lựa chọn làm vật trang trí, tạo cảnh quan trong các ngày lễ, tết.Vốn là mộtloài rất khó nhân giống bởi Hồ Điệp thường cho hệ số nhân rất thấp trong điều kiệnvườn ươm Để có được số lượng lớn cây giống đồng đều và sạch bệnh đáp ứng nhucầu thị trường là một vấn đề thật nan giãi Do đó, việc nhân giống bằng kỷ thuật nuôicấy mô ra đời tạo ra hàng loạt cây con ổn định về mặt di truyền, sạch bệnh, giá cả lạiphải chăng là rất hữu ích

Xuất phát từ thực tiễn này cộng với sự đam mê của chính bản thân mình, tôi đã

tiến hành tìm kiếm sưu tập từ đó đưa ra đề tài: “Các phương pháp nhân giống in vitro lan Hồ Điệp”

Phần II: Nội DungII.1 Tổng quan tài liệu

1.1 Lịch sử và thành tựu của nuơi cấy mơ [5]

1.1.1 Trên thế giới

• Năm 1902, nhà thơng thái Haberlant lần đầu tiên đưa ra ý tưởng cấy mơ củasinh vật ra ngồi cơ thể nhưng ơng đã dùng tế bào quá chuyên biệt nên khơng thànhcơng Mơ động vật được cấy trước tiên do A.Carrel(1919), đến năm 1934 mơ thực vậtmới được nuơi cấy

• Năm 1934 White đã thành cơng trong việc phát hiện ra sự sống vơ hạn của việcnuơi cấy tế bào rễ cà chua

• Năm 1964 Ball là người đầu tiên tìm ra mầm rễ từ nuơi cấy chồi ngọn Ơng đãthành cơng trơng việc chuyển cây con của cây sen cạn và cây White Lupin từ mơitrường nuơi cấy tối thiểu, tuy nhiên việc nhân giống vẫn chưa hồn chỉnh Sau đĩ,nhiều nhà nghiên cứu đã khám phá những thành phần dinh dưỡng qua trọng cần thiếtcho sự phát triển của tế bào được nuơi cấy (White (1951),Gauthere (1939),VanOverbeck (1941), Steward và Caplin (1951))

• Năm 1951, Skoog và Miller đã phát hiện ra các hợp chất cĩ thể điều khiển sựnảy chồi

• Năm 1962, Murashige và Skoog đã cải tiến mơi trường nuơi cấy đánh dấu mộtbước tiến trong kỷ thuật nuơi cấy mơ Mơi trường của họ dùng làm cơ sở cho việcnuơi cấy nhiều loại cây và vẫn cịn sử dụng rộng rải cho đến ngày nay

• Năm 1960-1964, Morel cho rằng cĩ thể nhân giống vơ tính lan bằng nuơi cấyđỉnh sinh trưởng.Từ kết quả đĩ, lan được xem là cây nuơi cấy mơ đầu tiên đượcthương mại hố Từ đĩ đến nay, cơng nghệ nuơi cấy mơ tế bào thực vật đã được pháttriển với tốc độ nhanh trên nhiều cây khác (Haramaki(1971), Murashige(1972), Miller

và Murashige (1976)) và được ứng dụng thương mại hĩa

1.1.2 Ở Việt Nam

Nuơi cấy mơ tế bào thực vật đã được phát triển ở Việt Nam sau chiến tranh thếgiới kết thúc (1975) Phịng thí nghiệm nuơi cấy mơ và tế bào đầu tiên được xây dựngđầu tiên ở viện sinh học, viện khoa học Việt Nam(KHVN) do tiến sĩ Lê Thị Muộiđứng đầu Bước đầu tập trung nghiên cứu những vấn đề cơ bản như nuơi cấy bao phấn,nuơi cấy mơ sẹo và protoplast Các kết quả đầu tiên về nuơi cấy thành cơng bao phấnlúa và thuốc lá được cơng bố năm 1978 (Lê Thị Muội và cs,, 1978; Lê Thị Xuân và cs,,1978) Tiếp đĩ là thành cơng về protoplast ở thuốc lá và khoai tây (Lê Thị Muội vàNguyễn Đức Thành(1978),Nguyễn Đức Thành và Lê Thị Muội 1980,1981).Trongcùng thời gian tại phân viện KHVN tại Tp.HCM, muội hơn nửa là tại Đại học Nơng

(KHKTNNVN) và các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô và tế bào cũng được thành lậpchủ yếu tập trung vào vi nhân giống khoai tây Hiện nay, chúng ta có rất nhiều phòngthí nghiệm nuôi cấy mô không những ở các trường đại học các viện nghiên cứu (viện

Di Truyền Nông Nghiệp(DTNN), viện Rau Quả Trung ương(RQTƯ)) mà ở cả một sốtỉnh và cơ sở sản xuất(Yên Bái ,Hưng Yên, Thanh Hóa….) Giữa những năm 1980 trởlại đây, các hướng nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy mô và tế bào thực vật phát triểnmạnh Những kết quả khích lệ đã đạt được trong lĩnh vực vi nhân giống khoai tây(việnCông Nghệ Sinh Học (CNSH), ĐHNNI, viện KHKTNNVN), dứa, chuối, mía (việnCNSH, ĐHNNI, viện KHKTNNVN, viện RQTƯ) một số cây hoa phong lan (phânviện CNSH thành phố Hồ Chí Minh), Hồng, Cúc, Cẩm Chướng(viện CNSH, việnDTNN) và cây công nghiệp như bạch đàn (viện DTNN, viện Lâm Nghiệp) Một số kếtquả bước đầu đã ghi nhận trong lỉnh vực chọn dòng tế bào như chọn dòng tế bàokháng bệnh (Lê Bích Thủy và cs,, 1994), chọn dòng chịu muối ,chịu mất nước(Nghuyễn Tường Vân và cs ,,1994; Đinh Thị Phòng và cs,, 1994) Các kết quả về dunghợp cây lai tế bào chất và chuyển gen lục lạp củng thu được kết quả lý thú (NguyễnĐức Thành và cs,, 1988; Nguyễn Đức Thành và cs,, 1993, 1997) nuôi cấy bao phấn đểtạo dòng thuần đã được ứng dụng nhiều ở viện CNSH và DTNN Nuôi cấy các dượcliệu quý để bảo tồn nguồn gen và tạo các tế bào có hàm lượng các chất sinh học quantrọng cao cũng đã và đang phát triển

1.2 Các giai đoạn nhân giống invitro [5]

Cho tới nay việc nhân giống invitro đã áp dụng cho nhiều loại cây (350 loài,Murashige (1974) chia quy trình nhân giống ra làm 4 giai đoạn :

• Nuôi cấy khởi đầu, tái sinh chồi, cụm chồi

• Nhân nhanh chồi, cụm chồi trong điều kiện invitro

• Tạo cây con hoàn chỉnh, huấn luyện cây con

• Phục hồi, chuyển cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên

1.3 Các phương pháp nhân giống invitro [5]

1.3.1 Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng

Một phương thức dễ dàng nhất đạt được mục tiêu trong nuôi cấy mô tế bào thựcvật là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng (bao gồm nuôi cấy chồi đỉnh và nuôi cấy chồi bên).Sau khi vô trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường thích hợp chứa đầy đủ cácchất dinh dưỡng khoáng vô cơ và hữu cơ hoặc môi trường khoáng có bổ sung chấtkích thích sinh trưởng thích hợp Từ một đỉnh sinh trưởng, sau một thời gian nuôi cấynhất định mẫu sẽ phát triển thành một chồi hay nhiều chồi Chồi tiếp tục phát triểnthân, ra lá và rể để thành một cây hoàn chỉnh Cây con được chuyển dần ra đất và thíchnghi bình thường

1.3.2 Nuôi cấy mô sẹo

Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phân hóa củacác tế bào đã được phân hóa Mô sẹo sẽ phát triển nhanh khi môi trường có sự hiệndiện của auxin Khối mô sẹo có khả năng phát triển thành cây con hoàn chỉnh trongđiều kiện môi trường không có chất kích thích tạo mô sẹo Nuôi cấy mô sẹo được thựchiện đối với các loại thực vật không có khả năng nhân giống thông qua nuôi cấy đỉnhsinh trưởng Cây tái sinh từ mô sẹo có đặc tính giống như cây mẹ Từ một cụm tế bào

mô sẹo có thể tái sinh cùng một lúc nhiều chồi hơn là nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, tuynhiên mức độ biến dị tế bào soma lại cao hơn

1.3.3 Nuôi cấy tế bào đơn

Khối mô sẹo được nuôi cấy trong môi trường lỏng và được đạt trên máy lắc cótốc độ điều chỉnh thích hợp sẽ tách ra thành nhiều tế bào riêng lẽ gọi là tế bào đơn.Tếbào đơn được lọc và nuôi cấy trên môi trường đặc biệt để tăng sinh khối Với các chấtthích hợp được bổ sung vào môi trường, tế bào có khả năng sản xuất các chất có hoạttính sinh học Sau một thời gian nuôi cấy kéo dài trong môi trường lỏng tế bào đơnđược tách ra và trải trên môi trường thạch

+ Khi môi trường thạch có bổ sung auxin, tế bào đơn phát triển thành từngcụm có mô sẹo

+ Khi môi trường thạch có tỷ lệ cytokinine/auxin thích hợp, tế bào đơn có khảnăng tái sinh thành cây con hoàn chỉnh

1.3.4 Nuôi cấy protoplast-chuyển gen

Protoplast (tế bào trần) là tế bào đơn được tách bởi vỏ cellullose, có sức sống vàduy trì đầy đủ các chức năng sẵn có

Trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, protoplast có khả năng tái sinh màng tế bào,tiếp tục phân chia và tái sinh cây hoàn chỉnh (tính toàn thể ở thực vật) Khi tế bào chấtmất vách và tiến hành dung hợp, hai protoplast có khả năng dung hợp với nhau tạo tếbào lai, đặc tính này cho phép cải thiện giống cây trồng Quá trình dung hợp protoplast

có thể thực hiện trên hai đối tượng cùng loài hay khác loài

1.3.5 Nuôi cấy hạt phấn đơn bội

Hạt phấn ở thực vật được nuôi cấy trên những môi trường thích hợp tạo mô sẹo

Mô sẹo này được tái sinh thành cây hoàn chỉnh là cây đơn bội

II.2 Tìm hiểu về nhân giống lan Hồ Điệp

2.1 Nguồn gốc và đặc điểm của lan Hồ Điệp [4]

2.1.1 Nguồn gốc

Lan Hồ Điệp là giống lan có tên gọi Phalaenopsis, thuộc họ phụ Vandeae.Tên gọi Phalaenopsis bắt nguồn từ tiếng Hi Lạp trong đó Phalaina có nghĩa là “conbướm” và Opsis có nghĩa là “giống như”.

Lan Hồ Điệp được khám phá năm 1750, đầu tiên được ông Rumphius đặt tên

là Angraecum album, năm 1753 Linne đổi tên thành Epidendrum, 1825 nhà thực vật

Hà Lan định danh lại là Phalaenopsis

Loài hoa này có xuất xứ ở miền Bắc Australia, Ấn Độ và các nước Đông Nam

Á như Philippine, Inđônêsia, bán đảo Đông Dương Quê hương của lan Hồ Điệp là cácnước của vùng Đông Nam Á, rừng Việt Nam không có loài Phalaenopsis amabilis, chỉ

có 5 loài tương tự được biết là Phaenopsis mannii, Phalaeopsis gibbosa, Phalaenopsislobbi, Phalaenopsis fuscata và Phalaenopsis cornu-cervi Lan Hồ Điệp được trồng ởmọi nơi trên thế giới, hầu hết là ở Đức, Nhật bản, Phần Lan, Đài Loan, Thái Lan và

Mỹ Cây con được nuôi cấy mô nhiều ở các nước Phần Lan, Thái Lan, Đài Loan…Hiện nay giống Hồ Điệp có trên 70 loài và càng ngày càng lai tạo ra rất nhiều

2.1.2 Đặc điểm

 Lan Hồ Điệp là cây đơn thân, ngắn, lá to, dày, mọc sát vào nhau Hoa nở luânphiên hết cái này đến cái khác, thời kì nở hoa thay đổi theo loài và thường nở trong vàitháng Phát hoa mọc từ nách lá, dài, chùm hoa nở từng cái, 3 đài to tròn, hai cánh xoèrộng kín, sắc đẹp Môi hoa cong dẹp có hai râu dài nên cả đóa hoa trong giống như conbươm bướm Hai hàng hoa xếp đều đặn 2 bên cành, khẽ đong đưa như đàn bướm xinhxắn đang bay lượn chập chờn Trụ có hình bán nguyệt với hai phân khối u lên, chứađầy phấn hoa Số hoa trên cành biểu thị sức sống của cây Số lượng càng nhiều thì câycàng sung sức Riêng đặc tính phân nhành hoa lại tùy thuộc nhiều vào từng loại giống

 Lan Hồ Điệp có màu sắc phong phú, không thua kém bất cứ giống lan nàokhác từ trắng, hồng, đỏ, vàng, tím đến các loại Hồ Điệp có sọc nằm ngang hoặc thẳngđứng, hoặc có đốm to hay nhỏ…Lan Hồ Điệp sinh trưởng chậm, khoảng 40 ngày vớiđiều kiện chăm sóc tốt mới mọc thêm một lá hoàn chỉnh Khi cây có trên 4 lá mới cóthể phân hoá mầm hoa Loài lan này có độ bền bông cao trong điều kiện thích hợp, rấtthích hợp để trồng trong nhà, dễ ra hoa Nhưng nó vốn vẫn là loài hoa khó tính

2.2 Điều kiện sinh thái [5]

2 2.1 Nhiệt độ [3]

Lan Hồ Điệp có nguồn gốc từ miền nhiệt đới, do đó nhiệt độ thích hợp để trồngLan Hồ Điệp tương đối cao, nhiệt độ thích hợp để trồng ban ngày là từ 25-280C, banđêm là 18-200Cgiai đoạn ươm cây non thì cần nhiệt độ ban đêm khoảng 230C Nếunhiệt độ nhà trông nhỏ hơn 150C rễ cây ngừng hút chất dinh dưỡng, quá trình sinhtrưởng ngừng lại, thậm chí bị lạnh hại làm rụng hoa hoặc làm cho cánh hoa xuất hiệncác đốm nhỏ ảnh hưởng đến vẽ đẹp của hoa, giai đoạn phấn hoa đòi hỏi phải có sự

cách biệt khá cao về độ lêch nhiệt độ ngày /đêm, nhiệt độ ban ngày thích hợp nhất là

25 0C, ban đêm 10-200C, kéo dài 3-6 tuần rất có lợi cho sự phân hóa hoa

2 2.2 Nước tưới

Hồ Điệp là loài đơn thân, không có giả hành nên không dự trữ nước, hơn nữadiện tích bốc hơi của bản lá khá lớn và chúng không có mùa nghỉ vì thế phải cung cấpcho không một lượng nước đầy đủ và thường xuyên trong suốt năm Trong mùa mưamỗi ngày phải tưới cho chúng 2 lần, trừ những ngày có mưa, một lần vào 9 giờ sáng,một lần vào 3 giờ chiều Tưới như vậy sẽ đảm bảo cây khô ráo khi trời tối vì đọngnước ở nách lá suốt đêm có thể gây ra sự thối rữa Vào mùa nắng, nên tưới cho chúng

1 ngày 3 lần

Điều kiện thoát nước là tương đối quan trọng, Hồ Điệp không thể chịu được một

độ ẩm lắng đọng (nhất là ban đêm), vì rất đễ tạo điều kiện cho bệnh thối rữa phát triển.Tốt nhất cứ ba ngày ta nên pha Dithane M45, Maneb, Captan vào trong nước tưới vớinồng độ 1/400 để ngừa chứng bệnh nói trên Nên nhớ, Hồ Điệp là loài lan thích hợpvới giá thể và nước tưới có pH khá thấp (pH=5,2) vì thế phải dùng axít phôtphoric đểgiảm pH của nước

Ở nước ta, vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh hơn, nhưng những giọt mưanặng hạt cũng không kém phần nguy hiểm vì thế đa số các loại Hồ Điệp bị chết donhững cơn mưa đầu mùa Đây cũng là một hình thức tưới của thiên nhiên mà ta khôngkiểm soát được Do đó để ngừa tình trạng trên, mái giàn che Hồ Điệp nên dùng nhữngtấm tôn nhựa xanh, như vậy sẽ loại trừ những trận mưa không cần thiết và tạo đượcnhững tia sáng khuếch tán rất lý tưởng

Vào mùa khô, ta vẫn duy trì mức độ tưới đều đặn như trong mùa mưa, vì lúc này

ẩm độ trong không khí giảm xuống rõ rệt Do đó, sự tăng số lần tưới nhằm mục đíchtạo cho

cây tăng trưởng liên tục Nếu cây có trạng thái thiếu nước, ủ rũ bạn nên chuyển câysang vị trí khác hoặc tăng số lần tưới lên Một lần tưới bổ sung vào giữa trưa trongmùa khô rất thích hợp cho sự phát triển của Hồ Điệp

2 2.3 Ánh sáng [3]

Lan Hồ Điệp rất kỵ ánh sáng chiếu thẳng trực tiếp, do đó phải có biện pháp chesáng đồng thời tùy thuộc vào cây lớn nhỏ mà có biện pháp điều chỉnh ánh sáng chothích hợp Thời kỳ ươm cây non nhu cầu về ánh sáng có cường độ 10.000-12.000 lux,giai đoạn cây bánh tẻ là 12.000-20.000 lux, giai đoạn thúc ra hoa 20.000-30.000 lux.Trong điều kiện trồng trong nhà lưới, mùa hè và mùa thu phải che đi 75-85% ánh sáng,cần phải có hai lớp che sáng đặt chồng lên nhau, mùa đông xuân thì ánh sáng yếu hơnchỉ cần che 40-50% là đủ

2 2.4 Độ thông thoáng

Rất cần thiết vì Hồ Điệp hay bị bệnh thối nhũn lá (phõng lá), sự thông thoánggiúp lá cây mau khô sau khi tưới và bộ rễ không bị úng nước nên hạn chế bệnh rấtnhiều Ở nước ta vào mùa mưa Hồ Điệp tăng trưởng mạnh những giọt mưa nặng hạt

có thể làm thối đọt Do đó để ngăn ngừa tình trạng trên nên dùng những tấm tôn nhựaxanh để che Có một số trường hợp trồng Hồ Điệp trên cao (sân thượng) có hiệu quảhơn Tuy nhiên gió nhiều và mạnh dễ làm cây mất nước nhanh nếu ta không cung cấp

đủ lá cây sẽ héo rũ, nhăn

2 2.5 Dinh dưỡng

Hồ Điệp cần dinh dưỡng thường xuyên, quanh năm vì không có mùa nghỉ Khitưới phân không nên tưới với nồng độ cao càng đừng tưới lên đọt, nhất là lúc lá nonmới nhú ra từ đỉnh sinh trưởng Hồ Điệp cần phân bón tưới với nồng độ loãng và cóthể tưới nhiều lần trong tuần Có thể tưới thêm phân hữu cơ như: bánh dầu 15ngày/lần, vitamin B1, kích thích ra rễ…

Cách tưới phân

+ Thời kỳ cây dưới 12 tháng tuổi cần dùng N, P, K với tỷ lệ cao 30-10-10,sau đó dùng phân N, P, K với tỉ lệ 20-20-20 hoặc 18-18-18 cho đến lúc ra hoa Tuynhiên vào mùa mưa nếu tưới phân 30-10-10 thấy cây yếu mềm quá có thể tăng cườnglượng lân và kali bằng cách xen kẽ phân 20-20-20 hoặc 18-18-18 (dù là cây con), đểcây được cứng cáp, tăng cường sức đề kháng sâu bệnh

+ Lúc cây trưởng thành (18-24 tháng tuổi) vào thời điểm cuối năm, thờitiết lạnh có thể kích thích cây ra hoa bằng cách tưới phân 10-30-30, đến khi cây bắtđầu nhú cành hoa rồi ta trở lại tưới phân 20-20-20 cho đến lúc hoa nở và tàn Khôngnên để cành hoa lâu quá trên cây, khi nụ hoa cuối cùng đã nở và có 1, 2 hoa bắt đầuhéo, thì ta nên cắt cành hoa bỏ đi để dưỡng sức cho cây Khi cắt cành hoa càng sớm thì

lá mới ra mau và cây sinh trưởng tốt hơn để lần ra hoa sau sẽ mạnh hơn

2.2.6 Sâu bệnh

Đối với phong lan, việc phòng bệnh hết sức quan trọng, vì khi cây đã bị bệnh rấtkhó trị và có thể làm chết cây Ngoài việc chăm sóc lan kỹ lưỡng đều đặn, tưới nưới vàdinh dưỡng cần phải tưới thêm thuốc trừ nấm bệnh nhằm tăng sức đề đề kháng chocây Lan Hồ Điệp hay bị con bọ trĩ chích tạo vết thương trên lá từ đó vi khuẩn xâmnhập gây bệnh thối nhũn trên lá Có thể dùng một số loại thuốc để phòng trị nhưMalathion, lannat… để phòng trị

2.2.7 Chậu, giá thể, cách trồng

Cách trồng chung nhất cho các loại Hồ Điệp là chậu thật thoáng, có nhiều lỗ cóthể sử dụng chậu đất nung có nhiều lỗ hay chậu nhựa cũng được Chậu phải thật sạchkhông có rêu bám trên thành chậu Thông thường các nhà vườn trồng lan với số lượng

lớn (vài ngàn cây) thường dùng than, dớ, xơ dừa, mút… làm giá thể để trồng lan HồĐiệp Có rất nhiều cách trồng lan Hồ Điệp tuỳ theo từng vùng Nhưng có điểm chung

là than, mút nằm dưới đáy chậu, còn xơ dừa hay dớn sẽ nằm trên miệng chậu cáchtrồng này giúp cây thoát nước tốt vào mùa mưa, không bị thối rễ và phát triển tốt.Trong thời gian khoảng 2 năm ta thay chậu một lần, nếu cây lớn quá mau có thể thaychậu sớm hơn

2.3 Tình hình sản xuất lan Hồ Điệp ở Việt Nam [5]

Hiện nay, tại TP.HCM cây lan Hồ Điệp được xem là cây trồng chiến lượt trongviệc chuyển đổi cơ cấu cây trồng và vật nuôi Đây là cây trồng đem lại hiệu quả caogấp 2-3 lần so với việc trồng lúa, hoa màu v.v Trong xu thế đất trồng ngày càng hẹpthì cây lan không chiếm diện tích đất nhiều nên là giải pháp rất hiệu quả Không chỉđẹp về màu sắc, hình dáng, hoa lâu tàn… giá thành rẻ nên ngày càng được ưa chuộng

và nuôi trồng Tại TP.HCM và các tỉnh lân cận có rất nhiều vườn trồng Hồ Điệp vớiqui mô từ vài trăm đến vài nghìn cây Điển hình là công ty Lâm Thăng của Đài Loanđầu tư và công ty Kim Ngân chuyên trồng về lan Hồ Điệp, hàng năm có thể cung ứngcho thị trường từ vài ngàn đếm vài chục ngàn cây, nhất là vào dịp Tết Nguyên Đán.Tuy nhiên do không có sự liên kết giữa các nhà vườn nên sản phẩm làm ra không tìmđược thị trường tiêu thụ, giữa cung và cầu không hợp lý

Về nguồn cây giống thì ở nước ta do không đầu tư nên cây giống không đạt chấtlượng tốt, giống mới không nhiều nên các nhà vườn thường nhập giống từ các nướcnhư Thái Lan, Đài Loan…Ngoài ra hàng năm việc nhập khẩu hoa từ các nước này ướctính tiêu tốn hàng triệu USD So với các nước có ngành trồng lan phát triển như ĐàiLoan hay Thái Lan thì ngành trồng ở nước ta cần phải học hỏi nhiều và cần phải cóchính sách phát triển hợp lý nhằm đem lại hiệu quả kinh tế cao hơn

2.4 Nhân giống invitro lan Hồ Điệp

2.4.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [14]

2.4.1.1 Vật liệu và phương pháp nuôi cấy

Trục phát hoa Hồ Điệp lai được cắt khi các hoa gần tàn Các mắt được làm sạch

và tẩy trùng bằng phương thức của Scuully, có 4 loại chồi khác nhau trên các khúcmắt được dùng trong thí nghiệm

• Chồi nguyên vẹn được dùng để kiểm chứng

• Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt bỏ 2/3 chồi theo mặt cắt song song vớitrục phát hoa và như thế mặt cắt sẽ nghiêng với hướng mọc một gốc α

• Chồi bị làm chấn thương bằng cách cắt chồi làm hai mặt cắt theo trục

• Đâm dọc chồi bằng một kim nhọn từ đỉnh xuống gốc

2.4.1.2 Điều kiện nuôi cấy

• Môi trường Murashige và Skoog( M+S).

• Môi trường Knudson C

• pH:5.8

• Ánh sáng: 5000 1m/m2

• Quang kỳ : 14 giờ

• Nhiệt độ: 2100C

• Dụng cụ chứa đựng môi trường là lọ thuốc nhỏ chứa 10ml

2.4.2 Gieo hạt lan Hồ Điệp nảy mầm trong điều kiện invitrro [3]

Trong tự nhiên hạt lan ít nảy mầm (chỉ nảy mầm 1-2%) do hạt lan không có chứaanbunin và một phôi chưa phân hóa, có kích thước nhỏ nên khó chứa chất dự trữ Vìvậy, trong tự nhiên hạt lan Hồ Điệp nảy mầm được nó phải cộng sinh với nấmRhizoctonia mucoroides Nấm sẽ cung cấp đường để nuôi cây, phân giải các chất hữu

cơ khó hấp thu Bù lại cây sẽ cung cấp nước cho nấm, chỗ ở và các khoáng chất mà nóthu được từ sương Dựa trên nguyên tắc này, các phòng thí nghiệm nuôi cấy mô đã tạomôi trường gieo hạt lan Hồ Điệp trên môi trường dinh dưỡng nhân tạo với tỉ lệ rất cao

đã chuẩn bị sẵn

• Để gieo hạy lan có thể sử dụng các loại môi trường nền: Knudson, Went (VW), Murashige –Skoog ( MS) có bổ sung thêm đường và các chất hữu như:Dịch nghiền của khoai tây, chuối , cà rốt, nước dừa, pepton…

Vacine-2.4.3 Ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm trong nhân giống Hồ Điệp lai [2] 2.4.3.1 Hệ thống nuôi cấy

Hệ thống ngập chìm tạm thời được sử dụng trong nghiên cứu này là hệ thốngbình nuôi cấy Plantima do công ty A-tech Bioscientific của Đài Loan sản xuất Hệthống này gồm những bộ phận chủ yếu sau: Bơm hay máy nén khí tạo áp lực để đẩymôi trường từ ngăn chứa lên ngăn chứa mẫu cấy và ngược lại, timer dùng để điềukhiển chu kỳ ngập, hệ thống ống dẫn và van điều khiển, các màng lọc thoáng khí vôtrùng, các bình Platima bằng nhựa polycarbonate gồm có 2 ngăn, ngăn dưới chứa môitrường lỏng và ngăn trên chứa mẫu thực vật

Bằng cách điều chỉnh tự động áp lực không khí thông qua một máy bơm, môitrường lỏng từ ngăn dưới sẽ được bơm lên ngăn chứa mẫu cấy và khi đạt đến thời gianngập chìm tạm thời dung dịch sẽ quay trở lại ngăn dưới Trong giai đoạn dung dịchngập mẫu có sự trao đổi không khí, mẫu được xoay chuyển nhẹ và làm mới không khíbên trong bình nuôi cấy, dòng khí đi vào và thoát ra được khử trùng nhờ cách lọc vôtrùng 0,45µm Thời gian ngập chìm và tần suất ngập chìm được điều khiển bằngtimer.

Hình 1: Hệ thống Plantima với hệ thống điều khiển chu kỳ ngập[11]

2.4.3.2 Mẫu cấy lan Hồ Điệp

Đối tượng thí nghiệm là một loài lan Hồ Điệp lai có tên gọi Doritaenopsis Taida

Salu Mẫu cấy gồm có :

• Protocorm – like bodies –PLBs của giống Dtps Taida Salu.

• Mẫu cấy chồi được lấy trong thí nghiệm tái sinh chồi từ PLBs trong các hệthống khác nhau trên môi trường tái sinh chồi

2.4.3.3 Phương pháp thí nghiệm

A Khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhau

Thí nghiệm khảo sát sự nhân nhanh PLBs trong các hệ thống nuôi cấy khác nhauđược tiến hành trong nhằm so sánh hiệu quả trong việc nâng cao hệ quả nhân và chấtlượng của PLBs trong hệ thống TIS so với các hệ thống nhân giống trên môi trườngthạch và trong hệ thống nuôi cấy lỏng lắc Đồng thời khảo sát các thông số tối ưu choviệc nhân PLBs trên hệ thống TIS Mật độ mẫu cấy và tần xuất ngập chìm

Môi trường nuôi cấy : Môi trường MS bổ sung BA và NAA, sucrose, glucose,nước dừa Môi trường đối chứng trên thạch có sử dụng than hoạt tính và agar.

B Khảo sát sự tái sinh chồi từ PLBs trong hệ thống TIS

Mẫu cấy là những PLBs thu được từ quá trình nhân PLBs Môi trường nuôi cấy

là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa, pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose Đốichứng là các mẫu được cấy trên môi trường đặc

Khảo sát các thông số tối ưu cho việc tái sinh chồi và nhân chồi trên hệ thốngTIS Mật độ mẫu cấy và tần suất ngập chìm

C Khảo sát sự ra rễ của chồi Hồ Điệp tái sinh từ PLBs trong hệ thống TIS

Mẫu cấy là những chồi được tách ra từ quá trình tái sinh chồi, chồi lúc cấy vào cóchiều dài là khoảng 8-9 mm, chiều rộng là khoảng 3-4 mm, chiều cao thân là khoảng10mm, không có rễ Môi trường nuôi cấy là môi trường MS 1/2 có bổ sung nước dừa,pepton, dịch chiết khoai tây, sucrose, IBA Đối chứng là mẫu nuôi cấy trên môi trườngđặc

Hình 2: Cây sinh trưởng trong hệ thống nuôi cấy ngập chìm [13]

2.4.4.4 Điều kiện thí nghiệm

Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng Công Nghệ Tế Bào Thực Vật (Trungtâm Công Nghệ Sinh Học TP HCM) trong điều kiện nhiệt độ khoảng 25 ± 20C, độ ẩm80- 85 %, thời gian chiếu sáng 10 giờ / ngày, cường độ chiếu sáng 2500 lux

2.4.4 Nhân nhanh phôi và Protocorm – like body cây lan Hồ Điệp bằng hệ thống Bioreactor [1]

2.4.4.1 Vật liệu và phương pháp

Đối tượng nghiên cứu

Giống lan Hồ Điệp có màu trắng (phalaenopsis amabilis ).

Mẫu thí nghiệm

Nguồn mẫu lá phôi và PLB ( có màu xanh, đường kính từ 1-1,5 mm) thu nhậnsau 2- 3 tháng cấy chuyền trên môi trường MS có bổ sung 2,0 mg/l BA, 0,5 mg/lNAA, 20%

nước dừa và 30 g/l đường Nguồn mẫu này được dùng làm nguồn vật liệu để làm thínghiệm

Môi trường nuôi cấy

Môi trường MS cơ bản có bổ sung kết hợp các thành phần BA, NAA, và nướcdừa, sau đó bổ sung 9g/l agar, 1g/l than hoạt tính, pH môi trường được điều chỉnh về5,8 trước khi hấp khử trùng

• Đối tượng thí nghiệm tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB.Dùng các bình thủy tinh có thể tích 250 ml, thể tích môi trường đỏ vào là 40 ml Bìnhthủy tinh có độ truyền suốt ánh sáng cao để mẫu cấy có khả năng quang hợp tốt

• Đối với hệ thống bioreactor

Bioreactor sử dụng trong nghiên cứu có dạng hình cầu, thể tích 3 lít (sản xuất tạiHàn Quốc) Phần đáy có dạng hình trụ (đường kính ngoài 45 mm, cao 100 mm) Phầntrên có dạng hình cầu (đường kính ngoài 170 mm) Đáy được nối với máy sục khí,bên dưới là một miếng ceramic (đường kính 20 mm, dày 2mm) có tác dụng tạo bọt khímịn Nắp đậy làm bằng vật liệu silicone, hình nón cụt, đường kính trung bình là 100

mm và có khả năng chịu nhiệt tốt (không biến dạng khi hấp vô trùng ở 1210C, 1atm,trong 30 phút) Trên nắp có ống nối với màng lọc khí Màng lọc khí sử dụng là loạichịu nhiệt, đường kính lỗ màng lọc là 0,2 Mm Hệ thống nuôi cấy này sử dụng 2 mànglọc, một để lọc khí vào và một để lọc khí ra Các ống dẫn khí được làm từ silicone chịunhiệt, chia làm 2 loại: Loại đường kính 7 mm và loại đường kính 13 mm Sử dụng mộtmáy bơm để cung cấp khí cho bioreactor với lượng khí khoảng 20 lít/ phút

Điều kiện nuôi cấy

Thực hiện các quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ 25 ± 20C, cường độ ánh sáng khoảng2000lux, sử dụng ánh sáng trắng từ đèn neon, thời gian chiếu sáng là 10 giờ /ngày, độ

ẩm trung bình là 75- 80%

Phương pháp thí nghiệm

Các bước thiết lập và vận hành hệ thống nuôi cấy bioreactor được thực hiện nhưsau:

Bước 1: Chuẩn bị các bộ phận của hệ thống bioreactor :bình cầu, nắp silicone,các ống dẫn silicone, máy lọc khí, máy sục khí Chuẩn bị môi trường nuôi Chuẩn bịmôi trường nuôi cấy và mẫu nuôi cấy

Bước 2 : Gói các bộ phận của hệ thống bioreactor vào trong túi nilon chịu nhiệt

và đem hấp khử trùng ở 121 0C, 1 atm trong 40 phút Đồng thời hấp vô trùng môitrường cùng một lúc

Bước 3 : Tiến hành lần lượt, đổ môi trường nuôi cấy vào bình cầu với thể tíchnuôi cấy là 1lít, cấy mẫu phôi và PLB vào, đậy nắp lại và sau đó gắn các màng lọc khí.Nắp đậy được dán bằng keo dán ống nước Sau cùng gắn máy sục khí vào hệ thống đểthực hiện quá trình nuôi cấy

Hình 3: Các thiết lập và vận hành hệ thống bioreactor.[1]

Thiết kế thí nghiệm

• Tối ưu hóa môi trường nuôi cấy tăng sinh phôi và PLB

Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thựcvật (BA, NAA) và nước dừa phát sinh phôi vô tính và PLB của lan Hồ Điệp Các thínghiệm được bố trí theo các bảng như sau

Sau 8 tuần nuôi cấy, thu nhận phôi và PLB, tiến hành lấy kết quả với các chỉtiêu sau: Trọng lượng tươi, đường kính phôi, PLB và đánh giá thông qua quan sát thựctế.

Bảng 1: Ảnh hưởng của BA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôicấy bổ sung 0,5 mg /l NAA và 20 % nước dừa

Bảng 2:Ảnh hưởng của NAA lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trường nuôicấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 20% nước dừa

Bảng 3: Ảnh hưởng của nước dừa lên sự tăng sinh của phôi và PLB trong môi trườngnuôi cấy bổ sung 2,0 mg /l BA và 0,5 mg /l NAA

• Khảo sát sự tăng sinh của phôi và PLB trong hệ thống nuôi cấy bioreactor

Từ kết quả đạt được ở thí nghiệm tối ưu môi trường tăng sinh phôi nhóm nghiêncứu xác định được các thành phần tối ưu cho môi trường nuôi cấy trong bioreactor là:Môi trường MS cơ bản, thể tích nuôi cấy 1lít bổ sung 2,0 mg / l BA , 1,0 mg /l NAA

và 20 % nước dừa, chỉnh pH về 5,8 trước khi đem đi hấp khử trùng ở 1210C, 1 atmtrong 40 phút Các bước tiến hành nuôi cấy trong hệ thống bioreactor đã được trình

Môi trường nuôi cấy BA (mg/ l)

bày ở trên Đồng thời tiến hành nuôi cấy trên môi trường agar truyền thống với thể tíchbình và môi trường tượng tự như trong hệ thống bioreactor là 3 lít (thể tích bình)và 1lít (thể tích môi trường) để làm mẫu đối chứng Tất cả các thí nghiệm đều được theodõi và tiến hành lấy số liệu sau 6 tuần nuôi cấy Kết quả thu nhận phôi và PLB thôngqua các chỉ số sau: Trọng lượng tươi, hệ số tăng sinh, tỉ lệ sống, số lượng, đường kínhcủa phôi và PLB được hình thành

Xử lý số liệu

Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, kết quả thí nghiệm được phân tích bằngDuncan, s test ( Ducan, 1995) với α = 0,05

2.5 Kết quả các thí nghiệm

2.5.1 Nhân giống Hồ Điệp lai từ trục phát hoa [4]

Hai tuần sau, các chồi nguyên vẹn phồng lên và phát triển thành tước, trong khicác chồi bị chấn thương đã phát triển thành mô sẹo Từ 6-8 tuần người ta có thể quansát thấy các chồi bất định nhỏ màu xanh, trên mô sẹo Kết quả thấy rằng mặt cắtnghiêng 2/3 chồi và đâm dọc chồi được coi là phương pháp tốt nhất Mặc dù phần lớnchồi phát sinh bất định từ mô sẹo, vẫn có một ít phát sinh không bất định từ các chồibên còn lại trên mặt chấn thương

Sau 10 tuần lễ các chồi bất định vừa đủ lớn thì không lấy ra được, biểu hiện lúccác lá hình thành chồi đạt được chiều dài 5-10 mm và rễ bắt đầu xuất hiện Cây conđược lấy ra trong điều kiện vô trùng, được trồng trên môi trường Knudson C và xử lýnhư cây con trồng hạt Khi cây con được lấy ra, các chồi khác vẫn được hình thành vàphát triển.Tuy nhiên, nếu để một số lượng quá nhiều trên một mắt thì các chồi lớn cảntrở sự phát triển các chồi nhỏ Để đảm bảo các chồi phát triển liên tục ta cấy chuyềncác khúc mắt lúc đầu sang môi trường mới khi các chồi đựơc lấy ra hoặc khi môitrường khô và cạn chất dinh dưỡng

Hình 4: Sự hình thành chồi sinh dưỡng từ phát hoa.[6]