Đề tài tổng hợp peptide dựa trên pha rắn

Đề tài:Tổng hợp peptide dựa trên pha rắn. TỔNG HỢP CỔ ĐIỂN Tổng hợp trong dung dịch: Dùng dư tác nhân phản ứng Cô lập và tinh chế chất trung gian, sản phẩm phản ứng,… TỔNG HỢP PHA RẮN Là kỹ thuật tổng hợp theo đó chất cần tổng hợp được tổng hợp trên một chất mang rắn (polymeric resin).

TIỂU LUẬN TỔNG HỢP HỮU CƠ PHA RẮN

Gíao viên hướng dẫn Học viên thực hiện:

TS Bùi Thị Bửu Huê 1 Huỳnh Thị Kim Chi

1

Đ ề tài:Tổng hợp peptide dựa trên

pha rắn.

TỔNG HỢP PHA RẮN

Là kỹ thuật tổng hợp theo đó chất cần tổng hợp được tổng hợp trên một chất

mang rắn (polymeric resin).

* Chất mang và Cầu nối

P Linker Substrate Resin

Chất mang (Resin)

 Một loại polymer

 Mức độ trương nở trong dung môi khác nhau:

Polystyrene trương nở tốt trong dung môi không phân cực; Polyethylene glycol (PEG): trương nở tốt trong cả dung môi phân cực và không phân cực

Cầu nối (Linker)

 Cấu trúc trung gian nối chất mang và tác

chất phản ứng.

 Nhiều loại cầu nối khác nhau.

• Đủ khả năng thẩm thấu và trương nở.

• Chủ yếu là polystyrene and các copolymer của styrene với các tác nhân liên kết ngang khác nhau

CẦU NỐI

• Liên kết cộng hóa trị kết nối các phân tử trên chất mang rắn và sẽ cung cấp một phương tiện cho việc gắn

và phân cắt hóa học của chúng

• Thường là những phân tử mang hai nhóm chức khác nhau bảo đảm cho việc kết nối chất nền (building block) đầu tiên vào chất mang rắn

Resin Linker Molecule

Cleavage

Molecule

• Cầu nối này phải bền trong điều kiện tổng hợp sau

đó và khi cần có thể dễ cắt đứt một cách chọn lọc ra khỏi chất mang

• Chất mang/cầu nối có thể được xem như nhóm bảo

vệ của một trong những nhóm chức của phân tử chất cần tổng hợp

CẦU NỐI

• Bên cạnh các loại cầu nối cổ điển có thể bị cắt trong môi trường acid hoặc base hoặc dựa trên phản ứng thân hạch, các loại cầu nối mới ngày nay có thể được cắt đứt bằng phản ứng quang hóa, bằng enzyme, hydrogen giải (hydrogenolysis) hoặc bằng kim loại chuyển tiếp.

10

Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc

phản ứng của pha rắn

• Diện tích tiếp xúc: Các chất không chỉ phải ở trạng thái rất mịn (kích thước hạt càng nhỏ, diện tích bề mặt các lớn) mà phải có xác suất tiếp xúc giữa các pha rắn là lớn nhất Điều này đòi hỏi sự trộn lẫn các pha tốt nhất và phải có sự nén ép các pha lại với nhau quá trình đó gọi là sự tạo viên (pelletize).

• Tốc độ khuếch tán: phụ thuộc vào

+ Nhiệt độ: theo quy tắc Tamman

+ Sai khuyết tinh thể: là cơ chế động học khuếch tán chính trong phản ứng pha rắn Thông thường, các chất rắn mới sinh ra đều có nồng độ sai khuyết tinh thể lớn Chính

vì vậy mà trong tổng hợp pha rắn người ta hay dùng muối của carbonate hay nitrate để làm tác chất ban đầu

Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc

phản ứng của pha rắn

• Tốc độ tạo mầm của pha rắn tạo thành

Tốc độ này lớn nhất khi có sự tương đồng về cấu

trúc tinh thể của các pha rắn tham gia phản ứng

13

Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc

phản ứng của pha rắn

Chương 2 TỔNG HỢP PEPTIDE TRÊN PHA RẮN

• Sau phản ứng ghép cặp, nhóm amino được giải bảo vệ

và nó tiếp tục phản ứng với nhóm carboxy của amino acid kế tiếp Quá trình được tiếp diễn cho đến khi chuỗi peptide được hoàn thành, khi đó phân tử sẽ cắt khỏi chất mang, giải bảo vệ ở các vị trí trong mạch và sau cùng peptide sẽ được tinh chế để loại các sản phẩm phụ

CHẤT MANG RẮN TRONG

TỔNG HỢP PEPTIDE

Có hơn một trăm loại chất mang khác nhau thích hợp cho tổng hợp peptide dựa trên cơ sở polystyrene và polyethylene glycol

• Merrifield’s resin là loại chất mang đầu tiên được

sử dụng trong tổng hợp peptide, là loại co-polyme giữa polystyrene và 2% divinylbenzene có các nhân thơm đã được chloromethyl hóa tạo ra nhóm chức hoạt động benzyl chloride

Cl

Merrifield resin

• TentaGel có độ trương nở trong dung môi hữu cơ phân cực (kể cả nước) tốt hơn polystyrene do đặc tính ưa nước của chuỗi POE.

Giống như chất mang polystyrene, TentaGel cũng được chức hóa với nhiều nhóm chức khác nhau thuận lợi cho việc ghép cặp với nhiều chất nền khác nhau

TentaGel resin

O

O H

n

• PAM resin là loại chất mang ngăn chặn peptide tách ra sớm khỏi chất mang PAM resin bền đối với sự thủy phân acid hơn hydroxymethyl polystyrene gấp

100 lần

PAM resin

OH O

CẦU NỐI SỬ DỤNG TRONG TỔNG HỢP

PEPTIDE TRÊN PHA RẮN

• Cầu nối được dùng cho acid carboxylic là cầu nối Wang Loại cầu nối này thường được gắn với cross-

linked polystyrene, TentaGel và polyacrylamide tạo thành chất mang tương ứng là Wang resin

• Polystyren sử dụng cầu nối acid PAM

• Polyacryamide sử dụng cầu nối benzylalcol cũng thích hợp với chiến lược Boc

Bảo vệ nhóm trong tổng hợp peptide

NHÓM BẢO VỆ BỘ KHUNG SƯỜN

(BACKBONE)

• Một loại bảo vệ khung sườn cho peptide, rất phù hợp

để tổng hợp peptide là nhóm Fmoc, được gọi là nhóm bảo

vệ Hmb (2-hydroxy-4-methoxybenzyl)

• Nhóm bảo vệ khung sườn thường được sử dụng trong giai đoạn tổng hợp peptide trên pha rắn và đang phát triển các hệ thống peptide với chất mang, với các peptide khác, hoặc với chính nó

HỢP CHẤT PEPTIDE VÒNG

• Vòng peptide có thể được tạo thành sau khi tách khỏi chất mang trong dung dịch (xem ví dụ) hoặc ngay cả khi còn gắn với chất mang Bên cạnh vòng peptide mạch chính, peptide còn có thể đóng vòng ở mạch nhánh Vòng peptide mạch chính không hòa tan trong chất mang, peptide được nối với chất mang hoặc với cầu nối amide mạch chính hoặc thông qua mạch nhánh của amnio acid

H N

N H

N R

N H

NH R

• Peptide cũng có thể bị đóng vòng bởi những nhóm chức ở mạnh nhánh (như khi sử dụng lysine, cysteine, glutamic acid, aspartic acid).

• Trong sự đóng vòng, quá trình giải phóng của peptide vòng bằng các tác nhân thân hạch xảy ra một cách tự phát sau khi tách khỏi phần cuối nhóm bảo vệ amine

• Phản ứng phụ có thể xảy ra trong quá trình đóng vòng peptide là phản ứng oligomer hóa

Chương 3 QUI TRÌNH TỔNG HỢP PEPTIDE

TRÊN PHA RẮN

3.1 Chất mang trong tổng hợp peptide

- Không hòa tan trong tất cả các dung môi, bền về mặt vật

lý, dễ dàng được lọc

- Chứa nhóm chức mà amino acid đầu tiên (được bảo vệ nhóm amino) dễ tấn công vào polymer để tạo liên kết cộng hóa trị chặt chẽ

- Thí dụ: polystyrene, cellulose, polyvinyl alcohol, polymethacrylate và sulfonate polystyrene…

• Merrifield’s resin là loại co-polymer giữa polystyrene

và 2% divinylbenzene có các nhân thơm đã được chloromethyl hóa tạo ra nhóm chức hoạt động benzyl chloride, hạt nhỏ có đường kính khoảng 20-150 µm

• Amino acid thứ nhất (với nhóm amino đã được bảo

vệ bằng nhóm chức thích hợp) được gắn vào chất mang thông qua nhóm carboxyl

• Nhóm chức ester tạo thành sẽ rất bền và có khả năng chống chịu trong các điều kiện phản ứng

• Khi tổng hợp kết thúc, nhóm ester này có thể dễ dàng được cắt đứt bằng acid flourhydric (HF) hoặc acid triflouromethanesulphonic (TFMSA),…

3.2 Giai đoạn tạo thành cầu nối ester

• Gắn amino acid thứ nhất trong tổng hợp peptide vào chất mang polystyrene đã được chloromethyl hóa

• Chloromethyl polystyrene được xử lý với muối triethylamonium và thực hiện phản ứng thế với amino acid đầu tiên (đã bảo vệ nhóm amino) cho cầu nối benzyl ester

• Phản được thực hiện với carbobenzoxyglycine, chưng cất hồi lưu trong dung môi khan như ethyl acetate, benzene hoặc dioxane cho polymer carbobenzoxyglycyl…

• Amino acid gắn vào chất mang với lượng khoảng 0,5 mmol/ g polymer

3.2.3 Giai đoạn bảo vệ nhóm amino

- Nhóm bảo vệ sử dụng trong suốt quá trình tổng hợp là nhóm carbobenzoxy

- Các chất phản ứng có thể tấn công vào nhóm benzyl ester với tốc độ chậm và có thể cắt đứt liên kết Để khắc phục vấn đề này polymer cần được nitro hóa hoặc brom hóa sau giai đoạn chloromethyl hóa

- Sau khi đã nitro hóa sự tách nhóm carbobenzoxy tăng lên đồng thời sự cắt đứt liên kết ester giảm rõ rệt

• Với HBr 30% nhóm carbobenzoxy được tách loại trong

2 đến 4 giờ

• Trong khi đó sự tách loại ester diễn ra yếu và ít nhất phải mất 6 giờ

• Trong thực tế peptide không thể được tách hoàn toàn từ nhựa nitro hóa ngay cả khi dùng HBr đặc Carbobenzoxy-L-valyl bromopolymer có tính chất trung gian giữa polymer nitro hóa và những dẫn xuất không thế và có liên quan mật thiết đến độ bền của nhóm carbobenzoxy và liên kết ester

41

Bảng 1 Giải bảo vệ nhóm carbobenzoxy và

nhóm ester bằng HBr-acid acetic

3.2.4 Giai đoạn hình thành peptide

• Sau khi giải bảo vệ nhóm amino, cho ghép cặp với amino acid kế tiếp Nhưng chúng cho hiệu suất không cao, thường xảy ra hiện tượng racemic hóa

• Dùng phương pháp N,N'-dicyclohexylcarbodiimide cho kết quả

khả quan Phản ứng xảy ra với hiệu suất cao trong khoảng 30 phút

ở nhiệt độ phòng

• Sản phẩm carbobenzoxyaminoacyldicyclohexyl carbamate được hình thành với hiệu suất tốt và sản phẩm phụ không hòa tan dicyclohexyl carbamate có thể được tách dễ dàng thông qua việc rửa

• Việc lựa chọn dung môi để ngưng tụ rất quan trọng Dung môi được sử dụng tốt nhất là dimethylformamide, methylenechloride cũng cho hiệu suất tốt, tuy nhiên các dung môi như dioxane, benzene, ethanol, pyridine và nước cho hiệu suất kém và không được sử dụng

• Ảnh hưởng của dung môi phụ thuộc vào khả năng trương phồng của chất mang và một số yếu tố khác

• Phản ứng ghép cặp trong qui trình nghiên cứu là giữa polymer glycylvalyl và dẫn xuất carbobenzoxy của leucine, leucine, isoleucine, valine, alanine, glycine,

phenyl alanine, O-benzyltyrosine, proline, serine,

threonine, methionine, S-benzylcysteine,

im-benzylhistidine, nitro- arginine, γ-methyl glutamate

và asparagines

• Lysine và dẫn xuất của nó không được sử dụng.

• Vấn đề quan trọng là sau khi peptide hình thành phải không còn nhóm amine chưa phản ứng

• Sau khi phản ứng ghép cặp được hoàn thành, nhóm amine chưa phản ứng được acetyl hóa với lượng lớn acetic anhydride và triethylamine

46

• Liên kết acetamido được tạo thành một cách bền vững sau 18 giờ ở 25o Do đó, nguy cơ nhóm amino phản ứng trong các giai đoạn tiếp theo bị loại bỏ.

• Các giai đoạn này theo một chu kỳ tuần hoàn và chuỗi peptide được nối dài Chu kỳ này mô tả sự giải bảo vệ nhóm amino và sự ghép cặp với carbobenzoxyamino acid

• Sau khi kết thúc quá trình giải nhóm bảo vệ carbobenzoxy, peptide được giải phóng khỏi polymer bằng phản ứng xà phòng hóa, trong trường hợp chất mang brom hóa thì xử lý với lượng lớn HBr

• Peptide được tinh khiết bằng sắc ký trao đổi ion, sinh hàn hồi lưu hoặc các phương pháp thích hợp khác

Ví dụ: Tổng hợp peptide đơn giản là

tetrapeptide L-leucyl-L-alanylglycyl-L-valine

- Điều cần thiết là lập các điều kiện tối ưu và kiểm tra tính khả thi của phương pháp thực nghiệm

- Carbobenzoxy-L-leucyl-L-alanylglycyl-L-valyl polymer phải được tiến hành từng bước:

+ Bước 1: Là phương pháp nitro phenyl ester

+ Bước 2: Là phản ứng diimide

3.2.5 Cô lập và tinh khiết peptide

• Peptide thô tách khỏi chất mang được sắc kí qua cột

Dowex 50-X4 với dung môi giải ly là đệm pyridine acetate 0,1 M pH = 4

• Các sản phẩm phụ như dipeptide và tripeptide tuy chỉ chiếm lượng nhỏ (20 mg và 33 mg) nhưng ảnh hưởng rất lớn đến quá trình tổng hợp, chúng cần được tách ra khỏi tetrapeptide bằng sắc kí

Đánh giá độ tinh khiết của tetrapeptide bằng

các bước sau:

• (1) Sắc ký cột Dowex 50 cho một mũi đơn duy nhất

• (2) Cho một mũi đơn đối xứng giống như tính toán

• (3) Sắc ký giấy cho một vết với ba hệ dung môi khác nhau

• (4) Tỷ lệ các amino acid được xác định thông qua phân tích định lượng là leucine 1.00, alanine 1.00, glycine 0.99, valine 1.00

• (5) Độ tinh khiết quang học được xác định thông qua

sự thủy phân với hai enzyme Leucine aminopeptidase thủy phân peptide cho biết độ tinh khiết của L-leucine và L-alanine (Bảng II) Carboxypeptidase thủy phân L-valine cho biết độ tinh khiết của amino acid này

• (6) Cuối cùng là so sánh sắc ký, độ quay quang học, phổ hồng ngoại với chất chuẩn

KẾT LUẬN

- Tổng hợp peptide trên pha rắn (SPPS) được Robert Bruce Merrifield nghiên cứu đầu tiên đã làm thay đổi mạnh mẽ

mô hình tổng hợp peptide theo hướng mới

- Ngày nay, SPPS là phương pháp được chấp nhận cho việc tạo ra các peptide và protein trong phòng thí nghiệm

- Kể từ khi được đề cập đến lần đầu tiên cách đây hơn 40 năm, SPPS đã được phát triển đến mức gần như hoàn thiện

+ Trước hết là việc hoàn thiện khả năng của các chất

mang, trong đó cầu nối giữa carbon cuối mạch của amino acid và nhựa polystyren đã được cải tiến để khi gắn vào hay tách ra đều thu được các sản phẩm có hiệu suất cao

+ Việc cải tiến các nhóm chức phụ trong các nhóm bảo

vệ cũng đã hạn chế nhiều phản ứng phụ không mong muốn xảy ra

+ Thêm vào đó, việc phát triển thêm các nhóm bảo vệ mới dựa trên nhóm carbonyl trong các amino acid thế cũng đã được cải tiến để phản ứng ghép cặp xảy ra và hạn chế sự epimer hóa.

Mỗi sự cải tiến này đều góp phần làm cho SPPS trở thành một kỹ thuật được ứng dụng rộng rãi đến tận ngày nay

56