NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN hóa học, KHẢO sát HOẠT TÍNH SINH học PHÂN đoạn KHÔNG PHÂN cực cây tắc kè đá DRYNARIA BONII CHRIST họ RÁNG (POLYPODIACEAE)

Phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn không phân cực của thân rễ cây Tắc kè đá.. Thử hoạt tính chống oxi hóa và kháng vi sinh vật kiểm định của các h

BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ

NỘI DUNG TRÌNH BÀY

MỤC TIÊU

1 Phân lập, xác định cấu trúc hóa học các hợp

chất tinh khiết từ phân đoạn không phân cực của thân rễ cây Tắc kè đá.

2 Thử hoạt tính chống oxi hóa và kháng vi sinh

vật kiểm định của các hợp chất phân lập được.

3

PHẦN TỔNG QUAN

4

Tên khoa học: Drynaria bonii Christ

Thuộc họ Ráng (Polypodiacea)

Tên Việt Nam: tắc kè đá, ráng đuôi phụng, tổ rồng,

1 ĐẶC ĐIỂM CÂY TẮC KÈ ĐÁ

5

1 ĐẶC ĐIỂM CÂY TẮC KÈ ĐÁ

Tắc kè đá sống phụ sinh trên các cây gỗ hay trên đá Thân rễ tựa củ gừng, mọc bò dài, mọng nước, phủ đầy lông màu vàng nâu Lá có 2 loại:

lá bất thụ hứng mùn hình trái xoan, màu nâu, rộng 10 cm, gần như ôm

nguyên lấy thân; loại còn lại lá hữu thụ có phiến màu xanh, dài 25-45 cm

xẻ thùy sâu thành 3-7 cặp thùy lông chim, cuống lá dài 10-20 cm Các ổ

Theo đông y Tắc kè đá có các tác dụng:

- Chắc răng, bổ thận, đồng thời có tác dụng hoạt huyết hành ứ

- Trị tổn thương do té ngã, gãy xương, đau nhức gân cốt lưng, gối, thận hư, ù tai.

2 CÔNG DỤNG CÂY TẮC KÈ ĐÁ

7

Một số nhóm hợp chất chính có trong các cây cùng chi:

- Flavonoid: quercetin, epiafzelechin , naringin,

kaempferol 3-O-α- L -rhamnosyl-7-O-- D -glucoside

- Chromone glycoside :

3 THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Năm 1992 Lii SQ và cộng sự tại Đại học Dược Trung Quốc đã

phân lập được (-)-epiafzelechin-3-O-β-allopyranoside (1) ;

4-O-β-D-allopyranosyl caffeat (2) ; sitosterol-3-β-D-glucopyranoside từ toàn cây

Drynaria propinqua.

O HO

OH H H

O H

OH

H

H

OH H

OH H

OH HO

HO

(2)

3.1 Cây Drynaria propinqua

9

•Năm 2001, N Ramesh và cộng sự đã phân lập từ rễ khô được 6

hợp chất: friedelin (3), epifriedelinol (4), β-amyrin (5), β-sitosterol (6), sitosterol-3-β-D-glucopyranoside (7) và naringin (8) Dịch chiết

MeOH có khả năng ức chế 10 chủng vi khuẩn

H 3 C CH 3

CH 3

CH 3

CH 3 H

CH 3 H

H

H

H H

O O

OH

7

O OH

OH OH

O

O OH

HO

O OH

•Năm 2007, Khan A đã phân lập được acid protocatechuic (9) và

acetyl lupeol (10) từ loài D quercifolia.

COOH

OH OH

• Năm 2003, Chang EJ đã phân lập từ dịch chiết MeOH rễ cây Bổ

cốt toái 8 hợp chất flavonoid: epiafzelechin (11); β-D-allopyranoside (12); epiafzelechin-3-O-(6"-O-acetyl)-β-D-

epiafzelechin-3-O-allopyranoside (13); 4β-carboxymethyl-(-)-epiafzelechin methyl ester (14); 4β-carboxymethyl-(-)-epiafzelechin (15); naringin; epiafzelechin-(4β->8)-4β-carboxymethylepiafzelechin methyl ester

(16) và (-)-epiafzelechin-(4β >8, 2β ->O->7)-epiafzelechin

-(4β >8)-epiafzelechin (17) Trong đó một số flavonoid có hoạt tính

phytoestrogen, ứng dụng trong việc điều trị chứng loãng xương ở phụ nữ mãn kinh

3.3 Cây Drynaria fortunei (Bổ cốt toái)

12

OH

OH HO

OH

11

O HO

OH

OH

O

H OH

OH H H

H

HO H O

OH

12

O HO

OH

OH

O

H OH

OH H H

H

HO H

O C O

H 3 C O

13 O

OH

OH OH

HO

CH 2 COOCH 3 14

O

OH

OH OH

HO

O

OH

OH OH

HO

COOCH 3

4

2 3 1

1

8 7 6 5

2 3 4 5

6 7 8

16

O

OH

OH OH

O

O

OH

OH OH

•Năm 2008, Xin-Luan Wang đã phân lập 11 flavonoid từ loài D.fortunei trong

đó có hai chất mới: kaempferol

3-O--D-glucopyranoside-7-O-α-L-arabinofuranoside (24) và

(2R)-5,7,3',5'-tetrahydroxyflavanone-7-O-neohesperidoside (20), cùng 9 hợp chất đã biết: naringin; narigenin

-7-O--D-glucoside (19); (2S)-5,7,3',5'-tetrahydroxyflavanone-7-O--D-glucopyranoside (21); kaempferol 3-O-α-L-rhamnosyl-7-O--D-glucoside (25); luteolin-7-O--D-

OH

OH

Tetrahydroxyflavanon

(2R)-5,7,3′,5′-7-O-neohesperidoside

R = neohesperidosyl

14

•Năm 2010 Yong-hong Liang và các cộng sự đã tách được 6

triterpenoid trong đó có 1 chất mới là chiratone được tách ra từ cao petroleum ether

H OH

H H

O 1

2

3 4 5

6 7 8

9 10

11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21

22

23 24

25 26

27 28

29 30

O

OH O

1 4

12

12-O-caffeoyl-12-hydroxydodecanoic acid

O OH

OH HO

OH

OCH 3

2,2′,4′,6′-tetrahydroxychalcone

3′-Lavandulyl-4-methoxy-15

•Năm 2009 Phạm Thị Nhật Trinh và cộng sự đã tách được 10 hợp chất Trong đó có một chất mới là fortunamide.

OH

NH 2

O O

H HO

H HO

H

H OH

OH

Fortunamide

16

PHẦN THỰC NGHIỆM

17

18

2 PHƯƠNG PHÁP

Phương pháp cô lập

Sử dụng sắc ký cột silica gel pha thường, pha đảo Rp 18, sắc ký cột Sephadex LH 20 kết hợp với kỹ thuật sắc ký lớp mỏng.

Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4/EtOH hay FeCl3/EtOH.

19

Phương pháp xác định cấu trúc

•Phổ khối lượng phun mù điện tử (ESI-MS) đo trên máy AGILENT 1100 LC-MSD Trap.

NMR ESI-MS

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer

20

Phương pháp thử hoạt tính sinh học

- Hoạt tính chống oxi hóa được thử nghiệm theo phương pháp DPPH.

- Hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định được thử nghiệm theo phương pháp Vander Bergher và Vlietinck (1991) tại phòng sinh học thực nghiệm, Viện hóa học các hợp chất thiên nhiên, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội, Việt Nam

21

3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM

Cao n-C6H14 Cao CHCl3 Cao EtOAc Cao MeOH

Cao EtOH Bột cây tắc kè đá

Cao H1 Cao H2 Cao H3 Cao H4 Cao H5

SKC silica gel, thu được 5 phân đoạn

DBH2 (7 mg)

DBH1 (5 mg)

DBH4 (6 mg)

DBH3 (12 mg)

3 QUY TRÌNH THỰC NGHIỆM (tt)

Cao C6

Cao CHCl3

Cao C1 Cao C2 Cao C3 Cao C4 Cao C5

SKC silica gel, thu được 6 phân đoạn

SKC silica gel, thu

được 4 phân đoạn

DBC1 (9 mg)

DBC2 (5 mg)

SKC silica gel, thu được 5 phân đoạn

23

KẾT QUẢ

&

THẢO LUẬN

24

PHỔ 1H-NMR HỢP CHẤT DBH1

-OH kiềm nối

3H(s )

OH O OH

O

CH 3

1 3

2 4 5

28

2 4 5

6

7 8 9

10

9a 8a 4a 10a

C-carbonyl

9 10

29

4 5

CH3

30

32

PHỔ HMBC (ex) HỢP CHẤT DBH1

H4

C9a

C2 C10

H2 C4

33

Tóm lại, dựa vào các kết quả phổ

cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc

trưng vật lý kết hợp so sánh với tài

liệu đã công bố [26], chúng tôi xác

2 4 5

6

10

9a 8a

4a 10a

34

6' 7' 8' 9'

10' 11'

12' 13'

12'a 2

3

4 5

6

7 8

8a 8b

-Tinh thể hình kim màu trắng ngà, tan tốt trong CHCl3

và acetone Nhiệt độ nóng chảy 182-184°C

-Rf = 0,65 (H:EA = 7:1).

3 Nhận danh cấu trúc DBH3

37

11 12 13

14

15 16 17

4 Nhận danh cấu trúc DBH4

-Tinh thể hình kim màu trắng ngà, tan tốt trong CHCl3

và acetone Nhiệt độ nóng chảy 124-125°C

- Rf = 0,65 (H:EA = 7:1).

39

Dựa vào các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, các đặc trưng vật lý và so sánh với tài liệu đã công bố [17], chúng tôi đã xác định DBH4

là cyclolaudenol.

Tóm lại: DBH4 → Cyclolaudenol

H HO

1 2 3

4 5 6 7

8

9 10

11 12 13

14 15 16 17

7 8 9

10

1' 2' 3'

4' 5' 6'

4H vòng benzen

18H của 6 nhóm

-OCH3

42

7 8 9

10

1' 2' 3'

4' 5' 6'

C-carbonyl

14C vòng benzen

6C mang oxygen

44

7 8 9

10

1' 2' 3'

4' 5' 6'

A

B C

PHỔ HMBC (ex) HỢP CHẤT DBC2

7-OCH3C7

4′-OCH3

C4′

3′-OCH3 C3′

48

Tóm lại: DBC2 → Nobiletin

D ựa vào các phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân và các đặc trưng vật lý kết hợp với so sánh tài liệu [39], chúng tôi đã xác định được hợp chất DBC2 là 5,6,7,8,3',4'-hexamethoxyflavone (nobiletin).

Đây là lần đầu tiên

nobiletin được cô lập từ

6

7 8 9

10

1' 2' 3'

4' 5' 6'

49

7 KẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH

KHÁNG KHUẨN

Kết luận:

Hợp chất DBH1 biểu hiện hoạt tính kháng vi khuẩn E.coli

Hợp chất DBH3 biểu hiện hoạt tính kháng vi khuẩn P.aeruginosa Hợp chất DBC2 biểu hiện hoạt tính kháng vi khuẩn A.niger

51

KẾT LUẬN

&

KIẾN NGHỊ

52

Đã cô lập và nhận danh cấu trúc 5 hợp chất:

2 3 4 5 6

7 8 9 10

1' 2' 3' 4' 5' 6'

8 9 10

11 12 13 14

15 16 17

18 19

20

21

22 23 24 25

26 27

11 12 13 14 15

16 17

6' 7' 8' 9'

10' 11'

12' 13'

12'a 2

3 4 5 6

7 8 8a 8b

4a 7a

Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn:

H ợp chất DBH1 biểu hiện hoạt tính kháng

KIẾN NGHỊ

Tiếp tục nhận danh hợp chất DBC1.

Thử hoạt tính gây độc tế bào và hoạt tính chống loãng xương

Tiếp tục khảo sát các loài thực vật khác

thuộc chi Drynaria ở Việt Nam ít hoặc chưa được khảo sát như: Drynaria sinica A,

Drynaria sinica B, Drynaria descensa,…

55