NGHIÊN cứu TỔNG hợp một số dẫn XUẤT của QUERCETIN, xác ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG nấm, KHÁNG KHUẨN của CHÚNG

Luận văn thạc sĩNGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN XUẤT CỦA QUERCETIN, XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN CỦA CHÚNG... Tuy nhiên, hiện nay người ta đang quan tâm nhiều đến việc tổng

Luận văn thạc sĩ

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT

SỐ DẪN XUẤT CỦA QUERCETIN, XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG

KHUẨN CỦA CHÚNG

•Học viên :

HOÀNG THỊ KIM DUNG

Cán bộ hướng dẫn :

TS NGUYỄN CỬU KHOA Chuyên ngành :

CÔNG NGHỆ HÓA HỮU CƠ

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Quercetin

Quercetin

kháng khuẩn của Quercetin và các dẫn xuất của nó

loại bệnh khác nhau  

Tuy nhiên, hiện nay người ta đang quan tâm nhiều đến việc tổng hợp ra các dẫn xuất của Quercetin vì một số dẫn xuất tổng hợp được

đã chứng tỏ hoạt tính mạnh so với Quercetin. 

Vì vậy, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài này để tổng hợp một vài dẫn xuất của Quercetin, xét nghiệm tính kháng nấm,kháng khuẩn của

chúng, từ đó có thể làm nền tảng để thực hiện những bước tổng hợp các dẫn

xuất khác tiếp theo trong những nghiên cứu sâu hơn sau này

Quercetin là một hợp chất phenol được tìm thấy trong nhiều loài cây thiên nhiên, trong nhiều sản phẩm thực phẩm, các loại thuốc nhuộm tự nhiên…

 Quá trình trích chiết lâu dài và kém hiệu quả

 Phương pháp khác hiệu quả hơn ?

 Phương pháp tổng hợp Quercetin cũng từ nguồn nguyên liệu thiên nhiên, đó là phương pháp thủy phân Rutin có trong nụ hòe Việt Nam

Lựa chọn nguyên liệu

(nụ hòe)

Xử lý nguyên liệu

Chiết tách Rutin

Tinh chế Rutin

Thủy phân Rutin thành Quercetin

Tinh chế Quercetin

Khảo sát quá trình tổng hợp

Pentaacetyl Quercetin Khảo sát quá trình tổng hợp

Zn-quercetin

Tinh chế sản phẩm Tinh chế sản phẩm

Xác định tính chất của sản

phẩm

Định tính, định lượng

Xác định cấu trúc

Hoạt tính sinh học

Sơ đồ 1 : Sơ đồ nghiên cứu

LỰA CHỌN, XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU:

Sơ đồ 2 : Xử lý nguyên liệu

Nụ hòe

Loại tạp (cành, hoa, đất…)

Sấy khô (50-60 o C)

Nghiền mịn

Nụ hòe dạng

bột

I- RUTIN:

        Công thức phân tử : C 27H30O16

 Khối lượng phân tử : M = 610,51

 Công thức cấu tạo:

O

O OH

O OH

1 2

3 4 5

6

7

8 9

Ứng dụng của rutin hiện nay tại việt nam:

 Nhuộm giấy, vàng mã…

 Sử dụng trong nhuộm màu thực phẩm

 Trong dược phẩm thì dùng để bao màu thuốc viên, dùng cho bệnh nhân cao huyết áp Rutin được chế thành thuốc viên, mỗi viên có 0,02g, ngày uống 3 lần, mỗi lần 1 hoặc 2 viên ( 0,06-0,12g/ngày )

 Chưa có các chất đi từ Rutin được sản xuất trên thị trường Việt Nam

Chiết tách rutin:

Rutin là một hợp chất có thể tan được trong nhiều dung môi:

Điều kiện tiến hành :

+ Thời gian chiết : 75 phút+ Nhiệt độ chiết : 75oC+ Dung môi : dung dịch NaOH 0,15%

+ Tỷ lệ chiết : 1 : 20 ( gam nguyên liệu : ml dung môi )+ Quá trình chiết được khuấy liên tục

Tinh chế và định lượng Rutin :

  - Rutin được tinh chế bằng ethanol

- Phương pháp tiến hành định lượng :

Mẫu Rutin được tinh chế nhiều lần bằng ethanol được dùng như Rutin chuẩn Rutin chuẩn được pha thành nhiều nồng độ khác nhau và xây dựng phương trình đường chuẩn thể hiện mối liên hệ giữa độ hấp thu A và nồng độ của dung dịch

Đồ thị 1: Đường chuẩn độ hấp thu A theo nồng độ của dung dịch Rutin

chuẩn tại 258 nm

y = 0.009x + 0.1839

R2 = 0.9901

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Nhận danh Rutin:

-         Dạng: bột mịn

-         Màu sắc: màu vàng nhạt có ánh xanh

-         Sắc ký lớp mỏng trên loại bản mỏng PolygramRSil G 40x80mm của hãng Macherey-Nagel, Đức với dung môi khai triển: n-butanol:acid acetic:H2O = 4:1:5 ( lấy phần trên ): cho một vệt màu vàng nâu(Rf = 0,57)

-         Nhiệt độ nóng chảy (To

nc) : 189  192oC

-         Phổ UV-Vis (methanol): có hai mũi cực đại tại:

+  = 258nm +  = 352nm

Phổ IR (KBr) cho kết quả: 3395; 2895; 1644; 1591; 1494; 1282 1352; 1195 1228cm-

-II- QUERCETIN:

 Công thức phân tử : C15H10O7

 Khối lượng phân tử : M = 302,23

 Công thức cấu tạo :

OH

1 2

3 4

5 6

Hình 2: Công thức cấu tạo của Quercetin

Hoạt tính và ứng dụng của Quercetin:

1) Trong dược phẩm và y tế:

-   Quercetin làm giảm nguy cơ ung thư

-   Quercetin giúp ngăn ngừa bệnh tim

- Là chất chống oxy hóa và đồng thời cũng là chất tăng cường sự oxy hóa

-   Hoạt tính kháng viêm, kháng virus

-  Một số nghiên cứu mới đây cho thấy Quercetin và một số dẫn xuất của nó

có khả năng ứng dụng trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh suy thoái

tìm kiếm các tác nhân chống ung thư hiệu quả nhất và đã đạt được một số kết

quả khả quan

 Các kết quả tương tự có thể đạt được trong quá trình phát triển các tác nhân chống tích tụ các tiểu huyết cầu, kháng virus, kháng viêm…dựa trên nền tảng của Quercetin

Phản ứng điều chế từ Rutin:

Tổng hợp quercetin:

Điều kiện tiến hành :

+ Thời gian: 90 phút+ Nhiệt độ : nhiệt độ sôi của dung dịch+ Dung môi : dung dịch H2SO4 2%

+ Tỷ lệ : 1 : 50 ( gam nguyên liệu : ml dung môi )

+ Quá trình thủy phân được khuấy liên tục.

Quy trình tổng hợp:

Dịch lọc

Quercetin thô

Tinh chế và định lượng Quercetin:

 Tinh chế Quercetin bằng ethanol

 Cách thực hiện quá trình định lượng tương tự như

Rutin

Đồ thị 2 : Đường chuẩn độ hấp thu A theo nồng độ của dung dịch chuẩn tại 255 nm

y = 0.0166x + 0.6313

R 2 = 0.989 0

0.5 1 1.5 2

Nhận danh Quercetin:

Sắc ký lớp mỏng, To

nc, UV-Vis:

-         Dạng : bột mịn

-         Màu sắc: màu vàng chói

-         Nhiệt độ nóng chảy (To

nc) : không xác định được, tới 300oC vẫn chưa chảy

-         Sắc ký lớp mỏng: cho một vệt màu vàng sáng (Rf = 0,77)

-         Phổ UV-Vis (methanol): có hai mũi cực đại tại:

+  = 255nm +  = 374nm

Phân tích nguyên tố:

Phoå IR cuûa Quercetin:

Khoái phoå cuûa Quercetin:

NMR của Quercetin:

Kết quả phân tích bằng NMR như sau:

  Bảng 2: 1 H-NMR của Quercetin trong CDCl 3

Vị trí proton Độ dịch chuyển hóa học

(, ppm)

H-6 H-8 H-5' H-6' H-2' -OH

6,17 (1H, d, J=1,95Hz) 6,40 (1H, d, J=1,95Hz) 6,86 (1H, d, J=8,5Hz) 7,55 (1H, dd, J=2,1 và 8,5Hz) 7,67 (1H, dd, J=2,1Hz)

9,32 (1H, s) 9,37 (1H,s) 9,61 (1H,s) 10,79 (1H,s) 12,49 (H,s)

Bảng 3:Kết quả phổ 13 C-NMR và DEPT của Quercetin

Vị trí

cacbon Loại cacbon Phổ

13C-NMR (, ppm) Phổ DEPT của Quercetin

C tứ cấp C-H

C tứ cấp

C tứ cấp

C tứ cấp C-H

C tứ cấp

C tứ cấp C-H C-H

145,43 122,45 176,22 156,56 98,62 164,28 93,79 161,13 113,45 136,16 115,53 148,06 147,15 116,05 120,43  

Triệt tiêu Triệt tiêu Triệt tiêu Triệt tiêu Mũi dương Triệt tiêu Mũi dương Triệt tiêu Triệt tiêu Triệt tiêu Mũi dương Triệt tiêu Triệt tiêu Mũi dương Mũi dương

gồm:

 Kết quả nhận được phù hợp với công thức của Quercetin:

OH

1

2

3 4

56

III- PENTAACETYL QUERCETIN:

 Công thức phân tử: C 25 H 20 O 12

 Khối lượng phân tử: M = 512

 Công thức cấu tạo:

5 6

7

8 9

O

O-C-CH3O

O-C-CH3O O

O

Ứng dụng:

học cho phép sử dụng trong điều trị bệnh ung thư ở người Khi thử nghiệm trên các dòng tế bào, thời gian chuyển hóa của sản phẩm dài hơn thời gian cần thiết để chuyển hóa Quercetin

gây nhiễm độc hệ gen

vị trí 7 do nhóm hydroxy ở vị trí này đặc biệt có hoạt tính Sản phẩm có tính chống oxy hóa mạnh hơn so với Quercetin, làm tăng khả năng tan của hợp chất trong dầu

thích hợp sử dụng làm các thuốc hỗ trợ trong y dược

Điều chế:

O HO

OH

OCOCH 3 OCOCH3(Ac) O / C H N

Khảo sát quá trình tổng hợp Quercetin thành Pentaacetyl Quercetin:

Khảo sát về thời gian phản ứng:

- Khối lượng nguyên liệu: 0.0600g Quercetin

- Lượng dung môi tham gia phản ứng: 1 ml pyridin

- Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ thường (300C)

- Lượng (CH3CO)2O : 0.15 ml

Đồ thị 3: Biểu diễn khối lượng sản phẩm theo thời gian phản ứng

0.06 0.065 0.07 0.075 0.08 0.085 0.09

Khảo sát về lượng dung môi tham gia phản ứng:

-         Khối lượng nguyên liệu: 0.0600g Quercetin

-         Thời gian phản ứng: 16 giờ

-         Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ thường (300C)

Khảo sát về nhiệt độ phản ứng:

-         Khối lượng nguyên liệu: 0.0600g Quercetin

-         Thời gian phản ứng: 10 giờ

-         Lượng (CH3CO)2O : 0.15 ml

-         Lượng dung môi: 1,2ml pyridin

Đồ thị 5: Biểu diễn khối lượng sản phẩm theo nhiệt độ phản ứng

0.068 0.072 0.076 0.08 0.084 0.088

Kết luận:

Dựa trên các kết quả khảo sát phản ứng ở trên, ta có thể chọn điều kiện tối ưu cho phản ứng acetyl hóa Quercetin như sau:

-         Khối lượng nguyên liệu: 0.0600g Quercetin

-         Thời gian phản ứng: 16 giờ

-         Lượng (CH3CO)2O : 0.15 ml

-         Lượng dung môi: 1,2ml pyridin

-         Nhiệt độ phản ứng : 30oC

-         Lượng sản phẩm : 0.0850g Pentaacetyl Quercetin (83.59%)

Tinh chế và định lượng Pentaacetyl Quercetin:

 Pentaacetyl Quercetin thu được đem tinh chế và kết tinh nhiều

lần trong hỗn hợp acetone + ethanol

 Định lượng thực hiện tương tự như quá trình định lượng Rutin

Đồ thị 6: Đường chuẩn độ hấp thu A theo nồng độ của dung dịch chuẩn tại 254 nm

y = 0.0259x + 0.0261

R 2 = 0.9983 0

0.5 1 1.5 2 2.5

Nhận danh Pentaacetyl Quercetin:

Sắc ký lớp mỏng, T o

nc , UV-Vis:

- Dạng : tinh thể hình kim

- Màu sắc: không màu

- Nhiệt độ nóng chảy (To

nc) : 194 197oC

- Sắc ký lớp mỏng : cho một vết dưới ánh sáng tử ngoại (Rf = 0,63)

- Phổ UV-Vis (methanol): có hai mũi cực đại tại:

+  = 254nm +  = 308nm

Phân tích nguyên tố:

Phoå IR cuûa Pentaacetyl Quercetin:

Khoái phoå cuûa Pentaacetyl Quercetin:

NMR của Pentaacetyl Quercetin:

Bảng 5: 1 H-NMR của Pentaacetyl Quercetin trong CDCl 3

Vị trí proton Độ dịch chuyển hóa học (d, ppm)

H-6 H-8 H-5' H-6' H-2' -CH3(5xOAc)

6,87 (1H, d, J=1,94Hz) 7,33 (1H, d, J=1,94Hz) 7,37 (1H, d, J=8Hz) 7,69 (1H, dd, J=2 và 8Hz) 7,73 (1H, dd, J=2Hz) 2,33 (x6H, s)

2,34 (x6H,s) 2,43 (x3H,s)

- Phổ 1H-NMR cho thấy có 5 nguyên tử H ở các vị trí H2', H6', H5', H8 và H6đặc trưng C-H của vòng thơm A, B và 15 nguyên tử H của 5 nhóm –CH trong

C tứ cấp C-H

C tứ cấp

C tứ cấp

C tứ cấp C-H

C tứ cấp

C tứ cấp C-H C-H -CH3     

C tứ cấp C=O

142,03 114,53 169,89 153,54 113,76 156,64 108,89 154,12 123,65 133,84 123,79 150,16 144,24 126,25 127,49 20,33 20,46x2 20,85 20,95 167,64 167.71x3 169,10

Triệt tiêu Triệt tiêu Triệt tiêu Triệt tiêu Mũi dương Triệt tiêu Mũi dương Triệt tiêu Triệt tiêu Triệt tiêu Mũi dương Triệt tiêu Triệt tiêu Mũi dương Mũi dương Mũi dương Mũi dương Mũi dương Mũi dương  Triệt tiêu Triệt tiêu Triệt tiêu

-         Kết quả phổ 13C-NMR và phổ DEPT cho thấy phân tử có 25 cacbon, gồm:

+ 15 cacbon tứ cấp (có 1 nhóm C=O của vòng và 5 nhóm C=O của ester )

5 6

O

IV- Zn-QUERCETIN:

 Công thức phân tử : C15H8O7Zn

 Khối lượng phân tử : M = 365,23

 Công thức cấu tạo:

OH

1 2

3 4

5 6

7

8 9

Zn

Hình 4: Công thức cấu tạo của Zn-Quercetin

Ứng dụng:

Có hoạt tính chống tăng sinh bằng hoặc hơn quercetin, có độ bền về mặt hóa học và dược học cho phép sử dụng trong điều trị bệnh ung thư ở người Khi thử nghiệm trên các dòng tế bào, thời gian chuyển hóa của sản phẩm dài hơn thời gian cần thiết để chuyển hóa quercetin

2 3

Quercetin

Zn

Zn(CH COO)

Zn-quercetin

Khảo sát quá trình tổng hợp Quercetin thành Zn-Quercetin:

Khảo sát về thời gian phản ứng:

-         Khối lượng nguyên liệu: 0.0420g

Quercetin

-         Dung môi: 20 ml ethanol

-         Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ thường (300C)

-         Tỷ lệ Quercetin : Zn(CH3COO)2 : 1:1 (mol)

Đồ thị 7: Biểu diễn khối lượng sản phẩm theo thời gian phản ứng

0.020.0250.030.0350.04

Khảo sát về lượng dung môi tham gia phản ứng:

  Khối lượng nguyên liệu: 0.0420g Quercetin

- Thời gian phản ứng: 60 phút

- Nhiệt độ phản ứng: nhiệt độ thường (300C)

- Tỷ lệ Quercetin : Zn(CH3COO)2 : 1:1 (mol)

Đồ thị 8: Biểu diễn khối lượng sản phẩm theo lượng dung môi tham gia

phản ứng

0.02 0.025 0.03 0.035 0.04

Khảo sát về nhiệt độ phản ứng:

-         Khối lượng nguyên liệu: 0.0420g

Quercetin

-         Thời gian phản ứng: 60 phút

-         Lượng dung môi: 20 ml ethanol

-         Tỷ lệ Quercetin : Zn(CH3COO)2 : 1:1

(mol)

0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 0.045

Kết luận:

Dựa trên các kết quả khảo sát phản ứng ở trên, ta có thể chọn điều kiện tối ưu cho phản ứng tạo Zn-Quercetin như sau:

-         Khối lượng nguyên liệu: 0.0420g Quercetin

-         Thời gian phản ứng: 60 phút

-         Lượng (CH3COO)2Zn : 0.15 ml

-         Lượng dung môi: 20 ml ethanol

-         Tỷ lệ Quercetin : Zn(CH3COO)2 : 1:1 (mol)

-         Nhiệt độ phản ứng : 30oC

-         Lượng sản phẩm : 0.0384g Zn-Quercetin (75,74%)

Nhận danh Zn-Quercetin:

Sắc ký lớp mỏng, T o

nc , UV-Vis:

-         Dạng : bột mịn

-         Màu sắc: màu vàng cam

-         Nhiệt độ nóng chảy (To

nc) : không xác định được

-         Sắc ký lớp mỏng: cho một vết dưới ánh sáng tử ngoại (Rf =

0,61)

-         Phổ UV-Vis (methanol + dung dịch đệm urotropin):

có hai mũi cực đại tại:

+  = 264nm +  = 422nm

Phân tích nguyên tố:

Phoå IR cuûa Zn-Quercetin:

Khoái phoå cuûa Zn-Quercetin:

 Kết quả nhận được phù hợp với công thức Zn-Quercetin:

OH

1 2

3 4

5 6

Zn

V- XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH KHÁNG NẤM, KHÁNG KHUẨN:

Phương pháp xác định: phương pháp đục lỗ trong môi trường thạch

Bảng 8: Kết quả xác định tính kháng nấm, kháng khuẩn

6 6 6 9 6

6 6 6 10 6

10 16 9 11 9  

Hình 30: Zn-Quercetin thử trên chủng Bacillus subtilis

Hình 32: Zn-Quercetin thử trên chủng Enterococcus faecalis

Hình 36: Rutin thử trên chủng Staphylococcus aureus

Hình 38: Rutin thử trên chủng Aspergillus oryzae

KẾT LUẬN

1 Lần đầu tiên tại Việt Nam, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu về phức của Quercetin với kim loại (Zn), tổng hợp và xác định cấu trúc cũng như hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn của phức này một cách có hệ thống và khoa học

2 Tách chiết được Rutin, từ đó tiến hành thủy phân ra Quercetin Quá trình này được thực hiện với hiệu suất cao, sản phẩm tương đối tinh khiết

3 Xác định được điều kiện tối ưu để tổng hợp Pentaacetyl Quercetin

4 Xác định được điều kiện tối ưu để tổng hợp Zn-Quercetin

5 Bằng các phương pháp phân tích hóa lý hiện đại như đo nhiệt độ nóng chảy,

UV, IR, phân tích nguyên tố, MS, 1H-NMR, 13C-NMR chúng tôi đã xác định được cấu trúc của các sản phẩm tổng hợp

6 Kết quả xác định hoạt tính kháng nấm, kháng khuẩn cho thấy: Zn-Quercetin có hoạt tính mạnh cao hơn rất nhiều so với Quercetin và Rutin cũng như Pentaacetyl Quercetin

Kết quả này cho thấy khả năng ứng dụng khá lớn của các sản phẩm này mà đặc biệt là Zn-Quercetin do đa số các chủng vi khuẩn, nấm thử nghiệm là những chủng độc và kháng với nhiều loại kháng sinh, do đó có thể nghiên cứu các chất này để đưa vào sử dụng

Đồng thời với kết quả này chúng ta có thể phát triển tiếp tục để mở ra một hướng đi mới trong việc tổng hợp các hợp chất có tác động kép trong phòng chống các bệnh nan y: sử dụng một nguồn tài nguyên có sẵn, rất phong phú và đa

Các kiến nghị cho những nghiên cứu tiếp theo:

1 Tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thêm một số dẫn xuất khác từ Quercetin cũng như từ một vài flavonoid khác ( chú ý đến việc tạo phức với Se, Pt… )

2 Thử nghiệm thêm trên các chủng vi khuẩn, vi nấm khác để có được một cách nhìn tổng quát hơn về hoạt tính của các sản phẩm

3 Thử tác dụng độc trên các loài động vật như chuột, thỏ,…

4 Đặc biệt, tiến hành nghiên cứu tác dụng của các chất này trên các dòng tế bào ung thư

Với việc đề nghị một số nghiên cứu tiếp theo đề tài này, chúng tôi hy vọng có thể góp phần tạo ra các sản phẩm có thể ứng dụng phục vụ trong ngành y tế, thú

y cũng như trong bảo quản thực phẩm ở nước ta