Nghiên cứu chiết xuất và tinh chế phospholipid từ hạt đậu nành bằng phương pháp c02 ở trạng thái siêu tới hạn

phospholid được chiết từ hạt đậu nành bằng C02 ở trạng thái siêu tới hạn thực nghiệm được tiến hành theo mô hình thực nghiệm trực giao bậc hai, ba yếu tố. Snả phẩm được phân tích bằng HPLC ELS có so sánh với sản phẩm chiết bằng dung môi hữu cơ

BO Y TE TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

LÊ THANH LOAN

NGHIÊN CỨU CHIET XUAT VA TINH CHE

PHOSPHOLIPID TU HAT DAU NANH BANG

PHUONG PHAP CO, O TRANG THAI SIEU TOI HAN

KHOA LUAN TOT NGHIEP DƯỢC SĨ KHOÁ 2004- 2009

Người hướng dâu : TS LƯU HOÀNG NGỌC

TS NGUYÊN THỊ LẬP Nơi thực hiện :; Phòng Hóa Thực Vật - Viện

Hóa học Công nghiệp Việt Nam Thời gian thực hiện : từ 10/2008 đến 5/2009

LOI CAM ON Trước hết, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Lưu Hoàng Ngọc, TS

Nguyễn Thị Lập - những người thây đã tận tình hướng dẫn đìu đắt và truyền đạt những kinh nghiệm cho em trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp

Em cũng xin trân trọng cảm ơn các thấy cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Hoá Sinh, trường Đại học Dược Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi để em có thê hoàn thành khoá luận của mình

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Nguyễn Ngọc Thanh, KS Nguyễn Mai Cương, Cứ nhân Lê Ngọc Thức và các cắn bộ công tác tại trưng tâm Hoá thực vật - Viện Hoá học công nghiệp - những người đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, hướng dẫn em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận

Em xin cảm ơn Ban giảm hiệu, Phòng đào tạo, các phòng bạn và bộ món

trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện cho em trong quá trình học tập tại trường và thực hiện khoá luận tốt nghiệp

Cuối cùng em xin phép được dành lời cảm ơn cho bố mẹ, anh em, bạn bè - những người đã luôn động viên khích lệ em trong học tập, trong cuộc sống và hết

lòng giúp đỡ đẻ em thực hiện khoá luận này

Hà Nội, tháng 5 năm 2009

Sinh viên

Lê Thanh Loan

MUC LUC

CAC KY HIEU VIET TAT

"b;à.` (.: Mu 1 PHÀN I: TÔNG QUAN, 2222222222222222222222222212122221222.cc.cccce 2

1.1 Phương pháp chiết bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn (SCO;) 2

1.1.1 Trang Giới đi (6ê ĐẠP «esoooeooesễseceseseseessooesoosesoooboooeooOSiSUEoSES2662622266,e66 2 1.1.2 Các đặc tính của CO; ở trạng thái siêu tới hạn .- 4

1.1.4 Một số ứng đụng chính . 2-52 s2 SssEeEEEsevvseerxkrrvsvee 5

1.2 Giới thiệu chung về đậu nành 2 2-22 252S2EE EU Sex e2 6

1.2.1 Đặc điểm thực vật + 2C EEkecExkEExecEEeEEAeEEervxerkssrved 6 L?9 Tinh Ha ROIRRG ————fÐÐEẰSỪ}=—_ 6

149 N2 h====—=——=—=————— 7 L5 Liên HN Hi ccnSŸEÏEeeeeceeeeeeeeeeeeeee======see===se=s==== 7

1.4 Téng quan vé phospholipid .0.0 0 000cc.cssssesssseessssessssuesssnnessneesssseennunsenncens 8

1.4.1 Giới thigu chung vé phospholipid .0 -.c0s-svesssseesssseeeeceeeeesneessneeee § 1.4.2 Vai trò và ứng đụng, 2-22 EV22919EE2211129222112222231 7222131 9

1.5 Công nghệ chiết xuất phospholipid từ hạt đậu nành -55- 10 1.5.1 Chiết xuất phospholipid bằng đung môi 5-5 se 10 1.5.2 Chiết xuất phospholipid bằng phương pháp SCO;, l3

A AN CR CNG iiss cies 31 2.4.1 Về lựa chọn nguyên liệu và phương pháp . 2e 31 2.4.2 Vé qua trinh chiét phospholipid .0.s00 sssecsseesssessssneeeoneeesneeeesneneees 31

2.4.3 Về tiềm năng ứng dụng của phospholipid 55-52 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 2 2222222222222121122220020021221000122 e0 36

CAC KY HIEU VIET TAT

C (Co-solvent): dung môi phụ trợ

Cạ„: hàm lượng dung môi phụ trợ tối ưu

CDHP: chất điện hoạt phổi

EtOH: ethanol

GL: glycolipid

Hoge: higu suất tối ưu

HPLC — ELS ( high performent liquid chrogratomaphy - evaporative light scattering ):

sắc ký lỏng hiéu nang cao véi detector tan xa anh sang bay hơi

McOH: Methanol

NL (neutral lipid): lipid trung tinh

T: nhiệt độ

P: áp suất

Poe: áp suất tối ưu

PA: acid phosphatidic

PL: phospholipid

PC: phosphatidyl cholin

PI: phosphatidyl inositol

PE: phosphatidy! ethanolamine

PG: phosphatidyl glycerol

PS: phosphatidyl serin

SM: sphingomyelin

SCO, (supercritical carbon dioxide) : CO, & trang thai siêu tới hạn

SCF (supercritical fluid ) : dung môi siêu tới hạn

TG: triglycerid

Tope: nhiét 46 t6i uu

DAT VAN DE

Công nghệ chiết bằng CO); ở trạng thái siêu tới hạn để sản xuất được chất và

hương liệu từ nguồn thiên nhiên là một kỹ thuật đang được phát triển cạnh tranh với

các kỹ thuật truyền thống do ưu thể vượt trội, tạo các sản phẩm có độ tỉnh khiết cao

giảm thiểu ô nhiễm môi trường và không để lại đư lượng hóa chất có hại cho sức khỏe

con người, đây là những tiêu chí quan trọng trong sản xuất các chế phẩm hóa được, mỹ

phẩm, và thực phẩm

Hiện nay, nghiên cứu công nghệ nano ứng dụng trong ngành Y- Dược là một

trong những hướng nghiên cứu mũi nhọn, đang được chính phủ và Bộ Y tế ưu tiên

phát triển Trong đó, việc nghiên cứu chế tạo liposom làm chất mang thuốc, thành

phan co ban 1a lớp phospholipid kép, đang góp phần tạo ra một số dạng bào chế hiện

đại, có tính sinh khả dung cao Liposom có cấu trúc kiểu màng sinh học của cơ thẻ, có

tính tương thích sinh học và độ an toàn cao rất có ý nghĩa trong việc mở ra hướng phát

triển mới cho các thuốc tác dụng tại đích trong một số điều trị đặc biệt như ung thư,

các bệnh nắm, bào chế vaccin, điều trị gen

Ở Việt Nam, chưa có nhiều nghiên cứu nhằm áp dụng đạng thuốc liposom vào

điều trị Một trong các lý đo là giá thành của các thương phẩm liposom và nguyên liệu

chủ yếu chế tạo liposom là phospholipid phải nhập ngoại với giá khá cao Vì vậy, việc

nghiên cứu tìm ra phương pháp và quy trình công nghệ chiết xuất phospholipid có độ

tỉnh khiết cao từ nguồn nguyên liệu rẻ tiền, sẵn có trong nước, đáp ứng được các tiêu

chuẩn chế tạo liposom là rất cần thiết

Trên cơ sở đó, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu chiết xuất

và tinh chế phospholipid tic hat đậu nành bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn ”

Mục tiêu của để tài là:

Chiết tách phospholipid từ hạt đậu nành bằng phương pháp CO; ở trạng thái siêu tới hạn;

vx Nghiên cứu ảnh hưởng của các thông số công nghệ đến hiệu suất chiết

phospholipid bing phương pháp CO; ở trạng thái siêu tới hạn, từ đó đưa

ra những thông số tối ưu cho quá trình chiết tách;

“ Phân tích, so sánh chất lượng sản phẩm của phương pháp chiết xuất bằng

dung môi hữu cơ và phương pháp CO; ở trạng thái siêu tới hạn

PHAN I: TONG QUAN

1.1 Phương pháp chiết xuất bằng CO; ở trạng thái siêu tới hạn (SCO;)

1.1.1 Trạng thái siêu tới hạn

Năm 1861, Gore lần đầu tiên giới thiệu về khả năng hòa tan tốt của Naphtalen

và Camphor trong CO; lỏng Vào các năm 1875 - 1876, Andrew, một trong những

người đầu tiên nghiên cứu vẻ trạng thái siêu tới hạn của CO;, đã tiên hành đo vả cung cắp những giá trị áp suất và nhiệt độ tới hạn của CO; khá gần với các số liệu hiện đại Hiện tượng một số muối vô cơ như KI, KBr có thể hòa tan trong dung môi EtOH vả tetrachloromethan ở trạng thái siêu tới hạn được Hannay vả Hogarth công bố lần đầu tiên tại hội nghị khoa học Hội khoa học Hoàng gia London năm 1879 [26,31] Buchner (1906) cũng thông báo về khả năng hòa tan của một số hợp chất hữu cơ kém bay hơi trong SCO, cao hon nhiêu lần so với trong CO; ở dạng khí [19]

Đối vối mỗi chất thông thường, dưới mỗi một điều kiện nhất định chúng sẽ tồn tại ở một trạng thái nào đó trong ba trạng thái rắn, lỏng và khí Nếu nén chất khí tới một áp suất đủ cao, chất khí sẽ hóa lỏng Tuy nhiên, có một giá trị áp suất mà ở đó, nếu nâng dẫn nhiệt độ lên thì chất lỏng cũng không thể trở về trạng thái khí, mà rơi vào một vùng trạng thái đặc biệt gọi là trạng thái siêu tới hạn (supercritical) Vật chất ở

trạng thái này mang nhiều đặc tính của cả chất khí va chất lỏng, chính vì vậy chúng

đều có những trạng thái ưu việt của cả hai pha khí và lỏng Ở trạng thái siêu tới hạn, tỉ

trọng của pha cũng tương đương như tỉ trọng của pha lỏng Nhưng sy linh động của

các phân tử lại rất lớn, sức căng bề mặt nhỏ, hệ số khuyếch tán cao [19]

P

Điểm ba (Pr, Tr) Điểm wi han (Pe, Te)

Đối với các chat có phân tử lượng nhỏ như các hydrocacbon có số cacbon tir |

đến 3 thì giá trị áp suất tới hạn của chúng không cao, mà chỉ xắp xi vào khoảng 45 bar,

nhưng giá trị nhiệt độ tới hạn (T,) của chúng phụ thuộc nhiều vào phân tử lượng của chất và độ phân cực trong phan tir [16]

Khi phân tử lượng của chất tăng lên thì có thể kéo theo giá trị T, cũng tăng lên

Tuy nhiên T, cũng không phụ thuộc nhiều vào giá trị phân tử lượng mà nó bị chỉ phối

mạnh bởi độ phân cực trong phân tử Độ phân cực trong phân tử càng lớn thì giá trị T,

càng lớn, điều này được giải thích do độ phân cực trong phân tử tăng lên, giữa các phân tử sẽ xuất hiện một lực cảm ứng giữa các cực do vậy ta sẽ cần phải tốn một năng

lượng rất lớn để phá vỡ trật tự giữa các phân tử khi nó ở pha lỏng Trong trường hợp

giữa các phân tử có lực liên kết hyđro, giá trị T sẽ tăng lên rất lớn

Ở các dung môi siêu tới hạn, ưu điểm nổi bật nhất mà mọi dung môi thông

thường khác không có được đó là khả năng hoà tan rất tốt các chất tan ở cả 3 trạng thái

rắn, lỏng và khí Dung môi ở trạng thái siêu tới hạn có sự tác động lên cả các chất đễ bay hơi và cả các cấu tử không bay hơi của mẫu Do vậy, dung môi ở trạng thái siêu tới hạn sẽ mang cả hai đặc tính: đặc tính phân tách của quá trình trích li và đặc tính phân tách của quá trình chưng cắt

Do vậy, có thé thấy rằng việc sử dụng dung môi siêu tới hạn đẻ tách chiết các chất sẽ mở ra một phương pháp kỹ thuật mới mà tiểm năng của nó trong tương lai sẽ

có sự tác động lớn tới nền công nghiệp hoá chất, thực phẩm, được phẩm và công nghệ

Dung môi Nhiệt độ tới hạn ( Áp suất tới hạn ( Tỷ trọng riêng

cc) (bar) téi han (g/em’)

1.1.2 Cac đặc tính của CO; ở trạng thái siêu tới hạn

CO; vả một số dung môi khác ở trạng thái siêu tới hạn có tinh chất hóa lý đặc biệt nhu [16, 19, 22, 26, 27]:

Đề đáp ứng các yêu cầu công nghệ chiết tách các hợp chất thiên nhiên, SCO; là

dung m6i được ưu tiên lựa chọn áp dụng vì các thuận lợi sau:

+ CO; là một chất để kiếm, rẻ tiền vì nó là sản phẩm phụ của nhiều ngành

công nghiệp hóa chất khác;

Là một chất trơ, ít có phản ứng kết hợp với các chất cần tách chiết Khi được đưa lên đến trạng thái siêu tới hạn, CO; không tự kích nẻ, không bắt

lửa và không duy trì sự cháy;

CO; không độc với cơ thẻ, không ăn mòn thiết bị:

Điểm tới hạn của CO; (P, = 73 atm; T, = 30,9°C) là một điểm có giá trị nhiệt độ, áp suất không cao lắm so với các chất khác cho nên sẽ ít tốn năng

lượng hơn để đưa CO; tới vùng siêu tới hạn;

Có khả năng hòa tan tốt các chất tan hữu cơ ở thể rắn cũng như lỏng, đồng

thời cũng hòa tan được cả các chất thơm đễ bay hơi, không hòa tan các kim

loại nặng và có thể điều chỉnh các thông số trạng thái như áp suất và nhiệt

độ để thay đổi độ chọn lọc của đung môi;

Khi sử dụng CO; thương phẩm đẻ chiết tách không có du lượng cặn độc hại trong chế phẩm chiết,

1.1.3 Sử dụng dung môi phụ trợ cho SCO;

Dung môi phụ trợ hay dung môi thứ cấp là một chất hữu cơ được đưa thêm vào dung môi chính của SCO; với một lượng rat nhỏ, thường là 1-5 % mol, nhằm biến đổi đặc tính của dung môi chính theo hướng có lợi cho mục tiêu chiết tách, chẳng hạn như làm thay đổi tính phân cực, hay các tương tác riêng của dung môi đối với các hoạt chất

tan, mà không làm thay đổi đáng kẻ tỷ trọng và tính khả nén của dung môi chính [30]

Ngoài ra dung môi phụ trợ có thể cải thiện tính chọn lọc của qúa trình tách

chiết bảng sự tương tác ưu tiên với một hay vải cấu tử Methanol là một ví dụ: cho

thêm 3,5 % mol methanol lam ting độ tan của 2 - aminobenzoic acid lên 620% trong SCO, [22]

Dung môi có trộn thêm dung môi phụ trợ sẽ có các giá trị tới hạn (nhiệt độ, áp suất) khác với giá trị của dung môi chính Thông thường với nồng độ dung môi phụ

nhỏ hơn 5 % mol, sự sai khác này không đáng kể và hỗn hợp dung môi thường vẫn ở

trạng thái siêu tới hạn [22]

1.1.4 Một số ứng dụng chính

Hiện nay công nghệ chiết bằng SCO; đã và đang được áp dụng phỏ biến để chiết tách các hoạt chất sử dụng trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp thực phẩm các hợp chất thiên nhiên, được phẩm và mỹ phẩm

Trên thế giới đã sứ dụng công nghệ SCO; vào việc loại cafein trong quá trình sản xuất các loại đồ uống từ chè, cà phê [19, 32] Trong công nghiệp thuốc lá, công nghệ SCO; được sử dụng để chiết những thành phần dễ bay hơi và tách phần hương tự nhiên từ cây thuốc lá để nâng cao chất lượng sản phẩm Trong ngành thực phẩm, công nghệ SCO; ứng dụng để sản xuất các sản phẩm có hàm lượng chất béo và cholestesrol thấp hoặc các thực phẩm chức năng (giàu axit béo, DHA, EPA vv ) SCO; còn được dùng để chiết các hợp chất của hoa huplon để dùng trong công nghệ bia và dược phẩm: chiết các hoạt chất chống oxy hoá có nguồn gốc tự nhiên Theo đánh giá của

các chuyên gia (Vitzthum và Hubetr; Behr và cộng sự) [ 19, 27] thì việc sử dung SCO,

vào chiết tách các hoạt chất thiên nhiên ứng dụng trong thực phẩm, mỹ phẩm, dược

phẩm với sản lượng lớn ở quy mô công nghiệp sẽ trở thành phỏ biến trong tương lai

Bang 1.2: Một số sản phẩm sản xuất bằng công nghệ SCO; ở quy mô công nghiệpƒ 19}

HAG-General Foods Ca phé Đức SKW Chemical Chè, huplon, gia vị

Australia Carlton & United Huplon

Anh English Hops Huplon, gia vị

General Foods Cà phê

Mỹ Pfizer Huplon

Phasex Các sản phẩm khác

-Bên cạnh đó, công nghệ SCO; được áp dụng rộng rãi trong chiết tách nhiêu loại tinh dầu từ thực vật như tinh đầu hoa nhải, hoa bưởi Sản phẩm có độ tính khiết cao, mùi đặc trưng vả hiệu suất khá cao Ngoài ra công nghệ nảy cũng có nhiễu triển vọng trong việc chiết xuất các hoạt chất có tác dụng chữa bệnh và tăng cường sức khỏe từ thảo mộc như: chiết vinblastin chữa ung thư máu từ cây dừa can (Catharanthus roseus), chiét các hợp chat triterpenoid (đặc trưng nhất là faradiol) có tác dụng chống

viêm tir hoa cay cic vang (Calendula officialis)

1.2 Giới thiệu chung về đậu nành [5]

1.2.1 Đặc điểm thực vật

Đậu nành (Đậu tương) - Giycine max (L.) Merr, thuộc họ Đậu — Fabaceae

Hạt đậu nành đã chế biến - Semen Sojae Preparatum, thường gọi là Đạm đậu xị

Đâu nành là cây thảo hàng

năm, có thân mảnh, cao 50-

IŠ50cm, có lông, các cảnh hướng

lên trên Lá mọc so le, c6 3 la chét |

hình trái xoan, gắn nhọn mũi, hơi

không đều ở gốc Hoa trắng hay

tím, xếp thành chùm ở nách Quả

thông, hình lưỡi liễm, có nhiều

lông mềm, màu vảng lục hay vàng

nhạt, thắt lại giữa các hạt Mỗi quả

có từ 2 — 5 hạt, gắn hình câu hay

hình thận, có màu sắc thay đối tuỳ

theo giống trồng Hoa đâu nành nở vào tháng 6-7, quả được thu hái vào tháng 7-9

Trong hạt đâu nành có các thành phân đã biết tính theo tỷ lệ %: Protein 35 -

40%, lipid 12 — 25%, glucid 10 — 15%; cac mudi khoang Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, BI, B2, D, E, F; cac enzym, sap, nhya, cellulose va cac acid amin co ban: isoleucin, leucin, lysin, methionin, phenylalanin, tryptophan, valin Ngoai ra, dau nanh

được coi là một nguễn cung cấp protein hoản chỉnh vì chứa một lượng đáng kế các acid amin thiết yêu Trong đạm đậu xị ngoài protein, lipid, glucid, cén có xanthin,

hypoxanthin, caroten, các vitamin BI, B2, vitamin PP

Lipid chiếm 12 - 25%, là một chất đậu rất rõ (do chất methylnonnyxeton), mùi

vị này lâu dần sẽ thay đổi do hiện tượng oxy hóa vả tạo thành một mảng mỏng trên

mặt dầu Lỏng ở nhiệt độ thường, đông đặc ở -13°C va & -15°C, ty trong 0,924 đến 0,927 (6 15°C), chỉ số khúc xạ 1,4762 - 1.4765 (ở 15°C) Sền sệt & +8°C va +15°C, các acid béo chảy ở 27 ~ 29°C, chỉ số iod 137 - 142, chỉ số xà phòng hóa 192,5 Trong dầu béo đậu nành còn có phospholipid (1 - 2%) bao gồm: PC, PI, PS, PA, PE trong đó chủ yếu là PC PC hoặc nằm trong dầu béo (tách ra bằng aceton lạnh) hoặc nằm trong phần bã (tách ra bằng dung môi bay hơi) [ I 1.21]

1.2.3 Phân bố và chế biến

Đậu nành được trồng phô biến ở Đông Nam Á, Bắc và Nam Mỹ Quê hương của đậu nành là Đông Nam châu Á, nhưng 45% điện tích trồng và 55% sản lượng đậu

nành của thế giới nằm ở Mỹ, sau đó đến Brasil, Argentina, Trung Quốc và Án Độ

Phân lớn sản lượng đậu nành của Mỹ hoặc để nuôi gia súc, hoặc để xuắt khẩu, mặc dù

lượng tiêu thụ ở người trên đất nước này đang tăng lên và dầu đậu nành chiếm tới 80%

lượng đầu ăn ở Mỹ Năm 2000, Mỹ sản xuất 75 triệu tắn đậu nành trong đó hơn một

phần ba được xuất khâu [29]

1.3 Lecithin thương mại

Lecithin thương mại hay lecithin thô là một hỗn hợp của PLs với TGs,

phytoglycolipids sterols, các acid béo và được sản xuất như 1 sản phẩm phụ của quá trình tỉnh chế dầu thô [18] Quá trình này được tiến thành bằng việc khuấy dầu thô với nước, nhờ đó phần lecithin phân cực được chuyển vào pha nước, sau đó lảm sạch vả sấy khô thu được lecithin thô Chúng được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm và được phẩm như chất nhũ hóa, chất điện hoạt

Lecithin tỉnh khiết được lấy từ hỗn hợp lipid phân cực và không phân cực từ

động vật và thực vật Lipid phân cực như glycolipid và phospholipid hầu hết không

hòa tan trong aceton, tương phản với lipid không phân cực, chủ yếu là TG hoà tan

trong aceton

Về phương diện thương mại, lecithin tỉnh khiết được sản xuất từ lecithin thô lấy

từ dầu thô của hạt đậu nành, cọ, hạt bông, oliu, hoa hướng đương Về phương diện

khoa hoe, lecithin tinh khiết quy vẻ phosphatidylcholine (PC) Lecithin với hàm lượng

PC cao có khả năng nhũ tương hóa tốt hơn hỗn hợp phospholipid, do đó cần tinh chế

làm giàu thêm phân đoạn lipid phân cực từ việc loại đầu của hạtmàm, hoặc từ leeithin

thô

\

Một phần chủ yếu của lecithin hiện nay được sắn xuất như một sản phẩm phụ

của quá trình tỉnh chế dầu đậu nành Dâu đậu nành thô tách chiết bằng hexan chứa 2- 3% lipid phân cực Leeithin đậu nành thương mại hay lecithin đậu nành thô chứa 35%

lipid không phân cực; 64,3% lipid phân cực trong đó bao gồm: 86% PL va 14% GL;

0,7% nước [22]

1.4 Tổng quan về Phospholipid

1.4.1 Giới thiệu chung về phospholipid

Phospholipid là este của rượu đa chức với các acid béo bậc cao và thành phần

có thêm gốc phosphat, bao gồm hai phân nhóm tủy thuộc vào thành phẩn alcol trong cấu tạo của lipid: glyeerophospholipid có.alcol là glyeerol và sphingolipid c6 alcol 1a

Il ⁄Z HạC——N —Cˆ—CH;OH PL có tên gọi PC

| nls — 5 HạN——C ——-CH;OH : PL có tên gọi PE |

OH HzC——(CH;»›£—~CHOH

PE: Phosphatidy! ethanolamin MÐ in

PI: Phosphatidyl inositol

PS: Phosphatidy! serin & HO

SM: Sphingomyelin

Tùy thuộc vào cầu trúc của X mà ta phân

ra nhiều loại phospholipid: PC, PS, PI, PE, SM

PL cé 2 phan: phan dau (head) va phan

dudi (tail) Phan dudi la hai chudi hydrocarbon,

gọi là hydrophobie có tính ky nước Phân đâu

có gốc phosphat và gắn các nhóm amino khác

nhau, gọi là hydrophilic có tính ưa nước Sự kết

hợp của 2 phần hydrophobic và hydrophilic tạo

thành phân tử có một đâu thân nước và một đâu

thân dâu, gọi là amphiphilic (lưỡng tính)

1.4.2 Vai trò và ứng dụng

* Vai trò tạo màng sinh học

Lớp phospholipid kép của màng: đây là cấu trúc cơ bản của màng tế bào, là một

lớp lipid mỏng liên tục bao quanh tế bào, mềm có thể uốn khúc Thành phần hoá học của lớp kép hầu như hoàn toàn là phospholipid và cholesterol có cấu trúc gồm một đầu thân nước và một đầu ky nước Các đầu ky nước quay vào trong gặp nhau, hút lẫn

nhau, còn đầu ưa nước thi quay về hai phía có nước ở ngoài và trong tế bao [3]

Lớp lipid kép là hàng rào ngăn không cho các chất tan trong nuée nhu glucose,

các ion đi qua Trong khi đó đễ dàng cho các chất tan trong mỡ như O;, rượu, các vitamin tan trong dầu đi qua

¥ Phospholipid véi vai tro lam tién chat của thông tim thứ 2 [1J

Inositol là đồng phân đị lập thể của myoinositol PI 4,5 - điphosphat là thành

phân quan trọng của PL màng tế bào, đưới tác dụng kích thích của một chất hiệp đồng

hormon, nó sẽ được cắt thành điacylglycerol va inositol triphosphat, cả hai chất này

đều hoạt động như là những tín hiệu nội tế bao hay còn gọi là chất truyền tin thứ hai

*_ ai trò tạo chất diện hoạt phổi (CDHP) [3J

CDHP gồm 85% là PL, 10% là lipid trung tính, 5% là apoprotein Trong đó loại

PL chiếm nhiều nhất và có hoạt tính nhất là PC Ngoài ra còn có các PL khác như PS,

PI, PE, SM CDHP tập trung ở màng ngăn cách giữa không khí và phế nang có vai trò làm giảm sức căng bể mặt do đó làm giảm lực co thắt ở bẻ mặt phổi và việc giãn phối

CDHP chỉ bắt đầu hình thành đầy đủ vào những tháng cuối của thời kỳ mang thai (sau tuần thứ 30) Do vậy, 60-70% trẻ đẻ non đưới 30 tuần thai mắc phải hội chứng suy hô hắp cắp tính Đây là nguyên nhân gây tử vong nhiều nhất ở trẻ sơ sinh,

*“ Nguyên liệu chế tạo liposome

Thuật ngữ liposom xuất phát từ tiếng Hy Lạp: lipo có nghĩa là lipid, soma có nghĩa là cấu trúc

Đầu tiên, liposom được các nhà sinh học chế tạo làm mô hình màng sinh học

Sau đó được các nhà bào chế nghiên cứu làm một chất mang thuốc với mục đích bảo

vệ được chất, kéo dài tác dụng của thuốc và đưa thuốc tới đích Hiện đang được áp dụng nhiều trong lĩnh vực: hóa trị liệu enzym trị liệu, insulin trị liệu, khử độc kim loại, kích thích hệ thống phòng vệ của cơ thẻ Tuy nhiên, do còn có những hạn chế

nhất định như độ ổn định của chế phẩm, tính đồng nhất giữa các lô mẻ trong điều chế

nên chưa được đưa vào sản xuất và ứng dụng ở quy mô lớn [2]

`

Liposom là dạng đặc biệt của microcapsule và nanocapsule, bao gồm một nhân

nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng trục,

có kích thước thay đổi từ hàng chục đến hàng ngàn nanomet [6]

Nguyên liệu chính đẻ điều chế liposom là PL, bao gồm các loại [4.7]:

e PL tự nhiên phosphaudyl cholin (lecithin của trứng hoặc đậu nành), phosphatidyl serin L, y = phosphatidyl cholin đilauryl

e© PL tổng hợp như: phosphatidyl (inositol, dipalmoyl phosphatidyl cholin, distearoy! phosphatidy! cholin )

e Cac loai PL khac nhu sphingomyelin

Cholesterol va din chat duge thém vao phospholipid dé lam giam độ cứng và tính thắm của liposom, thường phối hợp ở tỷ lệ 20-30% trong thành phần của màng

liposom

Ngoài ra còn dùng các chất tích điện, tạo lực đẩy tĩnh điện giữa các lớp vỏ của

liposom để làm tăng dung tích của khoang nước, đo đó làm tăng khả năng đưa các

dược chất thân nước vào liposom Chất làm cho liposom tích điện âm như: acid

phosphatidic, diethyl phosphat : chất làm cho liposm tích điện dương như: stearylamin

1.5 Công nghệ chiết xuất phospholipid từ hạt đậu nành

1.5.1 Chiết xuất phospholipid bằng dung môi hữu cơ

+ Theo phương pháp của Folch, nguyên liệu được chiết bằng hệ dung môi chloroform/methanol (2/1 v/v) theo tỉ lệ 1/20 (w/w) Quá trình chiết được thực hiện tại nhiệt độ phòng, thời gian 15-20 phút, có khuấy trộn Sau khi chiết, tiến hành lọc, cất loại dung môi Phần địch chiết được rửa bằng nước hoặc nước muối 0,9% theo tỉ lệ 1⁄4 (v/v) Quá trình tách lỏng lỏng được thực hiện trên thiết bị li tâm ở tốc độ 2000

vòng/phút để phân tách thành hai pha Nếu cần có thể rửa bề mặt bằng đung dịch methanol/nước: 1/1 (v/v) một hoặc hai lần không khuấy trộn Sau khi ly tâm và loại bỏ

lớp trên lớp chloroform phía đưới chứa lipid được cô cất chân không hoặc dưới áp

suất của dòng nitơ thu được PL Có thể dùng dichloromethan thay cho chloroform trong phương pháp chiết xuất lipid này { 15]

+ Theo kết quả nghiên cứu khác, Yutaka TAKAGI và Teruyoshi YNAGITA [15,33,34] da tiến hành nghiên cứu so sánh hiệu suất chiết PL trong đậu nành từ các

hỗn hợp dung môi khác nhau:

À

(1): Chiết nhanh với chlorofom/methanol: 2/1 (v/v) theo phương pháp của

Folch;

(2): Chiét Soxhlet bang diethylether trong 16 gid:

(3): Chiét Soxhlet bang benzen/EtOH : 4/1 (v/v) trong 16 gid;

(4): Hạt được ngâm nước 14 giờ trước khi chiết theo phương pháp của Folch

Dịch chiết lipid được phân tích xác định các thành phần PL, TG, và Sterol Methyl ester của acid béo được tỉnh chế và phân tích bằng sắc ký khí — lỏng Thành

phần PL được xác định bằng phương pháp của Bartlett {12] sau khi ngâm với HCIO;

70% va được phân tách bởi sắc ký lớp mỏng trên silicagel H với hệ dung môi:

chloroform - methanol - acid acetic - nước (25:1 §:4:2) [33]

Kết quả cho thấy, hiệu suất chiết PL theo (1) đạt 14,7 mg/g, tương đương với

(3) — 15,9 mg/g va (4) - 15,0 mg/g, cao hon nhiéu so véi (2) — 2,0 mg/g Thanh phan

của PLs chiết theo (1) và (3) cũng đã được phân tích, không thấy sự khác biệt nhiều

Bang 1.3: Kết quả phân tích PLs khí chiết theo phương pháp (1) và (3)

oo 1 Trung hda acid;

Hình 1.4: Quọy trình chiết tach lecithin thô từ hạt đậu nành

Tinh chế lecithin thô: Thông thường quá trình phân ly lipid phân cực (86% PL, 14% GL) và lipid không phân cực ( 35% TG) bao gồm 2 bước: nạp lecithin thô và

aceton lạnh dư vào thùng phân ly, khuấy đều Sau đó tach phan lipid phân cực không hòa tan, đem làm khô và hoà tan lại trong EtOH lọc tách bỏ phần cặn không tan, cô cất thu hồi dung môi Lecithin tỉnh khiết thu được là chất rắn có màu vàng sáng

[23.35.36]

Trong một quá trình khác, dung dịch của hexan và lecithin thô được chạy qua cột silicagel, trong khi lipid trung tính bị hap phụ trái lại PL chạy qua cột và được tập trung trong hexan (Schneider, 1988) [22]

1.5.2 Chiết xuất phospholippid bằng phương pháp SCO, [3|

+ Chiết dầu đậu nành bằng hexan theo phương pháp truyền thống, PL thu được

có lẫn dầu Tuy nhiên, nếu sử dụng SCO; để tách dầu từ đậu nành, sau đó chiết lại phần bã đã loại đầu thu được PL Khi sử dụng công nghệ SCO; có thêm dung môi phụ

trợ (EtOH), PC (lecithin tỉnh khiết) và PE được chiết chọn lọc hơn là PI Lượng PC và

PE thu được phụ thuộc vào nông độ EtOH trong SCO, (Montanari et al., 1994) Tiến

trình có thể được mô tả như sau [21,22]:

Hạt đậu nành , Chiết " KỶ Dầu đậu nành

(soybean Flakes) (700 bar, 80°C) ca (Soybean oil)

: Chiét bing SCO, + EtOH See (682 bar, 80°C) (om

Hinh 1.5: So dé quy trinh chiết tách PL từ hạt đậu nành bằng SCO); (22}

+ Theo báo cáo nghiên cứu của G Began, và cộng sự [I3], lecithin thô được

chiết với CO; ở các áp suất 120, 200, 240, 280, 320 bar và nhiệt độ 40°C để thu lecithin đã loại dầu Lượng PL (không tan trong aceton) tăng lên khi tăng áp suất

Lecithin sau khi tách đầu được tỉnh chế bằng EtOH, tuỳ thuộc vào áp suất chiết mà hàm lượng PC trong phan PL tan trong EtOH có thẻ lên tới 70.0%, tương ứng với

21,1% trong lecithin thô; hàm lượng PI trong phần không tan trong cồn có thể lên tới

37,1% tương ứng 12,3% trong lecithin thô

*

)

+ Leyla Teberikler và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu chiết chọn lọc PC từ

lecithin đậu nành bằng SCO; sir dung EtOH lam dung môi phụ trợ Nhiệt độ chiết trong khoảng 60 - 80C, áp suất 172 - 207 bar, nồng độ EtOH 10 - 12,5% mol theo

khối lượng, thời gian chiết được giữ cố định 150 phút trong các thí nghiệm Kết quả nghiên cứu cho thấy, áp suất và nồng độ EtOH ảnh hưởng tới hiệu suất của quá trình chiết trong khi nhiệt độ không làm ảnh hưởng Với các điều kiện chiết tách đã nghiên cứu, sản phẩm chính thu được là PC trong khi các PL khác tỷ lệ rất thấp Chiết ở 60°C

và 207 bar với 10% mol EtOH hàm lượng PC chiếm tới 95% trong sản phẩm thu được {17}

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Thiết kế nghiên cứu

Thông qua tài liệu tham khảo và các nghiên cứu sơ bộ chúng tôi đã xây dựng

thiết kế nghiên cứu thực hiện nhiệm vụ đẻ tài như sau (hình 2.3):

trình tách loại Các = kiện Lipid trung tính €

: Nghiên cứu quá Các thông số :

Tinh chế

Lượng đầu thô trên được thủy hóa với 2% H;O (v/v) tại 70°C khuay trong

Igiờ Tiến hành lọc vắt ly tâm ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 10 phút, tách bỏ lớp dau, lớp lắng cặn ở đưới được rửa sạch, sấy khô thu được lecithin thô

2.2.3 Chiét phospholipid bing SCO,

4- Bing dite khiến

Hình 2.4: Sơ đỏ hệ thống chiết suất bing SCO,