CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG VÀ PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Các đại lượng cơ bản trong sắc ký và động học của quá trình sắc ký1.1 1.2 1.3 1.4 CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG VÀ PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ Định nghĩa, phân loại các phương ph

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HỒ CHÍ MINH

KHOA CÔNG NGHỆ HÓA HỌC

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG

VÀ PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

GVGD: T.S NGUYỄN VĂN TRỌNG ĐTDĐ: 0903-543-882

EMAIL: trongphantich@yahoo.com

MÔN HỌC: PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH SẮC KÝ

Các đại lượng cơ bản trong sắc ký và động học của quá trình sắc ký

1.1

1.2

1.3

1.4

CHƯƠNG 1: CƠ SỞ LÝ THUYẾT CHUNG

VÀ PHÂN LOẠI CÁC PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ

Định nghĩa, phân loại các phương pháp sắc ký

Lịch sử ra đời và phát triển của phương pháp sắc ký

Sắc ký hấp phụ

1.5 Sắc ký phân bố

1.1 Lịch sử ra đời và phát triển của phương pháp

sắc ký

Nhà khoa học đầu tiên đã ghi nhận phương pháp sắc ký như là một phương pháp tách có hiệu năng cao là nhà thực vật học người Nga Mikhail Tswett (Mikhail Semyonovich Tswett), ông là người đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng – rắn để tách một số sắc tố của cây khi ông đang nghiên cứu về cholorophyll

Năm 1952 Archer John Porter Martin và Richard Laurence Millington Synge được trao giải Nobel hoá học cho phát minh của họ

về sắc ký phân bố

Thí nghiệm tách sắc tố ở lá cây

Thí nghiệm tách sudan và các hợp chất màu thực

phẩm bằng TLC

1.2 Định nghĩa, phân loại và hình dạng

sắc ký đồ

Phân loại theo cơ chế của quá trình tách

a Sắc ký hấp phụ (absorption chromatography)

b Sắc ký phân bố (distribution chromatography)

c Sắc ký trao đổi ion (ion exchange chromatography)

d Sắc ký rây phân tử (molecular sieve chromatography)

Phân loại theo tính chất của pha động

Hình dạng sắc đồ

Quá trình tách sắc ký làm cho các cấu tử được tách thành các vùng riêng biệt có màu hoặc không màu trên cột hoặc trên mặt phẳng Những vùng riêng biệt đó gọi là sắc đồ Dựa vào sắc đồ ta có thể suy đoán sự hiện diện của các cấu tử trong dung dịch phân tích

Sắc phổ

Trong quá trình tách bằng sắc ký, nếu bằng một cách nào đó ta có thể ghi được sự phân bố nồng độ các cấu tử dọc theo cột hoặc trên mặt phẳng, ta thu được một đường cong gọi là sắc phổ

1.3 Các đại lượng đặc trưng cơ bản

 Điểm O ứng với thời điểm đưa mẫu vào

 Điểm O’ ứng với thời điểm xuất hiện của chất lý tưởng, nghĩa là không bị hấp phụ lên cột.

 Đường OB là đường nền

 Khoảng cách GH gọi là chiều cao peak.

 Khoảng cách AB gọi là chiều rộng peak ở chân

 Khoảng cách EF gọi là chiều rộng ở giữa chiều cao.

H

Thời gian lưu, thể tích lưu

Thời gian lưu (tR): là thời gian từ lúc tiêm mẫu đến lúc ghi nhận được cực đại các mũi sắc ký, thường dùng trong định danh (giây, phút)  VR: thể tích lưu.

Thời gian lưu chết (tM): là thời gian một chất hoàn toàn không tương tác với pha tĩnh (không bị pha tĩnh giữ lại) đi qua cột Đó cũng là thời gian di chuyển của pha động từ đầu cột đến cuối cột, còn gọi là thời gian chất phân tích được lưu giữ trong pha động  VM: thể tích lưu chết.

Thời gian lưu hiệu chỉnh (t’R) là thời gian chất bị lưu giữ trong pha tĩnh, được tính theo công thức: t’R = tR – tM  Thể tích lưu hiệu chỉnh: V’R = VR – VM

Thời gian lưu, thể tích lưu

t’ R = t R – t M

V’ R = V R – V M

K 

 Pha động có năng suất rửa giải càng mạnh, K’ càng nhỏ các mũi ra nhanh và gần nhau

M

n K

 When k' is # 1.0, separation is poor

 When k' is > 30, separation is slow

 When k' is = 2-10, separation is optimum

Hệ số dung lượng hay hệ số lưu K’

Pha động có năng suất rửa giải lớn Pha động có năng suất rửa giải nhỏ

- K’ tuỳ thuộc vào bản chất của chất tan, pha tĩnh pha động, nhiệt độ, và đặc tính của cột sắc ký (kích thước hạt, chiều dài cột)

- Pha động có năng suất rửa giải càng mạnh, K’ càng nhỏ, các peak càng ra nhanh

và càng gần nhau.

- Khi K’ > 1 chất tan có ái lực với pha tĩnh lớn hơn pha động.

- Mối liên hệ: tR = tM (1 + K’) K’ tăng, tR và VR đều tăng

ĐĨA LÝ THUYẾT

2

2 1

R

2 R

w

t 5,55 w

t 16 H

L N

Tại sao có sự mở rộng mũi sắc ký?

a Khuếch tán xoáy - Eddy diffusion

b Truyền khối pha động - Mobile phase mass transfer

c Truyền khối pha động do ứ đọng - Stagnant mobile phase mass transfer

d Khuếch tán dọc - Longitudinal diffusion

a.) Khuếch tán xoáy: là một quá trình dẫn đến sự mở rộng đáy

của mũi sắc ký do sự hiện diện của nhiều dòng chảy trong cột

nhồi.

Khí các phân tử chất tan đi qua cột, một số phân tử sẽ kết thúc sớm hơn các phân tử còn lại, điều đó đơn giản là do các phân tử di

chuyển theo hướng khác nhau dẫn đến chúng

về đích với thời gian khác nhau.

Đường dài hơn sẽ hướng đến điểm cuối của cột lâu hơn.

Những phân tử chất tan nằm ở giữa dòng chảy sẽ có khuynh hướng di chuyển nhanh hơn các phân tử nằm

ở phía bìa ngoài do đó dẫn đến độ rộng của mũi sắc ký

Độ rộng của mũi sắc ký do khếch tán xoáy và truyền khối pha động phụ thuộc chủ yếu vào 2 yếu tố:

1) Kích thước của vật liệu nhồi 2) Tốc độ khuếch tán của chất tan

b.) Truyền khối pha động – là một quá trình làm tăng bề rộng của mũi sắc ký

mà nguyên nhân là do sự hiện diện của các dòng chảy khác nhau bên trong cột.

c.) Truyền khối pha động ứ đọng – độ mở rộng peak do sự khác nhau giữa tốc độ khuếch tán của chất tan bên trong và bên ngoài hốc của chất nền (pores of the support)

Từ một chất tan không di chuyển quanh co trong cột mà nó bị lưu giữ lại trong hốc và sau đó được đấy ra chúng sẽ tốn nhiều thời gian ở trong cột hơn so với phân

e.) Khuếch tán dọc – Sự mở rộng mũi sắc ký do khuếch tán của chất tan dọc theo chiều dài của cột theo pha động

Độ mở rộng của mũi sắc ký do khuếch tán dọc phụ thuộc vào các yếu tố:

1) khuếch tán của chất tan 2) tốc độ dòng của chất tan thông qua cột

How can band broadening be reduced? (and thus column efficiency be enhanced)

1 Decrease particle diameter

2 Decrease column width

3 Lowering temperature in GC (reduces

diffusion coefficient)

4 Minimize thickness of liquid stationary

phase

• Thông thường hai cấu tử có thể tách ra khỏi nhau khi >1,2,  càng lớn khoảng cách giữa hai mũi càng xa, hay hai mũi tách khỏi nhau hoàn toàn Hệ số chọn lọc phụ thuộc vào bản chất của A, B, pha

động, pha tĩnh và nhiệt độ.

• Ảnh hưởng của  rất mạnh khi   1 Để thay đổi  người ta cần thay đổi:

– Thành phần pha động – Độ phân cực của pha động – Bản chất pha tĩnh

– Nhiệt độ

Ý nghĩa của hệ số phân giải

- Hệ số phân giải là một đại lượng dùng để đánh giá hai peak liên tiếp có thể tách được hay không Để tăng RS có thể tăng tR hoặc giảm W2 và W1.

- Để tách được thì RS > 1 Để phân tích định lượng chính xác thì các mũi sắc

ký phải tách xa nhau hoàn toàn Do đó cần chọn điều kiện sao cho RS của các cặp phải thoả mãn RS > 1,5 thì phân tích mới chính xác.

Biểu thức liên hệ giữa hệ số phân giải với độ hiệu nghiệm,

1 + K là số hạng biểu diễn sự phụ thuộc vào dung lượng cột

Các yếu tố ảnh hưởng lên số đĩa lý thuyết

L N=

 

 

 

Ảnh hưởng của  đến N:

 Với 1 giá trị RS, N cần thiết càng nhỏ, ảnh hưởng của  càng mạnh.

 Ảnh hưởng của  rất mạnh khi  1

  tăng, khoảng cách 2 peak tăng

Để thay đổi  ta có thể thay đổi:

 thành phần pha động

 độ phân cực của của pha động

 

2 '

Các yếu tố ảnh hưởng lên số đĩa lý thuyết

Ảnh

 K’2 < 1, ảnh hưởng của K’2 rất mạnh

 K’2 ≥ 5, ảnh hưởng của K’2 rất yếu

Để thay đổi K’ ta có thể thay đổi:

 năng suất rửa giải của pha động

 lượng pha tĩnh chứa trong cột (VS tăng, VM giảm → K’ tăng)

Độ phân giải RS

 Tăng tR, tăng khoảng cách giữa 2 peak

 Giảm Wb1 và Wb2, giảm bề rộng đáy, tăng độ nhọn của peak

Chromatographic Separations with a twist

Separations with a twist

Chromatographic Relationships

Động học của quá trình sắc ký

Kích thước hạt quá lớn hay quá bé đều khó nạp cột đồng đều do đó làm cho tốc độ pha động khác nhau rõ rệt, trong sắc ký lỏng thường dùng hạt có kích thước đồng đều và có đường kính trung bình( = 1-6 mm)

Tốc độ dòng lớn quá hoặc bé quá đều giảm độ hiệu nghiệm của cột

Tốc độ tối ưu trong sắc ký lỏng thường bé hơn trong sắc ký khí 104 lần do

đó làm kéo dài thời gian phân tích Hiện nay nhờ kỹ thuật cao áp, ta có thể làm tăng tốc độ dòng để tăng nhanh thời gian phân tích mà kết quả tách vẫn tốt vì có thể tăng độ dài cột

PHƯƠNG TRÌNH VANDEEMTER

 Trong đó:

 - H A : Chiều cao riêng phần thể hiện chất lượng của cột nhồi gây ảnh hưởng đến tốc độ chuyển dịch khác nhau của các phần tử trong cột nhồi.

 - H B : Chiều cao riêng phần biểu diễn sự phân tán của cấu tử khảo sát trong pha động.

 - H C : Chiều cao riêng phần biểu diễn sự hấp phụ và giải hấp phụ của

Cu u

B A

H H

H

H  A  B  C   

Van Deemter Plot

Mass Transfer (both), Cu

Longitudinal diffusion, B/u

A + B/u + Cu

ĐÁP SỐ

 Hệ số dung lượng: k = 6.07

 Số đĩa lý thuyết: N = 296 đĩa

 Chiều cao của đĩa: HETP (H) = 3.38 cm

 Độ phân giải: Rs = 1.48 (tách định lượng được)

 Hệ số tách (chọn lọc):  = ?

Example 12: Given the following data and a 24.7 cm column

calculate the resolution between species C and D What column length is required for a resolution of 1.5?

Compound Retention Time (min) Peak Width(W B , min)

1.4 Sắc ký hấp phụ

 Nguyên tắc của sắc ký hấp phụ

 Các loại lực hấp phụ

 Pha tĩnh và pha động trong sắc ký hấp phụ

 Ưu và nhược điểm của phương pháp sắc ký hấp phụ

Các loại lực hấp phụ

Sắc ký hấp phụ là quá trình tách do ái lực khác nhau của các cấu tử lỏng đối với chất hấp phụ rắn

Lực hấp phụ bao gồm:

Lực Van der Waals là lực tương tác giữa các phân tử

Lực cảm ứng là lực hình thành khi trong phân tử có sẵn điện trường

Lực liên kết hoá học khi giữa chất hấp phụ và chất bị hấp phụ hình thành liên kết hoá học

Lực liên kết hydro khi chất hấp phụ phân cực như Al2O3, SiO2…hấp phụ các chất có nhóm cho proton

Pha tĩnh

Yêu cầu đối với chất hấp phụ

 Không tương tác hoá học với các cấu tử cần tách, không có hoạt tính xúc tác để tránh các phản ứng phụ như oxy hoá, polymer hoá…

 Chất hấp phụ phải ổn định để cung cấp các kết quả có độ lặp lại cao

 Diện tích bề mặt riêng và kích thước hạt phải thích hợp

 Chất hấp phụ phân cực (oxid kim loại, silicalgel …) hấp phụ chọn lọc các phân

tử phân cực (hydrocarbon chưa no và thơm như các amin, rượu, acid)

 Các chất hấp phụ không phân cực (than hoạt tính, diatomite…) không hấp phụ chọn lọc các cấu tử không phân cực mà thường được sử dụng làm chất mang

- Hoạt tính của nhôm oxid phụ thuộc rất lớn vào hình dạng và độ ẩm

- Khả năng hấp phụ tăng khi số nhóm OH giảm

Than hoạt tính không cực chỉ hấp phụ chủ yếu chất không cực, than hoạt tính

có cực thường hấp phụ các chất hữu cơ có cực

Pha động

Pha động hay dung môi sử dụng trong sắc ký phải đáp ứng các yêu cầu sau:

-Độ tinh khiết cao

-Hoà tan tương đối tốt tất cả các chất phân tích

-Bị hấp phụ tối thiểu trên pha tĩnh

-Không phản ứng hoá học với chất tan cũng như chất hấp phụ

Để tăng khả năng tách, có thể rửa giải bằng nhiều dung môi theo thứ tự khả năng giải hấp tăng dần

Trừ một vài ngoại lệ, khả năng giải hấp của dung môi phụ thuộc vào hằng số điện môi của chúng

-Đối với chất hấp phụ phân cực, dung môi có hằng số điện môi càng lớn sẽ có khả năng giải hấp càng cao đối với chất hấp phụ trên đó

-Với các chất hấp phụ không phân cực, dung môi có hằng số điện môi càng lớn sẽ giải hấp càng kém.

Ưu và nhược điểm của sắc ký hấp phụ

Ưu điểm

• Có độ chọn lọc cao với các đồng phân vị trí

• K’ tăng theo độ phân cực của chất tan

Nhược điểm

• Các peak dễ chập lên nhau, Rs nhỏ

• Trong SKHP, K = CS/CM không là hằng số nên peak trong SKHP không đối xứng, thường có đuôi

1.5 Sắc ký phân bố

 Cơ sở lý thuyết của sắc ký phân bố

 Phân loại sắc ký phân bố

Cơ sở lý thuyết của sắc ký phân bố

Sắc ký phân bố là phương pháp sắc ký dựa trên sự phân bố không giống nhau của chất tan giữa pha tĩnh và pha động Pha động và pha tĩnh không trộn lẫn vào nhau, tính chất phải khác hẳn nhau

Ví dụ: pha tĩnh phân cực thì pha động phải ít phân cực nghĩa là

PS > PM và ngược lại

Đối với sắc ký phân bố cổ điển, pha tĩnh thường là chất lỏng; nếu pha động là chất lỏng thì ta có phương pháp sắc ký lỏng – lỏng; nếu pha động

là chất khí thì ta có phương pháp sắc ký lỏng – khí

Sắc ký phân bố pha thường

Trong sắc ký phân bố pha thường, pha tĩnh thường là dung môi có độ phân cực cao hoặc silic ghép gốc phân cực ( - CN, - OH, - NH2); pha động thường là dung môi có độ phân cực thấp hơn (PS > PM)

Sắc ký phân bố pha thuận áp dụng cho những chất có độ phân cực tương đối cao, phân tử khối nhỏ

Dung môi thường dùng trong sắc ký phân bố pha thường là hexan,

CH2Cl2, MTBE, ACN

Sắc ký phân bố pha đảo

Trong sắc ký phân bố pha đảo, pha tĩnh có độ phân cực thấp hơn pha động PS < PM

Chất càng phân cực càng ít bị giữ lại, dung môi động càng phân cực, năng suất rửa giải càng yếu

Trái với sắc ký hấp phụ và sắc ký phân bố pha thường, nước là dung môi yếu nhất trong sắc ký phân bố pha đảo Khi thêm một dung môi hữu cơ vào nước, độ phân cực của của pha động giảm, năng suất rửa giải tăng

Sắc ký phân bố pha đảo được sử dụng cho những chất ít tan trong

 Thin layer is coated onto inside of GC column or on small particles on LC column

 Not used as widely as

partition used mainly

in TLC & very small

particles in LC

1.5 Phân tích định tính và định lượng trong sắc ký

Định lượng trong sắc ký

Đây là phương pháp cho phép xác định chính xác nồng độ của chất phân tích ở nồng độ có thể là mg/L, g/L, ppm, ppb, …

Phương pháp này thường dùng chủ yếu cho sắc ký lỏng, ít dùng cho sắc ký khí Đối với sắc ký khí, khi sử dụng phương pháp ngoại chuẩn, các thông số làm việc của máy như nhiệt độ, tốc độ dòng phải rất ổn định và lượng mẫu bơm vào phải có

độ ổn định cao

Trong sắc ký khí, nếu tiêm mẫu bằng tay, sai số có thể lên đến 30 % do thể tích tiêm mẫu giữa các lần tiêm sẽ khác nhau nhiều Để khắc phục, trong sắc ký khí, khi dùng phương pháp ngoại chuẩn người ta thường dùng bộ tiêm mẫu tự động (sai số khi sử dụng bộ tiêm mẫu tự động thường trong khoảng 2 – 3 %) Nếu không có bộ

Định lượng trong sắc ký

Phương pháp ngoại chuẩn

Phương pháp ngoại chuẩn

h

Diện tích S

C

h hoặc S

Đường chuẩn

Đây là phương pháp thường dùng trong sắc ký khí, phương pháp cho phép xác định chính xác nồng độ của chất phân tích mà không bị ảnh hưởng đáng kể bởi thể tích mẫu giữa các lần tiêm

Trong phương pháp này, ta thêm vào tất cả các dung dịch (mẫu, chuẩn) một lượng xác định (mIS hoặc CIS) của chất đươc chọn làm chất nội chuẩn Chất nội chuẩn có thể là một chất lạ và cũng có thể là một cấu tử nào đó sẵn có trên sắc ký

đồ, với điều kiện là sau đây

-Chất nội chuẩn phải có thời gian lưu gần với thời gian lưu của cấu tử cần phân tích

-Pic của chất nội chuẩn phải gần với pic của chất cần phân tích

Phương pháp nội chuẩn (Internal standard)

Chất nội chuẩn

Chất cần xác định

Phương pháp nội chuẩn (Internal standard)

Ưu điểm của phương pháp nội chuẩn là hạn chế sai số do thể tích mẫu vào cột sắc ký không đồng đều giữa các lần tiêm và khắc phục những nhược điểm của phương pháp ngoại chuẩn

Sắc ký đồ mẫu và kết quả tích phân

IS X

AX = 27.01

is x

is x is

x

c c

A A

R / 

Đường chuẩn với chất nội chuẩn

• Thêm hàm lượng của chất nội chuẩn

• Tiêm và đo đươc giá trị A x /A is

• Xác định giá trị c x /c is cho mẫu của bạn

từ đường chuẩn Với c is đã biết, c x rất

dễ dàng được tính theo công thức

c x = (c x /c is )c is

is x

is

x is

x

c c