NGHIÊN cứu TỔNG hộp một số dẫn CHẤT có tác DỤNG SINH học từ cây HOA hòe TRỒNG tại VIỆT NAM

TỔNG QUAN Tính chất dược lý của flavonoid:Flavonoid flavone, isoflavone, flavanone, flavonol Kháng oxy hóa Tác nhân chống ung thư Kháng khuẩn, kháng nấm Chống dị ứngBảo vệ gan ức ch ế tạ

THUY T MINH ẾT MINH ĐỀ T ĐỀ T ÀI: T

CHƯƠNG TRÌNH VƯỜN ƯƠM SÁNG TẠO KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP MỘT SỐ DẪN CHẤT CÓ TÁC DỤNG SINH

HỌC TỪ CÂY HOA HÒE TRỒNG TẠI

VIỆT NAM

Chủ nhiệm đề tài: Th.S HOÀNG THỊ KIM DUNG

Cơ quan chủ trì: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA

HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRẺ

- Mỹ phẩm

- Dược phẩm

Sử dụng trong:-Thực phẩm

- Mỹ phẩm

- Dược phẩm Nhu cầu của xã hội

Các flavonoid tự nhiên, flavonoid tổng hợp và các dẫn xuất có tác dụng mạnh

hơn, ít độc hơn ?

MỞ ĐẦU

TỔNG QUAN

Flavonoid: khoảng 4.000 chất đã được xác định trong tự

nhiên

Hoa: anthocyanine,

flavonol, flavanone, flavone, chalcone,

aurone

Vỏ quả: naringin, hesperidin (họ Cam)

HạtLá

Gỗ, rễ và vỏ cây

Rượu vang đỏ, trà, cà

phê,…

TỔNG QUAN

Dự đoán con người tiêu thụ

khoảng vài trăm mg flavonoid

với con người

TỔNG QUAN Tính chất dược lý của flavonoid:

Flavonoid (flavone, isoflavone, flavanone,

flavonol)

Kháng oxy hóa

Tác nhân chống ung thư

Kháng khuẩn, kháng nấm

Chống dị ứngBảo vệ gan

ức ch

ế tạo

chất trung

thư phổi

Flavonoid tổng hợp:

flavopiridol, phenoxodiol, silybin

TỔNG QUAN

Cơ chế kháng ung thư của flavonoid:

•Flavonoid là tác nhân ngăn ngừa về mặt hóa học

•Flavonoid ức chế sự phát triển hoặc sự tăng sinh của tế bào ung thư:

Một số flavonoid có thể gây độc tế bào ung thư và gây chết tế bào theo chương trình bằng cách biến đổi DNA

•Flavonoid là tác nhân chống lại sự xâm nhập, sự bám dính và sự phát triển mạch

•Các dẫn xuất flavonoid có tác dụng ngăn ngừa tác dụng phụ của các loại thuốc

trị ung thư khác (doxorubicin – bệnh tim).

Kháng viêmBền thành mạch máuGiảm nguy cơ bệnh tim Dưỡng da, chống tia UVChống ung thư

Thử lâm sàng: flavopiridol, aminoflavone, phenoxodiol, silybin

Năm 2007, để tăng khả năng di chuyển của quercetin qua màng tế bào, Lucia Biasutto đã tổng hợp một số dẫn xuất ester của quercetin

O O

OH OH HO

OH OH

O O

OH OH HO

O OH

O O

OH OH HO

O OH

O O

O O O

O

O OO

O O

O O O

O

O O

O Boc-HN-X

O O

O

O O

O O O

O

O O

O ClH.H2N-X

O O

O

(CH 3 CO) 2 O, pyridin

(CH 3 CO) 2 O, pyridin

Boc-NH-X-COOH EDC, DMAP, CH 2 Cl 2

TỔNG QUAN

Ở Việt Nam: flavonoid → kháng oxy hóa, kháng viêm, và một vài nghiên cứu rải rác

về gây độc tế bào, … (ĐH Y dược TP.HCM, Đại học Khoa học Tự nhiên TP.HCM)

TỔNG QUAN

XÁC ĐỊNH ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU:

Việt Nam (thảm thực vật đa

dạng, nguồn flavonoid trong

cây dồi dào)

Việt Nam (thảm thực vật đa

dạng, nguồn flavonoid trong

cây dồi dào)

Cây hòe: vùng nguyên

liệu lớn → flavonol

Cây hòe: vùng nguyên

liệu lớn → flavonol

Thuốc nhuộm, bài thuốc

dân gian, chiết rutin

Thuốc nhuộm, bài thuốc

dân gian, chiết rutin

Chọn đối tượng nghiên cứu:

RUTIN, QUERCETIN

Chọn đối tượng nghiên cứu:

Xác định cấu trúc, độ sạch: IR, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC

Xác định cấu trúc, độ sạch: IR, LC-MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC, HSQC

Xác định hoạt tính sinh học: kháng nấm, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, gây độc tế bào

Xác định hoạt tính sinh học: kháng nấm, kháng khuẩn, kháng oxy hóa, gây độc tế bào

MỤC TIÊU CỦA ĐỀ T TÀI

Tổng hợp các dẫn xuất của rutin, quercetin và xác định các hoạt tính kháng oxy hóa, kháng nấm, kháng khuẩn và khả năng gây độc tế bào ung thư của các hợp chất này

để từ đó làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo nhằm nâng cao ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của các flavonoid này

Mục đích tổng hợp các dẫn xuất để biến đổi cấu trúc của các chất ban đầu nhằm thay đổi tính chất lý hóa, từ đó sẽ làm thay đổi tác dụng sinh học của chất, tạo ra các sản phẩm có thể phù hợp hơn cho dược phẩm → các hợp chất có các hoạt tính sinh học tốt hơn.

Tổng hợp các dẫn xuất của các flavonoid:

Khi dựa vào một hợp chất tự nhiên làm cơ sở để thay đổi cấu trúc, ta có thể sử dụng các phương pháp:

 Đơn giản hóa công thức so với chất ban đầu

 Mở vòng hợp chất tự nhiên

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

giữ nguyên khung cấu trúc flavonoid

Phương pháp xác định hoạt tính sinh học:

2- Xác định khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp MDA (malonyl dialdehyde):

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

– MDA tạo thành do sự peroxy hóa lipid màng tế bào

HN N

H H

t0-2H2O

HN N

O

H MDA

Các chất chống oxy hóa sẽ ức chế quá trình peroxy hóa lipid màng tế bào, ngăn chặn

sự tạo thành MDA

3- Xác định khả năng kháng nấm, kháng khuẩn: phương pháp của Vanden Bergher và

Vlietlinck

4- Thử nghiệm khả năng gây độc tế bào theo phương pháp SRB (Sulforhodamine B)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính,

Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính

SRB là một thuốc nhuộm tích điện âm sẽ liên kết tĩnh điện được với các phần tích điện dương của protein Lượng thuốc nhuộm liên kết sẽ phản ánh lượng protein tổng của tế bào

Mật độ quang đo được của dung dịch tương quan với lượng protein tổng hay số lượng

tế bào Sự thay đổi lượng tế bào so với mẫu đối chứng phản ánh độc tính tế bào của chất thử

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

S¶n

phÈm R1 R2 R3 R4 R5 HiÖu

suÊt (%)

Q -H -H -H -H -H 71 Q-1 -CONHC4H9 -H -CONHC4H9 -CONHC4H9 -CONHC4H9 51,5

7 8 9 10 1'

2' 3'4' 5' 6'

C O

S

C O

S

C O

S C

O

S C

O S

O N C O O

N C O O

N C O O

N C O

1 Các dẫn xuất ester của quercetin (6):

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

Phổ 1H-NMR của Q-1 Phổ 1H-NMR của quercetin

OH O

1 23 4 5 6 7

8 9 10

O O

1' 2' 3' 4'5' 6'

C O

N CH2CH2CH2CH3 C

O H

N CH2CH2CH2CH3 H

C O

H

N CH2CH2CH2CH3

C O

OH O

1 23 4 5 6

7

8 9 10

OH OH

1' 2' 3' 4'5' 6'

Phổ 1H-NMR của Q

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

O O

OH O

1 23 4 5 6 7

8 9 10

O O 1'

2' 3' 4' 5' 6'

C O

N CH2CH2CH2CH3C

O H

N CH2CH2CH2CH3H

C O

H

N CH2CH2CH2CH3

C O

H N

H3CH2CH2CH2C

Phổ 13C-NMR của quercetin

O OH HO

OH O

1 23 4 5 6 7

8 9

10

OH OH

1' 2'

3' 4' 5' 6'

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

7 8 9 10 1'

2' 3'4' 5' 6'

Phản ứng SN2: - acetone: dung môi phân cực phi proton + hòa tan tốt các alkyl bromide và

sản phẩm tạo thành

- K2CO3: kiềm yếu

OH HO

OH O

1 2

3 4

1' 2' 3' 4'5' 6'

OH O

1 23 4 5

1' 2' 3' 4' 5' 6'

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

Phổ 1H-NMR của quercetin

O OH O

O O

1 23 4 5 6 7

8 9 10

O O

1' 2'

3' 4' 5' 6'

O OH O

O O

1 23 4 5 6 7

8 9

10

O O 1'

2'

3' 4' 5' 6'

OH O

1 23 4 5 6 7

8 9

10

OH OH

1' 2'

3' 4' 5' 6'

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

Phổ 13C-NMR của R-2

-CH3

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

3- Thử nghiệm khả năng kháng nấm, kháng khuẩn:

Mẫu

Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC: g/ml)

Vi khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men

E.coli P aeruginosa B subtilis S.aureus ASP.niger F

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

4.1- Khả năng đánh bắt gốc tự do DPPH:

4- Khả năng kháng oxy hóa:

- Quercetin có khả năng bắt DPPH rất cao (> 92%), tương đương với vitamin C (95%)

→ kết hợp nhóm 5-OH ở vòng A với nhóm 3-OH và 4-oxo ở vòng C và liên kết đôi 2,3.-Nhóm 3-OH bị khóa bởi gốc đường (R), hoạt tính giảm

- Q-11, Q-1, Q-4: còn 5-OH: mất hoạt tính

-So sánh Q-9, R-2, Q: 3-OH và liên kết đôi 2,3 là cấu trúc cơ bản bắt gốc tự do

Quercetin

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

4.2- Khả năng kháng oxy hóa theo phương pháp MDA:

Các hợp chất quercetin, rutin, R-2 thử so sánh với Trolox

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

5- Khả năng gây độc tế bào ung thư:

7.1- Các flavonol và dẫn xuất:

• Q-9 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào thấp hơn quercetin

• Ở Q-2 và Q-3 thì sự thay thế nhóm hydroxy bằng nhóm thiophene-2-carbonyloxy và benzoyloxy đã làm mất hoạt tính của quercetin

• Q-10 và Q-11 (10 g/ml) cho thấy có khả năng gây độc tế bào MCF-7

• So sánh R-2 và Q-9, khi nhóm 3-OH thay bằng nhóm methoxy thì hoạt tính gây độc tế bào tăng, đặc biệt ở dòng HeLa và NCI-H460

• Rutin không có hoạt tính

• Quercetin, Q-6, Q-5, Q-1 đều có hoạt tính gây độc trên các dòng tế bào

R-2

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

KẾT MINH ĐỀ TT QuẢ VÀ BÀN LuẬN

Mối tương quan giữa cấu trúc hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các flavonoid

STT Hợp chất LogP Trọng lượng phân tử

Bảng 4.38: Kết quả trọng lượng phân tử và tính toán logP

KẾT MINH ĐỀ TT LuẬn VÀ kiẾT MINH ĐỀ TN NGHỊ

2 Q-1 có khả năng mạnh nhất là kháng 6/8 dòng vi sinh vật thử nghiệm với nồng độ

ức chế tối thiểu (MIC) là 25; 50; 50; 50; 50; 50 g/ml, Q kháng được 2 dòng với MIC là 25; 25 g/ml, các hợp chất R, Q-2, Q-5 kháng được 1 dòng vi sinh vật với các giá trị MIC lần lượt là 12,5; 50; 50 g/ml, còn lại các hợp chất khác không có khả năng kháng nấm, kháng khuẩn

KẾT MINH ĐỀ TT LuẬn VÀ kiẾT MINH ĐỀ TN NGHỊ

3 Nghiên cứu về khả năng kháng oxy hóa của các hợp chất này cho thấy:

• Vị trí 3-OH và liên kết đôi 2,3 ở vòng C đóng vai trò cơ bản trong việc bắt các gốc tự do

• Ở vòng A, nhóm 7-OH đóng vai trò quan trọng hơn nhóm 5-OH về khả năng bắt các gốc tự do của các hợp chất

• Khi thay thế các nhóm OH bằng các nhóm –OCOR- hoặc –OR- đã làm mất khả năng cho điện tử do đó cũng làm mất khả năng bắt gốc tự do

4 Kết quả thử nghiệm khả năng gây độc tế bào cho những kết luận sau:

• Các hợp chất cồng kềnh, có khối lượng phân tử lớn, quá ưa béo hay quá ái nước (logP <

0 hay logP > 5) đều không có khả năng hoặc khả năng gây độc hại tế bào yếu

• Khi thay nhóm –OH bằng các nhóm ester sẽ có khuynh hướng làm tăng hoạt tính gây độc tế bào, và ngược lại các nhóm ether –OR- làm giảm hoạt tính gây độc tế bào

KẾT MINH ĐỀ TT LuẬn VÀ kiẾT MINH ĐỀ TN NGHỊ

KIẾN NGHỊ

• Cần tiếp tục nghiên cứu tổng hợp thêm các dẫn xuất mới trên cơ sở những kết luận

đã rút ra, đặc biệt cần chú ý đến việc thay thế nhóm 3-OH trong họ flavonoid bằng các nhóm có khả năng làm tăng hoạt tính gây độc tế bào

Nội dung:

quercetin

tổng hợp

các dẫn xuất trên 3 dòng HeLa,

- 1 bài tham gia Hội nghị Hóa hữu cơ toàn quốc 10/2007, 2 bài báo đăng trên tạp chí Dược liệu (4/2008 và 1/2009)

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN

SỰ QUAN TÂM THEO DÕI

CỦA HỘI ĐỒNG

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN

SỰ QUAN TÂM THEO DÕI

CỦA HỘI ĐỒNG